專利名稱：具有增強(qiáng)的鋅結(jié)合力的新型胰島素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的鋅結(jié)合力的胰島素類似物及其穩(wěn)定的鋅復(fù)合物，與人胰島素比較，它們具有延遲作用性，本發(fā)明還涉及它們的制備方法和用途，尤其是用作藥物制劑，治療Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
全世界大約1億2千萬(wàn)人患有糖尿病，其中約1千2百萬(wàn)人是Ⅰ型糖尿病，對(duì)這些人來(lái)說(shuō)，替代所缺少的內(nèi)分泌胰島素分泌是目前唯一可行的療法?；颊咝枰⑸湟葝u素，通常每天數(shù)次，持續(xù)一生。與Ⅰ型糖尿病不同，Ⅱ型糖尿病基本上不缺少胰島素，但是大量病例，尤其是晚期病例，使用胰島素治療，并適當(dāng)?shù)嘏湟砸环N口服抗糖尿病藥物，據(jù)認(rèn)為是最佳治療方案。
健康人中，胰腺釋放胰島素與血糖濃度密切相關(guān)。血糖水平的升高，如餐后，由相應(yīng)增加胰島素的分泌量迅速補(bǔ)償?？崭?fàn)顟B(tài)，血漿胰島素水平回落到基礎(chǔ)值，足以保證對(duì)胰島素敏感型組織和器官持續(xù)供應(yīng)葡萄糖，并維持夜間肝糖的低量產(chǎn)生。利用外源胰島素代替內(nèi)源性胰島素分泌物，通常大多通過(guò)皮下給藥方式，幾乎達(dá)不到上述血糖生理調(diào)節(jié)的質(zhì)量。經(jīng)常會(huì)失去對(duì)血糖向上或向下的控制，這在那些非常嚴(yán)重的病例中可能會(huì)危及生命。另外，沒(méi)有原始癥狀下血糖水平多年升高對(duì)健康也具有相當(dāng)大危險(xiǎn)。在美國(guó)，大量的DCCT研究(糖尿病控制及并發(fā)癥試驗(yàn)研究組(1993)，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志329,977-986)清楚證明，血糖水平的慢性升高是引起糖尿病晚期損傷發(fā)展的主要因素。糖尿病的晚期損傷是微小血管和大血管的損傷，在一定環(huán)境下表現(xiàn)為視網(wǎng)膜病、腎病或神經(jīng)病，導(dǎo)致失明、腎衰竭和肢端損失，并常伴有高危險(xiǎn)性的心血管病。因此，一種完善的糖尿病治療方案，其首要目的必須是盡可能地將血糖水平保持在生理范圍內(nèi)。按照強(qiáng)化胰島素治療的概念，這要靠每天大量注射快速和緩慢作用的胰島素制劑來(lái)達(dá)到。進(jìn)餐時(shí)給予快速作用制劑，以平衡飯后血糖升高，而緩慢作用基礎(chǔ)胰島素應(yīng)保證胰島素的基本供應(yīng)，特別是在晚上，不至導(dǎo)致低血糖。
目前可用的基礎(chǔ)胰島素不足以滿足上述要求，特別是常用的NPH胰島素，最大作用太強(qiáng)，而全程作用又太短。晚上給藥時(shí)，會(huì)陷于夜間低血糖和清晨高血糖的危險(xiǎn)。
EP 0 821 006公開(kāi)了具有增強(qiáng)的鋅結(jié)合力的胰島素類似物，結(jié)合鋅后與人胰島素相比，它具有延遲作用形式。基本上這些類似物與人胰島素不同在于其A鏈的A21位氨基酸變異，并在B鏈的B30位加入一個(gè)His殘基或一段含有1-5個(gè)His殘基的長(zhǎng)度為2-35個(gè)氨基酸殘基的肽。
本發(fā)明的目的在于進(jìn)一步提供胰島素類似物(人或動(dòng)物胰島素的類似物)，它們具有增強(qiáng)的鋅結(jié)合力，能形成一種包含胰島素類似物六聚體和鋅的穩(wěn)定復(fù)合物，并用在合適的制劑中，由于其與人胰島素相比所具有的延遲作用形式，使改善皮下注射治療Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病成為可能。
胰島素類似物來(lái)自天然產(chǎn)生的胰島素，即人胰島素(見(jiàn)SEQ ID NO:1人胰島素A鏈及SEQ ID NO:2人胰島素B鏈)或動(dòng)物胰島素，通過(guò)在天然胰島素的A鏈和/或B鏈中替換或缺失至少一個(gè)天然氨基酸殘基和/或添加至少一個(gè)氨基酸殘基獲得。
本發(fā)明目的通過(guò)以下方式達(dá)到1．式Ⅰ的一種胰島素類似物或其生理可耐受鹽
其中(A1-A5)為人胰島素(參見(jiàn)SEQ ID NO:1)或動(dòng)物胰島素A鏈A1-A5位點(diǎn)的氨基酸殘基，(A15-A19)為人胰島素(參見(jiàn)SEQ ID NO:1)或動(dòng)物胰島素A鏈A15-A19位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B8-B18)為人胰島素(參見(jiàn)SEQ ID NO:2)或動(dòng)物胰島素B鏈B8-B18位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B20-B29)為人胰島素(參見(jiàn)SEQ ID NO:2)或動(dòng)物胰島素B鏈B20-B29位點(diǎn)的氨基酸殘基，R8為Thr或Ala，R9為Ser或Gly，R10為Ile或Val，R14為Tyr、His、Asp或Glu，R21為Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，R1為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基、缺失或氫原子，R2為Val、Ala或Gly，R3為Asn、His、Glu或Asp，R4為Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，R30為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基或-OH，Z為氫原子或一段含有1-4個(gè)遺傳上可編碼的氨基酸殘基的肽，包括1-4個(gè)His殘基，附帶條件是當(dāng)Z為氫原子時(shí)，R1或R3為His、Glu或Asp，如果R1為中性或帶負(fù)電荷氨基酸殘基，R3則為His，或者附帶條件是如果其中Z為氫原子，R14為His、Asp或Glu，此外附帶條件是式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽與人胰島素相比，差異不是只在于式Ⅰ中R3位點(diǎn)，或R3和R21位點(diǎn)，或R3和R4位點(diǎn)氨基酸殘基變異(參見(jiàn)SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。
優(yōu)選地，此胰島素類似物或其生理可耐受鹽是其中
2．R8為Thr，R9為Ser和R10為Ile，3．R1為Phe、His、Asn、Asp或Gly，4．R30為Thr、Ala或Ser，或5．其中R21為Asn和R1為Phe。
6．本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R2為Val，R3為Asn和R4為Gln。
一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽另外的優(yōu)選方案，其區(qū)別在于R14為7．Tyr，8．His，9．Asp或10．Glu。
一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽另外的優(yōu)選方案，其區(qū)別在于R30為11．Thr，12．Ala，13．Ser或14．-OH。
一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽另外的優(yōu)選方案，其區(qū)別在于Z為15．His，16．His-Ala-或17．His-Ala-Ala-。
根據(jù)本發(fā)明胰島素類似物的實(shí)例是18．一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其區(qū)別在于B鏈具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys(SEQ ID NO:3)，例如His(B0),des(B30)人胰島素，
19．一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其區(qū)別在于B鏈具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:4)，例如His(B0)-人胰島素，20．一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其區(qū)別在于B鏈具有序列His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:5)，例如His(B-1),Ala(B0)人胰島素或21．一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其區(qū)別在于B鏈具有序列His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu AlaLeu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:6)，例如His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-人胰島素。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明胰島素類似物或其生理可耐受鹽的方法，包括構(gòu)建一種復(fù)制型表達(dá)載體，該載體含有編碼具有氨基酸序列Ⅱ的胰島素類似物前體的DNA序列Met-X2m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21Ⅱ，其中X1n為含有n個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，n為0-34的整數(shù)，X2m為含有m個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，m為0-20的整數(shù)，p為0、1或2，R30為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基，或者缺失以及Z缺失或?yàn)橐痪哂?-4個(gè)遺傳上可編碼的氨基酸殘基的肽段，包括1-4個(gè)His殘基，其它變量具有上面No.1所述含義，上述附帶條件仍然適用，
在宿主細(xì)胞中表達(dá)以及利用化學(xué)和/或酶學(xué)方法從其前體釋放胰島素類似物。
宿主細(xì)胞優(yōu)選細(xì)菌，特別優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)。
宿主細(xì)胞優(yōu)選酵母，特別優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，所述融合蛋白(SEQ ID NO:7-9)通常形成不溶性的包涵體，可在細(xì)胞破碎后離心分離，用變性劑(例如8M尿素或6M鹽酸胍)重新溶解?？蓪⑷芙獾娜诤系鞍走M(jìn)行亞硫酸鹽解，將巰基(SH)轉(zhuǎn)變?yōu)镾-磺酸鹽(例如R.C.Marshall和A.S.Iglis，實(shí)用蛋白質(zhì)化學(xué)手冊(cè)，A.Darbre編寫(1986)，49-53頁(yè))，從而改善該融合蛋白的溶解性，易于諸如利用陰離子交換或凝膠滲透層析方法純化。
將衍生化的融合蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑烊豢臻g結(jié)構(gòu)是和正確形成的二硫橋(折疊)的前胰島素原(preproinsulin)在稀釋的水溶液中，加入一定量的巰基試劑，如巰基乙醇、Cys或谷胱甘肽，隨后進(jìn)行空氣氧化作用進(jìn)行的。作為一個(gè)替代方法，未溶解、未衍生化的融合蛋白也可以在類似的條件下直接進(jìn)行折疊(EP-A-0 600 372,EP-A-0 668292)。
然后通過(guò)有限的蛋白裂解作用，將前胰島素原轉(zhuǎn)變成生物活性胰島素。為此，可能利用胰蛋白酶將式Ⅱ的前體序列Met-X2m-(Arg)p去除，并在X1n-Arg所示的肽鏈處斷裂，從而分開(kāi)B鏈和A鏈。通常，序列X1始于Arg、Arg2或不存在(n=0)，因此裂解后得到的胰島素衍生物在B鏈的C端被Arg、Arg2了，這些氨基酸可用羧肽酶B去除。也可提高胰蛋白酶濃度或延長(zhǎng)作用時(shí)間進(jìn)行胰蛋白酶裂解作用，使在Lys(B29)處再次斷裂，這種情況下，產(chǎn)生一種des(B30)胰島素衍生物。
裂解過(guò)程中形成的胰島素類似物可以用標(biāo)準(zhǔn)的層析步驟(例如離子交換和反相層析)進(jìn)行純化，最后通過(guò)沉淀、結(jié)晶或簡(jiǎn)單的凍干得到分離。
優(yōu)選地，該胰島素類似物前體含有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn(SEQ ID NO:7)，例如His(B0)-前胰島素原序列，或序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn(SEQ ID NO:8)，例如His(B-1),Ala(B0)-前胰島素原序列，或序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile CysSer Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(SEQ ID NO:9)，例如His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-前胰島素原序列。
本發(fā)明還涉及上述本發(fā)明胰島素類似物的前體，特別是前胰島素原，及編碼本發(fā)明胰島素類似物前體的DNA序列，含有編碼本發(fā)明新型胰島素類似物前體的DNA序列的表達(dá)載體，以及利用此種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及一種藥物制劑，其中包含至少一種胰島素類似物和/或至少一種生理可耐受鹽。
優(yōu)選地，該藥物制劑區(qū)別在于它包含溶解、無(wú)定型和/或結(jié)晶形式的本發(fā)明胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽。
該藥物制劑還可另外包含一種貯存輔助物，優(yōu)選硫酸魚(yú)精蛋白，其中胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽優(yōu)選地以與硫酸魚(yú)精蛋白共結(jié)晶的形式存在。
根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑還可另含有未修飾的人胰島素和/或其它胰島素類似物，優(yōu)選Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰島素。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及一種具有胰島素活性的注射液其中包括溶解形式的本發(fā)明藥物制劑，優(yōu)選含1μg-2mg鋅/ml，特別優(yōu)選含5μg-200μg鋅/ml。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽在制備具有延遲起始作用形式的胰島素活性的藥物制劑方面的用途。
開(kāi)始處所列的目的還通過(guò)一種胰島素-鋅復(fù)合物達(dá)到，該復(fù)合物包括胰島素六聚體和4-10個(gè)鋅離子/胰島素六聚體，其中該胰島素六聚體由六分子式Ⅰ的胰島素類似物組成 其中，(A1-A5)為人胰島素或動(dòng)物胰島素A鏈A1-A5位點(diǎn)的氨基酸殘基，(A15-A19)為人胰島素或動(dòng)物胰島素A鏈A15-A19位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B8-B18)為人胰島素或動(dòng)物胰島素B鏈B8-B18位點(diǎn)的氨基酸殘基，
(B20-B29)為人胰島素或動(dòng)物胰島素B鏈B20-B29位點(diǎn)的氨基酸殘基，R8為Thr或Ala，R9為Ser或Gly，R10為Ile或Val，R14為Tyr、His、Asp或Glu，R21為Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，R1為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基、缺失或?yàn)闅湓?，R2為Val、Ala或Gly，R3為Asn、His、Glu或Asp，R4為Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，R30為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基或-OH，Z為氫原子或一段含有1-4個(gè)遺傳上可編碼的氨基酸殘基的肽，包括1-4個(gè)His殘基，優(yōu)選地，該胰島素-鋅復(fù)合物中包括每胰島素六聚體5-8個(gè)鋅離子。
優(yōu)選地，該胰島素-鋅復(fù)合物含有胰島素六聚體，該胰島素六聚體由6分子的本發(fā)明上述式Ⅰ的胰島素類似物組成。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該胰島素-鋅復(fù)合物也可以是其中式Ⅰ的胰島素類似物B鏈含有序列Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:10)，例如His(B3)-人胰島素，或其中式Ⅰ的胰島素類似物的B鏈含有序列Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:11)，例如Asp(B3)-人胰島素。
本發(fā)明也涉及一種包括至少一種本發(fā)明胰島素-鋅復(fù)合物的藥物制劑，還涉及一種包括至少一種胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽的酸性溶液并含有合適量的鋅離子的藥物制劑，所述鋅可以使形成本發(fā)明的胰島素-鋅復(fù)合物成為可能，該胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽優(yōu)選包含本發(fā)明上述式Ⅰ的胰島素類似物，或B鏈具有編號(hào)SEQ IDNO:3,4,5,10或11序列的式Ⅰ的胰島素類似物。
優(yōu)選地，該藥物制劑是一種包含溶解的、無(wú)定形的和/或結(jié)晶形式的胰島素一鋅復(fù)合物的制劑。
本發(fā)明也涉及一種具有胰島素活性的可注射溶液，其中包含溶解形式的藥物制劑，優(yōu)選含1μg-2mg鋅/ml，特別優(yōu)選含5μg-200μg鋅/ml。
本發(fā)明還涉及胰島素-鋅復(fù)合物在制備具有延遲起始作用的胰島素活性的藥物制劑方面的用途。
根據(jù)本發(fā)明的胰島素類似物具有生物活性，在每周給狗皮下注射含80μg Zn++/ml(鋅/ml)的酸性透明溶液后，呈現(xiàn)很強(qiáng)的延遲作用。如果胰島素類似物B鏈N端因存在His而延長(zhǎng)，例如His(BO),des(B30)-人胰島素(參見(jiàn)SEQ ID NO:3)，其作用形式顯著依賴于加入鋅離子的量。無(wú)鋅制劑根本沒(méi)有貯存效應(yīng)(總作用6-8小時(shí)，實(shí)施例8)，其藥效學(xué)與人胰島素幾乎沒(méi)有差別，當(dāng)加入鋅離子(80μg/ml)后，發(fā)現(xiàn)延遲作用強(qiáng)烈(總作用約16小時(shí)，實(shí)施例8)，觀察到的貯存效應(yīng)遠(yuǎn)較NPH-胰島素顯著。另外，該類似物具有可在一定范圍內(nèi)預(yù)先設(shè)定鋅濃度，以控制其藥效學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，這在人胰島素是不可能的?？焖倨鹗甲饔玫闹苿┛梢韵竽切┲械然驈?qiáng)烈延遲作用的制劑一樣利用活性物質(zhì)，通過(guò)改變鋅濃度來(lái)制備。因此，作用形式可分別適應(yīng)病人的需要，或者應(yīng)用具有合適預(yù)設(shè)鋅濃度的制劑，或者由醫(yī)師或病人自己用高鋅濃度和低鋅濃度的制劑相混合完成。
此處所述類似物還包括與人胰島素相比，具有與鋅離子增強(qiáng)的親和力的類似物。
在中性水溶液中，人胰島素通過(guò)His(B10)側(cè)鏈絡(luò)合兩個(gè)鋅離子，形成六聚體，這些鋅離子在中性溶液中不能通過(guò)透析去除。相同條件下，此處所述的類似物可結(jié)合4個(gè)以上的鋅離子。根據(jù)本發(fā)明，在His(B0)-des(B30)-和His(B3)-胰島素中，每個(gè)六聚體約有7個(gè)鋅離子，在Asp(B3)-胰島素中，測(cè)量到每個(gè)六聚體有4.2個(gè)鋅離子(實(shí)施例9)。
眾所周知，在中性溶液中鋅導(dǎo)致形成相對(duì)高分子量的結(jié)合物，并導(dǎo)致胰島素沉淀。注射溶解成透明溶液的胰島素弱酸性含鋅制劑后，由于中和作用，胰島素-鋅復(fù)合物的形成導(dǎo)致胰島素在皮下組織中沉淀。胰島素從沉淀處重新溶解，透過(guò)血管，延遲地到達(dá)作用部位。對(duì)人胰島素來(lái)說(shuō)，這種延遲作用只是很微弱，但此處所述類似物具有增強(qiáng)的鋅親和力，因而其作用延遲顯著增強(qiáng)。因此，增強(qiáng)的鋅結(jié)合力是上述鋅依賴性作用延長(zhǎng)的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明不僅涉及所述胰島素類似物，還涉及有關(guān)的胰島素-鋅復(fù)合物。該復(fù)合物與相應(yīng)的人胰島素-鋅復(fù)合物不同在于前者含有高濃度的穩(wěn)定結(jié)合的鋅。很明顯，除了鋅，其它過(guò)渡金屬離子，如鈷或銅，也能用于形成相應(yīng)的復(fù)合物。
實(shí)施例1構(gòu)建編碼His(B3)-前胰島素原突變體的質(zhì)粒pINT345d。
美國(guó)專利5358857號(hào)描述了質(zhì)粒pINT90d，該質(zhì)粒DNA被用作構(gòu)建質(zhì)粒pINT345d的原始材料。與pINT90d相比，pINT345d特征在于具有兩個(gè)新特性。一方面，它編碼一種前胰島素原類似物，該類似物在B鏈位點(diǎn)3處含有His，而不是Asp。另一方面，在該前胰島素原突變體編碼序列起點(diǎn)前緊接有限制酶BssH2的識(shí)別序列，若考慮到前胰島素原序列中的Dra3切割位點(diǎn)，這樣易于操作編碼前胰島素原類似物的N端10個(gè)氨基酸的序列。為構(gòu)建質(zhì)粒pINT345d，由限制酶NcoⅠ和Dra3在284bp和351bp處雙酶切質(zhì)粒pINT90d的DNA，產(chǎn)生兩個(gè)片段。凝膠電泳分離酶切混合物，分離質(zhì)粒DNA大片段。
然后將該DNA片段與以下形式的合成DNA片段進(jìn)行T4連接酶作用，
Nco1 BssH2 B1 B2 His B4 B5 B65′- C ATG GCA ACA ACA TCA ACA GGA AAT TCG GCG CGC TTT GTG CAC CAG CAC CTG3′-CGT TGT TGT AGT TGT CCT TTA AGC CGC GCG AAA CAC GTG GTC GTG GACB7 B8 B9 Dra3TGC GGC TCC CAC CTA -3′ACG CCG AGG GTG -5′將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化混合物涂在含有20mg/ml氨芐青霉素的NA平板上，37℃溫育過(guò)夜。從出現(xiàn)的克隆中提取質(zhì)粒DNA，并用限制酶BssH2酶切，所需要的質(zhì)粒DNA則被切成線性，而與pINT90d質(zhì)粒DNA不同，后者由于其不含BssH2酶切位點(diǎn)，所以不能被酶切。
酶切正確的質(zhì)粒DNA稱作pINT345d。
它用于構(gòu)建以下所述前胰島素原突變體的起始材料。
實(shí)施例2構(gòu)建編碼His(B0)-前胰島素原突變體的質(zhì)粒pINT342dpINT345d質(zhì)粒DNA利用酶BssH2和Dra3雙酶切，利用凝膠電泳分離質(zhì)粒大片段，將該片段與以下形式的合成DNA片段進(jìn)行T4連接酶作用，His B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B105′- CG CGC CAC TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA-3′3′-G GTG AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5′BssH2 Hpa1 Dra3形成的pINT342d質(zhì)粒與起始質(zhì)粒相比，包含一個(gè)另外的HpaⅠ酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒編碼B0位置為His的前胰島素原突變體。
實(shí)施例3構(gòu)建編碼His(B-1),Ala(B0)-前胰島素原突變體的質(zhì)粒pINT343d將在實(shí)施例b中所述的剩余質(zhì)粒DNA片段與形式為His Ala B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B115′-CG CGC CAC GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA-3′3′-G GTG CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5′BssH2 Hpa1Dra3的合成DNA片段進(jìn)行T4連接酶作用，形成質(zhì)粒pINT343d，它同pINT342d一樣，與起始載體相比，也包含一個(gè)另外的HpaⅠ酶切位點(diǎn)。
實(shí)施例4構(gòu)建編碼His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-前胰島素原突變體的質(zhì)粒pINT344d將在實(shí)施例b中所述的剩余質(zhì)粒DNA片段與形式為His Ala Ala B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B115′- CG CGC CAC GCT GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA-3′3′-G GTG CGA CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5′BssH2 Hpa1Dra3的合成DNA片段進(jìn)行T4連接酶作用，形成質(zhì)粒pINT344d，它與起始載體相比，也包含一個(gè)另外的HpaⅠ酶切位點(diǎn)。
實(shí)施例5構(gòu)建的胰島素突變體的表達(dá)舉例來(lái)說(shuō)，將質(zhì)粒pINT342d、343d和344d分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12W3110。根據(jù)美國(guó)專利5227293號(hào)實(shí)施例4，將包含相應(yīng)突變體質(zhì)粒的重組細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵，獲得制備相應(yīng)胰島素突變體所需的原材料。
實(shí)施例6His(B0),des(B30)-胰島素的制備根據(jù)實(shí)施例5，在大腸桿菌中表達(dá)前胰島素原突變體，細(xì)胞破碎后離心，以包涵體形式分離。在尿素(8mol/l)中溶解包涵體，經(jīng)亞硫酸鹽解，陰離子交換(Q-Sepharose)和凝膠滲透層析(SephacrylS200)純化。層析用緩沖液包含4M尿素和50mM Tris/HCl(三羥甲基氨基甲烷/HCl)pH8.5。陰離子交換劑上的分級(jí)洗脫通過(guò)用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行。然后通過(guò)超濾和稀釋，將尿素濃度降到低于1M，在pH4條件下經(jīng)沉淀分離前胰島素原-S-磺酸鹽，最后干燥。
為形成與天然胰島素原中相同的正確的二硫橋，將前胰島素原-S-磺酸鹽溶于含有20mM甘氨酸的緩沖液pH10.8中，濃度為0.3g/l，在巰基乙醇(約25-50mol/mol前胰島素原)作用下，4℃攪拌過(guò)夜，然后用磷酸將pH值調(diào)節(jié)到3.5后，離心。上清中加入Tris(25mM)調(diào)節(jié)pH至8.2，前胰島素原轉(zhuǎn)換成胰島素，然后用胰蛋白酶(1.5mg/g前胰島素原)處理。經(jīng)反相HPLC監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)水解過(guò)程。約6小時(shí)后，產(chǎn)物中含有高濃度的His(B0),des(B30)-胰島素，作用在酸化至pH3.5后結(jié)束。通過(guò)離子交換層析(S-Hyper-D,Sepracor)和反相層析(PLRP-S RP300,Polymer Laboratories)純化胰島素類似物。離子交換層析在含30％2-丙醇和50mM乳酸(pH3.5)的緩沖液中進(jìn)行。結(jié)合的胰島素用0-0.5M NaCl線性梯度洗脫。反相層析在0.1％三氟乙酸中進(jìn)行，其中不斷提高乙腈的摻入量進(jìn)行洗脫。在pH5.4沉淀分離產(chǎn)物，凍干。
實(shí)施例7非腸道使用的胰島素類似物制劑該制劑每毫升pH4的無(wú)菌水溶液中含有40或100IU胰島素(1IU相當(dāng)于約6.2nmol)，20mg 85％甘油，2.7mg間甲酚以及適合時(shí)含有Zn++(氯化鋅)。
實(shí)施例8狗中His(B0),des(B30)-胰島素的作用形式6條狗(比格爾犬)每條皮下注射含40U/ml(實(shí)施例7)及指示量鋅的制劑，劑量為0.3IU/kg。后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在所指示時(shí)間測(cè)量血糖濃度。測(cè)量值以各自的起始值作百分比標(biāo)準(zhǔn)化換算，并平均。
實(shí)施例9胰島素類似物的鋅結(jié)合胰島素制劑(0.3mM胰島素，0.13mM NaCl,0.1％苯酚，100μg/mlZn++(氯化鋅)，25mM tris/HCl,pH7.4)在不含鋅的中性緩沖液(0.15MNaCl,10mM tris/HCl pH7.4中室溫3小時(shí)，10mM tris/HCl pH7.4中15℃72小時(shí)，再10mM tris/HCl pH7.4中15℃16小時(shí))中充分透析，透析物酸化后分析。利用反相HPLC測(cè)定胰島素濃度，鋅濃度由原子吸收光譜測(cè)定。利用不合胰島素的對(duì)照物中的鋅含量校正鋅值。
鋅結(jié)合
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh(B)街道-(C)城市法蘭克福(D)州-(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼65926(G)電話069-305-5307(H)傳真069-357175(I)電報(bào)-(ⅱ)申請(qǐng)名稱治療糖尿病的新型胰島素衍生物(ⅲ)序列數(shù)11(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀格式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..21(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:1:Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:2:Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:3:His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys20 25 30(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..31(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:4:His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..32(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:5:His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala1 5 10 15Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..33(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:6:His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu1 5 10 15Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys20 25 30Thr(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度98個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..98(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:7:Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln1 5 10 15His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly20 25 30Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp35 40 45Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser50 55 60Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val65 70 75 80Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr85 90 95Cys Asn(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度99個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..99(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:8:Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn1 5 10 15Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys20 25 30Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu35 40 45Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly50 55 60Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile65 70 75 80Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn85 90 95Tyr Cys Asn(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度100個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..100(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:9:Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val1 5 10 15Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val20 25 30Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala35 40 45Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala50 55 60Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly65 70 75 80Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu85 90 95Asn Tyr Cys Asn100(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:10:Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..30(ⅹⅰ)序列詳述SEQ ID NO:11:Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30
權(quán)利要求
1．一種式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽， 其中(A1-A5)為人胰島素或動(dòng)物胰島素A鏈A1-A5位點(diǎn)的氨基酸殘基，(A15-A19)為人胰島素或動(dòng)物胰島素A鏈A15-A19位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B8-B18)為人胰島素或動(dòng)物胰島素B鏈B8-B18位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B20-B29)為人胰島素或動(dòng)物胰島素B鏈B20-B29位點(diǎn)的氨基酸殘基，R8為Thr或Ala，R9為Ser或Gly，R10為Ile或Val，R14為Tyr、His、Asp或Glu，R21為Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，R1為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基、缺失或?yàn)闅湓樱琑2為Val、Ala或Gly，R3為Asn、His、Glu或Asp，R4為Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，R30為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基或-OH，Z為氫原子或一段含有1-4個(gè)遺傳上可編碼的氨基酸殘基的肽，包括1-4個(gè)His殘基，附帶條件是當(dāng)Z為氫原子，R1或R3為His、Glu或Asp，如果R1為中性或帶負(fù)電荷氨基酸殘基，R3則為His，或者附帶條件是如果其中Z為氫原子，則R14為His、Asp或Glu，此外附帶條件是式Ⅰ的胰島素類似物或其生理可耐受鹽與人胰島素相比，差異不是僅僅式Ⅰ中R3位點(diǎn)，或R3和R21位點(diǎn)，或R3和R4位點(diǎn)氨基酸殘基變異。
2．如權(quán)利要求1所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R8為Thr，R9為Ser及R10為Ile。
3．如權(quán)利要求1或2所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R1為Phe、His、Asn、Asp或Gly。
4．如權(quán)利要求1-3中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R30為Thr、Ala或Ser。
5．如權(quán)利要求1-4中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R21為Asn及R1為Phe。
6．如權(quán)利要求1-5中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R2為Val，R3為Asn及R4為Glu。
7．如權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R14為Tyr。
8．如權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R14為His。
9．如權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R14為Asp。
10．如權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R14為Glu。
11．如權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R30為Thr。
12．如權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R30為Ala。
13．如權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R30為Ser。
14．如權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中R30為-OH。
15．如權(quán)利要求1-14中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中Z為His。
16．如權(quán)利要求1-14中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中Z為His-Ala-。
17．如權(quán)利要求1-14中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中Z為His-Ala-Ala-。
18．如權(quán)利要求15所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中B鏈具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys(SEQ ID NO:3)。
19．如權(quán)利要求15所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中B鏈具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:4)。
20．如權(quán)利要求16所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中B鏈具有序列His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:5)。
21．如權(quán)利要求17所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽，其中B鏈具有序列His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:6)。
22．如權(quán)利要求1-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物或其生理可耐受鹽的制備方法，包括構(gòu)建一種可復(fù)制的表達(dá)載體，該載體包含一段編碼具有氨基酸序列Ⅱ的胰島素類似物前體的DNA序列Met-X2m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21Ⅱ，其中X1n為含有n個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，n為0-34的整數(shù)，X2m為含有m個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，m為0-20的整數(shù)，p為0、1或2，R30為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基或缺失，以及Z缺失或?yàn)橐痪哂?-4個(gè)遺傳上可編碼的氨基酸殘基的肽段，包括1-4個(gè)His殘基，其它變量具有權(quán)利要求1所述含義，權(quán)利要求1所述附帶條件仍然適用，在宿主細(xì)胞中表達(dá)以及利用化學(xué)和/或酶學(xué)方法從其前體釋放胰島素類似物。
23．如權(quán)利要求22所述的方法，其中宿主細(xì)胞是細(xì)菌。
24．如權(quán)利要求23所述的方法，其中細(xì)菌是大腸桿菌。
25．如權(quán)利要求22所述的方法，其中宿主細(xì)胞是酵母。
26．如權(quán)利要求25所述的方法，其中酵母是釀酒酵母。
27．如權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述的制備如權(quán)利要求19所述的胰島素類似物的方法，其中胰島素類似物前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn(SEQ ID NO:7)。
28．如權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述的制備如權(quán)利要求20所述的胰島素類似物的方法，其中胰島素類似物前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn(SEQ ID NO:8)。
29．如權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述的制備如權(quán)利要求21所述的胰島素類似物的方法，其中胰島素類似物前體具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile CysSer Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(SEQ ID NO:9)。
30．如權(quán)利要求22所述的胰島素類似物前體。
31．如權(quán)利要求27所述的胰島素類似物前體。
32．如權(quán)利要求28所述的胰島素類似物前體。
33．如權(quán)利要求29所述的胰島素類似物前體。
34．編碼如權(quán)利要求30所述的胰島素類似物前體的DNA序列。
35．編碼如權(quán)利要求31所述的胰島素類似物前體的DNA序列。
36．編碼如權(quán)利要求32所述的胰島素類似物前體的DNA序列。
37．編碼如權(quán)利要求33所述的胰島素類似物前體的DNA序列。
38．一種表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求34所述的DNA序列。
39．一種表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求35所述的DNA序列。
40．一種表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求36所述的DNA序列。
41．一種表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求37所述的DNA序列。
42．一種宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化了如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
43．一種藥物制劑，其包含如權(quán)利要求1-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的至少一種胰島素類似物和/或至少一種其生理可耐受鹽。
44．如權(quán)利要求43所述的藥物制劑，其包含溶解、無(wú)定形和/或晶體形式的胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽。
45．如權(quán)利要求43或44所述的藥物制劑，其另外包含一種貯存輔助物。
46．如權(quán)利要求45所述的藥物制劑，其中貯存輔助物為硫酸魚(yú)精蛋白，并且胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽與硫酸魚(yú)精蛋白以共結(jié)晶方式存在。
47．如權(quán)利要求43-46中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的藥物制劑，其另外包含未改性的人胰島素。
48．如權(quán)利要求43-47中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的藥物制劑，其另外包含一種胰島素類似物。
49．如權(quán)利要求48所述的藥物制劑，其中胰島素類似物為Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰島素。
50．一種具有胰島素活性的可注射溶液，其包含溶解形式的如權(quán)利要求43-49中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的藥物制劑。
51．如權(quán)利要求50所述的可注射溶液，其包含1μg-2mg鋅/ml。
52．如權(quán)利要求51所述的可注射溶液，其包含5μg-200μg鋅/ml。
53．如權(quán)利要求1-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽在制備具有延遲作用起始的胰島素活性的藥物制劑中的用途。
54．一種胰島素-鋅復(fù)合物，其包含一種胰島素六聚體及4-10個(gè)鋅離子/胰島素六聚體，其中所述胰島素六聚體由六個(gè)式Ⅰ的胰島素類似物組成， 其中，(A1-A5)為人胰島素或動(dòng)物胰島素A鏈A1-A5位點(diǎn)的氨基酸殘基，(A15-A19)為人胰島素或動(dòng)物胰島素A鏈A15-A19位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B8-B18)為人胰島素或動(dòng)物胰島素B鏈B8-B18位點(diǎn)的氨基酸殘基，(B20-B29)為人胰島素或動(dòng)物胰島素B鏈B20-B29位點(diǎn)的氨基酸殘基，R8為Thr或Ala，R9為Ser或Gly，R10為Ile或Val，R14為Tyr、His、Asp或Glu，R21為Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，R1為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基、缺失或?yàn)闅湓?，R2為Val、Ala或Gly，R3為Asn、His、Glu或Asp，R4為Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，R30為任意合乎需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基或-OH，Z為氫原子或一段含有1-4個(gè)遺傳上可編碼的氨基酸殘基的肽，包括1-4個(gè)His殘基。
55．如權(quán)利要求54所述的胰島素-鋅復(fù)合物，其中每胰島素六聚體包含5-8個(gè)鋅離子。
56．如權(quán)利要求54或55所述的胰島素-鋅復(fù)合物，其中胰島素六聚體由6分子的如權(quán)利要求1-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的式Ⅰ的胰島素類似物組成。
57．如權(quán)利要求54或55所述的胰島素-鋅復(fù)合物，其中式Ⅰ的胰島素類似物B鏈具有序列Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:10)。
58．如權(quán)利要求54或55所述的胰島素-鋅復(fù)合物，其中式Ⅰ的胰島素類似物B鏈具有序列Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:11)。
59．一種藥物制劑，其包含至少一種如權(quán)利要求54-58中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素-鋅復(fù)合物。
60．一種藥物制劑，其包含至少一種如權(quán)利要求54-58中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽及適量鋅離子的酸性溶液，使形成如權(quán)利要求54-58中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素-鋅復(fù)合物成為可能。
61．如權(quán)利要求60所述的藥物制劑，其包含如權(quán)利要求1-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽及適量鋅離子的酸性溶液，使形成如權(quán)利要求56所述的胰島素-鋅復(fù)合物成為可能。
62．如權(quán)利要求60所述的藥物制劑，其包含至少一種如權(quán)利要求57或58中一項(xiàng)所述的胰島素類似物和/或其生理可耐受鹽及適量鋅離子酸性溶液，使形成如權(quán)利要求57或58所述的胰島素-鋅復(fù)合物成為可能。
63．如權(quán)利要求59-62中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的藥物制劑，其包含溶解、無(wú)定形和/或晶體形式的胰島素-鋅復(fù)合物。
64．一種具有胰島素活性的可注射溶液，其包含溶解形式的如權(quán)利要求63所述的藥物制劑。
65．如權(quán)利要求64所述的可注射溶液，其包含lμg-2mg鋅/ml。
66．如權(quán)利要求65所述的可注射溶液，其包含5μg-200μg鋅/ml。
67．如權(quán)利要求54-58中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的胰島素-鋅復(fù)合物在制備具有延遲作用起始的胰島素活性的藥物制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的鋅結(jié)合力的胰島素類似物及其穩(wěn)定的鋅復(fù)合物,與人胰島素相比,它們具有延遲的活性。本發(fā)明還涉及所述胰島素類似物的生產(chǎn)方法及用途,尤其是作為藥物制劑用于治療Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的用途。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1304450SQ99807068
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月6日
發(fā)明者J·厄特爾, P·哈伯曼, K·杰森, G·賽普克, A·沃爾莫 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物德國(guó)有限公司