專利名稱：粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏菌)抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可能用來預(yù)防、診斷和/或治療粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏菌屬)感染的多肽，特別是粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏菌屬)的多肽。
背景技術(shù)：
粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏菌屬)(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)是引起人呼吸道感染的革蘭氏陰性雙球菌。如今認(rèn)為粘膜炎莫拉氏菌是繼肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)之后，引起嬰幼兒中耳炎的第三個最常見病因。粘膜炎莫拉氏菌也與幾種其它類型的感染有關(guān)，包括竇炎、持續(xù)性咳嗽、成人急性喉炎、化膿性角膜炎、新生兒結(jié)膜炎、以及無免疫應(yīng)答宿主中的侵襲性疾病。
大約90％的粘膜炎莫拉氏菌菌株耐受抗生素(β-內(nèi)酰胺酶陽性)，而且復(fù)發(fā)性中耳炎發(fā)病率高，因此有必要開發(fā)保護(hù)宿主防止粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗。粘膜炎莫拉氏菌感染誘導(dǎo)針對細(xì)菌細(xì)胞表面上抗原的免疫應(yīng)答。但尚未鑒定其中許多表面蛋白質(zhì)，也未確定防止不同菌株感染的免疫應(yīng)答。
為開發(fā)保護(hù)宿主防止粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗，主要致力于外膜蛋白質(zhì)，例如稱為泛在的表面蛋白質(zhì)A(UspA)的高分子量蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)被認(rèn)為是有希望的候選疫苗，因其單克隆抗體和多克隆抗體在小鼠肺清除模型中均顯示殺菌和保護(hù)作用。然而，該蛋白質(zhì)在不同粘膜炎莫拉氏菌菌株間的變異較強(qiáng)。除該蛋白質(zhì)以外，注意到其它的粘膜炎莫拉氏菌蛋白質(zhì)可作為可能的候選疫苗。具有保守性表位的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白暴露于細(xì)菌表面。然而，不同菌株之間蛋白質(zhì)的抗體交叉反應(yīng)性程度存在差異。其它研究者還關(guān)注45-kDa蛋白質(zhì)CD(OMP CD)。該蛋白質(zhì)在粘膜炎莫拉氏菌菌株間高度保守，但慢性阻塞性肺病的成年人對OMP CD的免疫應(yīng)答具有變異性。
因此，仍亟需可用于預(yù)防、診斷和/或治療粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏菌屬)感染的粘膜炎莫拉氏菌多肽。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
本發(fā)明一方面涉及包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽。
其它方面提供了由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽、藥物組合物、包含有效連接表達(dá)控制區(qū)的本發(fā)明多核苷酸的載體、利用所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞以及包含在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的多肽產(chǎn)生方法。
附圖簡述

圖1代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC2基因的DNA序列；SEQ ID NO1。下劃線部分序列代表前導(dǎo)肽編碼區(qū)。
圖2代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC2多肽的氨基酸序列；SEQ ID NO2。下劃線序列代表30個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽。
圖3代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658的BVH-MC2基因的部分DNA序列；SEQ ID NO3。
圖4代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658的BVH-MC2多肽的部分氨基酸序列；SEQ ID NO4。
圖5代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU T-25的BVH-MC2基因的部分DNA序列；SEQ ID NO5。
圖6代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU T-25的BVH-MC2多肽的部分氨基酸序列；SEQ ID NO6。
圖7代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株M-12的BVH-MC2基因的部分DNA序列；SEQ ID NO7。
圖8代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株M-12的BVH-MC2多肽的部分氨基酸序列；SEQ ID NO8。
圖9代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC3基因的DNA序列；SEQ ID NO9。下劃線部分序列代表前導(dǎo)肽編碼區(qū)。
圖10代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC3基因的氨基酸序列；SEQ ID NO10。下劃線序列代表46個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽。
圖11代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC4基因的DNA序列；SEQ ID NO11。下劃線部分序列代表前導(dǎo)肽編碼區(qū)。
圖12代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC4多肽的氨基酸序列；SEQ ID NO12。下劃線序列代表42個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽。
圖13代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC5基因的DNA序列；SEQ ID NO13。下劃線部分序列代表前導(dǎo)肽編碼區(qū)。
圖14代表來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC5多肽的氨基酸序列；SEQ ID NO14。下劃線序列代表60個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽。
圖15描述使用MacVector序列分析軟體的Clustal W程序(6.5版)對粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2、ETSU 658、ETSU T-25和M-12的BVH-MC2基因的部分核苷酸序列進(jìn)行的比較。共有序列一行位于比對下方，其中*和空格分別代表序列間相同的核苷酸以及差異。
圖16描述使用MacVector序列分析軟體的Clustal W程序(6.5版)對粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2、ETSU 658、ETSU T-25和M-12的BVH-MC2部分開放閱讀框架的預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行的比較。共有序列性一行位于比對下方，其中*代表相同的氨基酸殘基。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供純化和分離的多核苷酸，其編碼可用于預(yù)防、診斷和/或治療莫拉氏菌感染的莫拉氏菌多肽。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具至少95％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具至少95％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面涉及包含選自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽。
本發(fā)明一方面涉及以包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14的氨基酸序列為特征的多肽。
本發(fā)明一方面提供了編碼多肽帶有表位的部分的多核苷酸，該多肽包含選自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼多肽帶有表位的部分的多核苷酸，該多肽包含選自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面涉及編碼多肽帶有表位的部分，該多肽包含選自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
本發(fā)明一方面涉及編碼多肽帶有表位的部分，該多肽包含選自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具至少70％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具至少90％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面提供了編碼與第二種多肽具至少95％同一性的多肽的分離的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本發(fā)明一方面涉及包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽。
本發(fā)明一方面提供了包含選自下列多核苷酸的分離的多核苷酸
(a)編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(b)編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(c)編碼與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(d)編碼包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物序列的多肽的多核苷酸；(e)編碼能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽的多核苷酸；(f)編碼多肽帶有表位的部分的多核苷酸，該多肽包含選自SEQID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(g)包含選自SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13或其片段或類似物的序列的多核苷酸；(h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
本發(fā)明一方面提供了包含選自下列多核苷酸的分離的多核苷酸(a)編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(b)編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(c)編碼與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(d)編碼包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽的多核苷酸；(e)編碼能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽的多核苷酸；(f)編碼多肽帶有表位的部分的多核苷酸，該多肽包含選自SEQID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(g)包含選自SEQ ID No1、3、5、7、9、11和13的序列的多核苷酸；(h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
本發(fā)明一方面提供了包含選自下列多肽的分離的多肽(a)與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(b)與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(c)與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(d)包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽；(e)能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽；(f)多肽帶有表位的部分，該多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸殘基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
本發(fā)明一方面提供了包含選自下列多肽的分離的多肽(a)與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(b)與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(c)與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(d)包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽；(e)能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽；(f)多肽帶有表位的部分，該多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸殘基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括編碼本專利申請此處所述多肽的類似物例如突變體、變體、同源物和衍生物的DNA分子，即多核苷酸及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明也包括本發(fā)明的DNA分子對應(yīng)的RNA分子。除DNA和RNA分子以外，本發(fā)明包括相應(yīng)的多肽以及特異性結(jié)合該多肽的單克隆抗體。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是抗原性的。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是免疫原性的。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及能夠產(chǎn)生與上述本發(fā)明多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽。
“具有結(jié)合特異性”的抗體是識別并結(jié)合所選多肽、而基本上不識別并結(jié)合樣品中(例如，天然包括所選肽的生物樣品)其它分子的抗體。以所選多肽為抗原，利用ELISA分析可以測定其特異性結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，生物學(xué)研究中的″保護(hù)″定義為顯著提高存活曲線、存活率或存活時間。分別使用對數(shù)秩和檢驗(yàn)比較存活曲線，以及Fisher精確檢驗(yàn)比較存活率和至死天數(shù)的統(tǒng)計分析，可用來計算P值并確定兩組之間的差異是否在統(tǒng)計上有顯著意義。P值0.05被認(rèn)為不顯著。
本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明多肽的抗原性/免疫原性片段、或其類似物。
本發(fā)明的片段應(yīng)該包括一種或多種這樣的表位性區(qū)域，或與這樣的區(qū)域基本類似，以保留其抗原性/免疫原性性質(zhì)。因此，對于本發(fā)明的片段，同一性程度也許沒有關(guān)系，因?yàn)樗鼈兛赡芘c此處所述多肽或其類似物的特定部分具有100％的同一性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有本發(fā)明多肽序列的至少10個連續(xù)氨基酸殘基的片段。在一個實(shí)施方案中，至少15個連續(xù)的氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，至少20個連續(xù)的氨基酸殘基。
技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明多肽的類似物也在本發(fā)明范圍內(nèi)得到應(yīng)用，即作為抗原性/免疫原性物質(zhì)。因此，舉例來說，本發(fā)明包括包含一種或多種添加、缺失、置換等的蛋白質(zhì)或多肽。
此處所用本發(fā)明多肽的″片段″、″類似物″或″衍生物″包括其中一個或多個氨基酸殘基被替換為保守性或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性)的、可能天然或非天然存在的多肽。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的衍生物和類似物應(yīng)與圖示序列或其片段具有大約80％同一性。也就是說，80％的殘基相同。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于80％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于85％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于90％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于95％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于99％的同一性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的類似物具有少于約20個氨基酸殘基的置換、修飾或缺失，更優(yōu)選少于10個。
這些置換對該多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)影響極小。優(yōu)選本領(lǐng)域已知的保守性置換，即所置換的殘基共有物理或化學(xué)性質(zhì)，例如疏水性、大小、電荷或功能基團(tuán)。其中包括例如Dayhoff，M.在Atlas ofProtein Sequence and Structure 5，1978中以及Argos，P.在EMBO J.8，779-785，1989中所述的置換。例如，屬于下列各組之一的天然或非天然氨基酸代表保守性變化ala，pro，gly，gln，asn，ser，thr，val；cys，ser，tyr，thr；val，ile，leu，met，ala，phe；lys，arg，orn，his；以及phe，tyr，trp，his。
優(yōu)選的置換還包括相應(yīng)L-氨基酸的D-對映異構(gòu)體的置換。
在另一方法中，該類似物可以是融合多肽，例如通過有效標(biāo)識目的多肽，引入使純化更為容易的部分?？赡苄枰コ鍢?biāo)簽″，或可能融合多肽自身保有充分可用的抗原性。
同源性百分比定義為同一性百分比加上相似性或氨基酸類型保守性百分比的總和。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的類似物與圖示序列或其片段具有大約70％同一性。也就是說，70％的殘基相同。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于80％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于85％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于90％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于95％的同一性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于99％的同一性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的類似物具有少于約20個氨基酸殘基的置換、修飾或缺失，更優(yōu)選少于10個。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的類似物與圖示序列或其片段具有大約70％同源性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于80％的同源性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于85％的同源性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于90％的同源性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于95％的同源性。在另一實(shí)施方案中，多肽具有大于99％的同源性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的類似物具有少于約20個氨基酸殘基的置換、修飾或缺失，更優(yōu)選少于10個。
人們可以利用諸如CLUSTAL程序比較氨基酸序列。該程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行比較，通過在視情況而定的任一序列中插空而找到最佳比對。有可能計算氨基酸同一性或同源性，進(jìn)行最佳比對。類似BLASTx的程序可比對最長一段的相似序列，為該匹配賦值。因此有可能實(shí)現(xiàn)比對，其中找到各具有不同得分的若干相似性區(qū)域。兩種同一性分析均包含于本發(fā)明之內(nèi)。
在另一方法中，該類似物或衍生物可以是融合多肽，例如通過有效標(biāo)識目的蛋白質(zhì)或多肽，引入使純化更為容易的部分，可能需要去除″標(biāo)簽″，或可能融合多肽自身保有充分可用的抗原性。
眾所周知，有可能篩選抗原性多肽，以鑒定表位區(qū)，即決定該多肽抗原性或免疫原性的區(qū)域。進(jìn)行這種篩選的方法為本領(lǐng)域所公知。因此，本發(fā)明的片段應(yīng)該包括一種或多種這樣的表位區(qū)，或與這種區(qū)域基本類似，以保留其抗原性/免疫原性性質(zhì)。
因此，對于本發(fā)明的片段，同一性程度也許沒有關(guān)系，因?yàn)樗鼈兛赡芘c此處所述多肽、類似物的特定部分具有100％的同一性。
因此，對于類似物、衍生物和片段而言，重要的是它們具有至少所來源蛋白質(zhì)或多肽的一定程度的抗原性/免疫原性。
本發(fā)明還包括與可改變該多肽生物學(xué)或藥理學(xué)性質(zhì)的其它化合物融合的多肽，即提高半衰期的聚乙二醇(PEG)；便于純化的前導(dǎo)或分泌氨基酸序列；前原-和原-序列；以及(多)糖。
另外，當(dāng)發(fā)現(xiàn)氨基酸區(qū)域具有多態(tài)性時，可能需要改變一種或多種特定氨基酸，以更有效摹擬不同莫拉氏菌株的不同表位。
此外，可以通過末端-NH2的酰化作用(例如乙?；?、或巰基乙酸酰胺化、末端羧基酰胺化，例如利用氨或甲胺)修飾本發(fā)明的多肽，以提供穩(wěn)定性、提高疏水性，用于連接或結(jié)合支持物或其它分子。
本發(fā)明還包括該多肽片段和類似物的異型和同型多肽多聚體。這些多聚體形式包括，例如利用交聯(lián)劑例如親和素/生物素、戊二醛(gluteraldehyde)或二甲基superimidate交聯(lián)的一種或多種多肽。這種多聚體形式還包括通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多順反子mRNA制備的包含兩個或多個串聯(lián)或顛倒的連續(xù)序列的多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含一種或多種本申請附圖中定義的多肽、或其片段或類似物的嵌合多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含兩種或多種具有選自SEQID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽的嵌合多肽；只要該多肽被連接成嵌合多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含兩種或多種具有選自SEQID NO2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽的嵌合多肽，只要該多肽被連接成嵌合多肽。
本發(fā)明多肽的片段、類似物或衍生物優(yōu)選包含至少一個抗原性區(qū)域，即至少一個表位。
為了形成抗原性聚合物(即合成的多聚體)，可以使用具有雙鹵代乙?；?bishaloacetyl)、硝基芳鹵(nitroarylhalides)等的多肽，這些試劑對硫基具有特異性。因此，不同多肽的兩個巰基之間的連接可能是單鍵或可能由至少2個、一般至少4個、不多于16個、但通常不多于約14個碳原子的連接基團(tuán)組成。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽片段和類似物不包含起始?xì)埢?，例如甲硫氨?Met)或纈氨酸(Val)。優(yōu)選多肽不引入前導(dǎo)或分泌序列(信號序列)?？筛鶕?jù)已建立的分子生物學(xué)技術(shù)確定本發(fā)明多肽的信號部分。一般而言，可能從莫拉氏菌培養(yǎng)物分離目的多肽，隨后測序，以確定成熟蛋白質(zhì)的起始?xì)埢?，從而確定成熟多肽的序列。
應(yīng)當(dāng)理解，可以制備和/或使用無起始密碼子(甲硫氨酸或纈氨酸)和/或無前導(dǎo)肽的多肽，以利于制備和純化重組多肽。眾所周知，克隆無編碼前導(dǎo)肽序列的基因?qū)⑹乖摱嚯南抻诖竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)中，便于回收(Glick，B.R.和Pasternak，J.J.(1998)Manipulation of geneexpression in prokaryotes.″Molecular biotechnologyPrinciples andapplications of recombinant DNA″，第二版，ASM Press，WashingtonDC，109-143頁)。
本發(fā)明另一方面提供了(i)包含本發(fā)明多肽連同載體、稀釋劑或佐劑物質(zhì)的組合物；(ii)包含本發(fā)明多肽和載體、稀釋劑或佐劑的藥物組合物；(iii)包含本發(fā)明多肽和載體、稀釋劑或佐劑的疫苗；(iv)通過給予宿主致免疫有效量的本發(fā)明多肽，激發(fā)免疫應(yīng)答，例如對莫拉氏菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)宿主中針對莫拉氏菌的免疫應(yīng)答的方法；特別是(v)通過給予所需宿主預(yù)防性或治療性劑量的本發(fā)明多肽，而預(yù)防和/或治療莫拉氏菌感染的方法。
本發(fā)明另一方面提供了(i)包含本發(fā)明多核苷酸連同載體、稀釋劑或佐劑物質(zhì)的組合物；(ii)包含本發(fā)明多核苷酸和載體、稀釋劑或佐劑的藥物組合物；(iii)通過給予宿主致免疫有效量的本發(fā)明多核苷酸，激發(fā)免疫應(yīng)答，例如對莫拉氏菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)宿主中針對莫拉氏菌的免疫應(yīng)答的方法；特別是(iv)通過給予所需宿主預(yù)防性或治療性劑量的本發(fā)明多核苷酸，而預(yù)防和/或治療莫拉氏菌感染的方法。
本發(fā)明多肽也可以在免疫之前耦聯(lián)或綴合載體蛋白質(zhì)，例如破傷風(fēng)毒素、白喉毒素、乙型肝炎病毒表面抗原、脊髓灰質(zhì)炎病毒VP1抗原或任何其它病毒性或細(xì)菌性毒素或抗原、或任何合適蛋白質(zhì)以刺激形成更強(qiáng)免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^化學(xué)或遺傳方法進(jìn)行耦聯(lián)或綴合。有關(guān)肽-載體綴合的更詳細(xì)說明參見Van Regenmortel，M.H.V.，Briand J.P.，Muller S.，PlauéS.，《Synthetic Polypeptides as antigens》inLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，19卷(ed.)Burdou，R.H.&Van Knippenberg P.H.(1988)，Elsevier NewYork。
本發(fā)明另一方面提供了包含一種或多種本發(fā)明莫拉氏菌多肽與藥物可接受佐劑的混合的藥物組合物。合適的佐劑包括(1)水包油型乳劑，例如MF59TM、SAFTM、RibiTM；(2)弗氏完全或不完全佐劑；(3)鹽，即AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)2、Al(OH)3、AlPO4，硅土、高嶺土；(4)皂甙衍生物例如StimulonTM，或其形成的顆粒例如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物)；(5)細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素、干擾素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)；(6)誘導(dǎo)粘膜免疫的其它物質(zhì)，例如碳多核苷酸，即多聚IC和多聚AU，去毒霍亂菌毒素(CTB)以及大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素。佐劑的更詳細(xì)說明參見M.Z.I Khan等人綜述Pharmaceutical Research，11卷，No.1(1994)2-11頁，還參見Gupta等人綜述Vaccine，卷13，No.14，1263-1276頁(1995)以及WO99/24578。優(yōu)選的佐劑包括QuilATM、QS21TM、AlhydrogelTM和AdjuphosTM。
可通過注射、快速輸注、鼻咽吸收、皮膚吸收、或含服、或口服，經(jīng)腸胃外給予本發(fā)明的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌感染所致疾病和癥狀，所述于Manual of Clinical Microbiology，P.R.Murray(主編)，E.J.Baron，M.A.Pfaller，F(xiàn).C.Tenover和R.H.Yolken.ASM Press，Washington，D.C.第七版，1999，1773頁。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療或預(yù)防中耳炎、竇炎、持續(xù)性咳嗽、急性喉炎、化膿性角膜炎、新生兒結(jié)膜炎。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物可用于治療或預(yù)防莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌感染所致疾病和癥狀。在另一實(shí)施方案中，該莫拉氏菌感染為粘膜炎莫拉氏菌。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療易受莫拉氏菌感染宿主的莫拉氏菌感染的方法，其包含給予所述宿主預(yù)防性或治療性數(shù)量的本發(fā)明組合物。
本申請所用術(shù)語″宿主″包括哺乳動物。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動物是人。
在特定實(shí)施方案中，將藥物組合物給予處于莫拉氏菌感染危險中的宿主，例如新生兒、嬰兒、兒童、老人以及無免疫應(yīng)簽的宿主。
在特定實(shí)施方案中，將藥物組合物給予處于莫拉氏菌感染危險中的宿主，例如成人。
藥物組合物的單位劑型優(yōu)選約0.001-100μg/kg(抗原/體重)，更優(yōu)選0.01-10μg/kg，最優(yōu)選0.1-1μg/kg，1-3次，免疫之間間隔約1-6周。
藥物組合物的單位劑型優(yōu)選約0.1μg-10mg，更優(yōu)選1μg-1mg，最優(yōu)選10-100μg，1-3次，免疫之間間隔約1-6周。
本發(fā)明另一個方面提供了編碼多肽的多核苷酸，該多肽的特征在于，氨基酸序列包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
在一個實(shí)施方案中，多核苷酸如SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13所示，可能包括開放閱讀框架(ORF)，其編碼本發(fā)明的多肽。
應(yīng)當(dāng)理解，圖示多核苷酸序列可以改變?yōu)楹啿⒚艽a子，但仍編碼本發(fā)明多肽。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供可與此處上述的多核苷酸序列(或其互補(bǔ)序列)雜交的多核苷酸，序列之間具有70％同一性。在一個實(shí)施方案中，序列之間具有至少80％同一性。在一個實(shí)施方案中，序列之間具有至少85％同一性。在一個實(shí)施方案中，序列之間具有至少90％同一性。在另一實(shí)施方案中，多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，即具有至少95％同一性。在另一實(shí)施方案中，具有多于97％的同一性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定合適的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件(例如參見Sambrook等人，(1989)Molecular cloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology，(1999)Ausubel F.M.等人編著.，John Wiley & Sons，Inc.，N.Y.)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下列序列雜交的多核苷酸(a)編碼多肽的DNA序列，或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列；其中所述多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14、或其片段或類似物的序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下列序列雜交的多核苷酸
(a)編碼多肽的DNA序列，或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列；其中所述多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下列序列雜交的多核苷酸(a)編碼多肽的DNA序列，或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列；其中所述多肽包含至少10個連續(xù)的氨基酸殘基，其來自包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14、或其片段或類似物的序列的多肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下列序列雜交的多核苷酸(a)編碼多肽的DNA序列，或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列；其中所述多肽包含至少10個連續(xù)的氨基酸殘基，其來自包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽。
在另一實(shí)施方案中，多核苷酸如SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13所示，或?yàn)槠淦位蝾愃莆?，編碼本發(fā)明的多肽。
在另一實(shí)施方案中，多核苷酸如SEQ ID No1、3、5、7、9、11或13所示，編碼本發(fā)明的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，多核苷酸包括DNA和RNA。
本發(fā)明還包括與本申請所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
另一方面，編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸、或其片段、類似物或衍生物，可用于DNA免疫方法。也就是說，能夠?qū)⑺鼈円肟蛇M(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的載體，通過注射從而在體內(nèi)產(chǎn)生抗原性多肽。例如，可將多核苷酸引入質(zhì)粒載體，位于在真核細(xì)胞中起作用的CMV啟動子控制之下。優(yōu)選肌內(nèi)注射該載體。
本發(fā)明另一方面提供了通過重組技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述多肽的多核苷酸、并回收所表達(dá)的多肽產(chǎn)物、從而制備本發(fā)明多肽的方法。另外，可以根據(jù)已經(jīng)建立的化學(xué)合成技術(shù)制備該多肽，即液相或固相合成寡肽，連接起來制備完整的多肽(區(qū)段連接)。
下列參考文獻(xiàn)描述了獲取并鑒定多核苷酸和多肽的一般方法Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel F.M.等人編著，John Wiley and Sons，Inc.New York；PCR Cloning Protocols，from Molecular Cloning to GeneticEngineering，White B.A.編著，Humana Press，Totowa，New Jersey，1997，490頁；Protein Purification，Principles and Practices，Scopes R.K.，Springer-Verlag，New York，第三版，1993，380頁；CurrentProtocols in Immunology，Coligan J.E.等人編著，John Wiley & SonsInc.，New York。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生多肽的方法，其包含在適于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。
為進(jìn)行重組制備，利用編碼本發(fā)明多肽的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后在適當(dāng)改變的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以活化啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增基因。合適的載體可在所選宿主中存活并復(fù)制，包括染色體、非染色體以及合成DNA序列，例如細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、聯(lián)合質(zhì)粒和噬菌體DNA得到的載體?？梢岳孟拗菩詢?nèi)切酶將多肽序列引入載體適當(dāng)位點(diǎn)，使其有效連接包含啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(共有序列區(qū)域或SD序列)以及任選操縱子(控制元件)的表達(dá)控制區(qū)?？梢愿鶕?jù)已確立的分子生物學(xué)原理，選擇適于指定宿主和載體的各個表達(dá)控制區(qū)元件(Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel F.M.等人編著，JohnWiley and Sons，Inc.New York)。合適的啟動子包括但不限于LTR或SV40啟動子、E.coli lac、tac或trp啟動子以及噬菌體λPL啟動子。載體優(yōu)選引入復(fù)制起點(diǎn)以及選擇標(biāo)志，即氨芐青霉素抗性基因。合適的細(xì)菌性載體包括pET、pQE70、pQE60、pQE-9、pD10 phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5以及真核載體pBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。宿主細(xì)胞可能是細(xì)菌，即大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鏈霉菌(Streptomyces)；真菌，即黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲菌(Aspergillus nidulins)；酵母，即糖酵母屬(Saccharomyces)或真核細(xì)胞，即CHO、COS。
在培養(yǎng)物中表達(dá)多肽后，一般離心收集細(xì)胞，然后利用物理或化學(xué)方法裂解(如果該表達(dá)多肽未分泌到培養(yǎng)基中)，保留得到的粗提物，以分離目的多肽。根據(jù)多肽性質(zhì)，利用已建立的技術(shù)從培養(yǎng)基或裂解物中純化多肽，即使用硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、羥基磷灰石層析以及凝集素層析。使用HPLC完成最終純化。
該多肽可能在有或沒有前導(dǎo)或分泌序列的情況下表達(dá)。在前一種情況下，可能利用翻譯后加工去除前導(dǎo)序列(參見US 4,431,739；US4,425,437和US 4,338,397)，或在純化所表達(dá)的多肽之后，通過化學(xué)去除。
另一方面，本發(fā)明的莫拉氏菌多肽可用于莫拉氏菌感染、特別是粘膜炎莫拉氏菌感染的診斷性檢驗(yàn)?？赡苡腥舾稍\斷方法，例如，可以按照以下方法檢測生物樣品中的莫拉氏菌生物體(a)從宿主獲得生物樣品；(b)將與本發(fā)明的莫拉氏菌多肽具有反應(yīng)性的抗體或其片段與該生物樣品溫育，以形成混合物；以及(c)在混合物中檢測表示存在莫拉氏菌的特異性結(jié)合的抗體或片段。
另外，在包含或懷疑包含莫拉氏菌抗原的特異性抗體的生物樣品中檢測所述抗體的方法，可能如下進(jìn)行a)從宿主獲得生物樣品；b)將本發(fā)明的一種或多種莫拉氏菌多肽或其片段與該生物樣品溫育，以形成混合物；以及c)在混合物中檢測特異性結(jié)合的抗原或片段，其表示存在莫拉氏菌的特異性抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，該診斷性檢驗(yàn)可能具有幾種形式，包括免疫學(xué)檢驗(yàn)，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定或乳膠凝集測定，可基本確定生物體中是否存在該蛋白質(zhì)的特異性抗體。
編碼本發(fā)明多肽的DNA序列也可能用來設(shè)計DNA探針，用于在懷疑包含莫拉氏菌的生物樣品中檢測這種細(xì)菌。本發(fā)明的檢測方法包含(a)從宿主獲得生物樣品；(b)將具有編碼本發(fā)明多肽的DNA序列的一種或多種DNA探針與該生物樣品溫育，以形成混合物；以及(c)在混合物中檢測表示存在莫拉氏細(xì)菌的特異性結(jié)合的DNA探針。
本發(fā)明的DNA探針還可用于檢測循環(huán)中的莫拉氏菌，即樣品中的莫拉氏菌核酸，例如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，作為診斷莫拉氏菌感染的方法。探針可能使用常規(guī)技術(shù)合成并可能固定于固相上，或者利用可檢測標(biāo)志進(jìn)行標(biāo)記。本申請優(yōu)選的DNA探針是具有與本發(fā)明莫拉氏菌多肽的至少約6個連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的序列的寡聚體。在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選的DNA探針是具有與本發(fā)明莫拉氏菌多肽的至少約15個連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的序列的寡聚體。在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選的DNA探針是具有與本發(fā)明莫拉氏菌多肽的至少約30個連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的序列的寡聚體。在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選的DNA探針是具有與本發(fā)明莫拉氏菌多肽的至少約50個連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的序列的寡聚體。
檢測宿主中莫拉氏菌的另一診斷方法包含(a)利用可檢測標(biāo)志標(biāo)記與本發(fā)明多肽或其片段具有反應(yīng)性的抗體；(b)將該標(biāo)記抗體或標(biāo)記片段給予宿主；以及(c)在宿主中檢測表示存在莫拉氏菌的特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體或標(biāo)記片段。
另外，在包含或懷疑包含莫拉氏菌抗原的特異性抗體的生物樣品中檢測所述抗體的方法，可能如下進(jìn)行a)從宿主獲得生物樣品；b)將該生物樣品與本發(fā)明的一種或多種莫拉氏菌多肽或其片段溫育，以形成混合物；以及c)檢測混合物中特異性結(jié)合的抗原或片段，其表示存在莫拉氏菌的特異性抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，該診斷性檢驗(yàn)可能具有幾種形式，包括免疫學(xué)檢驗(yàn)，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定或乳膠凝集測定，可基本確定生物體中是否存在該蛋白質(zhì)的特異性抗體。
編碼本發(fā)明多肽的DNA序列也可能用來設(shè)計DNA探針，用于在懷疑包含莫拉氏菌的生物樣品中檢測這種細(xì)菌。本發(fā)明的檢測方法包含(a)從宿主獲得生物樣品；(b)將該生物樣品與具有編碼本發(fā)明多肽的DNA序列的一種或多種DNA探針溫育，以形成混合物；以及(c)在混合物中檢測表示存在莫拉氏菌的特異性結(jié)合的DNA探針。
本發(fā)明一方面提供抗體在治療和/或預(yù)防莫拉氏菌感染中的用途。
本發(fā)明另一方面在于本發(fā)明莫拉氏菌多肽作為免疫原在制備特異性抗體中的用途，用于診斷特別是治療莫拉氏菌感染。利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，例如通過在測試模型中測定特定抗體被動防止莫拉氏菌感染的能力，可以確定合適的抗體。動物模型的例子之一為此處實(shí)施例所述小鼠模型。該抗體可能是完整抗體或其抗原結(jié)合片段，并可能屬于任何免疫球蛋白類型。該抗體或片段可能來源于動物，特別是哺乳動物，更特別是小鼠、大鼠或人。可能是天然抗體或其片段，或如果需要，可能是重組抗體或抗體片段。術(shù)語重組抗體或抗體片段是指利用分子生物學(xué)技術(shù)制備的抗體或抗體片段。可能是多克隆的、或優(yōu)選單克隆的抗體或抗體片段?？赡芴禺愋葬槍εc莫拉氏菌多肽有關(guān)的多種表位，但優(yōu)選特異性針對一種。
本發(fā)明一方面提供抗體在預(yù)防和/或治療莫拉氏菌感染中的用途。
本發(fā)明另一方面在于本發(fā)明的莫拉氏菌多肽作為免疫原在制備特異性抗體中的用途，用于診斷特別是治療莫拉氏菌感染。利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，例如通過在測試模型中測定特定抗體被動防止莫拉氏菌感染的能力，可以確定合適的抗體。動物模型的例子之一為此處實(shí)施例所述小鼠模型。該抗體可能是完整抗體或其抗原結(jié)合片段，并可能屬于任何免疫球蛋白類型。該抗體或片段可能來源于動物，特別是哺乳動物，更特別是小鼠、大鼠或人?？赡苁翘烊豢贵w或其片段，或如果需要，可能是重組抗體或抗體片段。術(shù)語重組抗體或抗體片段是指利用分子生物學(xué)技術(shù)制備的抗體或抗體片段?？赡苁嵌嗫寺〉摹⒒騼?yōu)選單克隆的抗體或抗體片段。可能特異性針對與莫拉氏菌多肽有關(guān)的多種表位，但優(yōu)選特異性針對一種。
本發(fā)明另一方面在于針對本發(fā)明多肽的抗體在被動免疫中的用途?？梢允褂帽旧暾埶隹贵w。
本發(fā)明另一方面在于通過給予宿主數(shù)量足以提供被動免疫的本發(fā)明多肽進(jìn)行免疫、從而產(chǎn)生抗體的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的藥物組合物在制備預(yù)防性或治療性治療莫拉氏菌感染的藥物中的用途。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明多肽的試劑盒，用于檢測或診斷莫拉氏菌感染。
除非另外定義，此處所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的相同含義。此處提及的所有出版物、專利申請、專利及其它參考文獻(xiàn)均全文引入以供參考。如有沖突，則按本說明書、包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為說明目的，而非意在限制。
實(shí)施例1本實(shí)施例闡明BVH-MC2基因及相應(yīng)多肽的克隆和分子特征。
從粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因組DNA中PCR(DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)擴(kuò)增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因編碼區(qū)，使用下列寡聚物，其中包含供加入限制性位點(diǎn)NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的堿基突出端DMAR544(5′-CATCAGTGCATATGAATACGACACACCATCACACG-3′)；DMAR545(5′-GAGTTATTCTCGAGTTTGTCCAAATTTGGCTTAGTTTTAC-3′)。使用QIAgen的QIAquick凝膠提取試劑盒，按照廠家說明(Chatsworth，CA)，從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物，并用NdeI和XhoI(Amersham Pharmacia Biotech，Inc，Baie d′Urfé，Canada)消化。pET21b(+)載體(Novagen，Madison，WI)經(jīng)NdeI和XhoI消化，利用QIAgen(Chatsworth，CA)的QIAquick凝膠提取試劑盒，從瓊脂糖凝膠中純化。將NdeI-XhoI PCR產(chǎn)物連接到NdeI-XhoI pET21b(+)表達(dá)載體。按照Simanis方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，109-135頁)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌株DH5α[Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1hsdR17(rK-mK+)deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。使用QIAgen試劑盒(Chatsworth，CA)純化包含BVH-MC2基因的重組pET21b(+)質(zhì)粒(rpET21b(+))，測序DNA插入序列(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒，ABI，F(xiàn)oster City，CA)。
表1.用于PCR擴(kuò)增粘膜炎莫拉氏菌基因的寡核苷酸引物。
已經(jīng)確定，編碼BVH-MC2多肽的開放閱讀框架(ORF)包含1467bp，編碼488個氨基酸殘基的多肽，其預(yù)測的pI為6.08，預(yù)測的分子量為53754.35Da。使用Spscan軟件(Wisconsin Sequence AnalysisPackage；Genetics Computer Group)分析預(yù)測的氨基酸殘基序列(SEQID NO2)，提示存在30個氨基酸殘基的信號肽(MDTDMKHLTKHRLSAAIIGVLLFISPSVQA)，在丙氨酸和天門冬酰胺殘基間的切割位點(diǎn)處結(jié)束。
為利用PCR擴(kuò)增證實(shí)存在BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因，使用以下4個不同的粘膜炎莫拉氏菌菌株粘膜炎莫拉氏菌ETSU C-2、ETSU T-25和ETSU 658臨床分離物由East Tennessee StateUniversity提供；粘膜炎莫拉氏菌菌株M-12由centre de recherche eninfectiologie du centre hospitalier de l′universitéLaval提供。這些實(shí)驗(yàn)使用大腸桿菌XL1 Blue MRF′作為陰性對照。使用寡核苷酸引物DMAR544和DMAR545(表1)，從4株粘膜炎莫拉氏菌菌株和對照大腸桿菌菌株的基因組DNA中PCR(DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)擴(kuò)增BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因。在94℃30秒、51℃30秒、72℃1分20秒進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘，進(jìn)行PCR。在1％瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物，通過溴化乙錠染色觀察。PCR擴(kuò)增結(jié)果如表2所示。分析擴(kuò)增產(chǎn)物表明，BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因存在于所檢測的所有4個粘膜炎莫拉氏菌菌株的基因組中。同樣利用這些寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增對照的大腸桿菌DNA，未檢測到產(chǎn)物。
測序其它菌株的BVH-MC2基因，證實(shí)該基因在粘膜炎莫拉氏菌菌株間具有高水平的分子保守性。使用上述寡核苷酸引物DMAR544和DMAR545，PCR擴(kuò)增來自菌株ETSU 658(SEQ ID NO3)、ETSUT-25(SEQ ID NO5)以及M-12(SEQ ID NO7)的粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC2基因的各自編碼區(qū)。使用QIAgen的QIAquick凝膠提取試劑盒，按廠家說明書(Chatsworth，CA)從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物，測序DNA插入序列(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒，ABI，F(xiàn)oster City，CA)。按實(shí)施例1的相同方法獲得全序列。預(yù)測的菌株ETSU C-2(SEQ ID NO2)、ETSU 658(SEQ ID NO4)、ETSU T-25(SEQ ID NO6)以及M-12(SEQ ID NO8)的氨基酸序列分別如圖2、4、6和8所示。圖15和16分別描述粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC2的共有序列核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列。逐對比較BVH-MC2預(yù)測的多肽序列，顯示100％同一性。后一結(jié)果清楚表明BVH-MC2多肽在粘膜炎莫拉氏菌分離物之間高水平的分子保守性。
表2.PCR擴(kuò)增鑒定粘膜炎莫拉氏菌基因。
實(shí)施例2本實(shí)施例闡明BVH-MC3基因及相應(yīng)多肽的克隆和分子特征。
從粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因組DNA中PCR(DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)擴(kuò)增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC3(SEQ ID NO9)基因編碼區(qū)，使用下列寡聚物，其中包含供加入限制性位點(diǎn)NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的堿基突出端表1所示的DMAR592和DMAR593。用來將BVH-MC3克隆到表達(dá)載體并測序的方法與實(shí)施例1類似。
已經(jīng)確定，編碼BVH-MC3的開放閱讀框架(ORF)包含1656bp，編碼551個氨基酸殘基的多肽，其預(yù)測的pI為4.68，預(yù)測的分子量為58910.13Da。使用Spscan軟件(Wisconsin Sequence Analysis Package；Genetics Computer Group)分析預(yù)測的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO10)，提示存在46個氨基酸殘基的信號肽(MSLINKLNERITPHVLTSIKNQDGDNADKSNLLTAFYTIFAGRLSN)，在天門冬酰胺和谷氨酸殘基間的切割位點(diǎn)處結(jié)束。
使用寡核苷酸引物DMAR592和DMAR593進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，顯示在所檢測的4個粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在BVH-MC3基因(表2)。用來PCR擴(kuò)增BVH-MC3基因的方法與實(shí)施例1類似。同樣利用這些寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增對照的大腸桿菌DNA，未檢測到該產(chǎn)物。
實(shí)施例3本實(shí)施例闡明BVH-MC4基因及相應(yīng)多肽的克隆和分子特征。從粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因組DNA中PCR(DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)擴(kuò)增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC4(SEQ ID NO11)基因編碼區(qū)，使用下列寡聚物，其中包含供加入限制性位點(diǎn)NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的堿基突出端表1所示的RIOS71和RIOS72。用來將BVH-MC4克隆到表達(dá)載體并測序的方法與實(shí)施例1類似。
已經(jīng)確定，編碼BVH-MC4的開放閱讀框架(ORF)包含1251bp，編碼416個氨基酸殘基的多肽，其預(yù)測的pI為4.84，預(yù)測的分子量為46125.11Da。使用Spscan軟件(Wisconsin Sequence Analysis Package；Genetics Computer Group)分析預(yù)測的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO12)，提示存在42個氨基酸殘基的信號肽(MDTKHIQQNWLLPDGVADVLFTDAQKQESLRDALLFVLTAHG)，在甘氨酸和酪氨酸殘基間的切割位點(diǎn)處結(jié)束。
使用寡核苷酸引物RIOS71和RIOS72進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，顯示在所檢測的4個粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在BVH-MC4基因(表2)。用來PCR擴(kuò)增BVH-MC4基因的方法與實(shí)施例1類似。同樣利用這些寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增對照的大腸桿菌DNA，未檢測到該產(chǎn)物。
實(shí)施例4本實(shí)施例闡明BVH-MC5基因及相應(yīng)多肽的克隆和分子特征。
從粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因組DNA中PCR(DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)擴(kuò)增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因編碼區(qū)，使用表1所示的RIOS59和RIOS60寡聚物，其中包含供加入限制性位點(diǎn)NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的堿基突出端。用來將BVH-MC5克隆到表達(dá)載體并測序的方法與實(shí)施例1類似。
已經(jīng)確定，編碼BVH-MC5的開放閱讀框架(ORF)包含639bp，編碼212個氨基酸殘基的多肽，其預(yù)測的pI為7.45，預(yù)測的分子量為24020.08Da。使用Spscan軟件(Wisconsin Sequence Analysis Package；Genetics Computer Group)分析預(yù)測的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO14)，提示存在60個氨基酸殘基的信號肽(MNNFVYQLQSFWYELNQVNRHTIAQSPKYIQLTVLGLIVMIIGIFGWLLAIL PTIQKLNA)，在兩個丙氨酸之間的切割位點(diǎn)處結(jié)束。
使用寡核苷酸引物RIOS59和RIOS60進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，顯示在所檢測的4個粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在BVH-MC5基因(表2)。用來PCR擴(kuò)增BVH-MC5基因的方法與實(shí)施例1類似。同樣利用這些寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增對照的大腸桿菌DNA，未檢測到該產(chǎn)物。
實(shí)施例5本實(shí)施例闡明在CMV質(zhì)粒pCMV-GH中克隆粘膜炎莫拉氏菌基因。
將粘膜炎莫拉氏菌多肽DNA編碼區(qū)插入質(zhì)粒載體pCMV-GH(Tang等人，Nature，1992，356152)中，位于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的人生長激素(hGH)基因下游。該CMV啟動子在大腸桿菌細(xì)胞中是無功能質(zhì)粒，但在將該質(zhì)粒給予真核細(xì)胞后活化。該載體還引入了氨芐青霉素抗性基因。
從粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因組DNA中PCR(DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)擴(kuò)增BVH-MC2(SEQ ID NO1)、BVH-MC3(SEQ ID NO9)、BVH-MC4(SEQ ID NO11)和BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因不帶有其前導(dǎo)肽區(qū)的編碼區(qū)，使用表1所示的寡核苷酸引物，其中包含供加入限制性位點(diǎn)BamHI(GGATCC)、BglII(AGATCT)、SalI(GTCGAC)或HindIII(AAGCTT)的堿基突出端。使用QIAgen的QIAquick凝膠提取試劑盒(Chatsworth，CA)，從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物，并用限制性內(nèi)切酶(Amersham Pharmacia Biotech，Inc，Baie d′Urfe，Canada)消化。利用BamHI、BglII、SalI 或HindIII消化pCMV-GH載體(Laboratory of DR.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)，并使用QIAgen的QIAquick凝膠提取試劑盒(Chatsworth，CA)從瓊脂糖凝膠中純化。將消化的DNA片段連接到消化的pCMV-GH載體，產(chǎn)生位于CMV啟動子控制下的hGH-BVH-MC2、hGH-BVH-MC3、hGH-BVH-MC4和hGH-BVH-MC5融合多肽。按照Simanis方法(Hanahan，D.DNACloning，1985，D.M.Glover(ed)，109-135頁)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α[Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1hsdR17(rK-mK+)deoR thi-1 supE44λ-gyrA96 relA1](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。使用QIAgen試劑盒(Chatsworth，CA)純化重組pCMV質(zhì)粒，通過DNA測序證實(shí)DNA插入片段的核苷酸序列。
實(shí)施例6本實(shí)施例闡明DNA在激發(fā)對粘膜炎莫拉氏菌多肽抗原的免疫應(yīng)答中的用途。
在50μg表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的質(zhì)粒pCMV-GH-GM-CSF(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)的存在下，肌內(nèi)注射100μl編碼BVH-MC2(SEQ ID NO1)、BVH-MC3(SEQ ID NO9)、BVH-MC4(SEQ ID NO11)和BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因的50μg重組pCMV-GH，注射3次，間隔2或3周，免疫每組8只雌性BALB/c小鼠(Cha rles River，St-Constant，Québec，Canada)。在50μg pCMV-GH-GM-CSF存在下，給一組小鼠注射50μg pCMV-GH，作為對照。每次免疫之前以及第三次注射后七天，從眼窩采集血樣，使用相應(yīng)的His-Tag標(biāo)記的粘膜炎莫拉氏菌重組多肽作為包被抗原，利用ELISA測定血清抗體反應(yīng)。如實(shí)施例7所示制備并純化這些His標(biāo)簽標(biāo)記的粘膜炎莫拉氏菌重組多肽。
實(shí)施例7本實(shí)施例闡明粘膜炎莫拉氏菌重組多肽的制備和純化。
使用帶有BVH-MC2(SEQ ID NO1)、BVH-MC3(SEQ ID NO9)、BVH-MC4(SEQ ID NO11)和BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因的重組pET21b(+)質(zhì)粒電穿孔(Gene Pulser II儀器，BIO-RAD Labs，Mississauga，Canada)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 AD494 (DE3)[Δara-leu7697ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR ΔmalF3 F′[lac+(lacIq)pro]trxB::Kan(DE3)](Novagen，Madison，WI)。在該大腸桿菌菌株中，控制重組多肽表達(dá)的T7啟動子由T7RNA聚合酶(存在于λDE3原噬菌體)特異性識別，T7 RNA聚合酶基因位于可由異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的lac啟動子控制之下。將AD494(DE3)/rpET21b(+)轉(zhuǎn)化子在包含100μg/ml羧芐青霉素(Sigma-Aldrich，Canada Ltd.，Oakville，Canada)的LB培養(yǎng)基中(蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCll0g/L)、于37℃、250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)，直至A600達(dá)到0.5。為誘導(dǎo)His標(biāo)簽的粘膜炎莫拉氏菌重組多肽生成，將細(xì)胞在終濃度1mM IPTG存在下再培養(yǎng)3小時。離心沉淀500ml培養(yǎng)物的誘導(dǎo)細(xì)胞，凍于-70℃。
根據(jù)His·Tag序列(6個連續(xù)組氨酸殘基)可結(jié)合固定于His·Bind金屬螯合樹脂的二價陽離子(Ni2+)的特性，利用親和層析從IPTG誘導(dǎo)AD494(DE3)/rpET21b(+)的可溶性細(xì)胞質(zhì)組分中純化該重組多肽。簡言之，從IPTG誘導(dǎo)的500mL培養(yǎng)物中獲得的沉淀細(xì)胞重懸于包含1mM PMSF的裂解緩沖液(20mM Tris，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.9)，超聲處理，12,000Xg離心20分鐘，去除碎片。將上清置于Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，Mississauga，Ontario，Canada)。利用250mM咪唑-500mM NaCl-20mM Tris pH 7.9洗脫His標(biāo)簽標(biāo)記的粘膜炎莫拉氏菌重組多肽。通過對PBS 4℃透析，從樣品中去除鹽和咪唑。利用MicroBCA (Pierce，Rockford，Illinois)測定從大腸桿菌可溶組分中獲得的重組多肽數(shù)量。
實(shí)施例8本實(shí)施例闡明該His標(biāo)簽的粘膜炎莫拉氏菌重組多肽與人腭扁桃體以及利用粘膜炎莫拉氏菌抗原性制劑免疫小鼠后收集的血清的反應(yīng)性。
如表3所示，在免疫印跡中，人腭扁桃體中存在的抗體可識別BVH-MC2、BVH-MC3和BVH-MC4His標(biāo)簽的重組多肽。表明與粘膜炎莫拉氏菌一般接觸的人形成特異性針對這些多肽的抗體。這些特別的人類抗體可能與防止粘膜炎莫拉氏菌感染有關(guān)。此外，免疫印跡還顯示，利用富含可在小鼠模型中誘導(dǎo)顯著肺清除的膜多肽的粘膜炎莫拉氏菌抗原性制劑免疫小鼠后收集的血清，還形成可識別BVH-MC2His標(biāo)簽的重組多肽的抗體。這些結(jié)果表明，在保護(hù)小鼠抗感染的粘膜炎莫拉氏菌抗原性制劑中存在該多肽，可誘導(dǎo)與相應(yīng)BVH-MC2His標(biāo)簽的重組多肽反應(yīng)的抗體。
表3.人腭扁桃體以及利用粘膜炎莫拉氏菌抗原性制劑免疫后的小鼠血清與粘膜炎莫拉氏菌His標(biāo)簽的融合重組多肽在免疫印跡中的反應(yīng)性。
1使用如實(shí)施例7所述制備并純化的His標(biāo)簽的重組多肽進(jìn)行免疫印跡。
2SDS-PAGE之后測定His標(biāo)簽的重組多肽的分子量。
3人腭扁桃體不經(jīng)稀釋，進(jìn)行免疫印跡。
4利用富含膜多肽的粘膜炎莫拉氏菌抗原性制劑免疫后收集的小鼠血清合并，稀釋1/500，進(jìn)行免疫印跡。這些小鼠可防止粘膜炎莫拉氏菌的攻擊。
實(shí)施例9本實(shí)施例闡明BVH-MC2、BVH-MC3、BVH-MC4和BVH-MC5多肽的抗體可接近粘膜炎莫拉氏菌菌株表面。
細(xì)菌在包含0.25％葡萄糖的腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中，于37℃、8％CO2環(huán)境中生長至OD490nm為0.650(～108CFU/ml)。然后加入抗BVH-MC2、抗BVH-MC3、抗BVH-MC4、抗BVH-MC5或?qū)φ昭澹?℃溫育振搖2小時，使之與細(xì)胞結(jié)合。樣品在封閉緩沖液[包含2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)]中洗滌4次，然后加入1ml利用封閉緩沖液特定稀釋的綴合熒光素(FITC)的山羊抗小鼠IgGFc(γ)片段。暗處振搖室溫再培養(yǎng)60分鐘后，樣品在封閉緩沖液中洗滌4次，利用0.25％甲醛的PBS緩沖液4℃固定18小時。細(xì)胞在PBS緩沖液中洗滌2次，重懸于0.5ml PBS緩沖液中。細(xì)胞于4℃暗處保存，直至流式細(xì)胞術(shù)分析(EpicsXL；Beckman Coulter，Inc.)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，BVH-MC2、BVH-MC3、BVH-MC4和BVH-MC5的特異性抗體可有效識別所檢測的同源(ETSU C-2)粘膜炎莫拉氏菌菌株表面暴露的相應(yīng)表位(表4)。已經(jīng)確定，在所分析的10,000個莫拉氏菌細(xì)胞中，超過70％標(biāo)記有特異性血清中的抗體。這些觀察清楚表明，這些多肽可到達(dá)細(xì)胞表面，而易于被抗體識別。表明抗粘膜炎莫拉氏菌抗體在防護(hù)粘膜炎莫拉氏菌感染中具有重要作用。
表4.測定BVH-MC2、BVH-MC3、BVH-MC4和BVH-MC5的特異性抗體于粘膜炎莫拉氏菌ETSU-C2完整細(xì)胞的表面的附著。
1小鼠皮下注射混合10μg QuilA佐劑(Cedarlane Laboratories，Hornby，Canada)的20μg純化的重組多肽，注射5次，間隔2周。血清按1/50稀釋。
2將利用免疫血清標(biāo)記細(xì)胞后獲得的熒光中間值除以利用對照小鼠血清獲得的熒光值，計算熒光指數(shù)。熒光值為1表示在完整莫拉氏菌細(xì)胞表面未結(jié)合抗體。
3標(biāo)記細(xì)胞占10,000個分析細(xì)胞的％。
4合并從未免疫或偽免疫(sham-immunized)小鼠收集的血清，稀釋1/50，作為該分析的陰性對照。
5將利用20μg純化的外膜多肽免疫小鼠獲得的血清稀釋1/1000，用作該分析的陽性對照。
實(shí)施例10本實(shí)施例闡明抗BVH-MC2小鼠血清的殺菌活性。
將細(xì)菌接種于巧克力瓊脂平板，在37℃、8％CO2環(huán)境中培養(yǎng)18小時。細(xì)菌細(xì)胞然后重懸于溶菌緩沖液[10％Hanks’平衡鹽溶液(HBSS)和1％水解酪蛋白，pH 7.3]，至OD490nm為0.25，稀釋為8×104CFU/ml.混合25μl細(xì)菌懸液、50μl稀釋的熱滅活待檢血清和15μl HBSS，37℃、8％CO2下振蕩(200轉(zhuǎn)/分)溫育15分鐘，進(jìn)行殺菌分析。然后加入終濃度10％的含補(bǔ)體的兔血清，混合物于37℃、8％CO2下再振蕩(200轉(zhuǎn)/分)溫育60分鐘。溫育結(jié)束時將10μl分析混合物接種巧克力瓊脂平板，測定活細(xì)菌數(shù)。將平板于37℃、8％CO2環(huán)境下溫育18-24小時。利用熱滅活的、免疫前收集的小鼠血清和兔補(bǔ)體溫育細(xì)菌，作為對照。
按下列數(shù)學(xué)式確定裂解％100-[AB×100]]]>A＝細(xì)菌與免疫血清溫育時得到的CFUB＝由放血前的血清得到的CFU使用粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658評價血清的殺菌活性。確定利用純化的重組BVH-MC2多肽(SEQ ID NO2)免疫后收集的小鼠血清的裂解百分比為71.3(表5)。
表5.評價抗BVH-MC2小鼠血清的殺菌活性。
1小鼠皮下注射混合10μg QuilA佐劑(Cedarlane Laboratories，Hornby，Canada)的20μg純化的重組多肽，注射5次，間隔2周。
2將利用20μg純化的外膜多肽免疫小鼠獲得的血清稀釋1/35，用作該分析的陽性對照。
實(shí)施例11本實(shí)施例闡明抗BVH-MC3小鼠血清的殺菌活性。
將細(xì)菌接種于巧克力瓊脂平板，在37℃、8％CO2環(huán)境中培養(yǎng)18小時。細(xì)菌細(xì)胞然后重懸于溶菌緩沖液[10％Hanks’平衡鹽溶液(HBSS)和1％水解酪蛋白，pH 7.3]，至OD490nm為0.25，稀釋到8×104CFU/ml.混合25μl細(xì)菌懸液、50μl稀釋的熱滅活待檢血清和15μl HBSS，37℃、8％CO2下振蕩(200轉(zhuǎn)/分)溫育15分鐘，進(jìn)行殺菌分析。然后加入終濃度10％的含補(bǔ)體的兔血清，混合物于37℃、8％CO2下再振蕩(200轉(zhuǎn)/分)溫育60分鐘。溫育結(jié)束時將10μl分析混合物接種巧克力瓊脂平板，測定活細(xì)菌數(shù)。將平板于37℃、8％CO2環(huán)境下溫育18-24小時。利用熱滅活的、免疫前收集的小鼠血清和兔補(bǔ)體溫育細(xì)菌，作為對照。使用粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658評價血清的殺菌活性。按下列數(shù)學(xué)式確定裂解％100-[AB×100]]]>A＝細(xì)菌與免疫血清溫育時得到的CFUB＝由放血前的血清得到的CFU在利用純化的重組BVH-MC3多肽免疫的7只小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)殺菌性抗體(表6)。對照小鼠的血清沒有記錄到殺菌活性(數(shù)據(jù)略)。
表6.評價抗BVH-MC3小鼠血清的殺菌活性。
1小鼠S1-S7皮下注射混合10μg QuilA佐劑(CedarlaneLaboratories，Hornby，Canada)的20μg純化的重組多肽，注射5次，間隔2周。
2從BVH-MC3免疫小鼠收集的每份小鼠血清按1/50稀釋。
3將利用20μg純化的外膜多肽免疫小鼠獲得的血清按1/50稀釋，用作該分析的陽性對照。
實(shí)施例12本實(shí)施例闡明通過用純化的重組BVH-MC3多肽免疫誘導(dǎo)的對小鼠抗粘膜炎莫拉氏菌感染的保護(hù)作用。
在10％QuilA佐劑(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)存在下利用20μg親和純化的His標(biāo)簽的粘膜炎莫拉氏菌重組BVH-MC3多肽、或單獨(dú)QuilA佐劑的PBS溶液作為對照，皮下免疫每組雌性BALB/c小鼠(Charles River)，免疫5次，間隔2周。在每次免疫前的第0、14、28、42和56天、以及第5次注射后的14天(第70天)，從眼窩采集血樣。一周以后，利用大約1×106CFU的粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658肺內(nèi)攻擊小鼠。將粘膜炎莫拉氏菌攻擊接種物接種于巧克力瓊脂板塊，以測定CFU，確證攻擊劑量。感染5小時以后，通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(EuthanylTM)處死小鼠。切下完整的肺，在組織勻漿器中勻漿。通過接種系列稀釋的肺勻漿液，測定CFU，評價細(xì)菌清除作用。按下列數(shù)學(xué)式確定清除％100-[AB×100]]]>A＝利用BVH-MC3多肽免疫的小鼠得到的CFUB＝由對照小鼠得到的CFU
如表7所示，利用BVH-MC3多肽免疫的小鼠與對照組小鼠相比，測定其活細(xì)菌數(shù)量減少54％。因此，利用重組BVH-MC3多肽免疫可促進(jìn)從小鼠肺中快速清除異種粘膜炎莫拉氏菌菌株。
表7.通過用純化的重組BVH-MC3多肽免疫小鼠的肺部清除莫拉氏菌
a6只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
b7只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
c利用1×106CFU的細(xì)菌肺內(nèi)攻擊小鼠，攻擊5小時后從肺中回收存活細(xì)菌。利用上述數(shù)學(xué)式計算清除％。
序列表<110>Shire Biochem Inc.
<120>粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏球菌屬)抗原<130>74872-83<150>US 60/290,653<151>2001-05-15<160>30<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1467<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>1atggacactg acatgaaaca tttaacaaaa catcgcctat cagctgccat cattggcgtt 60ttattattca ttagcccatc agtgcaagca aatacgacac accatcacac gctaaccagt 120agcgagctta aacttgctga tgatagtatt attgatagta tcaatcaatt gggtgagctg 180accgtcaata ttccaaatac acaatatttt caaaccaaca acggtgtgag cgttgctttt 240acgccattac atgagctgcc tattgtcgat atcagcttgt attttaatgc agggtcagcg 300tatgaccatc aggttggcaa atcaggcacg gctaacatgg ttgcaaccat gctcacccaa 360ggaactgaca gcctttctga agatgagttt gttgctgcca aagagcgtct tggcattgat 420tttaccagta cagcaaataa ggataactta actttatcat taagaagctt gtctgatcaa 480tcattattaa atcaagccgc cgatttaatg gtcgatgctg tcactcaacc tgcttttgat 540gataagactc tacaacgcaa caaaaatcag ctcatcacca gtttaaaaca aaaaaagcaa 600aacccttatc atgtagcttc tgttgcttat catcaagccg tatatgaaaa tcatccttat 660gcacacgcaa ccacaggcga tgaagatagt attgccaaaa ttgatcgtga tgagctgctt 720aatttttggc atacttttat taatgcaaat aatgcgacac tggtgattac aggtgatatg 780accgccgagc aagccaaatc acttgccaac catctgaccg ccaaattacc gacaggcaag 840tcgtataaaa atacgctgga tttgacaaaa ccagttaagg ctcgtcatat ccatattcct 900cacaacagta gtcaaaccca aatcatcatc ggtcatccca ccagtaaagt acgcacggac 960aaagcaggtc gtcaagagtt cagcgatttt tcattaggta atgaaatttt ggcaggtggt1020gattttaatg ccagattgat gaaaaccatt cgagagcaaa aaggctacac ttatggcatt1080tatggcggta tggaacgcct cagagcaggt ggtaattatg tggttgaatt ttcaaccgat1140ggcgataaag cagccgatgc cattttagag acgctacaca tcattaatga gtcgctgaat1200gaaggcataa cccaagaaga gcttgagttg gtgcgtttgg gcaataaaaa tggttttgcc1260
aatatttttt caagcaatgc cagtattcat cgtgtcattg gtgctttatt tgttgccgat1320tatccaaaag atcatcttaa ccatacgctc aatcgcttgg ataatgccac gataaatagt1380gttaataccg cactgaactt gcgtatcaag cctgatgaat ttatcatcat caccgtgggt1440aaaactaagc caaatttgga caaataa1467<210>2<211>488<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>2Met Asp Thr Asp Met Lys His Leu Thr Lys His Arg Leu Ser Ala Ala1 5 10 15Ile Ile Gly Val Leu Leu Phe Ile Ser Pro Ser Val Gln Ala Asn Thr20 25 30Thr His His His Thr Leu Thr Ser Ser Glu Leu Lys Leu Ala Asp Asp35 40 45Ser Ile Ile Asp Ser Ile Asn Gln Leu Gly Glu Leu Thr Val Asn Ile50 55 60Pro Asn Thr Gln Tyr Phe Gln Thr Asn Asn Gly Val Ser Val Ala Phe65 70 75 80Thr Pro Leu His Glu Leu Pro Ile Val Asp Ile Ser Leu Tyr Phe Asn85 90 95Ala Gly Ser Ala Tyr Asp His Gln Val Gly Lys Ser Gly Thr Ala Asn100 105 110Met Val Ala Thr Met Leu Thr Gln Gly Thr Asp Ser Leu Ser Glu Asp115 120 125Glu Phe Val Ala Ala Lys Glu Arg Leu Gly Ile Asp Phe Thr Ser Thr130 135 140Ala Asn Lys Asp Asn Leu Thr Leu Ser Leu Arg Ser Leu Ser Asp Gln145 150 155 160Ser Leu Leu Asn Gln Ala Ala Asp Leu Met Val Asp Ala Val Thr Gln165 170 175Pro Ala Phe Asp Asp Lys Thr Leu Gln Arg Asn Lys Asn Gln Leu Ile180 185 190Thr Ser Leu Lys Gln Lys Lys Gln Asn Pro Tyr His Val Ala Ser Val195 200 205Ala Tyr His Gln Ala Val Tyr Glu Asn His Pro Tyr Ala His Ala Thr210 215 220Thr Gly Asp Glu Asp Ser Ile Ala Lys Ile Asp Arg Asp Glu Leu Leu225 230 235 240Asn Phe Trp His Thr Phe Ile Asn Ala Asn Asn Ala Thr Leu Val Ile245 250 255
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ttattaaatc aagccgccga tttaatggtc gatgctgtca ctcaacctgc ttttgatgat 420aagactctac aacgcaacaa aaatcagctc atcaccagtt taaaacaaaa aaagcaaaac 480ccttatcatg tagcttctgt tgcttatcat caagccgtat atgaaaatca tccttatgca 540cacgcaacca caggcgatga agatagtatt gccaaaattg atcgtgatga gctgcttaat 600ttttggcata cttttattaa tgcaaataat gcgacactgg tgattacagg tgatatgacc 660gccgagcaag ccaaatcact tgccaaccat ctgaccgcca aattaccgac aggcaagtcg 720tataaaaata cgctggattt gacaaaacca gttaaggctc gccatatcca tattcctcac 780aacagtagtc aaacccaaat catcatcggt caccccacca gtaaagtacg cacggacaaa 840gcaggtcgtc aagagttcag cgatttttca ttaggtaatg aaattttggc aggtggtgat 900tttaatgcca gattgatgaa aaccattcga gagcaaaaag gctacactta tggcatttat 960ggcggtatgg aacgcctcag agcaggtggt aattatgtgg ttgaattttc aaccgatggc 1020gataaagcag ccgatgccat tttagagacg ctacacatca ttaatgagtc gctgaatgaa 1080ggcataaccc aagaagagct tgaattggtg cgtttgggta ataaaaatgg ttttgccaat 1140attttttcaa gcaatgccag tattcatcgt gtcattggtg ctttatttgt tgccgattat 1200ccaaaagatc atcttaacca tacgctcaat cgcttggata atgccacgat aaatagtgtt 1260aataccgcac tgaacttgcg tatcaagcct gatgaattt 1299<210>4<211>433<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>4Glu Leu Lys Leu Ala Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ser Ile Asn Gln Leu1 5 10 15Gly Glu Leu Thr Val Asn Ile Pro Asn Thr Gln Tyr Phe Gln Thr Asn20 25 30Asn Gly Val Ser Val Ala Phe Thr Pro Leu His Glu Leu Pro Ile Val35 40 45Asp Ile Ser Leu Tyr Phe Asn Ala Gly Ser Ala Tyr Asp His Gln Val50 55 60Gly Lys Ser Gly Thr Ala Asn Met Val Ala Thr Met Leu Thr Gln Gly65 70 75 80Thr Asp Ser Leu Ser Glu Asp Glu Phe Val Ala Ala Lys Glu Arg Leu85 90 95Gly Ile Asp Phe Thr Ser Thr Ala Asn Lys Asp Asn Leu Thr Leu Ser100 105 110Leu Arg Ser Leu Ser Asp Gln Ser Leu Leu Asn Gln Ala Ala Asp Leu115 120 125
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Ala Thr Glu Gln Gly Arg Phe Gln Asn Arg Arg Ile Glu Phe Val Leu515 520 525Phe Gln Glu Gly Glu Ala Ile Thr Gln Val Gly His Ala Glu Asp Ala530 535 540Pro Thr Pro Val Ala Gln Asn545 550<210>11<211>1251<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>11atggatacaa aacacattca gcaaaattgg cttctacctg atggtgtggc tgatgtacta 60tttaccgatg ctcaaaaaca agaaagcctg cgtgatgcct tgctatttgt gctaaccgca 120cacggttatc gcttggtgtc accaccatta atagagtata ccgaaagtct gctaaataat 180gctgacgaag atctaaaacg ccaaactttc aaatttatcg atcagctcaa tggtcgtttg 240atgggtttgc gtgccgatat tacgccacaa attctacgca ttgatagcaa atatggtcaa 300ggcatcagcc gttactgtta tgttgggcaa gttgtcaaaa ccctaccgac tggtctgttt 360gggctgcgta caccgcttca attgggtgct gagatttttg ggatagatga tatccgtgcc 420gagcttgagc tgattgatct attggccgca ttggcagatg agatcggact aggccgagag 480atgctacatg tggatattgg tcatgtcgct atttttgatc gcttgtgtca gttgcatggc 540gtttcaaata aagatgctga tgagctgatt ggcatttacc ataaaaaagc catgccagaa 600cttgccaaat ggtgccaaaa tattggcaat agcctaaaca gcccaagcga tgcaaccgat 660tttttggtat tggctaagca tacattaagc agtgatcgga caccaaatgc cgaggcttta 720ttaagtaaac tgtccgataa agctcgccaa gataataaaa tcatccaagc ggcaaatgag 780cttgctactt tggcggcaca tatcagagcg gtgggtatga gtgtgagtat tgatgtgact 840gaattgtcag gatatcatta tcatactggt gtggtattta atgtctattt gggtaataga 900accacacaga ctcaagcttt ggtacgaggc ggtcgctttg atggtatctc aactcacagc 960gtagcaaggg gcgcaactgg ttttagcatg gatattaatc gtttgcttga atttgtagag1020cttgaagaag atactgtgat tttggtggat tatcacgatt tgcaaaatgc tgatgcagac1080acaaaagctg atttggccac acaaattaaa accttgcaat ctgaaggctg tattgtcatt1140aagcctttga ctgtagatga taagcctaac cagattgatg gtgttttgca ttgggacacc1200gatcaagata agccgatttg ggcggtgcga ttagttggtg atgagtacta a 1251<210>12<211>416<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>12Met Asp Thr Lys His Ile Gln Gln Asn Trp Leu Leu Pro Asp Gly Val1 5 10 15Ala Asp Val Leu Phe Thr Asp Ala Gln Lys Gln Glu Ser Leu Arg Asp20 25 30Ala Leu Leu Phe Val Leu Thr Ala His Gly Tyr Arg Leu Val Ser Pro35 40 45Pro Leu Ile Glu Tyr Thr Glu Ser Leu Leu Asn Asn Ala Asp Glu Asp50 55 60Leu Lys Arg Gln Thr Phe Lys Phe Ile Asp Gln Leu Asn Gly Arg Leu65 70 75 80Met Gly Leu Arg Ala Asp Ile Thr Pro Gln Ile Leu Arg Ile Asp Ser85 90 95Lys Tyr Gly Gln Gly Ile Ser Arg Tyr Cys Tyr Val Gly Gln Val Val100 105 110Lys Thr Leu Pro Thr Gly Leu Phe Gly Leu Arg Thr Pro Leu Gln Leu115 120 125Gly Ala Glu Ile Phe Gly Ile Asp Asp Ile Arg Ala Glu Leu Glu Leu130 135 l40Ile Asp Leu Leu Ala Ala Leu Ala Asp Glu Ile Gly Leu Gly Arg Glu145 150 155 160Met Leu His Val Asp Ile Gly His Val Ala Ile Phe Asp Arg Leu Cys165 170 175Gln Leu His Gly Val Ser Asn Lys Asp Ala Asp Glu Leu Ile Gly Ile180 185 190Tyr His Lys Lys Ala Met Pro Glu Leu Ala Lys Trp Cys Gln Asn Ile195 200 205Gly Asn Ser Leu Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Asp Phe Leu Val Leu210 215 220Ala Lys His Thr Leu Ser Ser Asp Arg Thr Pro Asn Ala Glu Ala Leu225 230 235 240Leu Ser Lys Leu Ser Asp Lys Ala Arg Gln Asp Asn Lys Ile Ile Gln245 250 255Ala Ala Asn Glu Leu Ala Thr Leu Ala Ala His Ile Arg Ala Val Gly260 265 270Met Ser Val Ser Ile Asp Val Thr Glu Leu Ser Gly Tyr His Tyr His275 280 285Thr Gly Val Val Phe Asn Val Tyr Leu Gly Asn Arg Thr Thr Gln Thr290 295 300Gln Ala Leu Val Arg Gly Gly Arg Phe Asp Gly Ile Ser Thr His Ser305 310 315 320Val Ala Arg Gly Ala Thr Gly Phe Ser Met Asp Ile Asn Arg Leu Leu325 330 335
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<223>引物<400>15catcagtgca tatgaatacg acacaccatc acacg 35<210>16<211>40<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>16gagttattct cgagtttgtc caaatttggc ttagttttac 40<210>17<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物
<400>17tcagtgagat cttgaatacg acacaccatc 30<210>18<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>18gatttgagtt gtcgacttat ttgtccaaat ttg 33<210>19<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>19cggagtgcca tatgagctta attaataaat taaatg 36<210>20<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>20tataactcga ggttttgtgc aacaggtgtt g 31<210>21<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>21cgcttgagat cttggaagat gtgtatcagc gtgc34<210>22<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>22caataacaaa gctttcagtt ttgtgcaaca ggtgttg 37
<210>23<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>23aaccgcacat atgtatcgct tggtgtcacc acc 33<210>24<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>24ggtgactcga ggtactcatc accaactaat cgcac 35<210>25<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>25gcaggatcct tatcgcttgg tgtcacc27<210>26<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>26atcaatcggg tcgacttagt actcatcacc a 31<210>27<211>34<212>DNA<213>人工<220>
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<212>DNA<213>人工<220>
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<223>引物<400>29accattcaaa agagatcttg gcccaaagtc aagaatctg 39<210>30<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>30gttagaccga gtcgactcat tgaacatcag gca 3權(quán)利要求
1.包含選自下列多核苷酸的分離的多核苷酸(a)編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(b)編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(c)編碼與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(d)編碼包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物序列的多肽的多核苷酸；(e)編碼能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽的多核苷酸；(f)編碼多肽帶有表位的部分的多核苷酸，該多肽包含選自SEQID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(g)包含選自SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13或其片段或類似物的序列的多核苷酸；(h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
2.包含選自下列多核苷酸的分離的多核苷酸(a)編碼與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(b)編碼與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(c)編碼與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，該第二種多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(d)編碼包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽的多核苷酸；(e)編碼能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽的多核苷酸；(f)編碼多肽帶有表位的部分的多核苷酸，該多肽包含選自SEQID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(g)包含選自SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13的序列的多核苷酸；(h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
7.分離的多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)編碼多肽的DNA序列或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交；其中所述多肽包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
8.權(quán)利要求1的多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)編碼多肽的DNA序列或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交；其中所述多肽包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列。
9.權(quán)利要求2的多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)編碼多肽的DNA序列或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交；其中所述多肽包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14的序列。
10.權(quán)利要求1的多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)編碼多肽的DNA序列或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交；其中所述多肽包含來自包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。
11.權(quán)利要求2的多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)編碼多肽的DNA序列或(b)編碼多肽的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交；其中所述多肽包含來自包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。
12.包含權(quán)利要求1的多核苷酸的載體，其中所述DNA與表達(dá)控制區(qū)有效連接。
13.包含權(quán)利要求2的多核苷酸的載體，其中所述DNA與表達(dá)控制區(qū)有效連接。
14.利用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
15.利用權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
16.產(chǎn)生多肽的方法，其包含在適于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞。
17.產(chǎn)生多肽的方法，其包含在適于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞。
18.包含選自下列多肽的分離的多肽(a)與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽，該第二種多肽具有包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的氨基酸序列；(b)與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽，該第二種多肽具有包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的氨基酸序列；(c)與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽，該第二種多肽具有包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的氨基酸序列；(d)包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽；(e)能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽；(f)多肽帶有表位的部分，該多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸殘基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
19.包含選自下列多肽的分離的多肽(a)與第二種多肽具有至少70％同一性的多肽，該第二種多肽具有包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的氨基酸序列；(b)與第二種多肽具有至少80％同一性的多肽，該第二種多肽具有包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的氨基酸序列；(c)與第二種多肽具有至少95％同一性的多肽，該第二種多肽具有包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的氨基酸序列；(d)包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽；(e)能夠產(chǎn)生對包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽具有結(jié)合特異性的抗體的多肽；(f)多肽帶有表位的部分，該多肽包含選自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸殘基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
20.包含兩種或多種具有選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或類似物的序列的多肽的嵌合多肽；只要將所述多肽連接成嵌合多肽。
21.包含兩種或多種具有選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽的嵌合多肽；只要將所述多肽連接成嵌合多肽。
22.藥物組合物，其包含權(quán)利要求18-21任一項的多肽以及藥物可接受載體、稀釋劑或佐劑。
23.預(yù)防性或治療性治療易受莫拉氏菌感染宿主的莫拉氏菌感染的方法，其包含給予所述宿主預(yù)防或治療量的權(quán)利要求22的組合物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述宿主是新生兒、嬰兒或兒童。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述宿主是無免疫應(yīng)答的宿主。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述宿主是成年人。
27.治療性或預(yù)防性治療中耳炎、竇炎、持續(xù)性咳嗽、急性喉炎、化膿性角膜炎、新生兒結(jié)膜炎和侵襲性疾病的方法，其包含給予所述宿主治療或預(yù)防量的權(quán)利要求22的組合物。
28.診斷易受莫拉氏菌感染宿主的莫拉氏菌感染的方法，其包含(a)從宿主獲得生物樣品；(b)將該生物樣品與對權(quán)利要求18-21任一項的多肽具有反應(yīng)性的抗體或其片段溫育，以形成混合物；(c)在混合物中檢測表明存在莫拉氏菌的特異性結(jié)合的抗體或片段。
29.在包含或懷疑包含莫拉氏菌抗原的特異性抗體的生物樣品中檢測所述抗體的方法，其包含(a)從宿主獲得生物樣品；(b)將該生物樣品與權(quán)利要求18-21任一項的一種或多種多肽或其片段溫育，以形成混合物；(c)在混合物中檢測表明存在莫拉氏菌的特異性抗體的特異性結(jié)合的抗原或片段。
30.權(quán)利要求22的藥物組合物用于制備預(yù)防性或治療性治療莫拉氏菌感染的藥物中的用途。
31.試劑盒，其包含權(quán)利要求18-21任一項的多肽，用于檢測或診斷莫拉氏菌感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于預(yù)防、診斷和/或治療目的的粘膜炎莫拉氏菌(布蘭漢氏菌屬)多肽。
文檔編號A61P11/04GK101063141SQ200710102839
公開日2007年10月31日 申請日期2002年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月15日
發(fā)明者D·馬丁, J·哈邁爾, B·R·布羅德爾, S·里奧克斯, J·庫圖里 申請人:益得生物醫(yī)學(xué)公司