專利名稱：三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)及使用它培養(yǎng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制成三維形狀的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，由此可以按照與在體內(nèi)細(xì)胞中相同的方式來表達(dá)細(xì)胞的增殖、形態(tài)和功能；本發(fā)明還涉及一種使用所述細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
近年來在改造糖的領(lǐng)域中已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展。例如，植物細(xì)胞細(xì)胞壁中的蛋白聚糖、糖脂、糖蛋白等是帶有糖鏈的生物聚合物的典型實(shí)例。認(rèn)為它們中的每一種均參與(1)細(xì)胞的穩(wěn)定；(2)細(xì)胞的分化、增殖、粘附和遷移以及(3)細(xì)胞之間的相互作用和細(xì)胞識(shí)別；且已經(jīng)得到了各種有關(guān)報(bào)導(dǎo)。此外，已經(jīng)逐步明確了機(jī)理，其中這些聚合物的糖鏈彼此起另外的作用、輔助、擴(kuò)展、調(diào)節(jié)或抑制其功能，由此它們可控制高級(jí)和精確的生物反應(yīng)。
此外，這類糖鏈?zhǔn)辜?xì)胞分化和增殖并參與細(xì)胞的粘附并且已經(jīng)明確了它們與細(xì)胞免疫和惡性改變的關(guān)系。因此，預(yù)計(jì)通過嘗試進(jìn)行一種用改造糖與藥物的最接近關(guān)系、細(xì)胞改造或組織改造的新型開發(fā)可以發(fā)展各種工業(yè)。
一個(gè)實(shí)例是在對(duì)因細(xì)胞表面上糖鏈之間和糖鏈?zhǔn)荏w中的異常相互作用而導(dǎo)致的疾病發(fā)作方面或?qū)μ擎溤谥T如AIDS這樣的病毒感染中的作用方面的研究已經(jīng)非?；钴S(Takehiro Kawano,Bio Industry,14,22-30(1997))。此外，對(duì)識(shí)別諸如促胰液素、接觸蛋白和contactinhibin這樣作為介導(dǎo)細(xì)胞之間粘附的分子的蛋白質(zhì)的研究在理解生物反應(yīng)中是重要的(Tuneshige Takeuchi和NaokiTakahashi,Saibo Kogaku,16,801-812(1997))。
本發(fā)明者已經(jīng)進(jìn)行了充分的研究，將注意力集中在糖鏈的細(xì)胞特異性相互作用方面；且作為用于對(duì)脫唾液酸糖蛋白受體的配體模型，他們?cè)O(shè)計(jì)并合成了聚(N-對(duì)乙烯基芐基-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺])(縮寫為PVLA)，它是在側(cè)鏈上帶有半乳糖的聚苯乙烯。例如，在用這種PVLA作為細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)包被的培養(yǎng)皿上進(jìn)行的肝細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通過PVLA與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面上脫唾液酸糖蛋白受體的特異性親和力可以選擇性地培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞且甚至在二維培養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境中也可以將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞本身制成三維形狀且特別是以球形體存在(A.kobayashi,M.Goto,K.Kobayashi,T.Akaike,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.,6,325-342(1994))。然而，這種PVLA具有含有聚苯乙烯的結(jié)構(gòu)，它是作為主鏈的合成聚合物；且因此它具有下列缺陷無法獲得生物降解力且存在表達(dá)抗原性和具有毒性的可能性。
同時(shí)，還使用用諸如屬于天然蛋白質(zhì)的膠原蛋白、纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白這樣的粘著蛋白包被的培養(yǎng)皿對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。然而，這是一種二維培養(yǎng)且由此并不能充分實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞功能的表達(dá)等。
近來已經(jīng)進(jìn)行了一種嘗試，其中使用紫外線、放射線或化學(xué)交聯(lián)劑來交聯(lián)諸如膠原蛋白、藻酸、透明質(zhì)酸和聚異丙基丙烯酰胺這樣的天然或合成聚合物，從而得到一種三維形式的培養(yǎng)物質(zhì)且使用它來培養(yǎng)細(xì)胞。然而，存在細(xì)胞粘附不充分的難題，由此細(xì)胞的增殖通常受到抑制、細(xì)胞功能降低、細(xì)胞形式的擴(kuò)展不同于體內(nèi)等且沒有獲得用于良好培養(yǎng)細(xì)胞的系統(tǒng)。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的由此是提供一種制成三維形式的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，由此促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖、維持并改善細(xì)胞功能且可以保持細(xì)胞形式接近體內(nèi)細(xì)胞形式；且本發(fā)明另外的目的是提供一種使用所述三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
因此，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其特征在于將一種包括含糖聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)制成三維形狀，在所述的含糖聚合物中，至少一類糖鏈通過間隔分子被作為側(cè)鏈結(jié)合。
此外，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于使用所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞，由此維持并改善細(xì)胞的增殖、形態(tài)和功能。
附圖簡述附

圖1是表示來自肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的清蛋白產(chǎn)量與培養(yǎng)天數(shù)之間關(guān)系的示意圖，其中使用LA-AG和藻酸的凝膠珠。
附圖2是表示在用膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的顯微照片。
附圖3是表示使用LA-AG凝膠珠培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的顯微照片。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)的特征在于含糖聚合物(即含有糖鏈的聚合物)作為主鏈且糖鏈通過間隔分子與主鏈連接作為側(cè)鏈。當(dāng)使用二胺作為間隔分子時(shí)，一般結(jié)構(gòu)通式如下列通式(1)中所示。 在上述通式(1)中，方括弧中的部分是一種含糖聚合物且優(yōu)選使用帶有諸如藻酸、透明質(zhì)酸、果膠酸或其衍生物這樣的羧基基團(tuán)的含糖聚合物。就果膠酸而言，也可以使用果膠酸作為主要成分的果膠。盡管在本發(fā)明中也可以使用非上述含糖聚合物的各種其它含糖聚合物以便它們能夠引入所述糖鏈作為側(cè)鏈，但是將上述典型的含糖聚合物廣泛用作用于食品、化妝品等的物質(zhì)且它們與細(xì)胞的親和力良好，由此它們是特別優(yōu)選的。就含糖聚合物的分子量而言，可以優(yōu)選使用大約30,000-200,000分子量的含糖聚合物。當(dāng)分子量過低時(shí)，產(chǎn)生溶膠形態(tài)且由此難以存在形成三維形狀的趨向。
在上述通式(1)中，R是與含糖聚合物連接作為側(cè)鏈的糖鏈。就本發(fā)明的糖鏈而言，可以使用任意的糖鏈，只要是能夠在與含糖聚合物連接作為側(cè)鏈的情況中保持與細(xì)胞相互作用的糖殘基，且其實(shí)例是單糖和寡糖諸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、乳糖、麥芽糖、昆布二糖(laminalibiose)、幾丁二糖、麥芽糖、與糖醛酸相關(guān)的物質(zhì)、硫酸化糖類等。
通過間隔分子進(jìn)行含糖聚合物與糖鏈之間的結(jié)合。就間隔基而言，可以優(yōu)選使用如上述通式(1)中所示分子中帶有兩個(gè)氨基的二胺。因此，在二胺中的一個(gè)氨基與內(nèi)酯化糖中末端羧基之間形成酰胺鍵，而在該二胺中另一個(gè)氨基與含糖聚合物中羧基之間形成另一個(gè)酰胺鍵(amino)，由此可以有效而方便地將所含的糖引入含糖聚合物中。在通式(1)中，間隔分子中的R’是烷基、苯環(huán)等且二胺是乙二胺、六乙二胺、二氨基二甲苯等。除二胺外，還可以使用諸如氨基乙醇這樣的分子中帶有兩個(gè)官能基的化合物作為間隔分子。就氨基乙醇而言，分子中的氨基和羧基能夠分別通過酰胺鍵和酯鍵與含糖聚合物糖鏈結(jié)合。另一方面，可以使預(yù)先引入了間隔分子的含糖聚合物與糖鏈結(jié)合或可以使預(yù)先引入了間隔分子的糖鏈與含糖聚合物結(jié)合。然而，當(dāng)糖鏈能夠被直接引入含糖聚合物的羧基時(shí)，并不總是需要間隔分子。
盡管并不對(duì)引入含糖聚合物的糖鏈的量作特別限定，但是優(yōu)選在含糖聚合物中引入大約10-50％羧基數(shù)量的糖鏈。引入含糖聚合物中的糖鏈可以是一類糖鏈或可以引入兩類或多類糖鏈。細(xì)胞具有其自身特異性糖鏈識(shí)別能力，且由此當(dāng)將引入了兩類或多類具有細(xì)胞不同識(shí)別特性的糖鏈的含糖聚合物用作培養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，能夠通過控制所結(jié)合的糖鏈的類型及其引入的比例而自由地控制細(xì)胞的增殖、形態(tài)和功能。
當(dāng)兩類或多類糖鏈與含糖聚合物結(jié)合時(shí)，不同類型的糖鏈能夠同時(shí)與含糖聚合物結(jié)合或還能夠在一類糖鏈與含糖聚合物結(jié)合時(shí)另一種糖鏈隨后與含糖聚合物結(jié)合。
引入糖鏈作為側(cè)鏈的含糖聚合物的特殊實(shí)例通過表示其結(jié)構(gòu)通式而在下文中描述。附帶地說，糖鏈與含糖聚合物的結(jié)合是聚合物與低分子量物質(zhì)的反應(yīng)且由此它可隨機(jī)發(fā)生而并不總是將這種結(jié)合限定在如通式中所示的結(jié)合位置。
由上述通式(2)代表的1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲酰胺藻酸酯(下文縮寫為LA-AG)是這樣一種化合物，其中乳糖酸與乙二胺中的氨基之一結(jié)合，而另一個(gè)氨基與藻酸中的羧基結(jié)合。 由上述通式(3)代表的1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲酰胺透明質(zhì)酸酯(下文縮寫為LA-HA)是這樣一種化合物，其中乳糖酸與乙二胺中的氨基之一結(jié)合，而另一個(gè)氨基與透明質(zhì)酸中的羧基結(jié)合。 由上述通式(4)代表的1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲酰胺果膠酸酯(下文縮寫為LA-PA)是這樣一種化合物，其中乳糖酸與乙二胺中的氨基之一結(jié)合，而另一個(gè)氨基與果膠酸中的羧基結(jié)合。
由上述通式(5)代表的化合物是這樣一種化合物，其中任意的糖鏈R與任意間隔化合物中的氨基之一結(jié)合，而另一個(gè)氨基與藻酸中的羧基結(jié)合。 由上述通式(6)代表的化合物是這樣一種化合物，其中任意的糖鏈R與任意間隔化合物中的氨基之一結(jié)合，而另一個(gè)氨基與透明質(zhì)酸中的羧基結(jié)合。 由上述通式(7)代表的化合物是這樣一種化合物，其中任意的糖鏈R與任意間隔化合物中的氨基之一結(jié)合，而另一個(gè)氨基與果膠酸中的羧基結(jié)合。
在本發(fā)明中，將一種包括上述含糖的聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)制成三維形狀，其中糖鏈與所述含糖聚合物連接作為側(cè)鏈，由此制備三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)。就用于制成三維形狀的方法而言，可以采用各種文獻(xiàn)中對(duì)常用含糖聚合物成形方法所述的公知方法(在含糖聚合物中，糖鏈不被連接成側(cè)鏈)。
例如，就藻酸是含糖聚合物的培養(yǎng)物質(zhì)而言，將鈣加入到這種培養(yǎng)物質(zhì)的溶液中，由此可以制備含有所述培養(yǎng)物質(zhì)與鈣的復(fù)合物的凝膠形式的珠。此外，就透明質(zhì)酸是含糖聚合物的培養(yǎng)物質(zhì)而言，將所述培養(yǎng)物質(zhì)的濃縮溶液用紫外線線、放射線、化學(xué)交聯(lián)劑等處理以便交聯(lián)透明質(zhì)酸、隨后凍干或在凍干后交聯(lián)，由此可以制備所述培養(yǎng)物質(zhì)的海綿狀物。此外，當(dāng)將藻酸是含糖聚合物的培養(yǎng)物質(zhì)溶液與鈣溶液混合以便勻化、隨后凍干時(shí)，可以制備海綿狀物。
還能夠通過諸如吸附這樣的物化方法或通過諸如形成三維形狀的共價(jià)鍵這樣的化學(xué)方法將培養(yǎng)物質(zhì)裝配在載體上。
在將細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)制成三維形狀的過程中，能夠進(jìn)一步如上所述使包括含糖聚合物的混合物成形，其中糖鏈被作為側(cè)鏈結(jié)合和通常的含糖聚合物(在含糖聚合物中，沒有糖鏈被作為側(cè)鏈結(jié)合)。
在使用上述本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，可以采用截止到目前通常使用的細(xì)胞培養(yǎng)方法。例如，在使用包括凝膠形式的珠的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)的情況中，使細(xì)胞混懸液與細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)的溶液混合并向其中加入鈣以便形成珠，由此可以制備包含有細(xì)胞的凝膠珠且可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的珠。
還能夠?qū)⒓?xì)胞混懸液接種在預(yù)先制備的海綿狀三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)上以便引入細(xì)胞且隨后通過用常規(guī)方法培養(yǎng)而使之混入所述海綿狀物。
當(dāng)照此培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞的特異性糖鏈識(shí)別能力，所以能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖、維持和改善細(xì)胞功能且保持細(xì)胞形狀與體內(nèi)細(xì)胞形狀類似。
在上述細(xì)胞培養(yǎng)過程中，僅可以使用本發(fā)明的一類三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)或可以混合兩類或多類三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)并使用它們。此外，不僅本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)而且(如果必要)與含糖聚合物諸如膠原蛋白這樣的粘著蛋白、各種天然聚合物等混合的本發(fā)明三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)均可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。實(shí)施例1.LA-AG(通式(1))的合成(a)1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲胺(下文縮寫為LA-ED)按照下列反應(yīng)式合成LA-ED。 首先，用M.Goto等在J.Controlled Release,28,223-233(1994)中所述的方法使乳糖內(nèi)酯化。將該過程概括如下。即將乳糖分散在蒸餾水中并用甲醇稀釋。將稀釋的分散液加入到溫?zé)岬牡獾募状既芤褐?，且在攪拌后，向其中逐步加入氫氧化鉀的甲醇溶液，直到碘的顏色消失為止。此后，用冰使反?yīng)溶液冷卻并過濾從其中析出的沉淀。將該沉淀進(jìn)行洗滌并重結(jié)晶至得到一種所述酸的鉀鹽。使所得鉀鹽通過離子交換樹脂以便轉(zhuǎn)化一種類型的酸并將甲醇加入到該酸型的級(jí)分中，隨后通過在減壓條件下濃縮而得到結(jié)晶。把將該結(jié)晶溶于少量甲醇并將乙醚加入到沉淀中的操作重復(fù)幾次并在此后將所述沉淀凍干至得到一種乳糖內(nèi)酯。
將所得乳糖內(nèi)酯(5g)溶于50ml的DMSO并向其中加入20g的乙二胺，隨后在回流條件下使反應(yīng)進(jìn)行4小時(shí)。使反應(yīng)冷卻，過濾出沉淀，將該反應(yīng)溶液加入到300ml的氯仿中并過濾出沉淀的白色結(jié)晶。用乙醚和少量冷甲醇將其洗滌至得到5g的LA-ED。
(b)LA-AG的合成將藻酸溶于50ml的TEMED緩沖液(pH4.7)，加入0.97g的水溶性碳化二亞胺(WSC)作為縮合劑并通過攪拌使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。將上述制備的LA-ED(2g)加入到該溶液中并使該混合物在室溫下通過攪拌反應(yīng)3天。將該溶液對(duì)20升純水透析且在完成透析后進(jìn)行凍干至得到所需的產(chǎn)物。從該產(chǎn)物的1H-NMR光譜中可以觀察到乙二胺CH2CH2為2.69ppm、酰胺NH為3.25ppm、乳糖和藻酸糖鏈為4.5ppm且證明產(chǎn)物是LA-AG。將引入其中的糖鏈的量計(jì)算約為15％。實(shí)施例2．使用LA-AG珠培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(a)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的收集按照文獻(xiàn)中所述的方法(A.Kobayashi,M.Goto,K.Kobayashi,T.Akaike,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.,6,325-342(1994))從小鼠肝臟中收集并分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。通過用含有5％胎牛血清的Willium’s培養(yǎng)基E稀釋來使用分離的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
(b)含細(xì)胞的LA-AG珠的制備向藻酸(1％w/v)和LA-AG(1％w/v)溶于生理鹽水的水溶液中所得到的混合溶液中加入胎牛血清(ECS；5％v/v)、表皮生長因子(EGF；20ng/ml)和胰島素(Ins；10-8M)，使得它們的各自濃度為圓括弧中給出的值；且然后使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與之混合而使細(xì)胞濃度為800,000個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞溶液放入注射器并使用26號(hào)針頭(G×1/2”)將其滴入100mM氯化鈣的水溶液中，由此制成凝膠珠。如此制備了具有約3mm平均顆粒大小的凝膠珠。通過培養(yǎng)5分鐘或5分鐘以上來使該珠膠凝。
接下來，在用CHES緩沖液(pH5.0)洗滌幾次后，用生理鹽水溶液洗滌幾次以上。此后，將該凝膠珠表面用聚-L-賴氨酸溶于生理鹽水溶液所得到的0.05％溶液處理5分鐘并用生理鹽水洗滌幾次。然后，將該凝膠珠表面用0.15％的藻酸水溶液包被5分鐘，隨后用生理鹽水溶液洗滌幾次。將該珠進(jìn)一步用50mM的檸檬酸鈉水溶液處理5分鐘并且用生理鹽水溶液洗滌3次以便制備含細(xì)胞的LA-AG珠。
根據(jù)引入LA-AG的糖鏈含量的不同，還能夠制成LA-AG和藻酸不混合而僅使用LA-AG的珠。
為進(jìn)行比較，除僅使用含2％w/v藻酸的生理鹽水溶液替代上述藻酸與LA-AG溶于生理鹽水溶液所得到的混合溶液外，進(jìn)行與如上所述相同的操作，由此制備含細(xì)胞的藻酸珠。
(c)含細(xì)胞的LA-AG珠的培養(yǎng)在含有FCS(5％v/v)、EGF(20ng/ml)和Ins(10-8M)的L15培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的含細(xì)胞的LA-AG珠并評(píng)估該珠中包含的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。為進(jìn)行比較，對(duì)含細(xì)胞的藻酸珠也進(jìn)行相同的培養(yǎng)并評(píng)估該珠中包含的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。
(e)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞功能的評(píng)估通過從肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的清蛋白的量來評(píng)估所述凝膠珠中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。通過使用測定清蛋白的試劑盒(由Bio-Rad,U.S.A.生產(chǎn))的常用方法來進(jìn)行清蛋白的測定。
清蛋白產(chǎn)生量的測定結(jié)果如附圖1中所示。就用LA-AG凝膠珠培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞而言，在培養(yǎng)后第8天產(chǎn)生的清蛋白的量為0.0158μg/ml，而僅用藻酸凝膠珠培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的清蛋白的量為0.00765μg/ml。從上述結(jié)果中注意到在用LA-AG凝膠珠培養(yǎng)的產(chǎn)物中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分功能得到了更好地維持和改善。
還注意到就在LA-AG凝膠珠培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞而言，從培養(yǎng)的第3天開始觀察到了含幾個(gè)細(xì)胞的球形體，由此促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和增殖。
進(jìn)一步明確了當(dāng)使用三維形狀的LA-AG凝膠珠進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生了不同于在膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞過程中觀察到的二維形狀的擴(kuò)展形(參照附圖2的顯微照片)的球形(參照附圖3的顯微照片)。從上述結(jié)果中注意到當(dāng)在LA-AG凝膠珠中培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞時(shí)，可以保持肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)的形態(tài)。實(shí)施例3．使用LA-AG海綿狀物培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(a)LA-AG海綿狀物的制備按照文獻(xiàn)中所述的方法(L.Shapio,S.Cohen,Biomaterials,18,583-590(1997))進(jìn)行該過程。即將1mlLA-AG(1％v/v)和藻酸(1％w/v)的混合溶液加入到24孔多孔平板上且然后逐步向其中加入相同量的0.01％(w/v)氯化鈣水溶液。使用勻漿器(6G,31,800rpm)將該體系混合3分鐘、在-18℃的冷凍機(jī)中冷凍且然后凍干至得到一種LA-AG海綿狀物。
為進(jìn)行比較，使用僅含藻酸(2％w/v)的水溶液替代LA-AG和藻酸的混合水溶液來進(jìn)行與如上所述相同的操作來制備藻酸海綿狀物(b)在海綿狀物上培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞用實(shí)施例2中所述的方法來收集并分離小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，將該細(xì)胞加入到含有FCS(5％v/v)、EGF(20ng/ml)和Ins(10-8M)的Willium’s培養(yǎng)基E中并接種在所述的海綿狀物上以便使細(xì)胞濃度為800,000個(gè)細(xì)胞/ml。將該海綿狀物培養(yǎng)預(yù)定的期限并通過測定清蛋白的產(chǎn)生量來評(píng)估海綿狀物上培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。
在培養(yǎng)的第8天時(shí)在LA-AG海綿狀物上培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生0.0144μg/ml的清蛋白，而在僅含藻酸的海綿狀物中產(chǎn)生的清蛋白的量為0.00544μg/ml。實(shí)施例4．使用LA-HA海綿狀物培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(a)LA-HA的合成按照實(shí)施例1中合成LA-AG的方法來進(jìn)行該過程。即，將透明質(zhì)酸溶于50ml的TEMED緩沖液(pH4.7)，加入0.97g的WSC作為縮合劑并通過在室溫下攪拌使該混合物反應(yīng)1小時(shí)。向該溶液中加入實(shí)施例1中獲得的2gLA-ED并使該反應(yīng)在室溫下通過攪拌反應(yīng)3天。將該溶液對(duì)20升純水透析且在完成透析后進(jìn)行凍干至得到所需的產(chǎn)物。從該產(chǎn)物的1H-NMR光譜中可以觀察到透明質(zhì)酸CH3為2.0ppm、酰胺NH為3.30ppm、乳糖和藻酸糖鏈為3.3-4.6ppm，由此證明產(chǎn)物是LA-HA。將引入其中的糖鏈的量計(jì)算約為13％。
(b)LA-HA的制備按照文獻(xiàn)中所述的方法(J.R.Glass等，Biomaterials,17,1101-1108(1997))進(jìn)行該過程。即，將LA-HA(1％w/v)和透明質(zhì)酸(1％w/v)混合并分散在0.5％的氫氧化鈉水溶液中。向該分散液中加入0.5μl的1,4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚(交聯(lián)劑)并使反應(yīng)進(jìn)行16小時(shí)。在透析該反應(yīng)溶液后，使用-20℃的冷凍機(jī)將其冷凍且然后凍干以制備一種LA-HA海綿狀物。
為進(jìn)行比較，僅使用透明質(zhì)酸替代LA-AH和透明質(zhì)酸來進(jìn)行與如上所述相同的操作以便制備透明質(zhì)酸海綿狀物。
(c)在海綿狀物上培養(yǎng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞用實(shí)施例2中所述的方法來收集并分離小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，將該細(xì)胞加入到含有FCS(5％v/v)、EGF(20ng/ml)和Ins(10-8M)的Willium’s培養(yǎng)基E中并接種在所述的海綿狀物上以便使細(xì)胞濃度為800,000個(gè)細(xì)胞/ml。將該海綿狀物培養(yǎng)預(yù)定的期限并通過測定產(chǎn)生清蛋白的量來評(píng)估海綿狀物上培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。
在培養(yǎng)的第8天時(shí)在LA-HA海綿狀物上培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生0.0166μg/ml的清蛋白，而在僅含透明質(zhì)酸的海綿狀物的情況中，產(chǎn)生的清蛋白的量為0.00483μg/ml。
工業(yè)實(shí)用性由于本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)包括含糖聚合物，其中對(duì)細(xì)胞具有特異性識(shí)別能力的糖鏈被作為側(cè)鏈結(jié)合，所以能夠因細(xì)胞與糖鏈之間的特異性相互作用而通過使用這類細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞來促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖、維持和改善細(xì)胞功能并保持細(xì)胞的形狀與體內(nèi)的形狀類似。因此，能夠制備可保持與體內(nèi)相同增殖和功能的任意形式的細(xì)胞，且例如能夠?qū)⒂纱酥苽涞募?xì)胞應(yīng)用于雜交人工肝臟。
此外，類似于不含諸如藻酸和透明質(zhì)酸這樣的糖鏈的含糖聚合物，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)能夠方便地產(chǎn)生三維形狀。特別是當(dāng)使用含有藻酸、透明質(zhì)酸、果膠酸或其衍生物時(shí)，可以方便地引入糖鏈作為側(cè)鏈且由于生產(chǎn)成本也相對(duì)較低，所以能夠制備一種一次性使用的產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1．一種三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其特征在于將一種包括含糖聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)制成三維形狀，在所述的含糖聚合物中，至少一類糖鏈通過間隔分子被作為側(cè)鏈結(jié)合。
2．一種三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其特征在于將一種細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)制成三維形狀，所述的細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)包括至少一類糖鏈通過間隔分子被作為側(cè)鏈結(jié)合的含糖聚合物與沒有糖鏈被作為側(cè)鏈結(jié)合的含糖聚合物的混合物。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其中所述的含糖聚合物是帶有羧基基團(tuán)或其衍生物的含糖聚合物。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其中所述的含糖聚合物是藻酸或其衍生物。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其中所述的含糖聚合物是透明質(zhì)酸或其衍生物。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其中所述的含糖聚合物是果膠酸或其衍生物。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其中所述的含糖聚合物是兩類或多類糖鏈被作為側(cè)鏈結(jié)合的含糖聚合物。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)，其中所述的間隔分子是一種二胺。
9．一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞，由此維持并改善細(xì)胞的增殖、形態(tài)和功能。
10．一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于使用混合了權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的兩種或多種三維細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞，由此維持并改善細(xì)胞的增殖、形態(tài)和功能。
全文摘要
本發(fā)明的技術(shù)方案是將包括含糖聚合物的一種細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)制成三維形狀,在所述的含糖聚合物中,至少一類糖鏈通過間隔分子被作為側(cè)鏈結(jié)合,由此制備三維細(xì)胞物質(zhì)。就所述的含糖聚合物而言,優(yōu)選使用帶有諸如藻酸、透明質(zhì)酸、果膠酸或其衍生物這樣的羧基的含糖聚合物。具有對(duì)細(xì)胞特異性識(shí)別特性的糖鏈作為側(cè)鏈被結(jié)合,因此,當(dāng)使用所述細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),能夠維持和改善細(xì)胞的增殖、形態(tài)和功能并因細(xì)胞與糖鏈之間的特異性相互作用而保持細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)細(xì)胞形態(tài)接近。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1320162SQ99811448
公開日2001年10月31日 申請(qǐng)日期1999年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月28日
發(fā)明者后藤光昭, 赤池敏宏, 楊軍 申請(qǐng)人:株式會(huì)社生物探索研究