一種液體Nisin防腐劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種液體Nisin防腐劑的制備方法。
【背景技術】
[0002] 乳酸鏈球菌素（肽），乳鏈菌肽（Nisin)，是由乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis)或乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)部分菌株發(fā)酵產生的由34個氨基酸組成的 小分子多肽類化合物，分子量約為3510,它能有效地抑制引起食品腐敗的革蘭氏陽細菌及 其孢子的生長，延長食品貨架期，繼1961年FA0/WH0批準Nisin作為食品添加劑使用后， 全世界已有50多個國家和地區(qū)批準其作為食品防腐劑。1990年，我國將其列入國家標準 GB2760-86,可以用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。由于Nisin容易被人體 消化道中的一些蛋白酶所降解，不會在人體內蓄積，是世界公認安全的天然防腐劑。
[0003] 長期以來，乳酸鏈球菌素生產過程中，面臨的最大的問題是提取收率過低，由于 nisin是一種小分子多肽，在其提取過程中，條件控制不恰當會發(fā)生活性的喪失，常見的提 取方法有以下幾種，①有機溶劑法，陳秀珠等利用正丙醇從氯化鈉飽和的發(fā)酵液中提取2 次，利用丙酮沉淀得到nisin粗品，然后將粗制品溶于0. 05mol/L HAc-NaAc (pH3. 6)緩沖 液，并用緩沖液透析24h，離心分離再經CM-SephadexC-25柱層析，得到聚丙稀酰胺凝膠電 泳純的乳鏈組分，活率回收僅為41. 7 %。②菌體吸附法，吳瓊等和葉嗣穎等對nisin隨pH 的改變吸附nisin的規(guī)律進行研宄，通過調整pH，使乳酸乳球菌選擇性地吸附、釋放nisin， 并達到了較好的效果，但是存在活性損失率偏高的問題。③膜分離法，Daoudi L等利用分 子截留量為1000道爾頓的中空纖維膜對經過離心處理除菌的發(fā)酵液進行超濾，最終濃縮 率達到5,收率達到74. 2%，膜分離法也存在一定的問題，如在操作中膜面會發(fā)生污染，使 膜性能降低。④鹽析法，Daoudi L.等利用鹽析法收集沉淀得到nisin粗制品，收率僅為 60%，而且鹽析法由于大量使用硫酸銨、氯化鈉等，廢水中含鹽量高，對環(huán)境造成嚴重的污 染。⑤泡沫分離技術是二十世紀開發(fā)的一種分離技術，1977年被引入生物分離領域，并用于 多種具有表面活性的蛋白質及酶的分離純化，并在實驗室階段取得良好的分離效果。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有乳酸鏈球菌素生產過程中存在的提取收率較低，成本較 高，市場競爭力不足的問題，乳酸鏈球菌素發(fā)酵液（效價10000~14000IU/mL)經過預處理 后，進行陶瓷膜過濾除菌，除菌后清液經過泡沫分離方式進行濃縮，得到高效價的乳酸鏈球 菌素溶液，按照比例添加保護劑、穩(wěn)定劑后，獲得一種液體Nisin防腐劑。
[0005] 本發(fā)明解決技術問題所采取的技術方案是：
[0006] 一種液體Nisin防腐劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：乳酸鏈球菌素發(fā) 酵液經過預處理后，進行陶瓷膜過濾除菌，除菌后清液經過泡沫分離方式進行濃縮，得到高 效價的乳酸鏈球菌素溶液，添加保護劑和穩(wěn)定劑后，得到液體Nisin防腐劑（穩(wěn)定性及瞬時 穩(wěn)定性更好）；
[0007] 所述預處理前乳酸鏈球菌素發(fā)酵液效價10000~14000IU/mL ;
[0008] 所述高效價的乳酸鏈球菌素溶液效價lOOOOOIU/mL以上。
[0009] 進一步的，所述乳酸鏈球菌素發(fā)酵液的預處理為：調節(jié)發(fā)酵液pH到1. 5-3. 0,加熱 〇.5-2h使乳酸鏈球菌素從菌體上分離下來后，進行陶瓷膜過濾除去菌體及大分子蛋白。
[0010] 進一步的，陶瓷膜截留分子量為5萬-10萬道爾頓。
[0011] 進一步的，除菌后的清液經過泡沫分離的方式進行濃縮，具體為在泡沫分離設備 內，通過不斷通入氣體進行吹泡，形成大量泡沫，使用泡沫收集裝置收集泡沫后，進行消泡 處理，得到高效價的乳酸鏈球菌素液體溶液（利用通氣鼓泡在發(fā)酵液中形成的氣泡為載 體，對發(fā)酵液中的Nisin以泡沫形式與發(fā)酵液分離，再收集泡沫并消泡回收Nisin)。
[0012] 進一步的，通入泡沫分離裝置的氣體為空氣、二氧化碳、氮氣中的一種或者幾種。
[0013] 進一步的，消泡的方式為物理消泡、化學消泡的一種或兩種；
[0014] 所述化學消泡為添加聚醚類消泡、食用油類消泡的一種或兩種。
[0015] 進一步的，所述保護劑為1-2 %的氯化鈉、0.02-0. 8 %的蔗糖、0.01-0. 5 %的谷氨 酸鈉、0. 05-0. 6 %的麥芽糊精；
[0016] 所述保護劑的添加量均以乳酸鏈球菌素溶液的重量為基準。
[0017] 進一步的，所述穩(wěn)定劑為0. 01-1 %的山梨醇、0. 02-0. 6 %的微晶纖維素、 0. 0001-0. 0005%的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0. 0005-0. 001 %的吐溫-20 ;
[0018] 所述穩(wěn)定劑的添加量均以乳酸鏈球菌素溶液的重量為基準。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 本專利創(chuàng)新性的利用泡沫分離技術分離、純化、濃縮除菌之后的乳酸鏈球菌素發(fā) 酵液，通過通入空氣、二氧化碳、氮氣中的一種或者幾種組合的氣體，收集泡沫后消泡處理， 得到高效價的Nisin溶液，原始發(fā)酵液效價一般為10000~14000IU/mL，經過鼓泡處理后得 到的高效價溶液一般為lOOOOOIU/mL以上，鼓泡濃縮過程收率達到95%以上，同時濃縮倍 數(shù)為8-10倍，而一般利用雙效蒸發(fā)濃縮乳酸鏈球菌素，其收率只有70-85%。
[0021] 同時本專利又創(chuàng)新性的在高效價的Nisin溶液中加入保護劑和穩(wěn)定劑，保護劑為 1-2 %的氯化鈉、0. 02-0. 8 %的蔗糖、0. 01-0. 5 %的谷氨酸鈉、0. 05-0. 6 %的麥芽糊精，穩(wěn)定 劑為0. 01-1 %的山梨醇、0. 02-0. 6%的微晶纖維素、0. 0001-0. 0005%的聚氧乙烯聚丙烯甘 油醚、0. 0005-0. 001 %的吐溫-20。加入保護劑、穩(wěn)定劑之后，各成分協(xié)同增效，防腐效果遠 高于單一的Nisin產品，由于是液態(tài)防腐劑，在食品中更容易混勻，滲透，對瞬時高溫等的 處理不會發(fā)生效價的損失，同時，使得該液體防腐劑的儲存時間能達到12月以上，不發(fā)生 效價的下降，不影響其在食品中的防腐效果。
[0022] 相比于粉狀Nisin的產品，該液體防腐劑制備過程中減少鹽析、噴霧干燥等過 程中乳酸鏈球菌素效價的損失，降低了成本，同時使用過程中直接將液體加入食品中即 可，不用經過溶解一步，GB2760規(guī)定食品中的最大使用量為0. 5g/kg，折合每kg食品需要 450000IU的Nisin，本發(fā)明的液態(tài)防腐劑效價為lOOOOOIU/mL以上，折合每kg食品添加量 為4. 5mL，不會影響食品固有的口感，而且使用更加方便，防腐效果更加突出。
[0023] 本發(fā)明創(chuàng)新性的開發(fā)出一種液態(tài)Nisin的防腐劑，防腐效果更加突出，使用更加 方便，同時克服了 Nisin在提取過程中的收率過低的困難，是一種極具有市場前景的防腐 劑產品。
【具體實施方式】
[0024] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的 內容不僅僅局限于下面的實施例，實施例不應視作對本發(fā)明保護范圍的限定。