一種降尿酸肽螯合鈣及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于秋刀魚的精深加工領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于秋刀魚的降尿酸肽螯合 鈣，及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿酸是內(nèi)源性嘌呤和飲食中嘌呤的代謝產(chǎn)物，主要由細(xì)胞代謝分解的核酸和其他 嘌呤類化合物經(jīng)酶作用分解而來(lái)。人體中尿酸20%來(lái)源于富含嘌呤或核酸蛋白食物，屬外 源性；而80%來(lái)源于內(nèi)源性嘌呤代謝。人體每天產(chǎn)生的尿酸中有將近70%經(jīng)過(guò)腎臟排泄， 一旦尿酸生成過(guò)量和/或排泄減少，將引起血尿酸水平的上升，當(dāng)血尿酸持續(xù)上升時(shí)，則會(huì) 引起尿酸鹽在軟組織中的沉積，進(jìn)而誘發(fā)高尿酸血癥和痛風(fēng)甚至累及生命。
[0003] 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平極大地提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式也隨 之發(fā)生了改變，近年來(lái)高尿酸病的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)，且易發(fā)于中老年人。雖然目前 已有一些具有明顯降尿酸或抗痛風(fēng)的藥物，但都不同程度存在毒副作用，使得人們對(duì)健康 藥物和保健食品的需求更加迫切。
[0004] 生物活性肽是指由氨基酸通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的具有某些特殊生理活性的多肽物 質(zhì)，其肽鏈長(zhǎng)度不一，結(jié)構(gòu)各不相同，導(dǎo)致其具有不同的生理活性，如降血壓、降膽固醇、抗 血栓、抗癌、抗氧化等。經(jīng)過(guò)科研工作者的不懈努力，越來(lái)越多的生物活性肽被不斷發(fā)現(xiàn)。
[0005] 此外，高尿酸血癥會(huì)引起通風(fēng)癥的發(fā)作，主要是由于當(dāng)血液中尿酸濃度達(dá)到飽和 時(shí)，尿酸水平的繼續(xù)增高會(huì)使得尿酸發(fā)生結(jié)晶，形成通風(fēng)石并沉積在關(guān)節(jié)內(nèi)的滑液中，不僅 使得滑液?jiǎn)适?rùn)滑保護(hù)關(guān)節(jié)的作用，反而會(huì)像沙漿一樣與關(guān)節(jié)摩擦、使病人疼痛難受形成 痛風(fēng)，而且還會(huì)磨壞關(guān)節(jié)表面的鈣質(zhì)，使得關(guān)節(jié)的承重能力更差，變形更嚴(yán)重。在我國(guó)，高尿 酸患者常見(jiàn)于中老年人，他們本來(lái)就存在不同程度的缺鈣，導(dǎo)致情況惡化。因此，在治療或 預(yù)防高尿酸血癥的同時(shí)，也應(yīng)該重視鈣的補(bǔ)充和吸收。
[0006] 秋刀魚是一種海洋魚，其長(zhǎng)期在海洋特殊環(huán)境中生存，其內(nèi)部必定存在某些獨(dú)特 的生物活性物質(zhì)，如果能夠?qū)⑦@些生物活性物質(zhì)釋放出來(lái)，并且與鈣質(zhì)結(jié)合，用于治療和 預(yù)防高尿酸癥，既能達(dá)到降尿酸的效果，又可起到補(bǔ)鈣的作用，將具有極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種降尿酸肽螯合鈣的制備方法，該方法是采用生物 酶解技術(shù)將秋刀魚內(nèi)部的降尿酸活性片段釋放出來(lái)，并將其與鈣發(fā)生螯合反應(yīng)。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的降尿酸肽螯合鈣，該產(chǎn)品兼具降尿 酸和補(bǔ)鈣作用。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述的降尿酸肽螯合鈣的用途。
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] 一種降尿酸肽螯合鈣的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)秋刀魚預(yù)處理：秋刀魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過(guò)絞肉機(jī)絞碎，加入秋刀魚碎 肉質(zhì)量3~5倍的水，在40~50°C下加熱攪拌1~2小時(shí)，然后調(diào)節(jié)體系pH值至4. 2,繼 續(xù)攪拌加熱1~1. 5小時(shí)，離心分離，棄除上清液和上層油脂，取沉淀物；
[0013] (2)降尿酸肽的制備：往秋刀魚沉淀物中加入其質(zhì)量1~1. 5倍的水，調(diào)節(jié)體系pH 值至7. 0,然后加入蛋白酶，在50~55°C下保溫水解6~9小時(shí)后，滅酶，離心，取上清液， 得到秋刀魚降尿酸肽液；以秋刀魚沉淀物的質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，蛋白酶的總加入量占1. 5~ 3.0% ；
[0014] (3)秋刀魚肽螯合鈣的制備：將秋刀魚降尿酸肽液的pH值調(diào)至7. 0~8. 5,按秋刀 魚降尿酸肽液固形物質(zhì)量30~50%加入氯化鈣固體，在30~35°C下保溫30~60min，然 后加入無(wú)水乙醇攪拌15~30min;此處，生成的螯合鈣不溶于無(wú)水乙醇，加入無(wú)水乙醇可以 達(dá)到分離螯合鈣的目的；將反應(yīng)物離心，取沉淀物真空干燥，得到降尿酸肽螯合鈣產(chǎn)品；
[0015] 所述的調(diào)節(jié)體系pH值是用0.1~0.5mol/L的NaOH溶液或HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0016] 所述的離心是5000r/min離心15~20min ;
[0017] 步驟⑵所述的蛋白酶是商業(yè)用的堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，優(yōu)選諾維信公司的 堿性蛋白酶（Alcalase 2. 4L)和風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme 500MG);堿性蛋白酶的加入量 占秋刀魚沉淀物質(zhì)量的0. 6~0. 8%，風(fēng)味蛋白酶的加入量占秋刀魚沉淀物質(zhì)量的1. 0~ 1. 5% ；
[0018] 步驟（3)中，無(wú)水乙醇質(zhì)量為秋刀魚降尿酸肽液質(zhì)量的8~12倍。
[0019] 由上述方法制得的降尿酸肽螯合鈣可用于制備具有降尿酸和/或補(bǔ)鈣功效的藥 物和保健品，在應(yīng)用時(shí)，可以將其與具有降尿酸作用的中草藥復(fù)配。
[0020] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0021] (1)本發(fā)明首先通過(guò)現(xiàn)代生物酶解技術(shù)釋放秋刀魚蛋白中的活性片段，然后采用 濕法螯合制備蛋白肽螯合鈣產(chǎn)品。從秋刀魚蛋白中釋放出來(lái)的生物活性肽段具有明顯降尿 酸功效，同時(shí)，該蛋白肽具有良好的螯合鈣質(zhì)的作用，制備得到的降尿酸肽螯合鈣產(chǎn)品不僅 具有顯著的降尿酸作用，同時(shí)解決了對(duì)維持骨、肌肉功能至關(guān)重要的鈣的正常吸收與利用 的損失問(wèn)題，可成為一種優(yōu)秀的兼?zhèn)浣的蛩岷脱a(bǔ)充鈣質(zhì)的產(chǎn)品。
[0022] (2)本發(fā)明工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、沒(méi)有任何污染，所得降尿酸肽螯合鈣產(chǎn)品 的降尿酸活性強(qiáng)，且鈣的吸收率高。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是各實(shí)施例和對(duì)比例產(chǎn)品在不同pH值條件下的溶解性柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0025] 以下各實(shí)施例中，各樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率的實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0026] (1)溶液的配置
[0027] 0?2mol/L (pH 7. 5)磷酸緩沖液（PBS):準(zhǔn)確稱取 30. 0838g Na2HP04 ? 12H20 和 2. 4962g NaH2P04 ? 2H20,用去離子水溶解，定容至500ml。
[0028] 黃嘌呤溶液：準(zhǔn)確稱取6. 4mg黃嘌呤，先用1ml1M NaOH將其溶解，再加入100ml PBS，以1M HC1調(diào)節(jié)pH值至7. 5。
[0029] 黃嘌呤氧化酶：取120 y 1酶液，以PBS稀釋至8ml。
[0030] 尿酸標(biāo)曲：準(zhǔn)確稱取10mg尿酸，加入10ml水，再稀釋至0. 1~0. 9mg/ml。
[0031] 醋酸胺-冰醋酸：準(zhǔn)確稱取醋酸胺3. 85g定容至1000ml，然后加入4ml冰醋酸。
[0032] (2)樣品預(yù)處理：
[0033] 將樣品稀釋至40mg/ml，在96孔酶標(biāo)板中依次加入50 y 1樣品與50 y 1黃嘌呤，每 個(gè)樣品做3個(gè)平行，37°C保溫lOmin后加入150 y 1黃嘌呤氧化酶，37°C繼續(xù)保溫20min后 加入80 y 1 1M HC1終止反應(yīng)，過(guò)0. 25 y m水性膜，待測(cè)。
[0034]色譜柱：ZorbaxEclipseXDB-C18 柱（5ym，4.6X 250mm,安捷倫），
[0035] 液相條件：洗脫液為10%甲醇+90%醋酸胺-冰醋酸溶液，進(jìn)樣體積為20yL，流 速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm，運(yùn)行時(shí)間10min〇
[0036] (3)計(jì)算公式
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降尿酸肽螯合鈣的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 秋刀魚預(yù)處理：秋刀魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過(guò)絞肉機(jī)絞碎，加入秋刀魚碎肉質(zhì) 量3~5倍的水，在40~50°C下加熱攪拌1~2小時(shí)，然后調(diào)節(jié)體系pH值至4. 2,繼續(xù)攪 拌加熱1~1. 5小時(shí)，離心分離，棄除上清液和上層油脂，取沉淀物； (2) 降尿酸肽的制備：往秋刀魚沉淀物中加入其質(zhì)量11~1. 5倍的水，調(diào)節(jié)體系pH 值至7. 0,然后加入蛋白酶，在50~55°C下保溫水解6~9小時(shí)后，滅酶，離心，取上清液， 得到秋刀魚降尿酸肽液；以秋刀魚沉淀物的質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，蛋白酶的總加入量占1. 5~ 3. 0% ； (3) 秋刀魚肽螯合鈣的制備：將秋刀魚降尿酸肽液的pH值調(diào)至7. 0~8. 5,按秋刀魚降 尿酸肽液固形物質(zhì)量30~50%加入氯化鈣固體，在30~35°C下保溫30~60min，然后加 入無(wú)水乙醇攪拌15~30min，離心，取沉淀物真空干燥，得到降尿酸肽螯合鈣產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降尿酸肽螯合鈣的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述的 蛋白酶為堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降尿酸肽螯合鈣的制備方法，其特征在于：堿性蛋白酶的 加入量占秋刀魚沉淀物質(zhì)量的〇. 6-0. 8%，風(fēng)味蛋白酶的加入量占秋刀魚沉淀物質(zhì)量的 I. 0-1. 5%〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降尿酸肽螯合鈣的制備方法，其特征在于：堿性蛋白酶是諾 維信公司的Alcalase 2. 4L，風(fēng)味蛋白酶是諾維信公司的Flavourzyme500MG。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降尿酸肽螯合鈣的制備方法，其特征在于：步驟（3)中，無(wú)水 乙醇質(zhì)量為秋刀魚降尿酸肽液質(zhì)量的8~12倍。
6. -種降尿酸肽螯合鈣，其特征在于：是由權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法制備得到。
7. 權(quán)利要求6所述的降尿酸肽螯合鈣在制備具有降尿酸和/或補(bǔ)鈣功效的藥物和保健 品中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的降尿酸肽螯合鈣在制備具有降尿酸和/或補(bǔ)鈣功效的藥物和 保健品中的應(yīng)用，其特征在于：將所述的降尿酸肽螯合鈣與具有降尿酸作用的中草藥復(fù)配。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降尿酸肽螯合鈣及其制備方法和用途，其制備方法包括以下步驟：將秋刀魚絞碎，然后加熱攪拌，再調(diào)節(jié)pH值至4.2，離心分離取沉淀，加入蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物離心后取上清，即秋刀魚降尿酸肽液；加入氯化鈣固體，然后加入無(wú)水乙醇攪拌，離心，取沉淀物真空干燥，得到降尿酸肽螯合鈣產(chǎn)品。本發(fā)明通過(guò)現(xiàn)代生物酶解技術(shù)釋放秋刀魚蛋白中的活性片段，然后采用濕法螯合制備蛋白肽螯合鈣產(chǎn)品。從秋刀魚蛋白中釋放出的生物活性肽段具有明顯降尿酸功效，同時(shí)，該蛋白肽具有較好的螯合鈣的作用，制備得到的降尿酸肽螯合鈣產(chǎn)品不僅具有顯著的降尿酸作用，同時(shí)解決了對(duì)維持骨、肌肉功能至關(guān)重要的鈣的正常吸收與利用的損失問(wèn)題。
【IPC分類】A23L1-305, A23L1-304, A23L1-327
【公開號(hào)】CN104664454
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510095099
【發(fā)明人】蘇國(guó)萬(wàn), 趙謀明, 趙容鐘, 趙強(qiáng)忠, 劉洋
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月3日