專利名稱：：誘導(dǎo)人類免疫缺陷病毒的中和抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)，具體而言，涉及誘導(dǎo)HIV中和抗體的方法以及適用于所述方法的化合物和組合物。
背景技術(shù)：
：在急性HIV-1感染中產(chǎn)生的第一抗體是抗以下位點(diǎn)的CD4結(jié)合位點(diǎn)(Mooreetal,J.Virol.68(8)5142(1994))、CCR5共受體結(jié)合位點(diǎn)(Choeetal,Cell114(2):161-170(2003))和V3環(huán)(Mooreetal,J.Acquir.Immun.Def.Syn.7(4):332(1994》。然而，這些抗體不能控制HIV-1并易被其逃脫(Burtonetal,NatureImmun.5:233-236(2004),Weietal，Nature422(6929):307-312(2003))?？棺泽w病毒的中和抗體在感染后五十六十天產(chǎn)生，但能中和異源HIV-1株的抗體直到感染第一年之后才產(chǎn)生(Richmanetal，Proc,Natl.Acad.Sci.USA100(7):4144-4149(2003),Weietal,Nature422(6929):307-312(2003》。mv-i包膜上與罕見的廣泛反應(yīng)性中和抗體相結(jié)合的四個(gè)表位是CD4結(jié)合位點(diǎn)(CD4BS)(mab(單克隆抗體)IgGlbl2)(Zwicketal,J.Virol.77(10):5863-5876(2003》、由人類mab2F5和4E10定義的膜近外側(cè)區(qū)域(membraneproximalexternalregion,MPER)表位(Armbrusteretal，J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004),Stiegler禾卩Katinger，J.Antimicrob.Chemother.51:757-759(2003)，Zwicketal,JournalofVirology79:1252-1261(2005),Purtscheretal,AIDS10:587(1996))(圖l)和由人類mab2G12定義的甘露聚糖表位(Scanlanetal,Adv.Exper.Med.Biol.535:205-218(2003))。這四個(gè)罕見的人類mab均是不尋常的兩個(gè)是IgG3(2F5和4E10),—個(gè)具有獨(dú)特的Ig二聚體結(jié)構(gòu)(2G12)，一個(gè)具有非常疏水的CDR3(2F5)(Ofeketal,J.Virol.198:10724(2004))，并且在所有四個(gè)抗體里面，CDR3異乎尋常的長(Burtonetal，NatureImmunol.5(3):233-236(2004),Kunertetal，AIDSRes.Hum.Retroviruses20(7):755-762(2004),Zwicketal,J.Virol.78(6):3155-3161(2004),Cardosoetal，Immunity22:163-172(2005))。其中，類似2F5和4E10的人類mab是非常罕見的。急性HIV-l患者不產(chǎn)生抗MPER或2G12表位的抗體(Robinson,未發(fā)表(2005),Shaw,未發(fā)表(2005))，MPER可由HIV包膜的氨基酸652683所限定(Cardosoetal,Immunity22:163-173(2005)(例如，QQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK)。CD4結(jié)合位點(diǎn)(BS)抗體通常在HIV-l感染早期產(chǎn)生，但這些抗體通常不具有mabIgGlbl2所表現(xiàn)出的廣譜中和性(Burtonetal，Nat.Immunol.5(3):233-236(2004))。己顯示許多HIV-l包膜的表位與宿主組織交叉反應(yīng)(Pintoetal,AIDSRes.Hum.Retrov.10:823-828(1994)，Douvasetal，AIDSRes.Hum.Retrov.10:253-262(1994),Douvasetal，AIDSRes.Hum.Retrov.12:1509-1517(1996))，并且已顯示自身免疫患者產(chǎn)生與HIV蛋白具有交叉反應(yīng)性的抗體(Pintoetal,AIDSRes.Hum.Retrov.10:823-828(1994),Douvasetal,AIDSRes.Hum.Retrov.10:253-262(1994)，Douvasetal,AIDSRes.Hum-Retrov.12:1509-1517(1996)，Bartheletal,Semin.Arthr.Rheum.23:1-7(1993))。類似地，已提示對自身表位的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是自身免疫異常禾口AIDS中T細(xì)胞缺失的原因(Douvasetal，AIDSRes.Hum.Retrov.12:1509-1517(1996)，Ziegleretal，Clin.Immunol.Immunopath.41:305-313(1986))。已制造了2F5mab的高親和性肽配體，其誘導(dǎo)高水平的抗所述肽的抗體，但沒有廣泛地中和HIV-l原初分離物(McGaugheyetal，Biochemistry42(11):3214畫3223(2003);Zhangetal，J.Virol.78(15):8342-8348(2004);Zwicketal，J.Virol.79:1252-1261(2005)中的綜述)。經(jīng)解釋這些結(jié)果意味著所述2F5的肽配體未具有合適的構(gòu)象以誘導(dǎo)抗-MPER抗體(Burtonetal,NatureImmunology5(3):233畫236(2004),Zwicketal,J.Virol.79:1252-1261(2005))。已制造一系列高度受限的HIV-1Env免疫原(其中穩(wěn)定表達(dá)IgGlbl2、2G12、2F5和4E10表位)，并且已證明這些免疫原在豚鼠或兔子中不誘導(dǎo)廣泛反應(yīng)性中和抗體，具體而言，不產(chǎn)生針對MPER表位的中和抗體(Liaoetal，J.Virol.78(10):5270-5278(2004);Haynes,未發(fā)表(2005))。這些結(jié)果已提出這樣的問題在正常動(dòng)物和人類中不產(chǎn)生針對HIV-1包膜的廣泛反應(yīng)性抗體是否是因?yàn)椴荒墚a(chǎn)生所述廣泛反應(yīng)性抗體。由于長的疏水CDR3區(qū)是天然的多反應(yīng)性自身抗體所特有的(Meffreetal，J.Clin.Invest.108:879-886(2001),Ramslandetal，Exp.Clin.Immun.18:176-198(2001))，以及HIV-1感染的患者的B淋巴細(xì)胞經(jīng)多克隆馬區(qū)使產(chǎn)生心磷月旨抗"i本(Weissetal，Clin.Immunol.Immunopathol.77:69-74(1995),Gr畫waldetal,Clin.Exp.Immunol.15:464-71(1999》，已進(jìn)行研究分析這些以及其他對于心磷脂的抗-HIV-lmab和其他自身抗原反應(yīng)性。本發(fā)明至少部分來自于以下認(rèn)識(shí)，即兩個(gè)廣泛反應(yīng)性HIV-1包膜gp41人類mab(2F5和4E10)是與心磷脂具有反應(yīng)性的多特異性自身抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明大體上涉及人類HIV。更具體地說，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)HIV中和抗體的方法以及適用于所述方法的化合物和組合物。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在其天然膜結(jié)合環(huán)境中呈遞MPER表位的免疫原，以及使用所述免疫原破壞耐受性的免疫方法。由以下描述可清楚了解本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)。圖1:廣泛中和抗體(2F5、4E10)與位于靠近宿主膜的表位結(jié)合。2F5和4E1mAb均是IgG3，具有長CDR3，并與位于HIV-1gp41(aa660-683)膜近外側(cè)區(qū)域(MPER)內(nèi)的表位結(jié)合。圖2A2D:2F5、4E10、IgGlbl2Mab與人類Hep-2上皮細(xì)胞的反應(yīng)性。圖2A顯示Mab2F5與Hep-2細(xì)胞以彌散細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核方式反應(yīng)，圖2B顯示Mab4E10與HEp-2細(xì)胞以與2F5相似的方式反應(yīng)。圖2C顯示MabIgGlbl2與Hep-2細(xì)胞以彌散細(xì)胞質(zhì)方式反應(yīng)，在細(xì)胞核中具有核仁反應(yīng)性。圖2C插入圖顯示更高倍率放大的細(xì)胞，其中顯示IgGlb12的核仁反應(yīng)性(箭頭)。圖2D顯示Mab1.9F對Hep-2細(xì)胞為負(fù)反應(yīng)性。在圖2A2D中所檢測的每個(gè)載玻片上的抗體量為每載玻片上3.75pg的Mab。Mab2F5在每個(gè)載玻片上0.125嗎(5jig/ml)時(shí)對HEp-2細(xì)胞為陽性。Mab4E10在每個(gè)載玻片上0.125嗎(5pg/ml)時(shí)對HEp-2為陽性。IgGlbl2在每個(gè)載玻片上1.25pg(50pg/ml)時(shí)為陽性。所有圖均放大200倍，圖2C插入圖放大400倍。所示圖像來自于所進(jìn)行的三次試驗(yàn)中的代表性試驗(yàn)。圖3A3D:Mab2F5和4E10抗脂質(zhì)以及結(jié)合特異性的分析。圖3A顯示MAb4E10(實(shí)心柱)和2F5(空心柱)對心磷脂(CL)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)的ELISA活性。盡管4E10和2F5均與心磷脂反應(yīng)，但僅有4E10與所測試的其他脂質(zhì)反應(yīng)。對照人類抗CCR5結(jié)合位點(diǎn)MAb1.7b的反應(yīng)性為陰性(數(shù)據(jù)未示出)。MAb對空白包被板的反應(yīng)性也相似地為陰性(未示出)。為顯示MAb2F5對心磷脂的結(jié)合特異性，使用150嗎/ml300嗎/ml的2F5和1000嗎/ml的抗2F5獨(dú)特型鼠類MAb3H6，所述MAb3H6阻斷MAb2F5對HIV-1的中和。(Kunertetal,AIDS16:667(2002))。在3次獨(dú)立的試驗(yàn)中，所述2F5抗獨(dú)特型以70%方式明顯地阻斷MAb2F5與心磷脂的結(jié)合(p0.03)(圖3B)。在獨(dú)立的ELISA中，MAb2F5以660nM的半數(shù)最大(EC50)應(yīng)答與心磷脂相結(jié)合(未示出)。圖3C顯示4E10MAb與心磷脂結(jié)合的劑量應(yīng)答曲線。所述4E10結(jié)合的半數(shù)最大(EC50)應(yīng)答(80nM)由四個(gè)參數(shù)S形曲線擬合分析計(jì)算所得。結(jié)合數(shù)據(jù)獲自4E10MAb(0.5nM1000nM)與包被在ELISA板上的心磷脂(1.35lag/孔)結(jié)合的ELISA。圖3D顯示表達(dá)所述4E10表位的可溶性HIV-1Envgpl40寡聚體(CON-S)抑制4E10MAb與心磷脂的結(jié)合。4E10與心磷脂結(jié)合的抑制作用的IC50經(jīng)計(jì)算為145nM。使用各種濃度的gpl40(19.25nM1230nM)進(jìn)行所述抑制分析，所述各種濃度的gpl40與10嗎/ml的4E10MAb混合，然后加入到含有1.35嗎心磷脂的孔中。MAb3H6(1mg/ml)(但不是對照MAb)也阻斷MAb2F5與SSA/Ro、著絲粒B和組蛋白的結(jié)合(未示出)。圖3A3D中的所有數(shù)據(jù)代表至少兩次所進(jìn)行的試驗(yàn)。圖4A和4B:CON-SEnvgpl60的氨基酸(圖4A)和核酸(圖4B)序列。在實(shí)施例2中使用圖4A的蛋白質(zhì)的CFI形式。(gpM0CFI指以下HIV-l包膜設(shè)計(jì)，其中刪除了切割位點(diǎn)(C)、融合位點(diǎn)(F)和gp41免疫顯性區(qū)(I)，以及刪除了跨膜域和胞質(zhì)域。)圖5:在免疫方案中使用的磷脂的結(jié)構(gòu)以及所得的中和滴度。圖6A和6B:在生成肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物中用到的肽序列。MAb2F5和4E10結(jié)合表位的標(biāo)稱表位分別包括序列ELDKWAS和WFNITNW，并標(biāo)以下劃線。V3序列來自于HIV-1MN株的gpl20，并用作對照構(gòu)建體。錯(cuò)義序列(scrambledsequence)用作對照。圖7:MPERgp41構(gòu)建體的多種設(shè)計(jì)的示意性表示圖。在每個(gè)示意性構(gòu)建體的上方標(biāo)出功能性區(qū)域。在每個(gè)示意性構(gòu)建體的下方標(biāo)出氨基酸序列。初始和成熟信號(hào)序列以藍(lán)色突出顯示；免疫顯性區(qū)以黑體突出顯示；MPER區(qū)以棕色突出顯示以及GTH1區(qū)以紅色突出顯示，而跨膜域標(biāo)以下劃線。組氨酸標(biāo)簽(His-tag)加到所述構(gòu)建體的C-端以易于純化，并以綠色突出顯示。圖8:mAb4E10與肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物的結(jié)合。BIAcore結(jié)合曲線顯示mAb4E10與GTH1-4E10脂質(zhì)體的特異性、明顯更強(qiáng)的結(jié)合。也檢測到與GTH1-2F5脂質(zhì)體的具有快速動(dòng)力學(xué)的低水平結(jié)合。圖9:2F5mAb與肽-脂質(zhì)體的結(jié)合。mAb2F5特異性地與GTH1-2F5脂質(zhì)體結(jié)合，并顯示出不與GTH1-4E10脂質(zhì)體結(jié)合。圖10:A32mAb與肽-脂質(zhì)體結(jié)合。對照抗gpl20Mab(即A32)顯9示不與任何脂質(zhì)體偶聯(lián)物相結(jié)合。17b，一種CD4誘導(dǎo)性mAb也顯示不與上述脂質(zhì)體偶聯(lián)物相結(jié)合(數(shù)據(jù)未示出)。圖11:偶聯(lián)熒光素的肽-脂質(zhì)體的生成。通過在脂質(zhì)組合物中加入熒光素-POPE將肽-脂質(zhì)體與熒光素標(biāo)簽偶聯(lián)。結(jié)合試驗(yàn)顯示在偶聯(lián)熒光素的脂質(zhì)體中保留了mAb4E10結(jié)合的特異性。熒光素偶聯(lián)的GTH1-2F5脂質(zhì)體給出類似結(jié)果。圖12:已免疫的豚鼠血清與4E10肽的反應(yīng)性。ELISA結(jié)合試驗(yàn)顯示來自用GTH1-4E10脂質(zhì)體免疫的兩只豚鼠的血清與4E10肽的強(qiáng)陽性反應(yīng)性。所有的預(yù)先取血血清均給出背景結(jié)合，而在來自于用4E10肽免疫的動(dòng)物的血清中僅觀察到低水平的結(jié)合。兩只來自于經(jīng)肽-脂質(zhì)體免疫的動(dòng)物的陽性血清均顯示出中和活性(表2)。一個(gè)血清(1102)顯示出MN和SS1196株的中和，抗體滴度分別為1:209和1:32。第二個(gè)血清(1103)僅有效抗MN病毒(1:60)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明至少部分來自于表明某些廣泛中和HIV-1抗體是自身抗體的研究。大量HIV+患者短暫地產(chǎn)生低水平的所述抗體，然而，此處描述的研究也指出gp41表位并不誘導(dǎo)這些抗體特異性，而是交叉反應(yīng)性自身抗原(包括心磷脂)是啟動(dòng)抗原。本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)能中和HIV的抗體的方法。所述方法包括向有需要的患者施用一定量的至少一種足以實(shí)現(xiàn)所述誘導(dǎo)的異源(例如非人類)或同源(例如人類)交叉反應(yīng)性自身抗原。適用于本發(fā)明的交叉反應(yīng)性自身抗原包括心磷脂、SS-A/RO、來自細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的dsDNA、著絲粒B蛋白和RiBo核蛋白(RNP)。合適的自身抗原也包括除心磷脂之外的磷脂，諸如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇或鞘磷脂，及它們的衍生物，例如l-棕櫚酰-2-油酰，-甘油基-3-[二氧磷基-L-絲氨酸](POPS)、1-棕櫚酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。采用磷脂的六角II相可以是有利的，并且優(yōu)選易于形成所述六角II管狀相(例如在生理?xiàng)l件下)的六角堆積柱的磷脂，正如能以六角II相穩(wěn)定的磷脂。(參見Rauchetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4112-4114(1990);Aguilaretal，J.Biol.Chem.274:25193-25196(1999》。也可以采用包含所述交叉反應(yīng)性表位的所述自身抗原的片段。可在例如初免加強(qiáng)方案中使用自身抗原或其片段，所述初免加強(qiáng)方案可容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員優(yōu)化(所述方案的編碼蛋白質(zhì)性組分的DNA序列可在使得在體內(nèi)制造所述蛋白質(zhì)性組分的條件下施用)。通過實(shí)施例的方式，可以將交叉反應(yīng)性自身抗原用作第一初免疫苗以加強(qiáng)天然自身抗體(例如類似于抗心磷脂4E10和2F5抗體)?；蛘呤亲陨砜乖?例如心磷脂(或其片段))，或者是含有交叉反應(yīng)性表位的HIV包膜蛋白/多肽/肽能用作加強(qiáng)物，所述交叉反應(yīng)性表位諸如2F5禾Q/或4E10表位(所述表位能至少分別包括序列ELDKWA禾口NWFDIT)(參見在PCT/US04/30397中披露的序列)(應(yīng)當(dāng)注意的是HIV-包膜不是自身抗原)。所述自身抗原和/或HIV-蛋白/多肽/肽，或者編碼序列的施用模式隨免疫原、患者以及所要得到的效果而變化，施用劑量也與此類似。最優(yōu)的劑量方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定。通常，施用為皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或口服施用。免疫原性物質(zhì)可與佐劑組合施用。盡管有多種佐劑可供使用，但優(yōu)選的佐劑包括CpG寡核苷酸或者其他能破壞對自身抗原的耐受性而不誘導(dǎo)自身免疫疾病的物質(zhì)(例如TRL9激動(dòng)劑)(Tranetal,Clin.Immunol.109:278-287(2003);美國專利申請20030181406、20040006242、20040006032、20040092472、20040067905、20040053880、20040152649、20040171086、20040198680、200500059619)。本發(fā)明包括適用于本發(fā)明方法中使用的組合物，包括含有所述自身抗原，和/或HIV蛋白/多肽/肽(其中包含一個(gè)或多個(gè)交叉反應(yīng)性表位(例如4E10禾卩/或2F5表位))，或4E10或2F5表位模擬物和載體的組合物。當(dāng)可使用DNA初免物或加強(qiáng)物時(shí)，合適的制劑包括DNA初免物和重組腺病毒加強(qiáng)物以及DNA初免物和重組分枝桿菌加強(qiáng)物，其中所述DNA或所述載體，例如，或者對HIV包膜或者對自身抗原蛋白如SS-A/Ro進(jìn)行編碼。其他這些載體的組合能用作初免物或加強(qiáng)物，或者伴隨或者未伴隨HIV蛋白/多肽/肽和/或自身抗原。所述組合物可例如以適用于注射或者鼻內(nèi)施用的形式存在。有利的是，所述組合物是無菌的。所述組合物可以以劑量單元形式存在。本發(fā)明還涉及被動(dòng)免疫療法，其中將來源于以下患者的B細(xì)胞用于制造交叉反應(yīng)性抗體(包括除4E10和2F5之外的單克隆抗體)，所述患者為患有原發(fā)性自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或抗磷脂抗體綜合征的患者或者患有梅毒、利什曼病和麻風(fēng)等感染性疾病的患者。即，本發(fā)明包括來源于SLE患者以及患有其他免疫調(diào)節(jié)紊亂的患者(即患有能產(chǎn)生與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性的自身抗體的原發(fā)性自身免疫疾病，或非-HIV感染等諸如上述的患者)的B細(xì)胞在制造永生細(xì)胞系中的用途，所述永生細(xì)胞系提供了與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性的抗體(例如，類似2F5或者4E10的抗體)源(參見Stiegleretal,AIDSRes.Hum.Retroviruses17:1757-1765(2001),Armbrusteretal,J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004)，USP5,831,034)。有利的是，B細(xì)胞來自受HIV感染的患者或者接受基于包膜的HIV疫苗的SLE患者(或患有另外的原發(fā)性自身免疫疾病的患者)(雖然不愿意受到理論的約束，但HIV感染或者接種可用于"加強(qiáng)"致敏的Bl細(xì)胞(例如心磷脂致敏的Bl細(xì)胞)以產(chǎn)生類似2F5和/或4E10的抗體并避免缺失(這會(huì)發(fā)生在正常受試者中)——所述"加強(qiáng)"可誘發(fā)體細(xì)胞超變因此所得Ig基因編碼以下抗體，該抗體適合于類似2F5和/或4E10的表位——或者適合于其他能誘導(dǎo)廣泛中和抗體但在正常個(gè)體中缺失的gpl60表位)?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的多種技術(shù)中的任一技術(shù)實(shí)現(xiàn)由B細(xì)胞制造永生細(xì)胞系，所述公知技術(shù)包括但不局限于將諸如B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以制造雜交瘤。一旦選定，編碼所述交叉反應(yīng)性抗體(或其結(jié)合性片段)的序列可以被克隆和擴(kuò)增(參見例如Huseetal,Science246:1275-1281(1989)，以及如在WO91/17271，WO92/01047，USP5,877,218、5,871,907、5,858,657、5,837,242、5,733,743和5,565,332中描述的噬菌體展示技術(shù))?？刹捎帽绢I(lǐng)域公知技術(shù)設(shè)計(jì)和制造用于治療的可溶性抗體(Stiegleretal,AIDSRes.Hum.Retroviruses17:1757-1765(2001)，Armbrusteretal，J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004》。依照該方法，所述抗體(或其結(jié)合性片段)可以以約10mg/劑100mg/劑，優(yōu)選25mg/劑的劑量范圍施用。劑量和頻率可隨抗體(或其結(jié)合性片段)、患者和所要得到的效果而變化(參見Armbrusteretal,J.Antimicrob.Chemother.54:915-920(2004))。上述抗體可以進(jìn)行預(yù)防性或治療性應(yīng)用。所述抗體(或其結(jié)合性片段)，或者編碼所述抗體或結(jié)合性片段的DNA可與載體(例如藥用載體)一起配制并通過例如腸道外、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或鼻內(nèi)途徑進(jìn)行施用。最后，動(dòng)物物種諸如駱駝(Ramslandetal,Exp.Clin.Immunogenet.18:176-198(2001),Litmanetal,A匪.Rev.Immunol.7:109-147(1999))，牛(Ramslandetal，Exp.Clin.Immunogenet.18:176-198(2001)，Litmanetal,Annu.Rev.Immunol.7:109-147(1999))和鳘魚(Ramslandetal,Exp.Clin.Immunogenet.18:176-198(2001)，Litmanetal,Annu.Rev.Immunol.7:109-147(1999)，Hohmanetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90:9882-9886(1993》具有非常長的CDR3長度，并且其抗體顯示出多反應(yīng)性。這些工程化的對HIV包膜顯示出多反應(yīng)性的CDR3可用于制造有效的針對HIV以及很多感染物的治療抗體(例如單克隆抗體，包括例如嵌合和人源化抗體，以及其抗原結(jié)合片段)。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及合成脂質(zhì)體-肽偶聯(lián)物以及使用其作為免疫原用于產(chǎn)生抗HIV-1的廣泛中和抗體的方法。本發(fā)明的該實(shí)施方式提供將與HIV-1gp41的MPER相結(jié)合的廣泛中和抗體的標(biāo)稱表位肽包埋在合成脂質(zhì)體中的組合物和方法。還提供的是用于產(chǎn)生抗HIV-1中和抗體和用于檢測抗原特異性B細(xì)胞應(yīng)答的免疫策略和方案。依照本發(fā)明的該實(shí)施方式，包含廣泛中和抗HIV抗體的標(biāo)稱表位和疏水接頭如GTH1(序列參見圖6)的肽序列包埋在合成脂質(zhì)體中。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述標(biāo)稱表位是mAb2F5(ELDKWAS)或4E10(WFNITNW)的標(biāo)稱表位，如上所述其位于HIV-1包膜gp41的MPER中。所述表位可存在于所述肽中使其特異性抗體能相對不受限制地靠近，或者作為另外一種選擇，所述表位能夠與所述疏水接頭相比存在于肽中以模擬所述MPER區(qū)的天然取向。適合用于本發(fā)明的肽序列的具體實(shí)例列在圖6中。此外，所述MPERgp41區(qū)可在人類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為在重組痘苗病毒中的重組蛋白，并在所述gp41組分的N端或C端形成兩性(x-螺旋以易于和脂質(zhì)體相結(jié)合(圖7)。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)體包括但不局限于含有POPC、POPE、DMPA(或鞘磷脂(SM))和膽固醇(Ch)的脂質(zhì)體。盡管最佳比例可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，但實(shí)例包括POPC:POPE:SM:Ch或POPC:POPE:DMPA:Ch的比例為45:25:20:10?？梢允褂玫闹|(zhì)體替代制劑包括以9:7.5:1的摩爾比例配制的DMPC(l，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)、膽固醇(Ch)和DMPG(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-二氧磷基-rac-(l-甘油)(Wassefetal,ImmunoMethods4:217-222(1994);Alvingetal，G.Gregoriadis(ed.)，Liposometechnology第二片反,vol.IllCRCPress,Inc.,BocaRaton,FL(1993);Richardsetal,Infect.Immun.66(6):285902865(1998》。肽與總脂質(zhì)的最佳比例可例如根據(jù)所述肽和脂質(zhì)體而變化。對于實(shí)施例3的肽，1:420的比例是有利的?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備脂質(zhì)體-肽偶聯(lián)物(也可參見以下實(shí)施例3)。本發(fā)明的所述肽-脂質(zhì)體免疫原可與有助于加強(qiáng)抗體應(yīng)答的佐劑(如脂質(zhì)A、oCpG、TRL4激動(dòng)劑或TLR7激動(dòng)齊lj)一同配制禾口/或施用(Raoetal,Immunobiol.CellBiol.82(5):523(2004))。其他可以使用的佐劑包括明礬(alum)和Q521(其不破壞已存在的B細(xì)胞耐受性)。優(yōu)選的制劑含有經(jīng)設(shè)計(jì)破壞B細(xì)胞耐受性形式的佐劑，例如在油乳劑如Emulsigen(水包油乳劑)中的oCpG(Tranetal，Clin.Immunol.109(3):278-287(2003))。其他合適的佐劑包括在2005年12月14號(hào)遞交的11/302,505中描述的佐劑，包括其中披露的TRL激動(dòng)劑。所述肽-脂質(zhì)體免疫原可例如通過靜脈內(nèi)(IV)、鼻內(nèi)、皮下、腹膜腔、陰道內(nèi)或者直腸內(nèi)施用。施用途徑可例如根據(jù)患者、偶聯(lián)物和/或所要得到的效果而變化，劑量方案也是如此。所述肽-脂質(zhì)體免疫原優(yōu)選為預(yù)防性使用，然而，對已感染個(gè)體進(jìn)行施用也可降低病毒負(fù)載。如以下實(shí)施例3所描述，所述肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物可用作檢測MPER-特異性B細(xì)胞應(yīng)答的試劑。例如，所述肽-脂質(zhì)體構(gòu)建體可以與可檢測標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記如熒光素)相偶聯(lián)。所述偶聯(lián)熒光素的脂質(zhì)體可用在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析中作為檢測宿主中的抗-MPER特異性B細(xì)胞應(yīng)答的試劑，所述宿主已用呈遞暴露的MPER區(qū)域的HIV-1Env蛋白進(jìn)行免疫過。這些試劑可用于外周血B細(xì)胞的研究，以通過測量免疫后循環(huán)記憶B細(xì)胞的數(shù)量來確定抗MPER抗體誘導(dǎo)的免疫有效性。由閱讀前文應(yīng)當(dāng)理解的是，如果HIV己進(jìn)化至不能被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)而逃避宿主的免疫應(yīng)答，其他感染物也可能已發(fā)生類似的進(jìn)化?！熠?，這將代表一種普遍的逃避機(jī)制。在如此的情況下，可以推想與此處描述相當(dāng)?shù)姆椒▽τ谶@樣的其他物質(zhì)的治療也有用。在以下的非限制性實(shí)施例中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的某些方面(也可參見Maksyutovetal,J.Clin.Virol.Dec;31Suppl1:S26-38(2004)，美國申請?zhí)?0040161429，禾卩Haynesetal,Science308:1906(2005》。實(shí)施例1設(shè)計(jì)能誘導(dǎo)廣泛反應(yīng)性屮和抗體的HIV-1免疫原是HIV-1疫苗開發(fā)的主要目的。盡管存在能廣泛中和HIV-1的罕見人類mab，但是HIV-1包膜免疫原并不誘導(dǎo)這些抗體特異性。在本研究中，己證明兩種最具有廣泛反應(yīng)性的HIV-1包膜gp41人類mab(2F5和4E10)是對心磷脂有反應(yīng)性的多特異性自身抗體。因此，由于自身抗體的gp41膜近表位模擬性的緣故，目前的HIV-1疫苗不能誘導(dǎo)抗膜近gp41表位的抗體。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)單克隆抗體。如所述制造Mab2F5、2G12和4E10(Steigleretal，AIDRes.HumanRetroviruses17:1757(2001),Purtscheretal，AIDS10:587(1996),Trkolaetal，J.Virol.70:1100(1996))。IgGlbl2(Burtonetal，Science266:1024-1027(1994))是DennisBurton,ScrippsInstitute,LaJolla,CA慷慨贈(zèng)送的禮物。Mab447-52D(Zolla-Pazneretal,AIDSRes.HumanRetroviral.20:1254(2004))獲自AIDSReagentRepository,NIAID,NIH。表1中其余mab由感染HIV-1的受試者產(chǎn)生并根據(jù)描述進(jìn)行使用。(Robinsonetal,AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990),Binleyetal,J.Virol.78:13232(2004))。自身抗體分析。如所述使用抗-心磷脂ELISA(DeRoeetal,J.Obstet.Gynecol.NeonatalNurs.5:207(1985)，Harrisetal，Clin.Exp.Immunol.68:215(1987))。類似的ELISA經(jīng)改進(jìn)以適應(yīng)分析mab對磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂(均購自于Sigma,St.Louis,MO.)的反應(yīng)性。將LuminexAtheNAMulti-LyteANA觀lR式(WampoleLaboratories,Princeton,NJ)用于檢測mab對于SS-A/Ro、SS-B/La、Sm、核蛋白(RNP)、Scl-70、Jo-l、雙鏈(ds)DNA、著絲粒B和組蛋白的反應(yīng)性。Mab的分析濃度為150嗎/ml、50嗎/ml、15嗎/ml和5)ig/ml。10(il的每種濃度(每個(gè)分析中分別為0.15(ig、0.05叱、0.015昭和0.005jig)與Luminex熒光小球一起溫育，并按照制造商說明書進(jìn)行測試。表1中的值是每個(gè)測試加入0.15嗎所得分析結(jié)果的值。此外，用于SS-A/Ro(ImmunoVision,Springdale,AR)禾口dsDNA(InovaDiagnostics,SanDiego,CA)的ELISA也用于確認(rèn)這些自身抗原的特異性。采用埃文斯藍(lán)(作為復(fù)染劑)和FITC-偶聯(lián)山羊抗人IgG(ZeusScientific,RaritanN丄)，使用在Hep-2載玻片上進(jìn)行的間接免疫熒光來確定對人類上皮Hep-2細(xì)胞的反應(yīng)性。在NikonOptiphot熒光顯微鏡上對載玻片進(jìn)行照相。用濁度法(DadeBehring,Inc(Newark,DE))測量類風(fēng)濕因子。根據(jù)描述用活化的部分促凝血酶原激酶(aPTT)和稀釋的拉塞爾蝰蛇毒測試進(jìn)行狼瘡抗凝血?jiǎng)┓治?Moll和Ortel，Ann.Int.Med.127:177(1997))。40)il的1mg/ml的2F5、4E10和對照mab加入到混合的正常血漿中(最終mab濃度，200(ig/ml)用于狼瘡抗凝血?jiǎng)┓治??？?32糖蛋白-1分析采用ELISA進(jìn)行(InovaDiagnostics,Inc.)。針對dsDNA、SS-A/Ro、SS-B/La、Sm、RNP和組蛋白的血清抗體在SLE患者中出現(xiàn)；針對著絲粒B和scl-70沐撲異構(gòu)酶I)的血清抗體在全身性硬化癥患者中發(fā)現(xiàn)；發(fā)現(xiàn)針對Jo-l的抗體與多肌炎相關(guān)(Rose和MacKay，TheAutoimmuneDiseases,第三版.AcademicPress,SandDiego,CA(1998》。結(jié)果己測定mab2F5和4E10,其它兩種罕見廣泛反應(yīng)性中和mab(2G12和IgGlbl2)以及31種普通抗HIV-lEnv人類mab與心磷脂的反應(yīng)性(Robinsonetal，AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990))(表1)。2F5和4E10均與心磷脂反應(yīng)，而所有33種其他mab為陰性。Mab2F5也與SS-A/Ro、組蛋白和著絲粒B自身抗原反應(yīng)，而mab4E10與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)自身抗原、SS-A/Ro反應(yīng)。2F5和4E10均與Hep-2人類上皮細(xì)胞以彌散細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核方式反應(yīng)(Robinsonetal,AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990))(圖2)。因此，2F5和4E10均具有多特異性自身反應(yīng)性的特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>除了Ku32mab與Sm反應(yīng)外，所有的Mab在與La(SSB)、Sm、Scl-70和Jo-l的反應(yīng)性分析中均為陰性。Ro(SSA)、dsDNA、著絲粒B、組蛋白和心磷脂抗體的數(shù)值為基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對單位。-=陰性在兩種其他的罕見中和mab中，一種單克隆抗體，即2G12，不是自身反應(yīng)性的，而另一種抗CD4結(jié)合位點(diǎn)的mab，即IgGlbl2(Stiegleretal，AIDSRes.Hum.Retroviruses17:1757(2001))與核蛋白、dsDNA和著絲粒B以及Hep-2細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核方式反應(yīng)(表1和圖2)。在所研究的31種較為常見的抗HIV-lmab中，只有兩個(gè)mab特異性地在靠近CD4結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合(A32、1.4G)，以及一種非中和gp41表位的mab(2.2B)顯示出多反應(yīng)性的跡象(表l)。為確證2F5和4E10是否與在SLE相關(guān)的抗磷脂綜合征中發(fā)現(xiàn)的促血栓形成的抗心磷脂抗體(Burtonetal，Science266:1024-1027(1994))相似，測試兩種mab的狼瘡抗凝活性，以及與凝血酶原(prothombin,PT)、(32糖蛋白-1、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)結(jié)合的能力(Robinsonetal，AIDSRes.HumanRetroviral.6:567(1990))。然而2F5對于這些反應(yīng)性為陰性；4E10具有狼瘡抗凝活性，并與PS、PC、PE呈強(qiáng)反應(yīng)，與SM和PT呈弱反應(yīng)，而與(32糖蛋白-l的反應(yīng)呈陰性(參見圖3)?？稍谟捎谧陨砻庖呒膊』蚋腥緦?dǎo)致的免疫調(diào)節(jié)混亂的患者中發(fā)現(xiàn)抗心磷脂抗體(Burtonetal，Science266:1024-1027(1994))?？剐牧字陨砜贵w可由梅毒、麻風(fēng)、利什曼病、EB病毒和HIV-1所誘導(dǎo)(Burtonetal,Science266:1024-1027(1994))。與在SLE中發(fā)現(xiàn)的抗心磷脂抗體不同，"感染性(infectious)"抗心磷脂抗體幾乎不是促血栓形成的，并且是暫時(shí)的。因此4E10與自身免疫疾病中的抗心磷脂抗體類似，2F5與感染性疾病中的抗心磷脂抗體類似。具有長CDR3長度的自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆通常被刪除或者使之對自身抗原產(chǎn)生耐受性((Zolla-Pazneretal,AIDSRes.HumanRetroviral.20:1254(2004))。因此，HIV-1可能已進(jìn)化至通過具有保守的中和表位作為自身抗體表位的模擬物從而逃避膜近抗體應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)指出目前的HIV-1疫苗不能常規(guī)誘導(dǎo)強(qiáng)的膜近抗包膜中和抗體，這是因?yàn)榘蚁蜻@些表位的抗體源自于以下自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆，該自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆通常被刪除或者使之對HIV-1Env引起的抗原刺激有耐受性。這些觀察結(jié)果也可以解釋在不能刪除這些克隆的SLE患者中幾乎不出現(xiàn)HIV-l(Foxetal,Arth.Rh腿.40:1168(1997》。實(shí)施例2對本發(fā)明的自身抗原誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力進(jìn)行研究，其中采用心磷脂(層狀相和六角相)、l-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-[二氧磷基-L-絲氨酸](POPS)(層狀相和六角相)、l-棕櫚酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)(層狀相)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(六角相)作為自身抗原。用在10叱的oCpG中的磷脂(心磷脂層狀相、心磷脂六角相、POPS層狀相、POPS六角相、POPE層狀相或者DOPE六角相)對豚鼠(每組4只)進(jìn)行4次免疫，每次免疫之間間隔2周。在所述四次磷脂免疫之后，用10嗎oCpG禾n100嗎M組共有Env，CON-Sgpl40CFI寡聚體(即，在圖4A中顯示的蛋白的CFI形式)通過腹膜內(nèi)(IP)進(jìn)行最后一次免疫。采用在TMZ細(xì)胞中的Env假模擬本中和分析進(jìn)行中和分析(Weietal，Nature422:307-312(2003),Derdeynetal,JVirol74:8358-8367(2000)，Weietal,AntimicrobAgentsChemother46:1896-1905(2002)，Piattetal,JVirol72:2855-2864(1998),Mascolaetal，J.Virol,79:10103-10107(2005》，描述如下細(xì)胞培養(yǎng)TZM-bl是粘附細(xì)胞系并保存在T-75培養(yǎng)瓶中。完全生長培養(yǎng)基(GM)由補(bǔ)充有10。/。胎牛血清(FBS，熱失活)和慶大霉素(50fig/ml)的D-MEM構(gòu)成。使用胰蛋白酶/EDTA處理來破壞并移除細(xì)胞單層破壞TZM-bl細(xì)胞單層的胰蛋白酶-EDTA處理當(dāng)為常規(guī)保存拆分細(xì)胞時(shí)以及當(dāng)為分析準(zhǔn)備細(xì)胞時(shí)，采用胰蛋白酶/EDTA處理來破壞和移除保存在T-75培養(yǎng)瓶中匯合成片時(shí)的細(xì)胞單層。1.輕輕倒出培養(yǎng)基，通過使用6ml的無菌PBS沖洗單層移除殘留的血清。2.緩慢加入2.5ml的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液以覆蓋所述細(xì)胞單層。在室溫溫育3045秒。輕輕倒出所述胰蛋白酶溶液并在37t:溫育4分鐘。在等待細(xì)胞分離時(shí)不要通過碰擊或者晃動(dòng)燒瓶來攪動(dòng)細(xì)胞。3.加入10ml的GM并通過輕柔的吸打動(dòng)作(pipetaction)使細(xì)胞懸浮。對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。4.用15ml的GM中的約106個(gè)細(xì)胞在新的T-75培養(yǎng)瓶中接種。培養(yǎng)物在37°C，5%002/95%空氣環(huán)境中溫育。應(yīng)當(dāng)約每3天拆分一次細(xì)胞。病毒存樣可在PBMC或者T細(xì)胞系中制備未克隆病毒的存樣?？赏ㄟ^在合適的細(xì)胞類型，如293T細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染來制造假病毒。通過低速離心和過濾(0.45微米)使所有病毒存樣不含有細(xì)胞并在-8(TC保存在含有20%FBS的GM中。TCID50測量在進(jìn)行中和試驗(yàn)前，必須確定每個(gè)病毒存樣在TZM-bl細(xì)胞中的單循環(huán)感染試驗(yàn)(2天溫育)中的TCID50。當(dāng)在TCID50試驗(yàn)中定量陽性感染時(shí)，采用2.5倍背景RLU作為截留值。在中和試驗(yàn)中過多的病毒可導(dǎo)致很強(qiáng)的病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)，這將干擾準(zhǔn)確的測量。大多數(shù)病毒存樣必須稀釋至少IO倍以避免殺死細(xì)胞。選擇200TCID50的標(biāo)準(zhǔn)接種物用于所述中和試驗(yàn)以使病毒誘導(dǎo)細(xì)胞病變效應(yīng)最小，同時(shí)保持測量病毒感染性的2-log減少的能力。應(yīng)當(dāng)注意的是不同菌株之間的致細(xì)胞病變性差異巨大?？稍诠鈱W(xué)顯微鏡下視覺觀察合胞體的形成來監(jiān)測病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)。也可在TCID50試驗(yàn)中在高病毒劑量下由發(fā)光減少來觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)。中和抗體試驗(yàn)方案注l:除非特別指明，所有溫育在濕潤的37'C，5%(302溫育器中進(jìn)行。注2:在含有1pM茚地那韋的DEAE-GM中進(jìn)行具有復(fù)制能力的病毒的化驗(yàn)。1.采用96孔平底培養(yǎng)板的形式，將150^的GM放入列l(wèi)(細(xì)胞對照)的所有孔中。將100pl放入列211(列2為病毒對照)的所有孔中。將40^再放入列312，行H的所有孔中(以接受測試樣品)。2.將11測試樣品加入到列3&4，行H的每個(gè)孔中。將11^第二測試樣品加入到列5&6，行H的每個(gè)孔中。將11^tl第三測試樣品加入到列7&8，行H的每個(gè)孔中。將11^第四測試樣品加入到列9&10，行H的每個(gè)孔中。將ll^d第五測試樣品加入到列l(wèi)l&12，行H的每個(gè)孔中。混合行H中的樣品并轉(zhuǎn)移50^d至行G。重復(fù)轉(zhuǎn)移并稀釋樣品直至行A(這是系列3倍稀釋液)。在最終轉(zhuǎn)移和混合完成后，從列312，行A的孔中棄去50pl至消毒劑廢物容器中。3.將所需數(shù)量的病毒小瓶放置在周圍環(huán)境溫度水浴中解凍。當(dāng)完全解凍后，在GM中稀釋所述病毒以獲得4,000TCID5。/ml的濃度。應(yīng)預(yù)先制備不含細(xì)胞的病毒存樣并冷凍儲(chǔ)藏在約1ml工作等分樣中。4.向列212，行AH的所有孔中分加50pl的不含細(xì)胞的病毒(200TCID5Q)。在每次轉(zhuǎn)移后用通過吸打動(dòng)作進(jìn)行混合。在每次轉(zhuǎn)移間在含有40ml無菌PBS的試劑儲(chǔ)罐中沖洗移液槍槍頭以避免粘附攜帶至下一次。5.將板覆蓋并溫育1小時(shí)。6.在含有DEAE葡聚糖的GM(37.5ng/ml)中以1X1()5細(xì)胞/ml的密度準(zhǔn)備TZM-bl細(xì)胞的懸浮液(在使用前用胰蛋白酶處理約1015分鐘)。向列112，行AH的各孔中分加100|dl的細(xì)胞懸浮液(每孔中10,000個(gè)細(xì)胞)。在每次轉(zhuǎn)移間在裝有無菌PBS的試劑儲(chǔ)罐中沖洗移液槍槍頭以避免粘附攜帶至下一次。DEAE葡聚糖的最終濃度是15pg/ml。7.將板覆蓋并溫育48小時(shí)。8.從每個(gè)孔中移去150^的培養(yǎng)基，留下約100^。向每個(gè)孔中分加100pl的BrightGk)TM試劑。在室溫下溫育2分鐘以使細(xì)胞裂解完全。通過吸打動(dòng)作進(jìn)行混合(至少兩下)并轉(zhuǎn)移150^至相應(yīng)的96孔黑色平板中。立即在照度計(jì)下對所述平板進(jìn)行讀數(shù)。9.中和百分比可如下確定，即計(jì)算測試孔(細(xì)胞+血清樣品+病毒)和細(xì)胞對照孔(僅有細(xì)胞，列l(wèi))之間的平均RLU的差值，將該結(jié)果除以病毒對照(細(xì)胞+病毒，列2)和細(xì)胞對照孔(列l(wèi))之間的平均RLU的差值，將其從1中減去然后乘以100。中和抗體滴度表示為將RLU減少50%所需的血清稀釋度的倒數(shù)。如圖5所示，接受DOPE(六角相)的動(dòng)物具有170的中和滴度。實(shí)施例3免疫原設(shè)計(jì)分別包含mAb2F5和4E10的標(biāo)稱表位(與疏水接頭(GTH1)相連)的肽序列經(jīng)過合成并包埋在合成脂質(zhì)體中(圖6)。第一代免疫原經(jīng)設(shè)計(jì)在所述脂質(zhì)雙層的遠(yuǎn)端具有2F5和4E10表位序列(圖6A)。這些構(gòu)建體使mAb不受限制地接近其相應(yīng)的表位。第二代構(gòu)建體經(jīng)設(shè)計(jì)以模擬所述MPER區(qū)域的天然取向，其中2F5和4E10mAb表位序列與疏水接頭緊鄰相連(圖6A、6B)。所述合成脂質(zhì)體的組合物包括以下溶解在氯仿中的磷脂POPC(1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)、POPE(l-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)、DMPA(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸酉旨)和膽固醇(購自AvantiPolarLipids(Alabaster,AL).)。通過在耐氯仿的試管中放入適當(dāng)摩爾量的磷脂(POPC:POPE:DMPA:Ch:45:25:20:10)制備合成脂質(zhì)體。通過渦旋來混合所述磷脂，然后在通風(fēng)櫥中平緩的氮?dú)饬飨赂稍锼龌旌衔?。在高真空下存放所述脂質(zhì)(15小時(shí))以除去任何殘留的氯仿。加入PBS或者TBS緩沖液(pH7.4)制得磷脂的水性懸浮液，并在37"C溫育1030分鐘，伴隨間歇的猛烈渦旋以使所述磷脂重懸浮。然后在浴式超聲波儀(MisonixSonicator3000,MisonixInc.,Farmingdale,NY)中超聲波處理磷脂的乳狀均勻懸浮液。所述超聲波儀經(jīng)設(shè)定運(yùn)行3個(gè)連續(xù)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的總超聲處理為45秒。每個(gè)循環(huán)包括5秒的超聲波脈沖(70瓦功率輸出)，隨后12秒的無脈沖時(shí)期。在超聲處理結(jié)束后，將所述層狀脂質(zhì)體的懸浮液保存在4"C。將HIV-1MPER肽GTH1-2F5和GTH1-4E10(圖6)溶解在70%氯仿、30%甲醇中。將脂質(zhì)的氯仿溶液加入到所述肽溶液中，摩爾比為45:25:20:10(POPC:POPE:DMPA:膽固醇)。每種肽加入的比例為肽:總磷脂=1:420。如上所述將所述混合物渦旋，然后干燥和重懸浮。在BAcoreLl傳感器芯片上俘獲所述脂質(zhì)體之后進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)以測試mAb與每種肽-脂質(zhì)偶聯(lián)物結(jié)合的特異性，所述BAcoreLl傳感器芯片借助疏水接頭固定脂質(zhì)雙層。將2F5、4E10和對照mAb(A32或17b)注射到或者附有合成脂質(zhì)體或者附有肽-脂質(zhì)偶聯(lián)物的各傳感器表面上，并在BIAcore3000儀器上監(jiān)測所述結(jié)合(圖8-11)。免疫策略所述免疫策略加入了能暫時(shí)破壞耐受性的方案。所述程序涉及使用oCpG(用于破壞小鼠中對于產(chǎn)生抗dsDNA抗體的耐受性的TLR9配體)(Tranetal,Clin.Immunol.109(3):278-287(2003))。所述肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物與佐劑(Emulsigen和oCpG)混合(l:l)。通過混合375pl的Emulsigen，250|il的oCpG和625pi的鹽水制備混有佐劑(2X)的Emulsigen。以21天的時(shí)間間隔，每只豚鼠或者僅用250嗎的肽，或者用具有相同量的肽的肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物進(jìn)行免疫。在第一次免疫前以及隨后的每次免疫前采集血清樣品作為預(yù)取血血樣。用ELISA試驗(yàn)(圖12)分析血清樣品與肽表位的結(jié)合以及病毒中和試驗(yàn)(表2)。圖12中的數(shù)據(jù)顯示來自用GTH1-4E10脂質(zhì)體免疫的兩只豚鼠的血清與4E10肽的強(qiáng)反應(yīng)性，而在來自于用4E10肽免疫的動(dòng)物的血清中僅觀察到低水平的反應(yīng)性。兩個(gè)陽性血清均能中和HIV-1MN株(表2)。表2.在用4E10肽-脂質(zhì)體免疫的豚鼠中誘導(dǎo)中和抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物在檢測抗原特異性B細(xì)胞應(yīng)答中的應(yīng)用上述肽-脂質(zhì)體偶聯(lián)物已被用作用于檢測MPER特異性B細(xì)胞應(yīng)答的試劑。所述肽-脂質(zhì)體構(gòu)建體(2F5和4E10)通過在脂質(zhì)組合物中加入熒光素-POPE而與熒光素偶聯(lián)。所述熒光素-POPE與未偶聯(lián)的POPE以45:55的比例混合，然后按上述的摩爾比例與剩下的脂質(zhì)混合。在BIAcore結(jié)合試驗(yàn)中，熒光素偶聯(lián)的2F5和4E10-肽-脂質(zhì)體均保持了它們與其相應(yīng)的mAb結(jié)合的特異性(圖11)。所有以上引用的文獻(xiàn)和其他信息來源在此以參考的方式整體引入。權(quán)利要求1.一種在患者中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體的方法，該方法包括向有需要的患者施用至少一種與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性的自身抗原，所述自身抗原的施用量足以實(shí)現(xiàn)所述誘導(dǎo)。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述自身抗原是誘導(dǎo)產(chǎn)生所述抗體的心磷脂、SS-A/RO、雙鏈(ds)DNA、著絲粒B蛋白或RiBo核蛋白(RNP)，或它們的片段。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述自身抗原是誘導(dǎo)產(chǎn)生所述抗體的心磷脂或其片段。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體與gp41膜近外側(cè)區(qū)域(MPER)表位相結(jié)合。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述MPER表位包含序列NWFDIT或ELDKWA。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括向所述患者施用含有與所述自身抗原具有交叉反應(yīng)性的表位的HIV包膜蛋白、多肽或肽。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中編碼所述HIV蛋白、多肽或肽的DNA序列在以下條件下施用，所述條件使得所述DNA序列得以表達(dá)并由此在所述患者中產(chǎn)生所述HIV蛋白、多肽或肽。8.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括向所述患者施用破壞對所述自身抗原的耐受性的佐劑。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述佐劑包含TRL9激動(dòng)劑。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述TRL9激動(dòng)劑包含CpG寡核苷酸。11.一種的組合物，該組合物含有與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性的自身抗原和破壞對所述自身抗原的耐受性的物質(zhì)。12.如權(quán)利要求ll所述的組合物，其中所述自身抗原是含有與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性的表位的心磷脂、SS-A/RO、雙鏈DNA、著絲粒B蛋白或RiB0核蛋白，或它們的片段。13.如權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述物質(zhì)是TRL9激動(dòng)劑。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述TRL9激動(dòng)劑包含CpG寡核苷酸。15.—種產(chǎn)生與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性的自身抗體的方法，該方法包括從以下患者分離B細(xì)胞，并由其建立產(chǎn)生所述自身抗體的永生細(xì)胞系，所述患者為患有原發(fā)性自身免疫疾病的患者或者患有選自由梅毒、利什曼病和麻風(fēng)組成的組中的感染性疾病的非HIV感染患者。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述患者是HIV感染的或者已接受基于包膜的HIV疫苗的原發(fā)性自身免疫患者。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成產(chǎn)生所述自身抗體的雜交瘤。18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述患者是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者、抗磷脂抗體綜合征患者或患有選自由梅毒、利什曼病和麻風(fēng)組成的組中的感染性疾病的非HIV感染患者。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述患者是HIV感染的或者已接受基于包膜的HIV疫苗的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者，或者所述患者是己接受基于包膜的HIV疫苗的患有選自由梅毒、利什曼病和麻風(fēng)組成的組巾的感染性疾病的非HIV感染患者。20."種在患者中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HIV抗體的方法，該方法包括向有需要的患者施用至少一種與HIV病毒顆粒具有交叉反應(yīng)性的自身抗原，所述自身抗原的施用量足以實(shí)現(xiàn)所述誘導(dǎo)。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述自身抗原是磷脂或其衍生22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述磷脂是心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇或鞘磷脂，或者它們的衍生物。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(六角相)。24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述自身抗原與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性。25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述自身抗原是含有與HIV病毒顆粒具有交叉反應(yīng)性的表位的著絲粒F蛋白或其片段。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述自身抗原與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性。27.—種組合物，該組合物含有與HIV病毒顆粒具有交叉反應(yīng)性的自身抗原和破壞對所述自身抗原的耐受性的物質(zhì)。28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述自身抗原是磷脂或其衍生物。29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述磷脂是心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇或鞘磷脂，或者它們的衍生物。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(六角相)。31.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述自身抗原與HIV包膜具有交叉反應(yīng)性。32.如權(quán)利要求1或20所述的方法，其中所述患者沒有感染HIV。33.—種在患者中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HIV抗體的方法，該方法包括向有需要的患者施用其量足以實(shí)現(xiàn)所述誘導(dǎo)的至少一種脂質(zhì)體-肽偶聯(lián)物，其中所述肽含有膜近外側(cè)區(qū)域(MPER)表位。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述肽包含序列ELDKWAS或WFNITNW。35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述脂質(zhì)體-肽偶聯(lián)物包含疏水接頭。36.含有包埋在脂質(zhì)體中的MPER表位的免疫原。37.如權(quán)利要求36所述的免疫原，該免疫原與可檢測標(biāo)記結(jié)合。全文摘要本發(fā)明大體上涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)，具體而言，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)HIV中和抗體的方法以及適用于所述方法的化合物和組合物。文檔編號(hào)A61K39/385GK101588813SQ200680016184公開日2009年11月25日申請日期2006年4月12日優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日發(fā)明者巴頓·F·海恩斯,廖化新,穆尼爾·S·阿拉姆申請人:杜克大學(xué)