專利名稱：含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合高敏度敏感膜及其制法和用途。
利用酶生物工程制造出的產(chǎn)品，廣泛用于人體及工業(yè)中，例如利用葡萄糖氧化酶組裝的葡萄糖生物傳感器，可用于測量人的血糖、工業(yè)廢水、發(fā)酵或飲料中的糖分。生物傳感器具有非常明顯的優(yōu)點(diǎn)，如高專一性、短時(shí)低費(fèi)用消耗、對分析物質(zhì)沒有特殊的要求、操作安全、便于現(xiàn)場測定等等，在許多國家已有很多成果。傳感器研究工作者都了解，研制酶生物傳感器，首先是研制以高效率工作的分子識別反應(yīng)的生物傳感器單元，對此追求的目標(biāo)是靈敏、價(jià)廉、微型化。但是生物傳感器發(fā)展至今，能進(jìn)入實(shí)際使用的為數(shù)不多。以葡萄糖生物傳感器為例，葡萄糖生物傳感器工作時(shí)通常是基于對葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖時(shí)產(chǎn)生的過氧化氫的電流進(jìn)行檢測。這種方法有如下局限溶氧的濃度不是足夠大時(shí)，難以對高含量底物進(jìn)行測定；而酶用量過多時(shí)響應(yīng)電流傳遞效率低。近年來，金屬、金屬氧化物半導(dǎo)體納米顆粒奇特的物理特性引起人們的注意。納米顆粒當(dāng)小到一定尺寸時(shí)，具有與其相應(yīng)塊體材料所不具有的新性質(zhì)和新效應(yīng)，如表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、隧道效應(yīng)、量子效應(yīng)等。由于其表面效應(yīng)，金屬顆粒表面帶有很高的負(fù)電荷，易于通過表面修飾調(diào)控光學(xué)、電學(xué)特性等，引起人們極大的興趣和關(guān)注。其中金屬顆粒導(dǎo)電性較佳，可在酶與電極間傳遞電子。提高固定化酶的催化活性。美國A.L.Crumbliss.等人曾引入親水的金顆粒到生物傳感器中，證明了金顆粒的生物相容性，但他們用的是50納米的親水金顆粒，對酶電極的電流響應(yīng)敏感度沒有幫助，這在《生物技術(shù)和生物工程》雜志，1992年，40卷，483-490頁的文章“適用于作為電沉析法組裝酶電極的一種生物相容固定介質(zhì)-膠體金”已有報(bào)導(dǎo)(A.L.Crumbliss.S.C.Perine,J.Stonehuerner,K.R.Tubergen,Junguo Zhao,andR.W.Henkens,Biotechnology and Bioengineering,Vol.40 Pp.483-490(1992))。
中國專利申請97116989.6中報(bào)導(dǎo)了含憎水納米金顆粒的氧化酶功能復(fù)合敏感膜，將通常含葡萄糖氧化酶的酶膜電極電流響應(yīng)靈敏度提高了至少10倍。目前生物傳感器的研究正向著高性能、微型化、走入家庭方向發(fā)展，是一種被普遍認(rèn)為最有可能形成產(chǎn)業(yè)的高技術(shù)。
本發(fā)明的目的在于將納米銀溶膠特別是憎水納米銀溶膠引入酶功能復(fù)合敏感膜中，提供一種能夠節(jié)約酶用量、提高酶生物傳感器電流響應(yīng)靈敏度的含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜及其制法和用途。這種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，酶用量僅是通常用量的幾分之一，而提高酶生物傳感器的電流響應(yīng)敏感度幾十倍。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于通過下述方法得到將重量摩爾濃度為1×10-6～10-1mol/kg的納米銀溶膠溶液0.1～10ml同濃度為50～1000個(gè)活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接著加入重量百分比濃度為0.5～5％的高分子的凝膠溶液10～200ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1～10％的戊二醛0.1～5ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
其中納米銀溶膠溶液為親水納米銀溶膠溶液或憎水納米銀溶膠溶液，銀溶膠的粒徑為1～25納米，優(yōu)選為1～12納米；氧化酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶等；高分子為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲或乙烯-乙烯醇共聚物等；固體載體為鉑絲。
本發(fā)明的含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的制法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行第一步采用溶膠-凝膠法制備親水納米銀溶膠溶液，具體制備方法如下①．分別配制硝酸銀及還原劑的水溶液，其重量摩爾濃度分別為1×10-6-1×10-1mol/Kg和1×10-6-1mol/Kg；其中還原劑為硼氫化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙醇或肼等；②．制備親水納米銀溶膠溶液室溫或在25-90℃下將硝酸銀水溶液和還原劑的水溶液分別加入反應(yīng)容器中，其中硝酸銀水溶液及還原劑的水溶液的摩爾比為1∶1～1∶30，混合溶液在攪拌下反應(yīng)0.5～10小時(shí)，即得到粒徑在1～25納米，優(yōu)選為1～12納米的親水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5×10-6-1×10-1mol/kg。
或采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液反膠束是指表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中，當(dāng)其濃度超過臨界膠束濃度(CMC)時(shí)，形成親水極性基頭朝內(nèi)，疏水鏈向外的液體顆粒結(jié)構(gòu)。反膠團(tuán)的內(nèi)核可增溶大量的水分子和水可溶的電解質(zhì)及不同的化合物，形成的水核是一個(gè)很好的“微型反應(yīng)器”。
具體制備方法如下①配制表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑溶液，其重量摩爾濃度為50-300毫摩爾/千克溶劑；其中表面活性劑為非離子表面活性劑如烷基酚聚氧乙烯醚(分子式為 烷基R為C7～C9的烷基)系列、山梨醇脂肪酸酯或失水山梨醇脂肪酸酯系列；陰離子表面活性劑如二辛基琥珀酸酯磺酸鈉(俗稱AOT)；天然表面活性劑如卵磷脂等；非極性有機(jī)溶劑為正己烷、環(huán)己烷、異辛烷或氯仿等。
②分別配制硝酸銀水溶液和還原劑水溶液，其重量摩爾濃度均為1×10-6～1×10-1摩爾/千克，且都依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的水與表面活性劑的摩爾比(Rw值)及電解質(zhì)硝酸銀或還原劑與表面活性劑的摩爾比(RE值)來確定，RE值包括RAg值和R還值。當(dāng)Rw值為1-15時(shí)，RE值為0.0001-0.015；或當(dāng)Rw值為22-50時(shí)，RE值為0.01-0.6；其中還原劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、硼氫化鈉、乙醇或肼等；反膠束內(nèi)的水核尺寸，是由增溶水的量決定的，即Rw值的大小代表了由表面活性劑所包圍的水核的直徑大小，隨Rw值的增大，水核直徑增大，因此在水核內(nèi)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)制備超細(xì)顆粒時(shí)，水核的尺寸直接限定顆粒尺寸的大小，是控制顆粒大小的最主要因素。RE值的大小，代表了由表面活性劑所包圍的水核里增溶的電解質(zhì)的量，隨RE值的增大，所增溶的硝酸銀或還原劑的量增大。其用量隨所用的表面活性劑和不同的溶劑來決定。本發(fā)明中，顆粒粒徑隨RAg值增大而增大。但做這方面工作的研究者都應(yīng)知道，這種變化比起導(dǎo)致膠體顆粒增大的水滴體積來說，這種變化是溫和的。
③制備硝酸銀及還原劑的反膠束溶液?、谥信浜玫南跛徙y及還原劑的水溶液分別加入到相同體積0.01～1升的步驟①中配制的表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑溶液中，硝酸銀及還原劑的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值及RE值來確定，其中當(dāng)Rw值為1-15時(shí)，RE值為0.0001-0.015；或當(dāng)Rw值為22-50時(shí)，RE值為0.01-0.6；④．制備憎水納米銀溶膠溶液室溫或25-35℃下，按相同體積將步驟③中的硝酸銀及還原劑的反膠束溶液在攪拌下混合1～8小時(shí)，即得到粒徑在1～25納米，優(yōu)選為1～12納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5×10-6～1×10-1摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)溶解在相應(yīng)的有機(jī)溶劑或水中，使得溶液的重量百分比濃度為0.5～5％；其中高分子物質(zhì)為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲、羥丙基纖維素或乙烯-乙烯醇共聚物等；有機(jī)溶劑為丙酮、無水乙醇、環(huán)氧六烷或異丙醇等；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為5×10-6～1×10-1mol/kg的納米銀溶膠溶液0.1～10ml同濃度為50～1000個(gè)活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接著加入重量百分比濃度為0.5～5％的高分子的凝膠溶液10～200ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1～10％的戊二醛0.1～5ml進(jìn)行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
其中銀溶膠溶液為親水納米銀溶膠溶液或憎水納米銀溶膠溶液，銀溶膠的粒徑為1～25納米，優(yōu)選為1～12納米；氧化酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶等；高分子為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲、羥丙基纖維素或乙烯-乙烯醇共聚物等；固體載體為鉑絲。
本發(fā)明的用途本發(fā)明所制備的酶功能復(fù)合敏感膜，可用于酶生物傳感器、生物分離膜和生物催化工程。尤其是葡萄糖生物傳感器特別適用于人體中的血糖、工業(yè)廢水、培養(yǎng)液、發(fā)酵及飲料中糖分的測量等。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明所制備出的納米銀溶膠生物膜，具有常規(guī)有機(jī)生物膜不可比擬的優(yōu)越性，從用本發(fā)明的膜做的生物傳感器電極就可看出。
將用上述方法制得的納米銀溶膠的葡萄糖氧化酶生物膜，涂在鉑絲上制成的電極作為工作電極，Ag/AgCl電極或甘汞電極做為參比電極，組成葡萄糖氧化酶生物傳感器。將葡萄糖氧化酶生物傳感器的雙電極置于PH值為6-7的磷酸鹽緩沖液電池里，測其基質(zhì)電流，然后依次加入不同濃度的葡萄糖水溶液，測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度(2-35mmol葡萄糖每升)做出電極電流響應(yīng)曲線。
由于此種生物傳感器電極酶膜對葡萄糖具有特征的響應(yīng)，因此它特別適用于人體中的血糖，工業(yè)廢水，發(fā)酵，飲料中糖分的測量等。
由于此種生物傳感器電極所用酶膜含有粒徑1-25納米，特別是1-12納米銀溶膠(又特別是憎水銀溶膠)，所以它的電極電流響應(yīng)比未引入銀溶膠的電極電流高幾十倍。且酶用量是通常用量的5～50分之一。如圖1所示曲線A是含憎水納米銀溶膠的葡萄糖氧化酶電極對葡萄糖濃度做的電極電流響應(yīng)曲線，而曲線B是不含憎水納米銀溶膠的葡萄糖氧化酶電極對葡萄糖濃度做的電極電流響應(yīng)曲線。曲線A的電流響應(yīng)值較曲線B的電流響應(yīng)值提高了50倍。
由于納米級的憎水銀溶膠的引入，憎水銀溶膠表面疏水鏈與葡萄糖氧化酶的疏水鏈作用，使葡萄糖氧化酶構(gòu)象變得更加穩(wěn)定，這種疏水作用的結(jié)果，也增加了葡萄糖氧化酶的靈敏度。同時(shí)，在與水混溶的高極性有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮里，它同高分子凝膠共價(jià)固定在電極的表面上，仍保持很高的酶活性。而通常，親水的氧化酶在這些高極性有機(jī)溶劑里會(huì)很快失活，而失去催化活性。含有粒徑1-10nm憎水納米銀溶膠的葡萄糖傳感器同時(shí)更加減少了葡萄糖氧化酶的用量，由于憎水銀溶膠的電子傳遞催化作用，每1ml高分子凝膠中僅用通常酶用量的幾-幾十分之一，即幾十個(gè)甚至幾個(gè)單位的葡萄糖氧化酶，就可以獲得幾千甚至幾萬納安/厘米2(nA/cm2)的響應(yīng)電流。另外，含憎水銀溶膠的葡萄糖傳感器的穩(wěn)定性也大大提高，實(shí)驗(yàn)連續(xù)測定50次，電極電流響應(yīng)結(jié)果很重復(fù)。而未引入納米憎水銀溶膠的傳感器僅能重復(fù)測定7、8次左右。
從上述結(jié)果就可看出，本發(fā)明的生物膜，特別適用于制造生物工程所用的產(chǎn)品，其效果具有突出的質(zhì)變。
總之，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)1．制備簡單易行，不需化學(xué)后處理，易于推廣應(yīng)用。
2．由于納米級的銀溶膠，特別是憎水銀溶膠的引入，能使產(chǎn)品穩(wěn)定性及壽命較未引入納米憎水銀溶膠的產(chǎn)品大大提高，所用酶量也比通常用量大大減少，這就大大降低了含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的成本。
3．在有機(jī)溶劑，即使在有與水可混溶的有機(jī)溶劑里，仍可保證酶蛋白無損傷固定化。


圖1-電極響應(yīng)電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線橫坐標(biāo)---葡萄糖濃度(單位mmol/L)縱坐標(biāo)---響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線A---含憎水納米銀溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線曲線B---不含憎水銀溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線圖2--含親水納米銀溶膠和葡萄糖氧化酶功能復(fù)合敏感膜生物電極的制法實(shí)施例1中電極響應(yīng)電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線橫坐標(biāo)---葡萄糖濃度(單位mmol/L)縱坐標(biāo)---響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線C---含親水納米銀溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線圖3--含憎水納米銀溶膠和葡萄糖氧化酶功能復(fù)合敏感膜生物電極的制法實(shí)施例2中電極響應(yīng)電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線橫坐標(biāo)---葡萄糖濃度(單位mmol/L)縱坐標(biāo)---響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線D---含憎水納米銀溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線圖4--含憎水納米銀溶膠和葡萄糖氧化酶功能復(fù)合敏感膜生物電極的制法實(shí)施例3中電極響應(yīng)電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線橫坐標(biāo)---葡萄糖濃度(單位mmol/L)縱坐標(biāo)---響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線E---含憎水納米銀溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響 應(yīng)曲線下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述實(shí)施例1第一步采用溶膠-凝膠法制備親水納米銀溶膠溶液分別配制硝酸銀及還原劑硼氫化鈉的水溶液，其重量摩爾濃度分別為3.9×10-4mol/Kg和3.9×10-3mol/Kg；制備親水納米銀溶膠溶液80℃將硝酸銀水溶液和還原劑硼氫化鈉的水溶液分別加入反應(yīng)容器中，其中硝酸銀水溶液及還原劑硼氫化鈉的水溶液的摩爾比為1∶10，混合溶液在攪拌下反應(yīng)0.5小時(shí)，即得到粒徑在6納米的親水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為3.9×10-4mol/Kg。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為3.9×10-4mol/Kg的納米銀溶膠溶液2ml同濃度為500個(gè)活力單位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液0.3ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子聚乙烯醇縮丁醛的凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛1ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
用Ag/AgCl電極做為參比電極，將雙電極置于5ml PH值為6.86的磷酸鹽緩沖液電池里，測其基質(zhì)電流，然后依次加入體積摩爾濃度為2.8、5.6、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3mmol/L的β-D葡萄糖水溶液，測其響應(yīng)電流(Y軸)，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度(X軸)做出響應(yīng)曲線C，如圖2所示，葡萄糖濃度為33mmol/L，電極響應(yīng)電流可達(dá)7875nA/cm2。而不含納米親水銀溶膠，但含相同酶用量的葡萄糖氧化酶電極的電極電流響應(yīng)僅500nA/cm2。實(shí)施例2第一步采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)．配制陰離子表面活性劑二辛基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)的環(huán)己烷溶液，其重量摩爾濃度為200毫摩爾/千克溶劑；2)．分別配制硝酸銀水溶液和還原劑硼氫化鈉水溶液，其重量摩爾濃度分別為3.9×10-4摩爾/千克，7.8×10-4摩爾/千克，所要求的Rw值為8，RAg值為0.005和R還為0.01值。
3)．制備硝酸銀及還原劑硼氫化鈉的反膠束溶液取硝酸銀及還原劑硼氫化鈉的水溶液分別加入到相同體積0.1升的步驟1)中配制的表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑壞己烷溶液中，硝酸銀及還原劑硼氫化鈉的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值8，RAg值為0.005和R還為0.01。
4)．制備憎水納米銀溶膠溶液25℃下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑硼氫化鈉的反膠束溶液在攪拌下混合8小時(shí)，即得到粒徑在8納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為3.9×10-4摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為3.9×10-4摩爾/千克的納米銀溶膠溶液5ml同濃度為500個(gè)活力單位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液0.3ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子聚乙烯醇縮丁醛的凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1％的戊二醛1.2ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度做出響應(yīng)曲線D。如圖3所示，葡萄糖濃度為33mmol/l，電極響應(yīng)電流可達(dá)32365nA/cm2。實(shí)施例3第一步采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)．配制非離子表面活性劑辛基酚聚氧乙烯醚(TritonX-45)的環(huán)己烷溶液，其重量摩爾濃度為300毫摩爾/千克溶劑；2)．分別配制硝酸銀水溶液和還原劑檸檬酸鈉水溶液，其重量摩爾濃度分別為2.3×10-5摩爾/千克，6.9×10-4摩爾/千克，所要求的Rw值為6，RAg值為0.0003和R還為0.009。
3)．制備硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的反膠束溶液取硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的水溶液分別加入到相同體積0.1升的步驟1)中配制的表面活性劑TritonX-45的環(huán)己烷溶液中，硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值6，RAg值為0.0003和R還為0.009。
4)．制備憎水納米銀溶膠溶液30℃下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的反膠束溶液在攪拌下混合8小時(shí)，即得到粒徑在8納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為2.3×10-5摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)醋酸纖維素溶解在丙酮中，使得溶液的重量百分比濃度為1％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為2.3×10-5摩爾/千克的納米銀溶膠溶液30ml同濃度為500個(gè)活力單位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液5ml混合；接著加入重量百分比濃度為1％的高分子醋酸纖維素的凝膠溶液100ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為10％的戊二醛2ml進(jìn)行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度做出響應(yīng)曲線E。如圖4所示，葡萄糖濃度為33mmol/l，電極響應(yīng)電流可達(dá)14526nA/cm2。實(shí)施例4第一步采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)．配制天然表面活性劑卵磷脂的非極性有機(jī)溶劑氯仿溶液，其重量摩爾濃度為100毫摩爾/千克溶劑；2)．分別配制硝酸銀水溶液和還原劑檸檬酸鈉水溶液，其重量摩爾濃度分別為1.6×10-3摩爾/千克，1.6×10-2摩爾/千克，所要求的Rw值為10，RAg值為0.002和R還為0.015值。
3)．制備硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的反膠束溶液取硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的水溶液分別加入到相同體積0.1升的步驟1)中配制的表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑氯仿溶液中，硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值10，RAg值為0.002和R還為0.015。
4)．制備憎水納米銀溶膠溶液25℃下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的反膠束溶液在攪拌下混合8小時(shí)，即得到粒徑在9納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為1.6×10-3摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚氨酯溶解在環(huán)氧六烷中，使得溶液的重量百分比濃度為1％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為1.6×10-3摩爾/千克的納米銀溶膠溶液1ml同濃度為50個(gè)活力單位/毫升的乳酸氧化酶水溶液0.1ml混合；接著加入重量百分比濃度為1％的高分子聚氨酯的凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛0.2ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為10mmol/L時(shí)電極響應(yīng)電流可達(dá)2436nA/cm2。實(shí)施例5第一步采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)．配制壬基酚聚氧乙烯醚(6)的正己烷溶液，其重量摩爾濃度為200毫摩爾/千克溶劑；2)．分別配制硝酸銀水溶液和還原劑肼的水溶液，其重量摩爾濃度分別為4.7×10-2摩爾/千克，7.1×10-1摩爾/千克，所要求的Rw值為45，RAg值為0.3和R還為0.6值。
3)．制備硝酸銀及還原劑的反膠束溶液取硝酸銀及還原劑肼的水溶液分別加入到相同體積0.1升的步驟1)中配制的壬基酚聚氧乙烯醚(6)的正己烷溶液中，硝酸銀及還劑的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值為45，RAg值為0.3和R還為0.6。
4)．制備憎水納米銀溶膠溶液25℃下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑肼的反膠束溶液在攪拌下混合8小時(shí)，即得到粒徑在23納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為4.7×10-2摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在異丙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為5％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為4.7×10-2摩爾/千克的納米銀溶膠溶液5ml同濃度為100個(gè)活力單位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶0.6ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子聚乙烯醇縮丁醛的凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1％的戊二醛1.2ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為33mmol/L時(shí)電極響應(yīng)電流可達(dá)11565nA/cm2。實(shí)施例6第一步采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)．配制陰離子表面活性劑二辛基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)的異辛烷溶液，其重量摩爾濃度為50毫摩爾/千克溶劑；2)．分別配制硝酸銀水溶液和還原劑檸檬酸水溶液，其重量摩爾濃度分別為7.8×10-6摩爾/千克，7.8×10-6摩爾/千克，所要求的Rw值為1 5，RAg值為0.0001和R還為0.0001值。
3)．制備硝酸銀及還原劑檸檬酸的反膠束溶液取硝酸銀及還原劑檸檬酸的水溶液分別加入到相同體積0.02升的步驟1)中配制的表面活性劑二辛基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)的異辛烷溶液中，硝酸銀及還原劑檸檬酸的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值15，RAg值為0.0001和R還為0.0001。
4)．制備憎水納米銀溶膠溶液室溫下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑檸檬酸的反膠束溶液在攪拌下混合6小時(shí)，即得到粒徑在3納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為7.8×10-6摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為7.8×10-6摩爾/千克的納米銀溶膠溶5ml同濃度為100個(gè)活力單位/毫升的醇氧化酶水溶0.3ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子聚乙烯醇縮丁醛的凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1％的戊二醛1.2ml進(jìn)行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為10mmol/l，電極響應(yīng)電流可達(dá)3054nA/cm2。實(shí)施例7第一步采用溶膠-凝膠法制備親水納米銀溶膠溶液分別配制硝酸銀及還原劑檸檬酸的水溶液，其重量摩爾濃度分別為5.6×10-4，mol/Kg和2.8×10-3mol/Kg；制備親水納米銀溶膠溶液60℃將硝酸銀水溶液和還原劑檸檬酸的水溶液分別加入反應(yīng)容器中，其中硝酸銀水溶液及還原劑檸檬酸的水溶液的摩爾比為1∶5混合溶液在攪拌下反應(yīng)0.5小時(shí)，即得到粒徑在12納米的親水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5.6×10-4mol/Kg。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為5.6×10-4mol/Kg的納米銀溶膠溶2ml同濃度為1000個(gè)活力單位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液0.3ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子的凝膠溶液20ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛3ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為10mmol/l，電極響應(yīng)電流可達(dá)8112nA/cm2。實(shí)施例8第一步采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)．配制非離子表面活性劑TritonX-100的環(huán)己烷溶液，其重量摩爾濃度為200毫摩爾/千克溶劑；2)．分別配制硝酸銀水溶液和還原劑檸檬酸鈉水溶液，其重量摩爾濃度分別為5.4×10-5摩爾/千克，2.7×10-4摩爾/干克，所要求的Rw值為2，RAg值為0.0007和R還為0.0035值。
3)．制備硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的反膠束溶液取硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的水溶液分別加入到相同體積0.1升的步驟1)中配制的非離子表面活性劑TritonX-100的環(huán)己烷溶液中，硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值2，RAg值為0.0007和R還為0.0035。
4)．制備憎水納米銀溶膠溶液25℃下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑檸檬酸鈉的反膠束溶液在攪拌下混合5小時(shí)，即得到粒徑在2納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5.4×10-4摩爾/千克。
第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為5.4×10-4摩爾/千克的納米銀溶膠溶5ml同濃度為500個(gè)活力單位/毫升的葡萄糖氧化酶水溶0.4ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子的凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛1.1ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體鉑絲表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
按實(shí)施例1的方式測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度做出響應(yīng)曲線葡萄糖濃度為20mmol/l，電極響應(yīng)電流可達(dá)8353nA/cm2。
權(quán)利要求
1．一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于通過下述方法得到將重量摩爾濃度為1×10-6～10-1mol/kg的納米銀溶膠溶液0.1～10ml同濃度為50～1000個(gè)活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接著加入重量百分比濃度為0.5～5％的高分子的凝膠溶液10～200ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1～10％的戊二醛0.1～5ml進(jìn)行交聯(lián)；將上述混合溶液涂在固體載體上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
2．如權(quán)利要求1所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于所述的納米銀溶膠溶液為憎水納米銀溶膠溶液。
3．如權(quán)利要求1所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于所述的納米銀溶膠溶液為親水納米銀溶膠溶液。
4．如權(quán)利要求1或2或3所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于所述的銀溶膠的粒徑為1～25納米。
5．如權(quán)利要求4所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于所述的銀溶膠的粒徑為1～12納米。
6．如權(quán)利要求1所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜，其特征在于所述的氧化酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶；高分子為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲或乙烯-乙烯醇共聚物；固體載體為鉑絲。
7．一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的制法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行第一步采用溶膠-凝膠法制備親水納米銀溶膠溶液，具體制備方法如下①．分別配制硝酸銀及還原劑的水溶液，其重量摩爾濃度分別為1×10-6-1×10-1mol/Kg和1×10-6-1mol/Kg；②．制備親水納米銀溶膠溶液室溫或在25-90℃下將硝酸銀水溶液和還原劑的水溶液分別加入反應(yīng)容器中，其中硝酸銀水溶液及還原劑的水溶液的摩爾比為1∶1～1∶30，混合溶液在攪拌下反應(yīng)0.5～10小時(shí)，即得到粒徑在1～25納米的親水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5×10-6-1×10-1mol/kg；或采用反膠束法制備憎水納米銀溶膠溶液1)配制表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑溶液，其重量摩爾濃度為50-300毫摩爾/千克溶劑，2)分別配制硝酸銀水溶液和還原劑水溶液，其重量摩爾濃度均為1×10-6～1×10-1摩爾/千克，且都依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的水與表面活性劑的摩爾比即Rw值及電解質(zhì)硝酸銀或還原劑與表面活性劑的摩爾比即RE值來確定，RE值包括RAg值和R還值；當(dāng)Rw值為1-15時(shí)，RE值為0.0001-0.015；或當(dāng)Rw值為22-50時(shí)，RE值為0.01-0.6；3)制備硝酸銀及還原劑的反膠束溶液取2)中配好的硝酸銀及還原劑的水溶液分別加入到相同體積0.01～1升的步驟1)中配制的表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑溶液中，硝酸銀及還原劑的水溶液的用量依據(jù)憎水納米銀溶膠的大小所要求的Rw值及RE值來確定，其中當(dāng)Rw值為1-15時(shí)，RE值為0.0001-0.015；或當(dāng)Rw值為22-50時(shí)，RE值為0.01-0.6；4)制備憎水納米銀溶膠溶液室溫或25-35℃下，按相同體積將步驟3)中的硝酸銀及還原劑的反膠束溶液在攪拌下混合1～8小時(shí)，即得到粒徑在1～25納米的憎水納米銀溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5×10-6～1×10-1摩爾/千克；第二步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)溶解在相應(yīng)的有機(jī)溶劑或水中，使得溶液的重量百分比濃度為0.5～5％；第三步制備含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜按如下步驟進(jìn)行將重量摩爾濃度為5×10-6～1×10-1mol/kg的納米銀溶膠溶液0.1～10ml同濃度為50～1000個(gè)活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.05～2ml混合；接著加入重量百分比濃度為0.5～5％的高分子的凝膠溶液10～200ml，攪拌均勻，再加入重量百分比濃度為1～10％的戊二醛0.1～5ml進(jìn)行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米銀溶膠的氧化酶功能復(fù)合敏感膜。
8．如權(quán)利要求7所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的制法，其特征在于所述的納米銀溶膠的粒徑為1～12納米。
9．如權(quán)利要求7所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的制法，其特征在于所述的還原劑為硼氫化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙醇或肼；所述的表面活性劑為非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或天然表面活性劑；所述的非極性有機(jī)溶劑為正己烷、環(huán)己烷、異辛烷或氯；所述的高分子物質(zhì)為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨酯、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲、羥丙基纖維素或乙烯-乙烯醇共聚物；所述的有機(jī)溶劑為丙酮、無水乙醇、環(huán)氧六烷或異丙醇。
10．如權(quán)利要求7或9所述的一種含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的制法，其特征在于所述的非離子表面活性劑為烷基酚聚氧乙烯醚系列或山梨醇脂肪酸酯或失水山梨醇脂肪酸酯系列；陰離子表面活性劑為二辛基琥珀酸酯磺酸鈉；天然表面活性劑為卵磷脂。
11．一種權(quán)利要求1所述的含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的用途，其特征在于用于酶生物傳感器、生物分離膜和生物催化工程。
12．如權(quán)利要求11所述的含納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜的用途，其特征在于所述的酶生物傳感器為葡萄糖生物傳感器，用于人體中的血糖、工業(yè)廢水、培養(yǎng)液、發(fā)酵及飲料中糖分的測量。
全文摘要
本發(fā)明涉及含納米銀溶膠尤其是憎水納米銀溶膠的酶功能復(fù)合敏感膜及其制法和用途,將1×10
文檔編號C12N11/00GK1297992SQ9912507
公開日2001年6月6日 申請日期1999年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月25日
發(fā)明者唐芳瓊 申請人:中國科學(xué)院感光化學(xué)研究所