專利名稱：醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醋酸桿菌的一種新的木糖醇脫氫酶、編碼此酶的基因以及生產(chǎn)木糖醇脫氫酶和木糖醇的方法。木糖醇在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域是很有用的。
木糖醇是一種天然糖醇，因?yàn)槠浜休^低的熱量卻具有與蔗糖相當(dāng)?shù)奶鸲?，所以是一種有廣闊應(yīng)用前景的低熱量甜料。此外，因?yàn)橛锌过x齒的特性，其可以作為一種預(yù)防齲齒的甜料。另外，因?yàn)槟敬继遣⒉簧咂咸烟堑乃剑虼吮焕糜谔悄虿〉牧黧w療法。由于這些原因，可以預(yù)計(jì)將來(lái)木糖醇的需求會(huì)增加。
目前木糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)主要利用如美國(guó)專利4008285中公開(kāi)的方法即D-木糖的脫氫來(lái)進(jìn)行。D-木糖作為原料通常由植物材料如樹(shù)木、稻草、玉米穗軸、燕麥殼和其它富含木聚糖的材料的水解作用而獲得。
然而，這種由植物材料水解而獲得的D-木糖因?yàn)槌杀靖咚杂袃r(jià)格較高的缺點(diǎn)。例如，植物材料水解處理的低產(chǎn)率導(dǎo)致了D-木糖醇的低純度。因此，水解處理后必須通過(guò)離子交換除去用于水解的酸和染料，并且合成的D-木糖必須進(jìn)一步的結(jié)晶以除去其它的半纖維素糖類。為了獲得適于作為食品的D-木糖，還要求進(jìn)一步的純化。這些離子交換處理和結(jié)晶處理導(dǎo)致了生產(chǎn)成本的增加。
因此，人們改進(jìn)一些生產(chǎn)木糖醇的方法，利用易得到的原料并只產(chǎn)生了很小的浪費(fèi)。例如，一些改進(jìn)的方法利用其它的戊糖醇作為初始原料。其中一種易得到的戊糖醇是D-阿拉伯糖醇，并且D-阿拉伯糖醇可由酵母產(chǎn)生(加拿大微生物學(xué)雜志，31.，1985，467-471；和普通微生物學(xué)雜志，139，1993，1047-54)。
因而，一些利用D-阿拉伯糖醇為原料生產(chǎn)木糖醇的方法得到了發(fā)展。在應(yīng)用微生物學(xué)，18，1969，1031-1035，上報(bào)道了一種方法，其中D-阿拉伯糖醇是由葡萄糖通過(guò)漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)ATCC 20121菌株發(fā)酵獲得，然后利用弱氧化醋桿菌(Acetobacter suboxydans)轉(zhuǎn)化為D-木糖，再在季也蒙氏假絲酵母(Candida guilliermondii)var.soya的作用下將D-木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。
EP 403 392A和EP 421 882A公開(kāi)的方法通過(guò)利用耐滲透壓的酵母發(fā)酵產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇，然后利用醋酸桿菌屬、葡糖桿菌或克雷白氏桿菌屬的桿菌將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，通過(guò)葡萄糖(木糖)異構(gòu)酶的作用由D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，再通過(guò)氫化作用將木糖和D-木酮糖的混合物轉(zhuǎn)化為D-木糖醇。同時(shí)，也公開(kāi)了木糖醇的產(chǎn)生包括木糖和D-木酮糖的混合物中的木糖的預(yù)濃縮以及通過(guò)氫化作用將濃縮的木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。
盡管上述利用D-阿拉伯糖醇作為原材料產(chǎn)生木糖醇的方法有比較高的產(chǎn)量，然而，存在著一個(gè)缺點(diǎn)即要求多個(gè)反應(yīng)步驟，因此生產(chǎn)過(guò)程變得復(fù)雜。所以，在經(jīng)濟(jì)上是不可能被接受的。
另一方面，人們?cè)噲D通過(guò)基因操作技術(shù)來(lái)繁殖木糖醇發(fā)酵微生物。國(guó)際公開(kāi)的WO94/10325公開(kāi)了使用重組微生物由葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生木糖醇的方法，所述重組微生物是通過(guò)將來(lái)自克雷白氏桿菌屬桿菌的阿拉伯糖醇脫氫酶基因和來(lái)自畢赤氏酵母(Pichia)屬桿菌的木糖醇脫氫酶基因?qū)氚⒗谴及l(fā)酵微生物(屬于念珠菌屬、球擬酵母屬或接合糖酵母屬的酵母)而獲得的。
然而，上面所述的通過(guò)基因操作技術(shù)來(lái)繁殖木糖醇發(fā)酵微生物作為一種實(shí)用方法是不完善的。
另外，木糖醇脫氫酶是一種催化由木糖生成木糖醇反應(yīng)的酶，已知其存在于各種微生物中。例如，酵母具柄畢赤氏酵母(Pichia stipiti)(發(fā)酵生物工程雜志，67.25(1989))，Pachysolen tannophilus(發(fā)酵技術(shù)雜志，64.219(1986))，休哈塔假絲酵母(應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)，26.197(1990))，近平滑假絲酵母(生物技術(shù)生物工程，58，440(1998))，漢遜氏德巴利氏酵母(應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)，56，79(1996))和出芽茁霉(Pullularia pullulans)(An.Acad.Brasil.Cienc.，53，183(1981))，絲狀桿菌如黑色曲霉(微生物學(xué)，140，1679(1994))和粗糙鏈孢霉(FEMS Microbiol.lett.，146，79(1997))，藻類如Galdieria sulphuraria(植物，202，487(1997))，細(xì)菌如Morgannelamorganii(細(xì)菌學(xué)雜志，162，845(1985))，等等。
關(guān)于木糖醇脫氫酶基因，已有具柄畢赤氏酵母(FEBS Lett，324，9(1993))和Morgannela morganii(DDBJ/GenBank/EMBL登記號(hào)L34345)的該基因核苷酸序列的報(bào)道。
然而，迄今為止人們對(duì)于來(lái)自醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因甚而其存在一無(wú)所知。
本發(fā)明的目的是提供一種與有較強(qiáng)木糖醇生產(chǎn)能力微生物的木糖醇生物合成有關(guān)的酶，及其基因，并且利用這些酶和基因以期建立一種技術(shù)用于有效地生產(chǎn)木糖醇或木糖醇發(fā)酵菌的繁殖。
為了達(dá)到上述目的，發(fā)明人尋找到一些有將D-阿拉伯醇直接轉(zhuǎn)化為木糖醇能力的微生物。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)葡糖桿菌屬或醋酸桿菌屬的細(xì)菌有這種能力。此外，成功地純化了兩種得自氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)的木糖醇脫氫酶，并且成功地分離出編碼這些酶和決定其結(jié)構(gòu)的基因。因而，本發(fā)明已經(jīng)完成。
即本發(fā)明提供了(1)在如下(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；和(2)在如下(C)或(D)中定義的蛋白質(zhì)(C)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(D)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供了(3)編碼在(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)的DNA；(A)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；(4)編碼(C)或(D)中定義的蛋白質(zhì)的DNA(C)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(D)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；
(5)上述(3)中的DNA，其定義于如下(a)或(b)(a)至少含有一段對(duì)應(yīng)于序列表中SEQ ID NO3第25到1053位的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴(yán)緊條件下可與具有對(duì)應(yīng)于序列表中SEQ ID NO3第25到1053位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制備的探針進(jìn)行雜交，并且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA；(6)上述(5)中的DNA，嚴(yán)緊條件是在60℃下，鹽濃度相當(dāng)于1x SSC和0.1％SDS時(shí)進(jìn)行洗滌。
(7)上述(4)中的DNA，其定義于如下(c)或(d)(c)至少含有一段對(duì)應(yīng)于序列表中SEQ ID NO5第1063到1848位的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴(yán)緊條件下可與具有對(duì)應(yīng)于序列表中SEQ ID NO5第1063到1848位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制備的探針進(jìn)行雜交，并且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA；和(8)上述(4)中的DNA，嚴(yán)緊條件是在60℃下，鹽濃度相當(dāng)于1x SSC和0.1％SDS時(shí)進(jìn)行洗滌。
本發(fā)明還提供了(9)以由上述(3)至(8)中任一DNA編碼的木糖醇脫氫酶可被表達(dá)的方式被導(dǎo)入所述DNA的細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了(10)生產(chǎn)木糖醇脫氫酶的方法，其中包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(9)的細(xì)胞以便木糖醇脫氫酶可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累，并且從培養(yǎng)基中收集木糖醇脫氫酶。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了(11)生產(chǎn)木糖醇的方法，其中包括用上述(1)或(2)的木糖醇脫氫酶作用于D-木酮糖，并收集產(chǎn)生的木糖醇；和(12)生產(chǎn)木糖醇的方法，其中包括用上述(9)的細(xì)胞作用于D-木酮糖，并收集產(chǎn)生的木糖醇。
盡管本發(fā)明的木糖醇脫氫酶有催化還原D-木酮糖產(chǎn)生木糖醇和催化氧化木糖醇產(chǎn)生D-木酮糖的活性，“有木糖醇脫氫酶活性”在這里是指至少有催化由D-木酮糖產(chǎn)生木糖醇的反應(yīng)的活性。
依照本發(fā)明，提供了新的木糖醇脫氫酶和編碼此酶的DNA，并且木糖醇脫氫酶可以通過(guò)使用該DNA來(lái)產(chǎn)生。
此外，木糖醇可以通過(guò)使用被導(dǎo)入木糖醇脫氫酶或編碼此酶的DNA的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。
而且，本發(fā)明的DNA可用于繁殖生產(chǎn)木糖醇的微生物。
附

圖1是純化XDH的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜；a)SDS-PAGE凝膠電泳后CBB染色，b)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后CBB染色，和c)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后活性染色。
附圖2是描繪XDH2酶活對(duì)pH依賴性圖譜。
本發(fā)明將在下文進(jìn)行具體地說(shuō)明。<1>本發(fā)明的木糖醇脫氫酶本發(fā)明的木糖醇脫氫酶是一類由氧化葡糖桿菌產(chǎn)生的酶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種這樣的酶，一種稱為XDH1，另一種是XDH2。XDH1有SEQ ID NO4的氨基酸序列，XDH2在序列表中有SEQ ID NO6的氨基酸序列。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)得XDH1和XDH2的分子量分別為大約36000到40000，和大約27000到30000。這兩種木糖醇脫氫酶，XDH1和/或XDH2，在下邊可被統(tǒng)稱為“XDH”。
正如在后面實(shí)施例5所涉及的，還原反應(yīng)中(由D-木酮糖產(chǎn)生木糖醇的反應(yīng))的XDH2的最適pH為5左右。已知木糖醇脫氫酶，例如得自黑色曲霉的木糖醇脫氫酶的還原反應(yīng)，其最適pH嚴(yán)格地為6.5(Cor F.B.Witteveen，et al，微生物學(xué)，140，1679-1685，1994)，因此與本發(fā)明得自葡糖桿菌屬桿菌的XDH2在最適反應(yīng)pH上有明顯的不同。
關(guān)于產(chǎn)生本發(fā)明的XDH的方法及分離和純化由氧化葡糖桿菌產(chǎn)生的XDH的方法的實(shí)施例將在下面說(shuō)明。
首先，用如超聲波處理的機(jī)械方法或使用細(xì)胞壁消化酶等的酶方法對(duì)氧化葡糖桿菌例如ATCC621菌株的細(xì)胞進(jìn)行破裂，然后通過(guò)離心或類似方法除去不溶解成分以制備細(xì)胞提取物。
可通過(guò)常規(guī)的例如陰離子交換層析、親和層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾層析等蛋白質(zhì)純化方法的聯(lián)合來(lái)分級(jí)分離如上述所獲得的細(xì)胞提取物以純化XDH。
作為陰離子交換層析的載體，可使用Q-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia生產(chǎn))，Mono-Q(Pharmacia生產(chǎn))等。含有XDH的提取物流過(guò)充滿此載體的柱以便酶被吸附到柱上，并且洗滌柱后，酶被高鹽濃度的緩沖液洗脫。在這種情況下，鹽濃度可以逐步增加，或應(yīng)用一個(gè)濃度梯度。例如，當(dāng)使用Q-瓊脂糖凝膠FF時(shí)，可用200到350mM KCl洗脫被吸附到柱上的XDH。當(dāng)使用Mono-Q時(shí)，可用150到250mMKCl洗脫。
作為親和層析的載體，可使用HiTrap Blue(Pharmacia生產(chǎn))。本發(fā)明的XDH是利用NAD或NADH作為輔酶，因此對(duì)這些物質(zhì)有親和力。被吸附到載體上的XDH可用含有大約5mM的NAD的緩沖液洗脫。
作為疏水層析的載體，可使用苯基瓊脂糖HP(Pharmacia生產(chǎn))，吸附到低鹽濃度載體上的XDH可用200到300mM硫酸銨洗脫。
按上述純化的XDH可通過(guò)凝膠過(guò)濾層析、SDS-PAGE凝膠電泳等方法進(jìn)一步純化并分離為XDH1和XDH2。作為凝膠過(guò)濾層析的載體，可使用交聯(lián)葡聚糖200HP(Pharmacia生產(chǎn))。
在上面所述的純化步驟中，級(jí)分中是否含有XDH可以通過(guò)用例如在后面實(shí)施例中所述的方法測(cè)量級(jí)分的XDH活性來(lái)證實(shí)。
如上所述已純化的XDH1和XDH2的N-端氨基酸序列分別示于序列表的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
盡管本發(fā)明的XDH可以如上所述通過(guò)分離和純化從氧化葡糖桿菌的細(xì)胞獲得，也可以通過(guò)將后面所述的編碼XDH的DNA導(dǎo)入合適的宿主從而使DNA得以表達(dá)再通過(guò)用常規(guī)方法發(fā)酵獲得異源的蛋白質(zhì)。
下面所述的不同的基因重組技術(shù)描述在“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。
作為用于獲得XDH基因表達(dá)的宿主，可使用多種原核細(xì)胞，包括埃希氏桿菌如大腸桿菌，葡糖桿菌如氧化葡糖桿菌，和枯草芽胞桿菌，多種真核細(xì)胞如釀酒酵母，具柄畢赤氏酵母和米曲霉。
用于將XDH基因?qū)胨拗鞯闹亟MDNA可通過(guò)將編碼XDH的DNA插入視宿主種類而定的載體中來(lái)獲得，在宿主中用這種方式可表達(dá)由DNA編碼的XDH。如果XDH基因的特定啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中具有活性時(shí)，此啟動(dòng)子可用作XDH基因表達(dá)的啟動(dòng)子。此外，如果需要，另外一個(gè)在宿主細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子可和編碼XDH的DNA連結(jié)在一起，在該啟動(dòng)子的控制下獲得表達(dá)。當(dāng)埃希氏桿菌屬作為宿主時(shí)，可使用lac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，PR啟動(dòng)子，λ噬菌體的PL啟動(dòng)子等。作為埃希氏桿菌的載體，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等也可以被使用。噬菌體DNA載體也可以使用。此外，含有啟動(dòng)子且能表達(dá)插入DNA序列的表達(dá)載體也可被使用。
根據(jù)例如D.A.Morrison的方法(酶學(xué)方法，68，326(1979))或其中受體細(xì)胞用氯化鈣處理以增加DNA的透過(guò)性(Mandel，M.and Higa，A.，分子生物學(xué)雜志，53，159(1970))的方法，通過(guò)導(dǎo)入質(zhì)粒大腸桿菌可以被轉(zhuǎn)化。<2>編碼XDH的DNA通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng)，見(jiàn)White，T.J.et.al；Trends Genet.，5，185(1989))或雜交可以從氧化葡糖桿菌的cDNA文庫(kù)或染色體DNA文庫(kù)獲得編碼XDH的DNA。用于PCR反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)基于所測(cè)定的純化的XDH1和XDH2氨基端的氨基酸序列。此外，由于本發(fā)明已闡明XDH1基因(SEQ ID NO3)和XDH2基因(SEQ ID NO5)的核苷酸序列，所以引物或用于雜交的探針可以以這些核苷酸序列為基礎(chǔ)來(lái)設(shè)計(jì)。通過(guò)使用含與5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)相對(duì)應(yīng)之序列的引物用于PCR，XDH編碼區(qū)的全長(zhǎng)序列可以被擴(kuò)增。
具體地，對(duì)于XDH2而言，含有SEQ ID NO5中第1063位核苷酸上游區(qū)域之核苷酸序列的引物可用作5’引物，含有第1851位核苷酸下游區(qū)域之核苷酸序列的引物可以用作3’引物。至于XDH1，含有SEQ ID NO3中第25位核苷酸上游區(qū)域之核苷酸序列的引物可以用作5’引物。
引物的合成可通過(guò)常用的方法，例如磷酰胺化方法(見(jiàn)Tetrahedron Letters，22，1859(1981))，使用商購(gòu)的DNA合成儀來(lái)進(jìn)行(例如，380B型DNA合成儀，由Appied Biosystems生產(chǎn))。此外，按照供應(yīng)商指定的方法，使用例如，PERKIN ELMER生產(chǎn)的Gene Amp PCR系統(tǒng)和TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)可進(jìn)行PCR。
本發(fā)明的DNA可編碼包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸在一個(gè)或多個(gè)位置發(fā)生替換、缺失、插入、增加、倒位的XDH1或XDH2，只要所編碼的XDH1或XDH2將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的活性不變即可。盡管“幾個(gè)”氨基酸的數(shù)目的不同取決于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基的位置和類型，其可為2到100，優(yōu)選為2到50，更優(yōu)選為2到10。
例如，通過(guò)XDH1基因或XDH2基因的核苷酸序列的修飾，例如，通過(guò)定點(diǎn)誘變法以使基因特定位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，即可獲得編碼與上述XDH1或XDH2基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA。上述的DNA修飾可通過(guò)已知的常規(guī)突變處理來(lái)得到。突變處理包括在體外用例如羥胺，處理編碼XDH的DNA的方法，和用紫外線照射或用通常用于突變處理的突變劑如N-甲基N`-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理微生物的方法，所述微生物如埃希氏桿菌屬攜有編碼XDH的DNA的細(xì)菌。
上述核苷酸的替換、缺失、插入、增加、倒位也包括自然發(fā)生的突變(突變體或變體)，例如，微生物的菌株、種或?qū)俚牟町悺?br> 通過(guò)在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)上述具有突變的DNA并目檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的XDH1或XDH2的活性可獲得編碼與XDH1或XDH2基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA。也可以通過(guò)從編碼具有突變的XDH1或XDH2的DNA中或從攜有所述DNA的細(xì)胞中分離DNA來(lái)獲得編碼與XDH1或XDH2基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA，所述DNA可在嚴(yán)緊條件下與例如含有SEQ ID NO3的第25到1053位核苷酸序列的DNA或由此DNA制備的探針雜交，或與含有SEQ IDNO5的第1063到1848位核苷酸序列的DNA或由此DNA制備的探針雜交，并且該DNA編碼有XDH1或XDH2活性的蛋白質(zhì)。這里所述的“嚴(yán)緊條件”是指在此條件下形成所謂的特異性雜合體，而不形成非特異性雜合體。使用任何數(shù)值都難以清楚地表述這種條件。然而，例如，嚴(yán)緊條件包括這樣一種條件，在此條件下，DNA有很高的同源性，例如，至少有50％同源性的DNA會(huì)相互雜交，DNA同源性低于上述值彼此則不雜交?？蛇x擇地，嚴(yán)緊條件例示于這樣一種條件，在此條件下，DNA之間的雜交在與Southern雜交的一般洗滌條件一致的鹽濃度下進(jìn)行，即60℃，1x SSC，0.1％SDS，優(yōu)選為0.1x SSC，0.1％SDS。
在上述條件下可雜交的基因，包括那些有終止密碼子產(chǎn)生的基因，和那些由于活性中心的突變而無(wú)活性的基因。然而，通過(guò)將基因與可商購(gòu)的活性表達(dá)載體連接，根據(jù)下面闡述的方法測(cè)定XDH1或XDH2活性，可很容易地去除這些突變基因。
本發(fā)明中編碼XDH的DNA除可用于上述XDH的生產(chǎn)方法和下述木糖醇的生產(chǎn)方法之外，還可用于生產(chǎn)木糖醇之微生物的繁殖。例如，通過(guò)增強(qiáng)具有將D-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的能力的如葡糖桿菌的微生物中的XDH基因，微生物將D-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的能力可得到提高。
<3>.生產(chǎn)木糖醇的方法通過(guò)將本發(fā)明的XDH或?qū)胍欢尉幋aXDH的DNA并表達(dá)XDH的細(xì)胞作用于D-木酮糖，并且收集產(chǎn)生的木糖醇，可以生產(chǎn)木糖醇。
XDH可以是提取自葡糖桿菌屬的酶，或利用可編碼XDH的DNA通過(guò)基因重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)的酶。此外，XDH可以是XDH1或XDH2，且可以是它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩?br> 由D-木酮糖生產(chǎn)木糖醇的反應(yīng)在20-60℃，更優(yōu)選在30-40℃，且pH為4-10，更優(yōu)選pH為4-8下進(jìn)行時(shí)通常會(huì)得到理想的結(jié)果。至于反應(yīng)，靜置培養(yǎng)或搖床培養(yǎng)均可以采用。反應(yīng)時(shí)間可以根據(jù)所用XDH的濃度、細(xì)胞的數(shù)量、底物濃度進(jìn)行變化，較理想地為1-100小時(shí)。
從完成反應(yīng)的混合物中收集和分離產(chǎn)生的木糖醇，包括使用合成的吸附劑、沉淀劑等的任何常規(guī)的方法均可使用。
本發(fā)明將引用以下的實(shí)施例進(jìn)一步明確地闡述。然而，本發(fā)明并不局限于實(shí)施例的描述。
實(shí)施例1通過(guò)氧化葡糖桿菌產(chǎn)生XDH和XDH的純化<1>氧化葡糖桿菌ATCC621的培養(yǎng)培養(yǎng)氧化葡糖桿菌ATCC621菌株以獲得有足夠XDH活性的細(xì)胞。30℃下，以PD培養(yǎng)基作為肉湯培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。PD培養(yǎng)基的組成為24g/L的馬鈴薯葡萄糖(Difco)，30g/L的酵母抽提物(Difco)，5g/L肉汁提取物(Difco)，15g/L甘油，10g/L D-阿拉伯糖醇，10g/L D-木糖，10g/L木糖醇，20g/L碳酸鈣(Kanto Chemical)，pH7.0。
首先，作為種子培養(yǎng)物，ATCC621菌株被接種至含有40ml PD培養(yǎng)基的坂口氏瓶，30℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將得到的濃度相當(dāng)于1％的培養(yǎng)液接種至各含40ml PD培養(yǎng)基的坂口氏瓶，并且于30℃下振蕩培養(yǎng)3天(主培養(yǎng)物)。通過(guò)離心去除碳酸鈣后，離心收集到細(xì)胞。上述所獲細(xì)胞用于XDH的提純材料。
通過(guò)下面的酶活測(cè)定法測(cè)得XDH的活性。將30μl的酶液加至含有100mM的(終濃度)木糖醇、2mMNAD和100mM CAPS(PH10.0)的570μl的反應(yīng)液中，30℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，利用分光光度計(jì)(BECKMAN生產(chǎn)的DU640分光計(jì))測(cè)量340nm處的吸收來(lái)測(cè)定反應(yīng)進(jìn)程中NADH的增加。每分鐘產(chǎn)生1μmol NADH的活性被定義為一個(gè)單位(U)。利用NADH在340nm下的分子吸收系數(shù)ε為6.3×103進(jìn)行計(jì)算。<2>XDH的純化(1)細(xì)胞提取物的制備將如上所獲的細(xì)胞懸浮于50mM磷酸鉀緩沖液中(pH7)，且5000xg下離心10分鐘重新收集沉淀部分，此過(guò)程中這些細(xì)胞的懸浮和離心均重復(fù)兩次以洗滌細(xì)胞。
將大約10g的已洗滌的細(xì)胞懸浮于50ml的緩沖液1中(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mMMgCl2，1mMDTT)，在4℃下用超聲波破碎20分鐘。將破碎細(xì)胞的懸浮液離心(8000rpm，10分鐘)以除去細(xì)胞碎片，進(jìn)一涉超速離心(56000rpm，30分鐘)以除去不溶解的部分。因而，就獲得了可溶的部分。
(2)陰離子交換層析將上述所獲的可溶部分上樣于用緩沖液1平衡過(guò)的陰離子交換層析柱Q-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia生產(chǎn))。通過(guò)此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩沖液1洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)(非吸附蛋白質(zhì))，用含有KCl的緩沖液作為洗脫液洗脫被吸附的蛋白質(zhì)。在此洗脫過(guò)程中，緩沖液中KCl的濃度是從0M到0.5M線性變化的。測(cè)得洗脫過(guò)程中得到的每一個(gè)洗脫級(jí)分的XDH活性。在對(duì)應(yīng)于大約200到350 mMKCl的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)洗脫級(jí)分中XDH的活性。
(3)NAD親和層析合并上面獲得的含XDH活性的部分，對(duì)緩沖液1進(jìn)行透析。用0.45μm的濾器過(guò)濾經(jīng)透析后的溶液。將濾液上樣于用緩沖液1平衡過(guò)的5ml NAD親和柱HiTrap Blue(Pharmacia生產(chǎn)的)。通過(guò)此操作，XDH被吸收到載體上。
用緩沖液1洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)(非吸附蛋白質(zhì))，然后用含NAD的緩沖液2(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，1mMDTT，5mM NAD)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質(zhì)。結(jié)果，在被洗脫的級(jí)分中測(cè)到XDH。
(4)陰離子交換層析通過(guò)0.45μm的濾器過(guò)濾上述含有XDH活性的洗脫級(jí)分。將獲得的濾液上樣于用緩沖液1平衡過(guò)的陰離子交換層析柱Mono-Q(Pharmacia生產(chǎn)的)。通過(guò)此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩沖液1洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)，然后用含有KCl的緩沖液作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質(zhì)，在此洗脫過(guò)程中，洗脫液中KCl的濃度是從0mM到500mM線性變化的。測(cè)得洗脫過(guò)程中得到的每一個(gè)洗脫級(jí)分的XDH活性。在對(duì)應(yīng)于大約150到250mMKCl的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)洗脫級(jí)分中的XDH活性。
(5)疏水層析對(duì)著緩沖液3(50mM磷酸鉀緩沖液，1M硫酸銨，pH7.0)透析需檢測(cè)活性的洗脫級(jí)分。通過(guò)0.45μm的濾器過(guò)濾透析后的溶液。將得到的濾液上樣于用緩沖液3平衡過(guò)的疏水層析柱苯基瓊脂糖凝膠HP(Pharmacia生產(chǎn))。通過(guò)此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩沖液3洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)，然后用緩沖液4(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質(zhì)，此洗脫過(guò)程中，緩沖液中硫酸銨濃度呈從1M到0M的線性變化。測(cè)得洗脫過(guò)程中得到的每一個(gè)洗脫級(jí)分的XDH活性。在對(duì)應(yīng)于大約200到300mM硫酸銨的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)洗脫級(jí)分中的XDH活性。
(6)純化級(jí)分的分析對(duì)通過(guò)上述純化獲得的XDH活性組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，確認(rèn)XDH被純化到可被檢測(cè)到兩條帶的水平，所述帶的分子量估計(jì)分別為大約27000到30000和大約37000到40000(見(jiàn)圖1)。自此以后，與分子量大約為36000到40000的帶相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)被稱為XDH1，與分子量大約為27000到30000的帶相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)被稱為XDH2。
此外，對(duì)獲得的活性組分進(jìn)行Native-PAGE電泳(非變性PAGE)和考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，兩條對(duì)應(yīng)于大于100kDa的分子量的帶被證實(shí)。當(dāng)經(jīng)Native-PAGE電泳后的凝膠被活性染色液(25mM甘氨酸緩沖液，2.5mMNAD，50mM木糖醇，0.2nM吩嗪硫酸甲酯，0.2mM四硝基藍(lán)四氮唑氯化物)活性染色時(shí)，在兩個(gè)對(duì)應(yīng)的帶里測(cè)到XDH的活性，已證實(shí)與在SDS-PAGE電泳中檢測(cè)到的兩個(gè)帶對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)都有XDH活性(圖1)。含有這些XDH1和XDH2的已純化組分有時(shí)在后面被簡(jiǎn)稱為XDH。
已測(cè)得作為上述純化的結(jié)果的XDH比活的增加。已測(cè)到上述細(xì)胞提取物和通過(guò)純化獲得的活性組分的XDH活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過(guò)一系列純化過(guò)程，每單位蛋白質(zhì)重量的比活增加550倍。通過(guò)用于這種測(cè)量的活性測(cè)定方法，純化的XDH的比活估計(jì)大約為130U/mg(30℃，pH10)。
(7)XDH氨基端氨基酸序列的測(cè)定按下述測(cè)定上述純化XDH氨基端的氨基酸序列。即，在SDS的存在下，在聚丙烯酰胺凝膠中電泳已純化的大約10μg XDH蛋白質(zhì)，然后將凝膠中的XDH印跡至濾膜上，通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序儀從N端分析氨基酸序列。具體地，利用Milliblot(Millipore)將經(jīng)半干法電泳后的凝膠中的目的酶印跡至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Tanpakushitu Kozo Kaiseki[蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析]，H.Hirano，Tokyo Kagaku Dojin)。然后，通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序儀(ABI生產(chǎn)的476A型)分析PVDF膠片上的目的酶(XDH1或XDH2)以進(jìn)行N端氨基酸序列分析。
結(jié)果，測(cè)得XDH1 N端27個(gè)殘基的氨基酸序列，和XDH2N端25個(gè)殘基的氨基酸序列。測(cè)得的XDH1 N端氨基酸序列示于序列表中的SEQ IDNO1，XDH2 N端氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO2。
實(shí)施例2利用XDH將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇使用實(shí)施例1獲得的純化的XDH(XDH1和XDH2)將D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。將0.2U的純化的XDH加至含21mM D-木酮糖、20mM NADH、100mMTris-HCl緩沖液(pH 8.0)的0.25ml反應(yīng)液中，30℃保溫1小時(shí)使其反應(yīng)。反應(yīng)完的溶液在下面的條件下經(jīng)過(guò)高效液相層析(HPLC)分析產(chǎn)物木糖醇。
柱Shodex SC1211 (Show Denko Co.，Ltd.生產(chǎn))流動(dòng)相50％乙腈/50％50ppm含水的Ca-EDTA流速0.8ml/分鐘溫度60℃檢測(cè)RI檢測(cè)器結(jié)果，反應(yīng)后在溶液中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了18mM的木糖醇，且顯示了使用純化的XDH可由D-木酮糖產(chǎn)生木糖醇。
實(shí)施例3得自葡糖桿菌的XDH基因的分離
<1>通過(guò)PCR擴(kuò)增XDH基因(1)制備以XDH的N端氨基酸序列作為基礎(chǔ)的PCR引物以來(lái)自上述氧化葡糖桿菌ATCC621的每個(gè)XDH(XDH1，XDH2)的N端氨基酸序列(SEQ ID NO1和2)為基礎(chǔ)，分別制得具有如SEQ ID NO7-10所示核苷酸序列的混合引物。
(2)制備氧化葡糖桿菌ATCC621的染色體DNA在如下條件下培養(yǎng)氧化葡糖桿菌ATCC621菌株。首先，在20ml的YPG培養(yǎng)基(3％葡萄糖，0.5％的Bacto酵母抽提物，0.3％Bacto蛋白胨，pH6.5)中將ATCC621菌株培養(yǎng)過(guò)夜作為種子培養(yǎng)物。使用5ml此培養(yǎng)物作為接種菌，使用100ml YPG培養(yǎng)基進(jìn)行主培養(yǎng)，在30℃下振蕩培養(yǎng)。
細(xì)菌在上述的條件下培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期后，離心100ml的培養(yǎng)物肉湯(12000xg，4℃，15分鐘)以收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于10ml的50∶20TE(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM EDTA)中，洗滌細(xì)胞并離心回收之。將細(xì)胞再懸浮于10ml的50∶20TE中。將0.5ml的20mg/ml的溶菌酶溶液和1ml的10％的SDS溶液加至此懸浮液中，55℃保溫20分鐘。保溫后，加入等體積的10∶1的TE-飽和的苯酚進(jìn)行脫蛋白質(zhì)作用。通過(guò)將等體積的2-丙醇加至已分離的水層得到DNA沉淀，然后收集之。沉淀DNA溶解于加入了5μl 10mg/ml的核糖核酸酶和5μl 10mg/ml的蛋白酶K的0.5ml的50∶20 TE中，55℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后，通過(guò)加入等體積的10∶1的TE-飽和的苯酚進(jìn)行脫蛋白質(zhì)作用。在分離的水層中再加入等量的24∶1的氯仿/異戊醇，攪拌，并收集水層。此步驟重復(fù)兩次后，在得到的水層中加入3M的醋酸鈉溶液(pH5.2)以獲得0.4M的終濃度，再加入兩倍體積的乙醇。產(chǎn)物DNA作為沉淀被收集，用70％的乙醇洗滌，干燥，溶解于1ml的10∶1的TE中。
(3)通過(guò)PCR制備DNA片段通過(guò)使用TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(TaKaRa Shuzo公司提供)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增和分離含有來(lái)自葡糖桿菌屬的編碼XDH的基因的DNA分子。除非另有說(shuō)明實(shí)驗(yàn)是按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。
將上述(2)得到的5μg染色體DNA用限制性酶PstI或HindIII進(jìn)行降解。然后，將一個(gè)PstI盒或HindIII盒與用乙醇沉淀收集得到DNA片段連接。此外，乙醇沉淀后，使用引物C1和下述引物的聯(lián)合對(duì)收集的DNA進(jìn)行首次PCR。即將與一個(gè)PstI盒連接的DNA作為基于XDH1氨基酸序列的引物XDH1-S1的模板DNA，將與一個(gè)HindIII盒連接的DNA作為基于XDH2氨基酸序列的引物XDH2-S1的模板DNA。引物C1、引物XDH1-S1、引物XDH2-S1的核苷酸序列分別示于序列表的SEQ ID NO11、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9。引物C1包含在TaKaRaLAPCR體外克隆試劑盒中，且對(duì)應(yīng)于PstI盒和HindIII盒的序列。PCR反應(yīng)是通過(guò)基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)9600(由PERKIN ELMER生產(chǎn))進(jìn)行的，反應(yīng)在如下條件下重復(fù)30個(gè)循環(huán)。
94℃ 30秒55℃ 2分鐘72℃ 1分鐘然后，將反應(yīng)的混合物稀釋100倍，并新加入引物C2和引物XDH1-S2或引物XDH2-S2，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件與第一次的相同。引物C2、引物XDH1-S2、引物XDH2-S2的核苷酸序列分別示于序列表的SEQ IDNO12、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10。引物C2包含于TaKaRaLAPCR體外克隆試劑盒中，且具有對(duì)應(yīng)于PstI盒和HindIII盒之序列的序列。按已知的氨基酸序列設(shè)計(jì)的引物XDH1-S2和XDH2-S2分別含有一個(gè)序列，該序列對(duì)應(yīng)于EcoRI和EcoRI位點(diǎn)。
反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)3μl的反應(yīng)混合物進(jìn)行0.8％的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，證實(shí)當(dāng)使用XDH1-S2為引物時(shí)，大約1kb的DNA被擴(kuò)增，使用XDH2-S2為引物時(shí)，大約1.7kb的DNA被擴(kuò)增。
(4)將經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段克隆到pUC19中通過(guò)將PCR擴(kuò)增得到的大約1kbp(XDH1)和大約1.7kbp(XDH2)的DNA片段與pUC19連接而進(jìn)行克隆。連接反應(yīng)是通過(guò)使用DNA連接試劑盒Ver.2(TaKaRa Shuzo公司提供)進(jìn)行的。除非另有說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)是按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。
用PstI和EcoRI消化使用引物XDH1-S2擴(kuò)增得到的400ng大約1kb的DNA片段，然后純化之，與經(jīng)PstI和EcoRI消化的pUC19連接。使用這種連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
另外，用HindIII和EcoRI消化使用引物XDH2-S2擴(kuò)增得到的400ng大約1.7kb的DNA片段，然后純化之，與經(jīng)HindIII和EcoRI消化的pUC19連接。使用這種連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
每次從獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，選擇用pUC19轉(zhuǎn)化的含有大約1kbp(XDH1)或大約1.7kbp(XDH2)目的DNA片段的幾個(gè)JM109菌株。選擇的方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。
(5)XDH2基因片段核苷酸序列的測(cè)定制備被pUC19轉(zhuǎn)化的JM109攜帶的質(zhì)粒，其中pUC19含有大約1.7kbp(XDH2)的DNA片段，制備方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”，測(cè)定插入的DNA片段的核苷酸序列。測(cè)序反應(yīng)是通過(guò)使用DyeTerminator Cycle測(cè)序試劑盒(ABI生產(chǎn))，按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。使用DNA測(cè)序儀373(ABI生產(chǎn))進(jìn)行電泳。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的DNA片段中具有從序列表中SEQ ID NO5所示核苷酸序列的第1160位胸苷殘基到第2774位胸苷殘基的序列。
(6)通過(guò)PCR制備XDH2基因上游區(qū)域的DNA片段使用如上測(cè)定的核苷酸序列通過(guò)PCR擴(kuò)增和分離XDH2基因和XDH2基因上游區(qū)域的DNA片段。PCR反應(yīng)是使用TaKaRa LAPCR體外克隆試劑盒(TaKaRa Shuzo公司提供)進(jìn)行的。除非另有說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)是按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。
將(2)中制備的5μg染色體DNA用限制性酶SalI消化。然后，將SalI盒與用乙醇沉淀收集的DNA片段連接。再用乙醇沉淀，通過(guò)使用引物C1和引物XDH2UP-S1對(duì)收集的DNA進(jìn)行首次PCR。引物C1、引物XDH2UP-S1的核苷酸序列分別示于序列表的SEQ ID NO11和SEQ ID NO13。引物XDH2UP-S1是和SEQ ID NO5所示的編碼葡糖桿菌屬XDH2的基因簇核苷酸序列的第1317位胞嘧啶殘基到第1283位胞嘧啶殘基區(qū)域互補(bǔ)的序列。
PCR反應(yīng)是通過(guò)基因擴(kuò)增PCR9600系統(tǒng)(由PERKINELMER生產(chǎn))進(jìn)行的，反應(yīng)在如下條件下重復(fù)30個(gè)循環(huán)。
94℃ 30秒55℃ 2分鐘72℃ 1分鐘然后，將反應(yīng)的混合物稀釋100倍，并新加入引物C2和引物XIDH2UP-S2，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件與第一次的相同。引物C2、引物XDH2UP-S2的序列分別示于序列表的SEQ ID NO12和SEQ ID NO14。引物XDH2UP-S2是由與SEQ ID NO5所示的編碼葡糖桿菌屬XDH2的基因的核苷酸序列中的第1255位鳥(niǎo)嘌呤殘基到1225位鳥(niǎo)嘌呤殘基區(qū)域互補(bǔ)的一段序列組成。反應(yīng)完成后，將3μl的反應(yīng)混合物用于0.8％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果證實(shí)大約1.3kb的DNA片段被擴(kuò)增。
(7)XDH2基因的核苷酸序列和含有其上游序列的DNA片段的檢測(cè)將上述PCR擴(kuò)增得到的大約1.3kbp DNA片段進(jìn)行純化，并且測(cè)定其核苷酸序列。通過(guò)使用Dye Terminator循環(huán)測(cè)序試劑盒(ABI生產(chǎn))，按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)使用DNA373測(cè)序儀(ABI生產(chǎn))進(jìn)行電泳。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)(6)中擴(kuò)增的DNA片段中具有序列表中SEQ ID NO5所示核苷酸序列的從第1位鳥(niǎo)嘌呤殘基到第1224位鳥(niǎo)嘌呤殘基的一段序列。示于SEQ ID NO5的核苷酸序列包括與(5)中測(cè)定的核苷酸序列結(jié)合的這段核苷酸序列?？赡苡稍摱魏塑账嵝蛄芯幋a的氨基酸序列可由通用密碼子來(lái)推導(dǎo)，該氨基酸序列一起示于SEQ ID NO5，也顯示于SEQ ID NO6。從第2到26位氨基酸殘基的序列完全對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2所示XDH2的N端氨基酸序列的從第1到25位氨基酸殘基的序列。自此證實(shí)了PCR擴(kuò)增得到的DNA片段為來(lái)源于葡糖桿菌屬的靶XDH2基因及其上游區(qū)域。
(8)含有全長(zhǎng)XDH2基因編碼區(qū)的DNA片段的克隆通過(guò)PCR擴(kuò)增含有全長(zhǎng)XDH2基因編碼區(qū)的DNA片段，并將其連接到pUC18上以進(jìn)行克隆。該P(yáng)CR反應(yīng)利用TaKaRa LAPCR試劑盒(由TakaraShuzo Co.，Ltd.提供)進(jìn)行。除非另有說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)是按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。
PCR是通過(guò)將使用與(2)中相同的方法生產(chǎn)的氧化葡糖桿菌ATCC621菌株的1μg染色體DNA用作模板，并且利用引物XDH2-5’和引物XDH2-3’來(lái)進(jìn)行的。引物XDH2-5’的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO15，引物XDH2-3’的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO16。引物XDH2-5’含有一個(gè)序列，此序列對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO5所示XDH2基因的核苷酸序列的從第1043位胞嘧啶殘基到第1063位胞嘧啶殘基區(qū)域，引物XDH2-3’含有互補(bǔ)于上述核苷酸序列的第1957位胞嘧啶殘基到1978位胞嘧啶殘基區(qū)域的一段核苷酸序列。
該P(yáng)CR反應(yīng)是通過(guò)基因擴(kuò)增PCR9600系統(tǒng)(由PERKIN ELMER生產(chǎn))進(jìn)行的，反應(yīng)在如下條件下重復(fù)30個(gè)循環(huán)。
94℃ 30秒55℃ 2分鐘72℃ 1分鐘反應(yīng)完成后，將3μl的反應(yīng)混合物用于0.8％的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果證實(shí)大約1kbp的DNA片段被擴(kuò)增。
將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增得到的大約1kbp的DNA片段連接到pUC18上進(jìn)行克隆，此克隆利用DNA連接試劑盒Ver.2(由Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)進(jìn)行。除非另有說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)是按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。用BamHI和EcoRI消化400ng大約1kb的擴(kuò)增DNA片段，然后純化之，與用BamHI和EcoRI消化的pUC18連接。利用這種連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
從獲得的轉(zhuǎn)化子中，選擇用pUC18轉(zhuǎn)化的含有大約1kbp目的DNA片段的幾個(gè)JM109菌株。選擇的方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。
來(lái)源于氧化葡糖桿菌的XDH2基因可由上述方法克隆。通過(guò)上述方法獲得的含有XDH2目的基因片段的質(zhì)粒被稱作pUCXDH2。
(9)測(cè)定XDH1基因片段的核苷酸序列提取從(4)中選擇的被含大約1kbp(XDH1)DNA片段的pUC18轉(zhuǎn)化的JM109菌株所攜帶的質(zhì)粒，提取方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”，測(cè)定插入的DNA片段的核苷酸序列。測(cè)序反應(yīng)是通過(guò)使用DyeTerminator循環(huán)測(cè)序試劑盒(ABI生產(chǎn))，按照試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。使用DNA測(cè)序儀373(ABI生產(chǎn))進(jìn)行電泳。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的DNA片段含有序列表的SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第52位的鳥(niǎo)嘌呤殘基到1011位鳥(niǎo)嘌呤殘基的序列。
(10)從染色體DNA文庫(kù)克隆XDH1基因i)染色體DNA文庫(kù)的構(gòu)建用HindIII完全消化上文(2)中制備的1μg染色體DNA。用乙醇沉淀收集DNA，然后溶解于10μl的10∶1的TE中。將5μg的此溶液和1ng用HindIII消化過(guò)并經(jīng)BAP(細(xì)菌的堿性磷酸酶)脫磷酸化的pUC19(Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)混合，連接反應(yīng)是通過(guò)使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)進(jìn)行的。將3μl的此連接反應(yīng)混合物與100μl的大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)的感受態(tài)細(xì)胞混合以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將此涂布于適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基從而構(gòu)建染色體DNA文庫(kù)。
ii)探針的制備用(3)中得到的XDH1基因的一部分作為探針。將(3)中得到的使用引物C2和引物XDH1-S2擴(kuò)增的大約1kbDNA片段在1％瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行分離。切下靶帶，用Gene CleanII試劑盒(Funakoshi生產(chǎn))純化DNA。最終獲得16μl的50ng/μlDNA溶液。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用DIG High Prime(Boehringer Mannheim生產(chǎn))和此DNA片段制得地高辛標(biāo)記的探針。
iii)通過(guò)菌落雜交進(jìn)行篩選為了得到全長(zhǎng)的XDH1基因，利用上述的探針通過(guò)菌落雜交進(jìn)行染色體DNA文庫(kù)的篩選。菌落雜交的方法見(jiàn)“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。
將染色體DNA文庫(kù)的菌落印跡至尼龍濾膜上(Amershm生產(chǎn)的Hybond-N)，堿變性，中和，固定。用EASYHYB(Boehringer Mannheim生產(chǎn))進(jìn)行雜交。將濾膜浸入緩沖液(EASYHYB)，且于42℃預(yù)雜交1小時(shí)。然后，加入上述標(biāo)記的探針，42℃雜交16小時(shí)。接著，在室溫下用含有0.1％SDS的2x SSC沖洗濾膜20分鐘。而后，65℃用含有0.1％SDS的0.1x SSC沖洗濾膜15分鐘兩次。
根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)用DIG核苷酸檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim生產(chǎn))檢測(cè)可與上述探針雜交的菌落。結(jié)果，檢測(cè)得到四株可與探針雜交的菌落。
(11)XDH1基因的DNA序列用與(5)中相同方法，檢測(cè)到插入pUC19的DNA片段的核苷酸序列，結(jié)果示于序列表的SEQ ID NO3。通過(guò)通用密碼子推導(dǎo)出的由核苷酸序列編碼的氨基酸序列連同核苷酸序列示于SEQ ID NO3，也示于SEQ ID NO4。從第2到第28位氨基酸殘基的氨基酸序列完全對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1所示的由第1到第27位的27個(gè)氨基酸殘基組成的序列。自此證實(shí)獲得的DNA片段是來(lái)源于葡糖桿菌屬的靶XDH1基因及其側(cè)翼區(qū)。
實(shí)施例4來(lái)源于葡糖桿菌屬細(xì)菌的XDH1基因在大腸桿菌中的表達(dá)及產(chǎn)物的純化<1>攜有重組XDH2基因的大腸桿菌的培養(yǎng)與表達(dá)的誘導(dǎo)實(shí)施例3所獲的pUCXDH2中，來(lái)源于葡糖桿菌屬細(xì)菌的編碼XDH2基因的DNA與lacZ啟動(dòng)子的下游區(qū)域相連，因此其表達(dá)是在lacZ啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行的。
于37℃，在50ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)用pUCXDH2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109和用pUC18轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109(對(duì)照)過(guò)夜，以作為種子培養(yǎng)物。將1％量的用pUCXDH2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109種子培養(yǎng)物接種在含新鮮培養(yǎng)基的燒瓶中作為平行實(shí)驗(yàn)1。另一方面，將1％量的用pUC18轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109種子培養(yǎng)物接種在含新鮮培養(yǎng)基的燒瓶中作為平行實(shí)驗(yàn)2(對(duì)照)。培養(yǎng)每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，當(dāng)培養(yǎng)物在610nm處的光吸收變?yōu)?.7時(shí)，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖)至1mM的終濃度。然后，4小時(shí)后，培養(yǎng)結(jié)束。
<2>驗(yàn)證由誘導(dǎo)表達(dá)獲得的蛋白質(zhì)培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心(12000xg，15分鐘)10ml的肉湯培養(yǎng)基收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在2ml的10mM Tris-HCl，pH7.5溶液中，洗滌后離心回收。將細(xì)胞懸浮于1ml相同的緩沖液中，使用多珠粒震蕩儀(Yasui Kikai)通過(guò)用0.1mm氧化鋯珠粒搖蕩3分鐘破裂細(xì)胞。將破碎后的細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)SDS-PAGE，并用CBB(考馬斯亮藍(lán))染色。結(jié)果證實(shí)一條對(duì)應(yīng)于分子量大約27000到30000的帶，僅僅能在實(shí)驗(yàn)1中觀察到(用pUCXDH2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109)。從分子量可推導(dǎo)出已表達(dá)了所需的XDH2蛋白質(zhì)。
<3>XDH活性的證實(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)的XDH活性已被測(cè)得。根據(jù)實(shí)驗(yàn)1的方法，使用上述破碎細(xì)胞懸浮液檢測(cè)XDH活性。結(jié)果，在用pUCXDH2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109中檢測(cè)到XDH的活性為14U/mg，然而作為對(duì)照的用pUC18轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109中沒(méi)有檢測(cè)到XDH活性。從此結(jié)果可確認(rèn)用pUCXDH2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109顯示了XDH的活性。
<4>從重組的大腸桿菌JM109中純化XDH2離心收集上述<2>中培養(yǎng)的用pUCXDH2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109細(xì)胞。獲得的細(xì)胞用作純化XDH的材料。通過(guò)實(shí)施例1所述的方法測(cè)得XDH活性。
(1)細(xì)胞提取物的制備將上述的細(xì)菌細(xì)胞懸浮于50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7)中，通過(guò)5000xg離心10分鐘再收集所獲得的沉淀部分。進(jìn)行包括懸浮和離心的步驟的目的是洗滌細(xì)胞。重復(fù)兩次洗滌細(xì)胞的過(guò)程。
將3g已洗滌的細(xì)胞懸浮于20ml的緩沖液1(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，1mM DTT)，4℃時(shí)用超聲波破碎20分鐘。離心(8000rpm，10分鐘)破碎細(xì)胞的懸浮液以去除細(xì)胞殘?jiān)?，并超速離心(56000rpm，30分鐘)以去除不可溶部分。
(2)陰離子交換層析將所獲的可溶部分上樣于用緩沖液1平衡過(guò)的Q-瓊脂糖FF陰離子交換層析柱(Pharmacia生產(chǎn))。通過(guò)此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩沖液1洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)(非吸附蛋白質(zhì))，用含有KCl的緩沖液作為洗脫液洗脫被吸附的蛋白質(zhì)。在此洗脫過(guò)程中，洗脫液中KCl的濃度是從0M到0.5M線性變化的。測(cè)定洗脫過(guò)程中得到的每一個(gè)洗脫組分的XDH活性，且發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于大約200到350mM KCl濃度的洗脫組分中有XDH活性。
(3)NAD親和層析合并上面獲得的含XDH活性的成份，對(duì)緩沖液1進(jìn)行透析。用0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾經(jīng)透析后的溶液。將濾液上樣于用緩沖液1平衡過(guò)的5ml NAD親和柱HiTrap Blue(Pharmacia生產(chǎn))。通過(guò)此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩沖液1洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)(非吸附蛋白質(zhì))，然后用含NAD的緩沖液2(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，1mMDTT，5mM NAD)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質(zhì)。結(jié)果，在被洗脫的成分中測(cè)到XDH。
(4)疏水層析對(duì)著緩沖液3(50mM磷酸鉀緩沖液，1M硫酸銨，pH7.0)透析需檢測(cè)活性的洗脫級(jí)分。通過(guò)0.45μm的濾器過(guò)濾透析后的溶液。將得到的濾液上樣于用緩沖液3平衡過(guò)的疏水層析柱苯基瓊脂糖凝膠HP(Pharmacia生產(chǎn))。通過(guò)此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩沖液3洗去沒(méi)有被吸附到載體上的蛋白質(zhì)，然后用緩沖液4(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質(zhì)，此洗脫過(guò)程中，緩沖液中硫酸銨濃度呈從1M到0M的線性變化。測(cè)得洗脫過(guò)程中得到的每一個(gè)洗脫級(jí)分的XDH活性。在對(duì)應(yīng)于大約200到300mM硫酸銨的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)洗脫級(jí)分中的XDH活性。
對(duì)純化獲得的XDH活性成分進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，確認(rèn)XDH2被純化到僅能檢測(cè)出一條帶的水平，分子量估計(jì)大約為27000到30000。也就是說(shuō)，在大腸桿菌JM109中表達(dá)的XDH2能夠被純化為單酶。
實(shí)施例5XDH最適pH的測(cè)定通過(guò)使用實(shí)施例4獲得的XDH2酶，如下測(cè)定依賴于反應(yīng)pH的酶活的差異以確定最適pH。
醋酸鈉緩沖液(pH3.3，4，4.5，5和6，)，Tris-HCl(pH7和8)，甘氨酸-氫氧化鈉(pH9)，和CAPS-NaOH(pH10)緩沖液被用作酶反應(yīng)緩沖液。XDH還原反應(yīng)活性測(cè)定如下30℃時(shí)將30μl的酶液加至570μl含有100mM(終濃變)D-木酮糖，0.2mM NADH，和100mM緩沖液的反應(yīng)液中進(jìn)行酶反應(yīng)，通過(guò)使用分光光度計(jì)(BECKMAN生產(chǎn)的DU 640分光計(jì))測(cè)定340nm處的光吸收來(lái)測(cè)定反應(yīng)進(jìn)程中NADH的減少。每分鐘減少1μmol NADH的活性定義為1U。利用NADH在340nm下的分子消光系數(shù)ε為6.3×103進(jìn)行計(jì)算。加入每一種緩沖液使反應(yīng)溶液有100mM的濃度。用上面純化的XDH組分作酶源，且反應(yīng)在30℃下進(jìn)行。測(cè)定結(jié)果被表示為相對(duì)于各個(gè)反應(yīng)溶液實(shí)際測(cè)定的pH值的酶活值。為了方便起見(jiàn)，將pH5時(shí)的氧化反應(yīng)活性定義為100。測(cè)量的結(jié)果示于圖2。
本發(fā)明的XDH2的還原反應(yīng)(從D木酮糖到木糖醇的反應(yīng))的最適pH大約為5(見(jiàn)圖2)。由于據(jù)Cor.F.B.Witteveen，et al(微生物學(xué)，140，1679-1685，1994)報(bào)道，得自黑色曲霉的XDH的還原反應(yīng)的最適pH嚴(yán)格為6.5，因此本發(fā)明得自葡糖桿菌屬的XDH2在反應(yīng)的最適pH上與已知的XDH明顯不同。也就是說(shuō)，已證明通過(guò)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了得自葡糖桿菌屬的XDH，至少XDH2的特征在于在還原反應(yīng)中有較低的最適pH。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>(醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因)<130>OP880<141>1999-07-<160>16<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>27<212>PRT<213>氧化葡糖桿菌<400>1Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro Leu1 5 10 15Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys20 25<210>2<211>25<212>PRT<213>氧化葡糖桿菌<400>2Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly1 5 10 15Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg20 25<210>3<211>1056<212>DNA<213>氧化葡糖桿菌<220><221>CDS<222>(25)..(1053)<400>3cacccgccag aaggagtctt ttcc atg gct gat aca atg ctc gcc gcc gtc51Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val1 5gtc cgt gaa ttc ggc aag ccg ctc tcc atc gag cgg cta ccc atc ccg 99Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro10 15 20 25gac atc aag ccc cac cag atc ctc gtg aag gtc gat acc tgt ggc gtc 147Asp Ile Lys Pro His Gln Ile Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val30 35 40tgc cac act gac ctg cac gcc gcg cgc ggg gac tgg ccg tcc aag ccc 195Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro45 50 55aac 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35<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2UP-S1的描述<400>13gatcttccga agtcccggac cacgctatcc g 31<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2UP-S2引物的描述<400>14cggaattccg tcacagacat aggagcgggc ttcgacgcc 39<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2-5’引物的描述<400>15ccgggattcc agagtttgag gcattcgga 29<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2-3’引物的描述<400>16ccgggatccg caagatggct cgcaggacgc 30
權(quán)利要求
1.在如下(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
2.在如下(C)或(D)中定義的蛋白質(zhì)(C)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(D)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
3.編碼在如下(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表中SEQ ID NO4氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
4.編碼在如下(C)或(D)中定義的蛋白質(zhì)的DNA(C)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(D)具有序列表中SEQ ID NO6氨基酸序列，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求3中的DNA，其定義于如下(a)或(b)(a)至少含有一段對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO3中第25到1053位的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴(yán)緊條件下可與具有對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO3中第25到1053位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制備的探針進(jìn)行雜交，并且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
6.權(quán)利要求5中的DNA，嚴(yán)緊條件是在60℃下，鹽濃度相當(dāng)于1x SSC和0.1％SDS時(shí)進(jìn)行洗滌。
7.權(quán)利要求4中的DNA，其定義于如下(c)或(d)(c)至少含有一段對(duì)應(yīng)于序列表SEQ ID NO5中第1063到1848位的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴(yán)緊條件下可與具有對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO5中第1063到1848位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制備的探針進(jìn)行雜交，并且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
8.權(quán)利要求7中的DNA，嚴(yán)緊條件是在60℃下，鹽濃度相當(dāng)于1x SSC和0.1％SDS時(shí)進(jìn)行洗滌。
9.以由權(quán)利要求3至8中任一DNA編碼的木糖醇脫氫酶可被表達(dá)的方式被導(dǎo)入所述DNA的細(xì)胞。
10.生產(chǎn)木糖醇脫氫酶的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求9的細(xì)胞以便木糖醇脫氫酶可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累，并且從培養(yǎng)基中收集木糖醇脫氫酶。
11.生產(chǎn)木糖醇的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1或2的木糖醇脫氫酶作用于D-木酮糖，并收集產(chǎn)生的木糖醇。
12.生產(chǎn)木糖醇的方法，所述方法包括用權(quán)利要求9的細(xì)胞作用于D-木酮糖，并收集產(chǎn)生的木糖醇。
全文摘要
通過(guò)木糖醇脫氫酶或被導(dǎo)入編碼木糖醇脫氫酶的DNA的細(xì)胞產(chǎn)生木糖醇,木糖醇脫氫酶是一種作用于D－木酮糖的(A)或(B)蛋白質(zhì),并收集產(chǎn)生的木糖醇:(A)具有序列表中SEQIDNO:4氨基酸序列的蛋白質(zhì);(B)具有序列表中SEQIDNO:4氨基酸序列,其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生替換、缺失、插入、增加或倒位,且有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1247230SQ99119628
公開(kāi)日2000年3月15日 申請(qǐng)日期1999年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月30日
發(fā)明者杉山雅一, 外內(nèi)尚人, 鈴木俊一, 橫關(guān)健三 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社