專利名稱：與抗原相結(jié)合的腸細菌OmpA蛋白用于產(chǎn)生抗病毒、抗寄生蟲、或抗腫瘤的細胞毒性應(yīng)答的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸細菌，特別是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)OmpA膜蛋白，與一種抗原或半抗原相結(jié)合，用于制備旨在產(chǎn)生或增強針對傳染性因子或腫瘤細胞的細胞毒性T應(yīng)答的藥物組合物的用途。本發(fā)明包括這些化合物用于預(yù)防和治療感染或癌癥，特別是與腫瘤抗原相關(guān)的癌癥(諸如黑素瘤)的用途，以及包含一些這類化合物的藥物組合物。
接種疫苗是預(yù)防或治療病毒或細菌感染的有效方法。接種疫苗運動在這些領(lǐng)域的成功使之有可能將至今在傳染病學(xué)領(lǐng)域中使用的疫苗概念延伸到癌癥和自身免疫疾病領(lǐng)域。單獨施用于宿主的疫苗抗原的免疫原性常常不足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因此必需與佐劑相伴或與載體蛋白偶聯(lián)來誘導(dǎo)(或增強)免疫原性。在這些條件下，只能誘導(dǎo)體液類型的免疫應(yīng)答。現(xiàn)在，在抗病毒治療的過程中，產(chǎn)生能夠識別并消滅病毒的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是極其重要的(Bachmann等人，1994，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)242228-2236；P.Borrow，1997，病毒性肝炎雜志(J.Virol.Hepat.)416-24)，正如許多研究證明的，在體內(nèi)顯示針對病毒表位的應(yīng)答的保護性作用(A.M.Arvin，1992，傳染病雜志(J.Inf.Dis.)166S35-S41；Koszinowski等人，1987，免疫學(xué)通訊(Immunol.Lett.)16185-192)。
CTL應(yīng)答的重要性在抗腫瘤應(yīng)答中同樣獲得了證明，特別是針對黑素瘤細胞的應(yīng)答(回顧見Rivoltini等人，1998，免疫學(xué)評論性回顧(Crit.Rev.Immunol.)1855-63)。已經(jīng)定義了數(shù)種抗原的CTL表位(與I型分子相互作用并呈遞給CD8+T淋巴細胞的肽序列)。然而，困難在于在體內(nèi)產(chǎn)生CTL，因為這些肽的免疫原性是微弱的(Melief，1992，癌癥研究進展(Adv.Cancer Res.)58143-175；Nandaz和Sercaz，1995，細胞(Cell)8213-17)。
因此，研究針對鑒定使之有可能誘導(dǎo)CTL的新的佐劑或抗原遞送系統(tǒng)。由于它們在呈遞抗原和刺激免疫系統(tǒng)、樹突細胞中的有效性，例如已經(jīng)用于產(chǎn)生抗病毒CTL應(yīng)答(B.Ludewig等人，1998，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)723812-3818；P.Brossard等人，1997，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1583270-3276)或抗癌CTL應(yīng)答(F.O.Nestle等人，1998，自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)4328-332)。這些方法在于，給樹突細胞離體裝載感興趣的抗原(肽或溶胞產(chǎn)物)，并將這些細胞重新移植到患者體內(nèi)。其它方法在于，用編碼感興趣抗原的基因離體轉(zhuǎn)染樹突細胞，并重新注射這些經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞(E.Gilboa等人，1998，癌癥免疫學(xué)免疫療法(Cancer Immunol.Immunother.)4682-87)。這些方法已經(jīng)成功的用于小鼠和最近用于人(F.J.Hsu等人，1996，自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)252-58)，但是由于細胞必需進行離體處理(細胞轉(zhuǎn)化或抗原內(nèi)化)并移植到宿主生物體內(nèi)，因而仍然是復(fù)雜的。相似的，使用病毒型顆粒(G.T.Layton等人，1993，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1511097-1107)或不完全弗氏佐劑(IFA)(Valmori等人，1994，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)241458-1462)使之有可能產(chǎn)生CTL應(yīng)答。然而，使用對應(yīng)于CTL表位的肽進行的抗病毒或抗腫瘤免疫當存在這種佐劑時可能導(dǎo)致特異性耐受狀態(tài)，這可能在某些情況中產(chǎn)生與期望相反的效果，即免疫應(yīng)答降低(Toes等人，1996，美國國家科學(xué)院進展(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)93，7855-7860)。
由此，現(xiàn)在非常需要當與分子(特別是抗原或半抗原)相結(jié)合時能夠產(chǎn)生針對所述分子的CTL的化合物。這種化合物能夠(特別是)用于制備旨在誘導(dǎo)抗病毒、抗細菌、抗真菌、抗寄生蟲、或抗腫瘤的CTL類型的免疫保護的免疫組合物。
令人驚訝的是，已經(jīng)證明革蘭氏陰性細菌外膜蛋白，特別是腸細菌OmpA蛋白，諸如肺炎克雷伯氏菌P40蛋白(WO95/27787和WO96/14415中描述的蛋白質(zhì))，具有引發(fā)針對與之共價或非共價結(jié)合的分子的CTL應(yīng)答的特性，優(yōu)選不需加入另一種佐劑。
由此，本發(fā)明涉及腸細菌OmpA蛋白或其片段或者編碼所述OmpA蛋白的核酸序列或其片段，用于制備旨在在體外或體內(nèi)(優(yōu)選體內(nèi))產(chǎn)生或增強針對傳染性因子或腫瘤細胞的細胞毒性T應(yīng)答的藥物組合物的用途和用于制備旨在產(chǎn)生或增強所述細胞毒性T應(yīng)答的藥物組合物的用途。
在本發(fā)明中，術(shù)語“蛋白質(zhì)”旨在表示肽或多肽，術(shù)語“OmpA”(“外膜蛋白”)旨在表示A型外膜蛋白。
表述“OmpA蛋白片段”旨在表示(特別是)OmpA蛋白氨基酸序列所含的任何氨基酸序列片段，當其與傳染性因子或腫瘤細胞特異的抗原或半抗原相結(jié)合時，能夠產(chǎn)生或增強針對所述感染性因子或所述腫瘤細胞的細胞毒性T應(yīng)答，該OmpA蛋白片段包含至少5個氨基酸，優(yōu)選至少10個氨基酸，或更優(yōu)選至少15個氨基酸。
表述“傳染性因子或腫瘤細胞特異的抗原或半抗原”旨在表示(特別是)傳染性因子(諸如病毒、細菌、酵母、真菌、或寄生蟲)或腫瘤細胞表達的任何化合物或其結(jié)構(gòu)類似物，其單獨或與免疫佐劑相結(jié)合時能夠誘導(dǎo)對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞特異的免疫應(yīng)答。
在此描述中，表述“抗原或半抗原的類似物”旨在表述(特別是)與所述抗原或半抗原具有結(jié)構(gòu)相似性、能夠在預(yù)先用所述相似化合物免疫的生物體內(nèi)誘導(dǎo)針對所述抗原或半抗原的免疫應(yīng)答的化合物。
本發(fā)明的一個主題是本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述藥物組合物還包含與所述腸細菌OmpA蛋白相結(jié)合的、對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞特異的抗原或半抗原。
優(yōu)選的，本發(fā)明包括本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述傳染性因子是病毒顆粒、細菌、酵母、真菌、或寄生蟲。
在一個特定實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明中要求保護的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述腸細菌的培養(yǎng)物獲得。
用于提取細菌膜蛋白的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是知道的，因而在此描述中將不再詳述。例如，可能會提及Haeuw J.H.等人(1998，歐洲生化雜志(Eur.J.Biochem.)255446-454)描述的提取方法，但是不受其限制。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還包括本發(fā)明中要求保護的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段通過重組途徑獲得。
用于制備重組蛋白的方法在當今對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，因而在此描述中將不再詳述；然而，可以參照實施例中描述的方法。在可能用于產(chǎn)生這些重組蛋白的細胞中，當然應(yīng)當提及細菌細胞(P.O.Olins和S.C.Lee，1993，大腸桿菌中異源基因表達的最新進展，生物技術(shù)中的現(xiàn)行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4520-525)、酵母細胞(R.G.Buckholz，1993，用于表達異源基因產(chǎn)物的酵母系統(tǒng)，生物技術(shù)中的現(xiàn)行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4538-542)、動物細胞特別是哺乳動物細胞培養(yǎng)物(C.P.Edwards和A.Aruffo，1993，基于COS細胞的瞬時表達系統(tǒng)的現(xiàn)行應(yīng)用，生物技術(shù)中的現(xiàn)行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4558-563)、和昆蟲細胞，用于昆蟲細胞的方法可能采用例如桿狀病毒(V.A.Luckow，1993，用于表達人類基因產(chǎn)物的桿狀病毒系統(tǒng)，生物技術(shù)中的現(xiàn)行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4564-572)。
完全優(yōu)選的是，本發(fā)明中要求保護的用途的其特征在于所述腸細菌是肺炎克雷伯氏菌。
本發(fā)明特別涉及本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述肺炎克雷伯氏菌OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)優(yōu)化比對后，與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列，優(yōu)選90％和95％；或c)如a)中定義的序列的至少5個氨基酸的片段的氨基酸序列片段，優(yōu)選10、15、20、和25個氨基酸。
表述“優(yōu)化比對后，與給定的核酸或氨基酸序列具有至少80％同源性的核酸或氨基酸序列”旨在表示與所述給定序列優(yōu)化比對后包含與所述給定序列具有至少80％百分率同一性的序列。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語兩種核酸或氨基酸序列之間的“百分率同一性”旨在表示優(yōu)化比對后獲得的所比較的兩種序列之間相同核苷酸或氨基酸殘基的百分率，該百分率完全是統(tǒng)計學(xué)的，兩種序列之間的差異隨機分布且包含于其全長。兩種核酸或氨基酸序列之間的序列比較通常通過將這些序列優(yōu)化比對后比較來進行，所述比較通過片段或通過“比較窗”來進行，從而鑒定并比較局部區(qū)域的序列相似性。除了手工操作，用于比較的序列優(yōu)化比對可以通過Smith和Waterman(1981，應(yīng)用數(shù)學(xué)進展(Ad.APP.Math.)2482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443)的局部同源性算法、Pearson和LipmaN(1988，美國國家科學(xué)院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444)的相似性搜索方法、使用這些算法的計算機軟件(威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，或者BLASTN或BLASTP比較軟件)產(chǎn)生。
兩種核酸或氨基酸序列之間的百分率同一性通過比較經(jīng)比較窗優(yōu)化比對的這兩種序列來測定，待比較的核酸或氨基酸序列在比較窗中的區(qū)域相對于用于這兩種序列間優(yōu)化比對的參考序列可能包含添加或刪除。百分率同一性的計算方法是，測定兩種序列之間核苷酸或氨基酸殘基相同的同一位置的數(shù)目，將此同一位置數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)目，并將得數(shù)乘以100，從而獲得這兩種序列之間的百分率同一性。
例如，可以利用BLAST程序“BLAST2 sequences”，可以由站點http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html獲得，所用參數(shù)為缺省值(特別是“開放缺口罰”參數(shù)5和“延伸缺口罰”參數(shù)2；所選矩陣是例如由程序提供的“BLOSUM62”矩陣)，待比較的兩種序列之間的百分率同一性由程序直接計算。
在所述與參考OmpA序列具有至少80％同源性的序列中，優(yōu)選能夠誘導(dǎo)特異針對與之相結(jié)合的抗原或半抗原的CTL活性的肽序列，或其編碼序列，例如，CTL活性用途下文實施例中所述標準技術(shù)來測量。
本發(fā)明還包括本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述抗原或半抗原選自蛋白質(zhì)、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂類、或能夠特異誘導(dǎo)針對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞的CTL應(yīng)答的任何化合物。
本發(fā)明的一個主題是本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)或混合。
本發(fā)明還包括本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述抗原或半抗原通過共價連接(特別是化學(xué)偶聯(lián))與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)。
在特定實施方案中，本發(fā)明中要求保護的用途的其特征在于在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中導(dǎo)入一種或多種連接元件，從而有助于化學(xué)偶聯(lián)；所述導(dǎo)入的連接元件優(yōu)選氨基酸。
如本發(fā)明中要求的，可導(dǎo)入一種或多種連接元件，特別是氨基酸，從而有助于OmpA蛋白或其片段與所述抗原或半抗原之間的偶聯(lián)反應(yīng)。如本發(fā)明中要求的，OmpA蛋白或其片段與所述抗原或半抗原之間的共價偶聯(lián)可能在OmpA蛋白或其片段的N或C末端進行。能夠進行這種偶聯(lián)的雙功能試劑將由選擇用來進行偶聯(lián)的OmpA蛋白或其片段的末端和待偶聯(lián)的所述抗原或半抗原的本性來確定。
在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明中要求保護的用途的其特征在于當所述抗原或半抗原的本質(zhì)是肽時，所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段之間的偶聯(lián)通過基因重組產(chǎn)生。
由與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)衍生的綴合物可以通過基因重組制備。嵌合或雜合蛋白(綴合物)可以使用重組DNA技術(shù)，通過在編碼所述OmpA蛋白或其片段的DNA序列中插入或添加編碼其本質(zhì)是肽的所述抗原或半抗原的序列而產(chǎn)生。
用于合成雜合分子的方法包括在基因工程中用于構(gòu)建編碼期望多肽序列的雜合多核苷酸的方法。有利的是，例如可以參考由D.V.Goeddel(1990，基因表達技術(shù)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)1853-187)描述的用于獲得編碼融合蛋白的基因的技術(shù)。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于藥物組合物包含編碼所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物，或包含含編碼所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物的載體，或包含所述核酸構(gòu)建物、能夠表達所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞。
本發(fā)明還包括本發(fā)明中要求保護的用途，用于制備旨在消除傳染性因子或抑制腫瘤生長的藥物組合物。
優(yōu)選的是，本發(fā)明中要求保護的用途涉及旨在預(yù)防或治療傳染病或癌癥的藥物組合物的制備，優(yōu)選與腫瘤抗原相關(guān)的癌癥。
在腫瘤表達相關(guān)腫瘤抗原、可以用本發(fā)明中要求保護的用途預(yù)防或治療的癌癥中，可能特別提及(但是不受其限制)·乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、和胃癌(Kawashima等人，1999，癌癥研究(Cancer Res.)59431-435)；·間皮瘤、骨肉瘤、腦癌(Xie等人，1999，國家癌癥學(xué)會會刊(J.Natl.Cancer.Inst.)91169-175)；·黑素瘤(Zheuten等人，1998，Bratilsl.Lek.Listy 99426-434)；·胰囊腺瘤(Hammel等人，1998，歐洲胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志(Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.)10345-348)；·結(jié)腸直腸癌(Ogura等人，1998，抗癌研究(Anticancer Res.)183669-3675)；·腎細胞癌(Jantzer等人，1998，癌癥研究(Cancer Res.)583078-3086)；和·卵巢和宮頸癌(Sonoda等人，1996，癌癥(Cancer)771501-1509)。
本發(fā)明的一個主題特別是本發(fā)明中要求保護的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，用于制備旨在預(yù)防或治療傳染病(特別是病毒、細菌、真菌、或寄生蟲起源)或癌癥(優(yōu)選與腫瘤抗原相關(guān)的，特別是黑素瘤)的藥物免疫組合物。
本發(fā)明還包括本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述藥物組合物的裝載形式使之可改進其穩(wěn)定性和/或其免疫原性，特別是呈脂質(zhì)體的形式。
優(yōu)選的是，本發(fā)明包括本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述載體是包含編碼所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物的病毒載體，或能夠表達所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞。
本發(fā)明還包括本發(fā)明中要求保護的用途，其特征在于所述核酸構(gòu)建物、或包含于所述載體或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞中的核酸構(gòu)建物，所含核酸序列選自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15個連續(xù)核苷酸(優(yōu)選20、25、30、40、和50個連續(xù)核苷酸)的片段、或與所述序列之一優(yōu)化比對后具有至少80％(優(yōu)選90％和95％)同源性的序列。
另一方面，本發(fā)明包括上文中本發(fā)明要求保護的用途中定義的藥物組合物。
在這些藥物組合物中，優(yōu)選藥物組合物的其特征在于，在制藥學(xué)可接受介質(zhì)中包含至少一種腸細菌OmpA蛋白或其片段，其通過混合或偶聯(lián)與至少一種腫瘤細胞相關(guān)或特異的抗原或半抗原相結(jié)合。
為了本發(fā)明的目的，制藥學(xué)可接受介質(zhì)是本發(fā)明化合物在其中施用的介質(zhì)，優(yōu)選能夠給人注射的介質(zhì)。它可由水、水性鹽溶液、或基于右旋糖和/或甘油的水溶液組成。
在特定實施方案中，本發(fā)明中要求保護的組合物還包含去污劑。
本發(fā)明中要求保護的組合物還可以包含去污劑，特別是任何形式的制藥學(xué)可接受的表面活性劑，諸如例如陰離子、陽離子、非離子、或兩性表面活性劑。優(yōu)選使用去污劑Zwittergent3-12和辛基吡喃葡糖苷，甚至更優(yōu)選Zwittergent3-14。
優(yōu)選的是，本發(fā)明中要求保護的藥物組合物的其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述腸細菌的培養(yǎng)物或者通過重組途徑獲得。
再次優(yōu)選的是，本發(fā)明中要求保護的藥物組合物的其特征在于所述腸細菌是肺炎克雷伯氏菌。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明中要求保護的組合物，其特征在于所述OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)如a)中定義的序列的至少5個氨基酸的片段的氨基酸序列片段，優(yōu)選10、15、20、和25個氨基酸。
在作為本發(fā)明中要求保護的組合物的一部分的抗原或半抗原之中，優(yōu)選選自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂類、或能夠特異性引發(fā)針對腫瘤細胞的CTL應(yīng)答的任何化合物。
在同等優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明中要求保護的組合物，其特征在于所述抗原或半抗原通過共價連接與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)，特別是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的偶聯(lián)，可以在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中適當導(dǎo)入一種或多種連接元件，諸如氨基酸，從而有助于所述化學(xué)偶聯(lián)。
在同等優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明中要求保護的組合物，其特征在于當所述抗原或半抗原的本質(zhì)是肽(雜合蛋白的表達)時，所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段之間的偶聯(lián)通過基因重組產(chǎn)生。
由此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明中要求保護的組合物，其特征在于藥物組合物包含編碼所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物可能包含于載體或能夠表達所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞之中。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明中要求保護的組合物，其特征在于所述核酸構(gòu)建物所含核酸序列選自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15個連續(xù)核苷酸的片段、或與所述序列之一具有至少80％同源性的序列。
在本發(fā)明要求保護的組合物之中，還優(yōu)選其裝運形式使之可改進其穩(wěn)定性和/或其免疫原性的藥物組合物，特別是呈脂質(zhì)體形式的含編碼所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物的病毒載體，或能夠表達所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞。
在最后一個方面，本發(fā)明中要求保護的組合物的其特征在于，除了所述腸細菌OmpA蛋白或其片段或編碼所述OmpA蛋白或其片段的核酸構(gòu)建物，即本發(fā)明中要求保護的組合物用于誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的特征性成分，它不包含其它用于誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的佐劑。
下文的圖例和實施例旨在例證本發(fā)明，絕非限制其范圍。
圖例

圖1A、1B、1C、和1D效應(yīng)細胞抗MELAN-A和抗TRP-2的CTL活性測量。
在用與3μg rP40混合的50μg hELA(圖1A)、與300μg rP40混合的50μghELA(圖1B)、與rP40偶聯(lián)的50μg hELA(圖1C)、或與300μgrP40混合的TRP-2肽(圖1D)免疫之后，在評估它們殺傷可能經(jīng)相關(guān)肽預(yù)脈沖(長方形)或可能未經(jīng)相關(guān)肽預(yù)脈沖的(菱形)靶細胞的能力之前，用經(jīng)照射和用1μM相關(guān)肽預(yù)脈沖的EL-4 A2/Kb細胞(圖1A、1B、或1C)或EL-4細胞(圖1D)刺激引流淋巴結(jié)細胞。
圖1A-1D的X軸點對應(yīng)于效應(yīng)T細胞(活性淋巴細胞)與靶細胞(EL-4 A2/Kb或EL-4)混合的比率。
圖2A、2B、2C、和2D與由標準免疫方案獲得的CTL活性比較，當存在rP40蛋白時效應(yīng)細胞抗MELAN-A的CTL活性測量。
在單獨用50μg hELA(ELA，圖2A)、與300μg rP40混合的hELA(ELA+P40，圖2B)、與300μg rP40偶聯(lián)的hELA(ELA/P40，圖2C)、或以IFA為佐劑與50μg P30肽混合的hELA(ELA+IFA+TT，圖2D)(IFA指不完全弗氏佐劑，TT指破傷風類毒素)免疫之后，在評估它們殺傷可能經(jīng)hELA肽預(yù)脈沖的(長方形)或可能未經(jīng)hELA肽預(yù)脈沖的(菱形)EL-4A2/Kb靶細胞的能力之前，在體外用經(jīng)照射和用1μM相關(guān)肽預(yù)脈沖的EL-4A2/Kb細胞刺激引流淋巴結(jié)細胞2周。
圖3A、3B、3C、和3D用rP40+TRP-2肽免疫的CTL活性和抗腫瘤效果。
圖3A用TRP-2肽與rP40混合物的免疫誘導(dǎo)對肽特異的CTL應(yīng)答。給C57BL/6小鼠皮下注射與300μg rP40混合的50μgTRP-2肽。10天后，分離淋巴結(jié)并用可能經(jīng)TRP-2肽脈沖的(長方形)或可能未經(jīng)TRP-2肽脈沖的(菱形)經(jīng)照射EL-4細胞再刺激。
圖3B、3C、和3DC57BL/6小鼠接受2×103個B16F10自體黑素瘤細胞，皮下注射至脅腹。同時(圖3B和3D)或4天后(圖3C)，給這些小鼠中的一些(尾基)皮下免疫與300μgrP40混合的50μg TRP-2肽(○)，給其余小鼠單獨免疫P40蛋白(圖3B和3C的■)或TRP-2肽(圖3D的■)。由移植的第18天開始測量腫瘤體積。
圖4A、4B、和4C用與p257-264OVA肽偶聯(lián)的rP40蛋白免疫后抗OVA的CTL活性測量。
C57BL/6小鼠通過尾基皮下注射接受200μg P40-Ova(■)、Ova偶聯(lián)珠(○)、增溶Ova(□)、Ova-BS3(▲)(BS3指二(琥珀酰亞胺基)辛二酸酯)、P40(←)、或DT-Ova(●)(DT指白喉類毒素)。
將用50μg/ml OVA肽(圖4B)脈沖(圖4B)或未脈沖(圖4C)或者用ova基因(E.G7系)轉(zhuǎn)染(圖4A)的ELA胸腺瘤靶細胞于37℃與51Cr一起溫育，并與效應(yīng)細胞一起培養(yǎng)。
實施例實施例1編碼肺炎克雷伯氏菌P40蛋白的基因的克隆通過PCR擴增由肺炎克雷伯氏菌IPI145(Nguyen等人，1998，基因(Gene))基因組DNA獲得編碼P40蛋白的基因。將編碼該基因的基因片段插入多種表達載體，受多種啟動子，特別是Trp操縱子的控制。P40蛋白的核苷酸序列和肽序列分別由下文的序列SEQ ID NO.1和SEQID NO.2表示。用pvaLP40表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12生產(chǎn)菌株。以包涵體的形式生產(chǎn)重組P40蛋白(rP40)，產(chǎn)量相當高(g蛋白質(zhì)/g干生物量大于10％)。
此實施例僅僅是rP40蛋白表達的例示，此例示有可能延伸至其它細菌菌株和其它表達載體。實施例2用于rP40融合蛋白的發(fā)酵的方法在裝有250ml含氨芐青霉素(100μg/ml，Sigma)和四環(huán)素(8μg/ml，Sigma)的TSB(胰胨豆胨培養(yǎng)基，Difco)培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種上述經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株。于37℃溫育過夜后，用200ml此培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐(Biolaffite，法國)中的2L培養(yǎng)基。在相當傳統(tǒng)的方法中，培養(yǎng)物培養(yǎng)基可能包含已知促進高密度細菌細胞生長的添加維生素和/或酵母提取物的化學(xué)試劑。
在發(fā)酵過程中控制的參數(shù)是pH、攪拌、溫度、含氧水平、和混合源(甘油或葡萄糖)的供應(yīng)。一般而言，pH調(diào)至7.0，溫度固定在37℃。通過恒速(12ml/h)供應(yīng)甘油(87％)來控制生長，從而將溶氧張力信號維持在30％。當培養(yǎng)物的混濁度(于580nm測量)達到80時(培養(yǎng)大約24小時后)，通過加入吲哚丙烯酸(IAA)至終濃度25mg/L來處理蛋白質(zhì)生產(chǎn)。誘導(dǎo)大約4小時后，通過離心收獲細胞。獲得的凈生物量為大約200g。實施例3用于提取并純化rP40蛋白的方法提取rP40將培養(yǎng)物離心(4000rpm(轉(zhuǎn)/分)，10min，4℃)后，將細胞重懸于25mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)。用溶菌酶處理(0.5g/L，1h，室溫，溫和攪拌)后獲得不溶性成分即包涵體。將通過離心(15min，10,000rpm，4℃)獲得的包涵體沉淀用含5mM MgCl2的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)吸收，然后離心(15min，10,000rpm)。
將包涵體在含7M尿素(變性劑)和10mM二硫蘇糖醇(還原二硫鍵)的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中于37℃溶解2小時。離心(15min，10,000rpm)使之可消除不溶性顆粒。
然后重懸于13倍體積的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中。將溶液于室溫接觸空氣溫和攪拌過夜(從而通過稀釋和二硫鍵的再氧化促進蛋白質(zhì)復(fù)性)。純化rP40蛋白-陰離子交換層析步驟再次離心后，將溶液用含0.1％Zwittergent3-14(100倍緩沖液體積)的25mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)于4℃透析過夜。
將透析液上樣至用上述緩沖液以線性流速15cm/h平衡的含強陰離子交換劑類載體(Biorad Macro Prop High Q凝膠)的層析柱。于280nm檢測蛋白質(zhì)。用含0.2M NaCl和0.1％Zwittergent3-14的25mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)以線性流速60cm/h洗脫rP40蛋白。-陽離子交換層析步驟合并含rP40蛋白的收集液，并通過超濾濃縮。對于大約100ml體積，借助帶攪拌的Amicon小室系統(tǒng)使用YM10型Diaflo膜(截留閾值10kDa)濃縮；對于較大體積，借助Millipore Minitan切向流過濾系統(tǒng)，使用截留閾值10kDa的膜板濃縮。將由此濃縮的收集液用含0.1％Zwittergent3-14的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0)于4℃透析過夜。
將透析液上樣至用含0.1％Zwittergent3-14的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0)平衡的含強陽離子交換劑類載體(Biorad Macro Prop HighS凝膠)的層析柱。用0.7M NaCl濃度以線性流速61cm/h洗脫rP40蛋白。電泳圖顯示大約95％的純度。通過SDS-PAGE監(jiān)測蛋白質(zhì)狀態(tài)。由肺炎克雷伯氏菌膜提取的P40蛋白根據(jù)其是否變性或呈天然形式而具有特征性電泳(泳動)行為。事實上，天然形式(β-折疊結(jié)構(gòu))的分子量小于由變性劑(諸如尿素或鹽酸胍)作用或存在SDS時于100℃加熱產(chǎn)生的變性形式(α-螺旋結(jié)構(gòu))。不管進行后者時是否存在0.1％(w/v)Zwittergent3-14，rP40蛋白在復(fù)性結(jié)束時不正確復(fù)性。另一方面，用含0.1％(w/v)Zwittergent3-14的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)透析后獲得完全復(fù)性。然而，應(yīng)當注意的是，只有在室溫的稀釋步驟和處理在Zwittergent3-14(不含去污劑陰性結(jié)果)中進行時獲得這種復(fù)性。實施例4CTL的產(chǎn)生為幾種抗原定義了針對黑素瘤細胞的抗腫瘤CTL應(yīng)答。這些抗原包括于下列三類之一a)黑素瘤特異性排異抗原，諸如MAGE家族(由van der Bruggen等人綜述，科學(xué)(Science)2541643)；b)來自正常蛋白質(zhì)突變的抗原。這一組包括MUM-1(Coulie等人，1995，美國國家科學(xué)院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)927976-7980)；CDK4(Wolfel等人，1995，科學(xué)(Science)2961281-1284)；和HLA-A2(Brandel等人，1996，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1832501-2508)；c)黑素瘤和黑素細胞表達的分化抗原。這一組包括酪氨酸酶(Wolfel等人，1994，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)4759和Brichard等人，1996，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)26224)；gp100(Kang等人，1995，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1551343；Cox等人，1994，科學(xué)(Science)264716；和Kawakami等人，1995，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1553961)；gp75(Wang等人，1996，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1831131)；和Mart-1/MelanA(參閱美國專利5,620,886)。
在所有這些抗原中，Mart-1/MelanA似乎是用于免疫治療的最佳候選者，這有幾個原因。首先，該抗原是根據(jù)CTL應(yīng)答鑒定的，所述CTL應(yīng)答是體內(nèi)浸潤黑素瘤的淋巴細胞，不是體外外周血細胞，這說明了該抗原在天然應(yīng)答中的較大相關(guān)性，所述天然應(yīng)答在體內(nèi)是針對黑素瘤的(Kawakami等人，1994，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)180347)。此外，Mart-1/MelanA在所有檢查的黑素瘤上表達，使之成為免疫治療干預(yù)的優(yōu)選靶。最后，由Mart-1/MelanA衍生的肽能夠在患有黑素瘤(表達HLA-A2組織相容性抗原)的患者體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答(Rivoltini等人，1995，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1542257；Valmori等人，1998，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1601750)。
HLA-A2是在高加索人中表達的最常見的等位基因。已經(jīng)為該等位基因定義了Mart-1/MelanA的CTL表位。由大多數(shù)人類CTL系識別的抗原肽包括第27-35位氨基酸AAGIGILTV(Kawakami等人，1994，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)180347)。此外，關(guān)于與HLA-A*0201的結(jié)合親和力和CTL克隆的識別的研究已經(jīng)證明，用于這兩種功能的最佳肽是第26-35位十肽EAAGIGILTV(Romero等人，1997，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1592366)。然而，這些肽在體外(Valmori等人，1998，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1601750)和在體內(nèi)(Jaeger等人，1996，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)66162)似乎免疫原性微弱。
當將Mart-1/MelanA的T表位氨基酸序列與A*0201的肽基序(Rammensee等人，1995，免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics)41178)進行比較時，第26-35位和第27-35位肽似乎在第2位具有非優(yōu)勢錨定殘基，由此微弱結(jié)合HLA-A*0201分子(Kawakami等人，1995，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)154，3961)，這可以解釋其微弱的免疫原性。以編號WO98/58951公開的國際專利申請描述了第26-35位肽的類似物，其中第2位丙氨酸用亮氨酸替代(序列將命名為ELA的序列SEQ IDNO.3)。
用于下文實驗的hELA肽是專利申請WO98/58951的主題，該專利屬于路德維希癌癥研究學(xué)會(Institut Ludwig de Recherche sur leCancer)。hELA是在黑素細胞和黑素瘤上表達的蛋白質(zhì)Melan-A/Mart-1第26-35位十肽(EAAGIGILTV)的類似物。雖然Melan-A/Mart-1第26-35位十肽能夠結(jié)合HLA-A0201分子(Romero等人，1997，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1592366-2374)，但是它在體外和體內(nèi)是微弱的免疫原(Valmori等人，1998，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1601750-1758)。hELA類似物通過用亮氨酸替代Melan-A/Mart-1第26-35位十肽的第2位氨基酸(丙氨酸)來產(chǎn)生。根據(jù)關(guān)于將肽錨定至HLA-A0201分子所需殘基的分析，所述替代在體外導(dǎo)致黑素瘤患者CTL的更有效識別和更好的免疫原性(Valmori等人，1998，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1601750-1758)。將C57B1/6×BDA/s品系的HLA-A*0201/Kb(A2/Kb)轉(zhuǎn)基因小鼠(Vitiello等人，1991，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1731007-1015)用于該研究以測試ELA。在這些小鼠中表達的I型MHC分子是由人類HLA-A0201分子(發(fā)現(xiàn)的最常見的同種異型)的α1和α2結(jié)構(gòu)域和鼠Kb分子的α3結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的嵌合分子。
TRP-2肽的序列SEQ ID NO.4是對應(yīng)于酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)第181-188位氨基酸(VYDFFVWL)的八肽。TRP-2在黑素細胞和黑素瘤中表達。已經(jīng)證明該抗原在C57BL/6(H-2Kb)小鼠中誘導(dǎo)針對黑素瘤提供保護的CTL應(yīng)答(Bloom等人，1997，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)185453-459)。A用與肽(Melan-A或TRP-2類似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A和抗TRP-2的CTL的產(chǎn)生實驗方案A2/Kb小鼠通過尾基皮下注射接受-與3或300μg rP40混合的50μg ELA；-與300μg rP40共價偶聯(lián)的50μg ELA。
C57BL/6小鼠通過尾基皮下注射接受-與300μg rP40混合的50μg TRP-2肽(第181-188位)。細胞毒性效應(yīng)細胞的產(chǎn)生免疫后10天，處死小鼠并由引流淋巴結(jié)回收淋巴細胞，以在體外用相關(guān)肽進行刺激。
將這些淋巴細胞(4-5×106)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μM β-2-巰基乙醇的DMEM中，與2-5×105個經(jīng)照射(10kRad)和經(jīng)脈沖(用1μM相關(guān)肽于37℃ 1h)的EL-4 A2/Kb細胞或ELA細胞一起培養(yǎng)。每周一次刺激2次后，測定細胞的細胞毒性活性。細胞毒性活性的測量將EL-4 A2/Kb細胞或ELA細胞與51Cr在存在或不存在相關(guān)肽的條件下溫育1小時，清洗，然后以多種比率與效應(yīng)細胞一起在96孔板中體積200μl于37℃溫育4-6小時。然后將細胞離心，并在100μl上清液中測量51Cr釋放。如下計算比裂解百分率％比裂解＝(實驗釋放-自發(fā)釋放)/(總釋放-自發(fā)釋放)×100。結(jié)果如圖1A-1D所示，用在與hELA(圖1B)或TRP-2(圖1D)的混合物中的最佳劑量的rP40(300μg)免疫小鼠，誘導(dǎo)強烈的特異性CTL應(yīng)答。在用與hELA偶聯(lián)的rP40(圖1C)免疫后也觀察到這種應(yīng)答。另一方面，單獨用肽或單獨用rP40(結(jié)果未顯示)或者用在與亞最佳劑量rP40(3μg)的混合物中的hELA肽免疫不誘導(dǎo)任何CTL活性(圖1A)。這些結(jié)果證明與免疫原性肽混合或偶聯(lián)的rP40分子使之有可能在不加入佐劑的情況下在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答。B用與肽(Melan-A類似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A的CTL的產(chǎn)生，與標準免疫方案比較實驗方案A2/Kb小鼠接受-50μl IFA(不完全弗氏佐劑)，通過尾基皮下注射；3周后，50μg hELA，同時存在50μg由破傷風類毒素(TT)衍生的輔助T p30肽(Panina-Bordignon等人，1989，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)192237)，以IFA為佐劑。此方案被描述用于產(chǎn)生抗肽CTL(Valmori等人，1994，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)241458)并作為陽性對照使用。-50μg hELA或與50μg hELA混合或偶聯(lián)的300μg rP40。細胞毒性效應(yīng)細胞的產(chǎn)生最終免疫后10天，處死小鼠并由引流淋巴結(jié)回收淋巴細胞，以在體外用相關(guān)肽刺激。
將這些淋巴細胞(4-5×106)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μM β-2-巰基乙醇的DMEM中，與2-5×105個經(jīng)照射(10kRad)和經(jīng)脈沖(用1μM相關(guān)肽于37℃1h)的EL-4 A2/Kb細胞(經(jīng)HLA-A*0201/Kb基因轉(zhuǎn)染的鼠細胞)一起培養(yǎng)。
每周一次刺激1次、2次、或3次后，測定細胞的細胞毒性活性。
根據(jù)上述方法測量細胞毒性活性。結(jié)果用與hELA偶聯(lián)的無佐劑的rP40免疫后，測量到與用hELA+P30/IFA免疫后觀察到的相當?shù)目筯ELA的CTL活性(參照圖2C和2D)。相似的，rP40+hELA肽混合物(其自身也無佐劑的)產(chǎn)生CTL，其方式與用于產(chǎn)生CTL的傳統(tǒng)方案獲得的相似(參照圖2B和2D)。
單獨用肽(參照圖2A)或單獨用rP40蛋白(未顯示)免疫后，無論在哪天刺激效應(yīng)細胞，沒有檢測到CTL活性。實施例5用rP40與小鼠黑素瘤表達的肽的混合物免疫的抗腫瘤效果為了評價rP40產(chǎn)生抗腫瘤CTL應(yīng)答的能力，測試rP40蛋白誘導(dǎo)針對肽序列SEQ ID NO.4(VYDFFVWL)的CTL應(yīng)答的能力。肽序列SEQID NO.4(VYDFFVWL)衍生自酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)，該蛋白質(zhì)由C57BL/6小鼠衍生的B16F10黑素瘤表達。這種肽在這種品系中具有免疫原性。然后測試移植到經(jīng)或未經(jīng)rP40與TRP-2肽混合物免疫的C57BL/6小鼠中的B16F10細胞的生長。實驗方案為了產(chǎn)生抗TRP-2肽的CTL應(yīng)答，使用與實施例4中所述相同的方案，除了在這種情況下使用C57BL/6小鼠。
對于保護實驗，C57BL/6小鼠通過皮下(s.c.)注射至脅腹接受2×103個B16F10自體黑素瘤細胞。同時或4天后，這些小鼠中的一些于尾基皮下免疫與300μg rP40混合的50μg TRP-2肽。然后以規(guī)則間隔測量腫瘤的生長。結(jié)果如圖3A所示，使用TRP-2與rP40蛋白混合物的免疫能夠產(chǎn)生針對這種肽的特異性CTL應(yīng)答，這確認了實施例4中所述用hELA蛋白獲得的結(jié)果。此外，這種CTL應(yīng)答與抑制B16F10黑素瘤的生長有關(guān)(圖3B、3C、和3D)。值得注意的是，這種保護作用不僅在移植腫瘤的同時進行TRP-2肽+rP40免疫時(圖3B和3D)是顯著的，而且在移植4天后進行免疫時(圖3C)同樣顯著。
這些結(jié)果清楚的顯示使用與抗原性腫瘤肽相結(jié)合的腸細菌OmpA蛋白(諸如肺炎克雷伯氏菌OmpA蛋白)用于誘導(dǎo)有效預(yù)防或治療癌癥(諸如黑素瘤)的特異性CTL型應(yīng)答的治療效果。實施例6用與p257-264 Ova肽偶聯(lián)的rP40免疫后抗OVA的CTL的產(chǎn)生Ova肽p257-264是對應(yīng)于卵清蛋白序列第257-265位氨基酸序列(包括末端)的卵清蛋白保守序列片段的八肽。卵清蛋白作為針對表達卵清蛋白的腫瘤細胞提供保護的肽使用。實驗方案C57BL/6小鼠通過尾基皮下注射接受200μg P40-Ova(●)、Ova偶聯(lián)珠(○)、增溶Ova(□)、Ova-BS3(▲)(BS3指二(琥珀酰亞胺基)辛二酸酯)、P40(←)、或DT-Ova(●)(DT指白喉類毒素)。細胞毒性效應(yīng)細胞的產(chǎn)生免疫后7天，處死小鼠并回收脾。將脾細胞(4×107)在燒瓶中在含1.5×106個經(jīng)照射(4kRad)E.G7細胞的DMEM中進行培養(yǎng)。細胞毒性活性的測量將經(jīng)或未經(jīng)OVA肽脈沖或者經(jīng)ova基因(E.G7系)轉(zhuǎn)染的EL-4胸腺瘤細胞或EL4細胞于37℃與51Cr一起溫育并與上文獲得的效應(yīng)細胞一起培養(yǎng)。
如實施例4A所述計算比裂解百分率。結(jié)果如圖4A-4C所示，用與OVA肽偶聯(lián)或混合的rP40蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)強烈的特異性CTL應(yīng)答。這種應(yīng)答與用陽性對照即卵清蛋白偶聯(lián)珠(見圖4A和4B)免疫后觀察到的相似。另一方面，用可溶性卵清蛋白、ova-BS3、和DT-Ova免疫沒有效果。這些結(jié)果證明與免疫原性肽偶聯(lián)的rP40模塊使之可在不加入佐劑的情況下在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.腸細菌OmpA蛋白或其片段用于制備旨在產(chǎn)生或增強針對傳染性因子或腫瘤細胞的細胞毒性T應(yīng)答的藥物組合物的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述藥物組合物還包含與所述腸細菌OmpA蛋白相結(jié)合的、對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞特異的抗原或半抗原。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述傳染性因子是病毒顆粒、細菌、或寄生蟲。
4.權(quán)利要求1-3之一的用途，其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述腸細菌培養(yǎng)物獲得。
5.權(quán)利要求1-3之一的用途，其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段通過重組途徑獲得。
6.權(quán)利要求1-5之一的用途，其特征在于所述腸細菌是肺炎克雷伯氏菌。
7.權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述OpmA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)如a)中定義的序列的至少5個氨基酸的片段的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求2-7之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原選自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂類、或能夠特異性引發(fā)針對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞的CTL應(yīng)答的任何化合物。
9.權(quán)利要求2-8之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)或混合。
10.權(quán)利要求9的用途，其特征在于所述抗原或半抗原通過共價連接與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)。
11.權(quán)利要求10的用途，其特征在于通過共價連接的偶聯(lián)是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的偶聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的用途，其特征在于在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中導(dǎo)入一種或多種連接元件，從而有助于化學(xué)偶聯(lián)。
13.權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述導(dǎo)入的連接元件是氨基酸。
14.權(quán)利要求10的用途，其特征在于當所述抗原或半抗原的本質(zhì)是肽時，所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段之間的偶聯(lián)通過遺傳重組產(chǎn)生。
15.權(quán)利要求14的用途，其特征在于藥物組合物包含編碼所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物。
16.權(quán)利要求15的用途，其特征在于所述核酸構(gòu)建物包含于載體或能夠表達所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞中。
17.權(quán)利要求1-16之一的用途，用于制備旨在消除傳染性因子或抑制腫瘤生長的藥物組合物。
18.權(quán)利要求1-17之一的用途，用于制備旨在預(yù)防或治療包括病毒、細菌、真菌、和寄生蟲感染的傳染性疾病之藥物組合物。
19.權(quán)利要求1-17之一的用途，用于制備旨在預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物。
20.權(quán)利要求19的用途，用于制備旨在預(yù)防或治療與腫瘤抗原相關(guān)的癌癥的藥物組合物。
21.權(quán)利要求19和20的用途，用于制備旨在預(yù)防黑素瘤的藥物組合物。
22.權(quán)利要求1-21之一的用途，其特征在于所述藥物組合物以使之可改進其穩(wěn)定性和/或其免疫原性的形式運載。
23.權(quán)利要求22的用途，其特征在于所述載體是脂質(zhì)體，包含編碼所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物的病毒載體，或能夠表達所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞。
24.權(quán)利要求15、16、和23的用途，其特征在于所述核酸構(gòu)建物或包含于所述載體或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞中的核酸構(gòu)建物包含這樣的核酸序列，其選自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15個連續(xù)核苷酸的片段、或與所述序列之一具有至少80％同源性的序列。
25.一種藥物組合物，其特征在于它在制藥學(xué)可接受介質(zhì)中包含至少一種腸細菌OmpA蛋白或其片段，其通過混合或偶聯(lián)與至少一種腫瘤細胞相關(guān)或特異的抗原或半抗原相結(jié)合。
26.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述腸細菌培養(yǎng)物獲得。
27.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于所述腸細菌OmpA蛋白或其片段通過重組途徑獲得。
28.權(quán)利要求25-27之一的組合物，其特征在于所述腸細菌是肺炎克雷伯氏菌。
29.權(quán)利要求28的組合物，其特征在于OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)如a)中定義的序列的至少5個氨基酸的片段的氨基酸序列。
30.權(quán)利要求25-29之一的組合物，其特征在于所述抗原或半抗原選自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂類、或能夠特異性引發(fā)針對腫瘤細胞的CTL應(yīng)答之任何化合物。
31.權(quán)利要求25-30之一的組合物，其特征在于所述抗原或半抗原通過共價連接與所述OmpA蛋白或其片段偶聯(lián)。
32.權(quán)利要求31的組合物，其特征在于通過共價連接的偶聯(lián)是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的偶聯(lián)。
33.權(quán)利要求32的組合物，其特征在于在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中導(dǎo)入一種或多種連接元件，從而有助于化學(xué)偶聯(lián)。
34.權(quán)利要求33的組合物，其特征在于所述導(dǎo)入的連接元件是氨基酸。
35.權(quán)利要求31的組合物，其特征在于當所述抗原或半抗原的本質(zhì)是肽時，所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段之間的偶聯(lián)通過遺傳重組產(chǎn)生。
36.權(quán)利要求35的組合物，其特征在于藥物組合物包含編碼由所述偶聯(lián)后獲得的雜合蛋白的核酸構(gòu)建物。
37.權(quán)利要求36的組合物，其特征在于所述核酸構(gòu)建物包含于載體或能夠表達所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞中。
38.權(quán)利要求36和37的組合物，其特征在于所述核酸構(gòu)建物包含這樣的核酸序列，其選自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15個連續(xù)核苷酸的片段、或與序列SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的序列。
39.權(quán)利要求25-38之一的組合物，其特征在于所述藥物組合物以使之可改進其穩(wěn)定性和/或其免疫原性的形式運載。
40.權(quán)利要求39的組合物，其特征在于所述載體是脂質(zhì)體，包含編碼所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的核酸構(gòu)建物的病毒載體，或能夠表達所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞。
41.權(quán)利要求25-40之一的組合物，其特征在于所述制藥學(xué)可接受介質(zhì)由水、水性鹽溶液、或基于右旋糖和/或甘油的水性溶液組成。
42.權(quán)利要求25-41之一的組合物，其特征在于所述組合物還包含去污劑。
43.權(quán)利要求25-42之一的組合物，不含任何其它用于誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及腸細菌膜蛋白OmpA,特別是肺炎克雷伯氏菌,與一種抗原或半抗原相結(jié)合用于制備產(chǎn)生或增強針對感染或腫瘤細胞的細胞毒性T應(yīng)答的藥物組合物的用途。本發(fā)明還涉及該化合物用于預(yù)防和治療感染或癌癥的用途,特別是與腫瘤抗原相關(guān)的癌癥,諸如黑素瘤,和包含一些該化合物的藥物組合物。
文檔編號A61P37/04GK1344166SQ0080509
公開日2002年4月10日 申請日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月17日
發(fā)明者T·倫諾, J－Y·邦尼費 申請人:皮埃爾法博赫藥品公司