專(zhuān)利名稱(chēng)：聯(lián)合應(yīng)用抗血管生成和免疫治療以治療腫瘤和轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于一種抗血管生成治療和一種有針對(duì)性抗腫瘤免疫治療聯(lián)合用藥抑制原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移的方法。
背景技術(shù)：
新血管的產(chǎn)生或者說(shuō)血管生成，在惡性疾病的發(fā)生過(guò)程中有重要的作用，因此引起了人類(lèi)研發(fā)那些抑制血管生成藥物的極大興趣。(見(jiàn)例如Holmgren，L.，O’Reilly，M.S.和Folkman，J.(1995)“Dormacyof micrometastasesbalanced proliferation and apoptosis inthe presence of angiogenesis suppression”，Nature Medicine1，149-153；Folkman，J.(1995)“Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid and other disease”，Nature Medicine 1.27-31；O’Reilly，M.S.等(1994)“Angiostatina novelangiogenesis inhibitor that mediates the suppression ofmetastases by a Lewis lung carcinoma”，Cell 79，315-328；Kerbel，R.S.(1997)“A cancer therapy resistant toresistance”，Nature 390，335-336；Boehm，T.等，“Antiangiogenictherapy of experimental cancer does not induce acquired drugresistance”，Nature 390，404-7；Volpert，O.V.等(1998)“A human fibrosarcoma inhibits systemic angiogenesis and thegrowth of experimental metastases via thrombospondin-1”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)95，6343-6348。
已經(jīng)知道，在通過(guò)減少實(shí)體腫瘤血液供應(yīng)從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法中，可以應(yīng)用αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑抑制血管生成。見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,753,230(Brooks和Cheresh)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,766,591(Brooks和Cheresh)，其中描述道應(yīng)用合成多肽、單克隆抗體和擬態(tài)αvβ3等αvβ3拮抗劑，它們可以和αvβ3受體結(jié)合，從而抑制血管生成。
另外，還描述了抗體-細(xì)胞因子融合蛋白療法，它可以促進(jìn)免疫反應(yīng)介導(dǎo)的對(duì)諸如轉(zhuǎn)移癌等建立的腫瘤的抑制作用。例如，將細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(IL-2)融合到單克隆抗體重鏈，在兩個(gè)獨(dú)立的融合蛋白處，與腫瘤相關(guān)抗原-表皮細(xì)胞黏附分子(EP-CAM，KSA，KS1/4抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)；或分別通過(guò)應(yīng)用KS1/4和ch14.18抗體與二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD2發(fā)生免疫反應(yīng)，形成融合蛋白KS1/4-IL-2和ch14.18-IL-2。見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,650,150(Gillies)。
與特定靶向腫瘤腔隙(tumor compartment)療法一致的血管生成作用的脈管特異性抑制劑的識(shí)別有助于制定最有效的腫瘤治療方案。
血管生成的特征在于內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和繁殖，這是一種依靠細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用的過(guò)程。在本文中可以看到，αvβ3整聯(lián)蛋白的內(nèi)皮粘附受體對(duì)提供抗血管生成治療策略的血管特異性目標(biāo)具有關(guān)鍵作用。(Brooks，P.C.，Clark，R.A.，& Cheresh，D.A.(1994)“Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 forangiogenesis”，Science 264，569-571；Friedlander，M.，等(1995)“Defintion of two angiogeneic pathways by distinct alpha vintegrins”，Science 270，1500-1502)。在一些體內(nèi)模型中，不論αvβ3整聯(lián)蛋白的肽拮抗劑還是抗αvβ3抗體LM609的全身用藥，均可使移植的人類(lèi)腫瘤造成的新血管生成受到完全抑制，由此顯示出血管αvβ3整聯(lián)蛋白在血管生成作用中的必要性。(Brooks，P.C.，等，(1994)，Science supra；Brooks，P.C.，等，(1994)，“Integrinalpha v beta 3 antagonists promote tumor regression byinducing apoptosis of angiogenci blood vessels”，Cell 79，1157-1164)。鼠雜交瘤LM609于1987年9月15日保藏于布達(dá)佩斯條約國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)-美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)，ATCC保藏號(hào)為HB9537。此類(lèi)拮抗劑阻斷了整聯(lián)蛋白αvβ3的結(jié)扎，這可促進(jìn)新生的血管細(xì)胞調(diào)亡并因此破壞了新生血管的成熟，而后者是腫瘤增生擴(kuò)散的基本條件。
一般認(rèn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種選擇性的血管生成生長(zhǎng)因子，可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂。人體腫瘤活檢發(fā)現(xiàn)惡變細(xì)胞的VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而且臨近的內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體mRNA表達(dá)增強(qiáng)。在腫瘤到臨近的無(wú)血管的壞死區(qū)域中VEGF表達(dá)最強(qiáng)。(見(jiàn)Thomas等(1996)綜述“Vascular Endothelial Growth Factor，a Potent and Selective Angiogenic Agent”，J.Biol.Chem.271(2)603-606。利用針對(duì)性的VEGF受體的單克隆抗體抑制血管生成，可以進(jìn)行有效的抗腫瘤治療。(Witte.L.，等(1998)“Monoclonalantibodies targeting the VEGF receptor-2(F1K1/KDR)as ananti-angiogenic therapeutic strategy”，Cancer Metastasis Rev17(2)155-61。
對(duì)于有效治療擴(kuò)散的惡性病變的主要障礙包括以微轉(zhuǎn)移為特征的微小殘留腫瘤，其缺乏充足的血液供應(yīng)以實(shí)施治療。從這一點(diǎn)來(lái)看，利用腫瘤腔隙特異性單克隆抗體將細(xì)胞因子送到腫瘤的微環(huán)境中，這種新穎的免疫療法被證明是有效的。通過(guò)抗體—細(xì)胞因子融合蛋白的再結(jié)合，產(chǎn)生了能保持腫瘤特異性唯一的單克隆抗體和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，才能達(dá)到此目的。利用抗體-IL-2融合蛋白將IL-2轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤腔隙中，導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞激活，侵入腫瘤微環(huán)境，引起存在于三種不同的同源基因小鼠腫瘤模型中的微轉(zhuǎn)移灶的有效根治。(Becker，J.C.，等(1996)“Tcell-mediated eradicationof murine metastatic melanoma induced by targeted interleukin2 therapy”，J.Exp.Med 183，2361-2366；Xiang，R.，等，(1997)“Elimination of established murine colon carcinomametastases by antibody-interleukin 2 fusion protein therapy”Cancer Res.57，4948-4955；Lode，H.N.，等(1998)“Natural killercell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bonemarrow by targeted interleukin-2 therapy”，Blood 91，1706-1715)。這種指向腫瘤腔隙的方法雖然在腫瘤轉(zhuǎn)移早期非常有效，但在腔隙血管發(fā)育完全的腫瘤轉(zhuǎn)移晚期，只能延緩轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)。因此，我們致力于此問(wèn)題當(dāng)我們先后和同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用這兩種方法時(shí)，會(huì)不會(huì)對(duì)特異血管和指向腫瘤腔隙治療策略帶來(lái)一些有益的補(bǔ)充。
我們?cè)诮Y(jié)腸癌、惡性黑色素瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤三種同源基因鼠腫瘤模型上檢驗(yàn)了此方法，后者的特征是自發(fā)肝轉(zhuǎn)移灶。這三種模型全部都和人類(lèi)相同疾病非常相似。惡性黑色素瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型表達(dá)了二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD2，一種充分存在于諸如神經(jīng)外胚層惡性腫瘤的腫瘤相關(guān)抗原(Irie，R.F.，Matsuki，T.和Morton，D.L.(1989)“Human monoclonal antibody to ganglioside GM2 formelanoma treatment”，Lancet 1，786-787；Handgretinger，R.，等(1995)“A phase I study of human/mouse chimericantiganglioside GD2 antibody ch14.18 in patients withneuroblastoma”Eur.J Cancer 31A，261-267)；并且，結(jié)腸癌模型的特征為表達(dá)表皮細(xì)胞黏附分子(Ep-CAM、KSA、KS1/4抗原)-在人體被動(dòng)免疫治療中得以成功應(yīng)用的一種靶分子(Riethmuller G.，等(1994)“Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvanttherapy of resected Duke’s C colorectal carcinoma”，Lancet343，1177-1183)。在這些與人/鼠嵌合的抗GD2抗體(ch14.18-IL-2)(Gillies，S.D.等(1992)“Antibody-targeted interleukin 2stimulates T-cell killing of autologous tumor cells”，Proc.Natl.Acad Sci.(U.S.A)892，1428-1432)和人類(lèi)化的抗Ep-CAM(抗KSA、抗KS1/4抗原)抗體KS1/4-IL-2(Xiang，R.等(1997)見(jiàn)上文；Gillies，S.等(1998)“Antibody-IL-2 fusion proteinsare effective in SCID mouse models of prostrate and coloncarcinoma metastases”，J.Immunol.160，6195-6203)的抗體-IL-2融合蛋白靶向模型中，這些抗原特異性描述了腫瘤腔隙。正如在幾種動(dòng)物模型中所描述的，這些腫瘤模型的血管腔隙是通過(guò)在新生血管中表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3定義的。(Brooks，P.C.，等，(1994)，見(jiàn)上文)。這些數(shù)據(jù)顯示出，對(duì)原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移病灶的特異性靶向腫瘤和血管腔隙的同時(shí)和連續(xù)療法具有協(xié)同作用。認(rèn)為此協(xié)同作用的機(jī)制是減少血管形成，而且，僅在用此聯(lián)合療法治療的動(dòng)物身上觀察到炎癥反應(yīng)的加重。這些試驗(yàn)觀察強(qiáng)調(diào)了抗血管生成和腫瘤特異性抗腫瘤免疫治療的聯(lián)合療法的有益效果。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種方法用來(lái)治療需要此治療的病人的腫瘤細(xì)胞，該方法包括給所述病人服用抑制腫瘤細(xì)胞繁殖的血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑。對(duì)腫瘤細(xì)胞繁殖的抑制作用包括抑制腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還包括抑制其它腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成，甚至使腫瘤細(xì)胞死亡。血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑基本上可以同時(shí)和先后給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)一個(gè)病人聯(lián)合使用至少一種血管生成抑制劑和至少一種抗腫瘤免疫治療劑，本發(fā)明描述了對(duì)此病人治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。在此方法中，上述病人的腫瘤細(xì)胞繁殖得到了有效的抑制。
該病人可在通過(guò)外科手術(shù)以切除全部或部分腫瘤之前、同時(shí)或之后接受上述治療組合物治療?？梢酝ㄟ^(guò)浸泡、全身或局部靜脈注射(i.v.)、腹膜內(nèi)注射(i.p.)、皮下注射(s.c.)、肌肉注射(i.m.)、或直接注射到腫瘤中、和/或口腔服用適當(dāng)制劑。
適用于本發(fā)明的血管生成抑制劑是這樣一種制劑，它可以抑制新血管的形成(新血管生成作用)或抑制腫瘤細(xì)胞周?chē)M織已經(jīng)存在的毛細(xì)血管網(wǎng)的擴(kuò)大。合適的血管生成抑制劑可以是具有血管生成抑制活性的肽，例如腫瘤相關(guān)抗原PSA。其它合適的血管生成抑制劑可以是和血管生成作用相關(guān)的VEGF拮抗劑，例如細(xì)胞表面的VEGF受體拮抗劑。一種優(yōu)選的血管生成抑制劑是與細(xì)胞結(jié)合的αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑。在本發(fā)明的方法中使用的αvβ3拮抗劑是在靶組織或細(xì)胞中應(yīng)用時(shí)，在腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)組織中可以抑制血管生成的抑制劑。此拮抗劑可以是獨(dú)特的線形或環(huán)形多肽、線形或環(huán)形的含有RGD的多肽、抗體、或者是擬態(tài)αvβ3，它們與αvβ3受體結(jié)合，從而抑制血管生成。
既然αvβ3拮抗劑是一種抗體，就會(huì)期待有諸如多克隆、單克隆抗體，或其一種抗原結(jié)合片段，對(duì)αvβ3或αvβ3受體具有抗原特異結(jié)合性。一種優(yōu)選的和αvβ3整聯(lián)蛋白結(jié)合的單克隆抗體是標(biāo)記為L(zhǎng)M609(ATCC保藏號(hào)為HB 9537)的單克隆抗體。
優(yōu)選的血管生成抑制劑是多肽，該多肽是可以抑制靶細(xì)胞的整聯(lián)蛋白受體的αvβ3受體拮抗劑。一種αvβ3拮抗劑的最優(yōu)實(shí)施方案是合成的含RGD的環(huán)形肽(RGDfN-MeV)(SEQ ID NO11)等。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,262,520(Plow等)描述了這種普通型環(huán)形肽。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,780,426(Palladino等)中描述了不含RGD的肽。
適用于本發(fā)明方法的抗腫瘤免疫治療劑是這樣的免疫治療劑，它包括了一個(gè)細(xì)胞效應(yīng)器部分結(jié)合到腫瘤相關(guān)抗原靶部分。合適的細(xì)胞效應(yīng)器部分包括細(xì)胞毒性化學(xué)藥品，細(xì)胞毒性放射性同位素，和細(xì)胞信號(hào)制劑如細(xì)胞因子。
合適的腫瘤靶部分是多肽鏈，它和腫瘤細(xì)胞上或周?chē)M織基質(zhì)中的諸如受體蛋白鏈或免疫球蛋白鏈這些腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。
可用作免疫治療劑的靶子的與腫瘤相關(guān)的抗原包括AFP(甲胎蛋白)、CA125、CEA(癌胚抗原)、CD19、CD20、CD44、CD45、EGF受體、GD2、GD3、GM1、GM2、Her-2/Neu、Ep-CAM(KSA)、IL-2受體、Lewis-Y、Lewis-X(CD15)、惡性黑色素瘤相關(guān)的蛋白聚糖MCSP、PSA和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
優(yōu)選的免疫治療劑具有一個(gè)結(jié)合到靶部分的細(xì)胞效應(yīng)器部分，該細(xì)胞效應(yīng)器部分是一個(gè)細(xì)胞因子多肽鏈，靶部分是一種免疫球蛋白(Ig)多肽鏈。Ig多肽鏈包括了一個(gè)和腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的可變區(qū)域。優(yōu)選的是，當(dāng)所述免疫球蛋白鏈和適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)鏈結(jié)合時(shí)(例如一條重鏈和一條輕鏈互補(bǔ))，免疫球蛋白鏈就限定了一個(gè)與腫瘤相關(guān)的抗原具有特異性的抗體活性位點(diǎn)。
免疫治療劑的腫瘤靶標(biāo)Ig部分可以包括一個(gè)完整的免疫球蛋白鏈氨基酸序列或至少包括此蛋白質(zhì)的抗原特異結(jié)合部分的片段。因此，適當(dāng)?shù)腎g多肽鏈將至少具有一個(gè)對(duì)腫瘤相關(guān)的抗原特異性的Ig可變區(qū)域。
由此看來(lái)，適合用于本發(fā)明方法的抗體和多肽鏈將有一個(gè)可能屬于任何哺乳動(dòng)物起源的氨基酸序列。當(dāng)此抗體蛋白和預(yù)料的病人不具有相同起源時(shí)，就可以應(yīng)用諸如F(ab’)2、Fab、Fv或設(shè)計(jì)的Fv單鏈抗體蛋白的片段。為了更好的減少抗體蛋白的抗原性，可以通過(guò)改變此抗體的氨基酸序列，使此蛋白和病人正常抗體部分更加相似，以減少抗原性。例如，為了病人的使用，可以通過(guò)各種手段，使抗體人體化，把鼠單克隆抗體氨基酸序列改變的和人類(lèi)更相似。
另一種選擇是使抗體具有人類(lèi)源性(通常通過(guò)人類(lèi)Ig基因編碼)但由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生，將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)人類(lèi)Ig基因，而不是表達(dá)它們天然的Ig基因。例如以表達(dá)編碼人類(lèi)Ig蛋白的人類(lèi)源性的DNA建立轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)這種轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生單克隆抗體，將在鼠B細(xì)胞雜交瘤中表達(dá)人類(lèi)DNA編碼的具有人類(lèi)源性氨基酸序列的抗體。在用于病人治療中，這將大大地減少這些抗體的免疫原性。
在病人治療時(shí)，在要求專(zhuān)利保護(hù)的發(fā)明方法中使用的優(yōu)選抗體是人體化的抗GD2腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體ch14.18和抗KS1/4腫瘤相關(guān)抗原(也稱(chēng)為Ep-CAM和KSA)的單克隆抗體KS1/4。
適合應(yīng)用于本發(fā)明方法、組合物和試劑盒的免疫治療細(xì)胞效應(yīng)器部分是從下列細(xì)胞因子中選出的BDNF、CNTF、EGF、Epo、FGF、F1t3L、G-CSF、GM-CSF、I-309/TCA-3、gamma-IP-10、IFN alpha、IFN beta、IFN gamma、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、LT、MCP-1到MCP-3、M-CSF、MIF、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NGF、NT-3、NT-4、OSM、PBP、PBSF、PGFD、PF-4、RANTES、SCF、TGF alpha、TGF beta、TNF alpha、Tpo和VEGF。合適的細(xì)胞因子是趨化因子，趨化因子可選自C10、EMF-1 ENA-78、Eotaxin、GCP-2、HCC-1、I-309、IL-8、IP-10、Lymphotactin、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MGSA、MIG、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NAP-2、PF-4、RANTES、SCM-1和SDF-1。上述免疫治療劑的細(xì)胞因子部分可以是完整的細(xì)胞因子蛋白的氨基酸序列，或相應(yīng)足夠引出細(xì)胞因子特異性生物反應(yīng)的融合蛋白片段。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫治療的細(xì)胞因子部分具有IL-2生物活性。
在一個(gè)包含細(xì)胞因子多肽連接到一個(gè)Ig多肽的免疫治療劑中，一個(gè)細(xì)胞因子多肽和一個(gè)Ig多肽的合適連接部分包括一個(gè)直接的多肽鍵，一個(gè)在兩條鏈之間的多肽連接，或者兩條鏈之間包括利用生物素化作用和抗生物素蛋白復(fù)合體的其它的化學(xué)連接。不論是直接連接還是多肽之間的多肽連接都是優(yōu)選的連接方式。這種直接連接允許由用編碼融合蛋白免疫治療劑的合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞作為單獨(dú)的融合蛋白以表達(dá)免疫治療劑。
因此，在本發(fā)明中應(yīng)用的優(yōu)選免疫治療劑是一個(gè)雙功能融合蛋白，它具有一個(gè)細(xì)胞因子部分和腫瘤相關(guān)的抗原靶部分，其中靶部分是一個(gè)對(duì)某一個(gè)腫瘤相關(guān)的抗原具有特異性的Ig多肽鏈。那些優(yōu)選的免疫治療劑的實(shí)例包括GD2靶向融合蛋白ch14.18-IL-2，和KS1/4腫瘤相關(guān)的抗原(也稱(chēng)為Ep-CAM和KSA)靶向融合蛋白KS1/4-IL-2。
除此之外，適合應(yīng)用于本發(fā)明的另一個(gè)免疫治療方法、組合物和試劑盒可以有一個(gè)細(xì)胞效應(yīng)器部分，即細(xì)胞毒性制劑。合適的細(xì)胞毒性制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒性效應(yīng)，即免疫毒性、放射性同位素、細(xì)胞毒性藥物等。和上文描述的細(xì)胞因子免疫治療作用一樣，細(xì)胞毒性肽可以與腫瘤相關(guān)抗原靶Ig多肽連接，直接或通過(guò)連接肽或鏈間隔相連接形成融合蛋白?？梢灾圃彀蠭g鏈的化學(xué)性細(xì)胞毒素的化學(xué)連接，也可以構(gòu)建與抗體鏈連接的放射性同位素。
從另一方面看，本發(fā)明包含了一種治療方法組合物，它包含了一種血管生成抑制劑和一種抗腫瘤免疫治療劑。通過(guò)將一種腫瘤相關(guān)抗原特異性部分與細(xì)胞效應(yīng)器部分結(jié)合，使抗腫瘤免疫治療劑針對(duì)腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶是優(yōu)選的。在本發(fā)明的優(yōu)選的治療組合物中，抗腫瘤免疫治療劑是一種雙功能蛋白，該蛋白具有一個(gè)效應(yīng)器部分連接到一個(gè)腫瘤靶部分。效應(yīng)器部分是一個(gè)細(xì)胞因子多肽，腫瘤靶部分是一個(gè)免疫球蛋白(Ig)多肽鏈，其中所述Ig鏈包含了一個(gè)和腫瘤相關(guān)的抗原結(jié)合的可變區(qū)域。
然而，本發(fā)明的另一方面是一個(gè)用來(lái)治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的試劑盒。該試劑盒包括一個(gè)包裝，內(nèi)裝一種血管生成抑制劑，例如一個(gè)能夠抑制上述腫瘤或上述腫瘤轉(zhuǎn)移的血管生成的αvβ3拮抗劑，一個(gè)具有細(xì)胞因子活性和腫瘤抗原特異性的雙功能蛋白，和關(guān)于在腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移中治療腫瘤細(xì)胞的說(shuō)明。此試劑盒還可以包括特定的標(biāo)簽，對(duì)治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的試劑盒部分的用法作了簡(jiǎn)要說(shuō)明。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案參考下文附圖進(jìn)行描述，其中

圖1以圖表形式描述了用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和用抗體-IL-2融合蛋白的抗腫瘤腔隙特異性免疫療法聯(lián)合之后對(duì)原發(fā)腫瘤的治療效果。圖1A描述了通過(guò)皮下注射(2×106)NXS2神經(jīng)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生的對(duì)原發(fā)腫瘤的治療效果。圖1B描述了通過(guò)皮下注射(2×106)CT26-KSA結(jié)腸癌產(chǎn)生的對(duì)原發(fā)腫瘤的治療效果。圖1C描述了通過(guò)皮下注射(2×106)B78-D14惡性黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)原發(fā)腫瘤的治療效果。
圖2以圖表形式描述了聯(lián)合應(yīng)用抗血管和抗腫瘤治療對(duì)血管化作用和抗腫瘤免疫反應(yīng)的效果。圖2A描述的是不論以αv整聯(lián)蛋白拮抗劑、ch14.18-IL-2融合蛋白還是二者聯(lián)合對(duì)血管及腫瘤腔隙治療后(*P＜0.001，Student’s T試驗(yàn))，對(duì)原發(fā)腫瘤中血管密度的治療效果。圖2B描述了分別以血管和腫瘤腔隙治療后原發(fā)腫瘤的白細(xì)胞滲出結(jié)果(*P＜0.001，Student’s T試驗(yàn))。
圖3以圖表形式描述的是應(yīng)用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和用抗體-IL-2融合蛋白進(jìn)行的抗腫瘤腔隙特異性免疫治療，二者先后作用對(duì)自發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤肝轉(zhuǎn)移的治療效果。肝轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量通過(guò)肝臟病灶的顯微計(jì)數(shù)方法確定(n＝8)(**P＜0.01，WilcoxonRank-Sum檢驗(yàn))。
圖4以圖表形式描述的是應(yīng)用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗體-IL-2融合蛋白進(jìn)行的抗腫瘤腔隙特異性免疫治療，二者同時(shí)使用對(duì)自發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤肝轉(zhuǎn)移的治療效果。顯示了在原發(fā)腫瘤切除前(圖4A)或切除后(圖4B)以整聯(lián)蛋白或拮抗劑(17.5μg/h)和腫瘤特異性的ch14.18-IL-2融合蛋白(5μgx5)治療的效果。自發(fā)肝轉(zhuǎn)移的通過(guò)肝臟病灶的顯微計(jì)數(shù)方法確定(n＝8)(**P＜0.01，Wilcoxon Rank-Sum檢驗(yàn))。
發(fā)明詳述例如血管生成的抑制和靶向的免疫治療的原發(fā)腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的抑制和根治是癌癥交替治療策略的主要目的。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞處理上，在此稱(chēng)為(1)(抗血管生成)血管生成抑制療法和(2)抗腫瘤免疫療法，通過(guò)這兩種治療形式的聯(lián)合應(yīng)用，會(huì)有意外的有效協(xié)同效應(yīng)。特別是描述了αv拮抗劑治療和抗腫瘤抗原/細(xì)胞因子融合蛋白治療的聯(lián)合應(yīng)用。
腫瘤血管特異性抗血管生成的整聯(lián)蛋白αv拮抗劑和腫瘤特異性抗體-IL-2融合蛋白分別使用，在兩種單一的療法直接作用于血管和腫瘤腔隙時(shí)，發(fā)現(xiàn)會(huì)有一個(gè)協(xié)同作用。
這兩種單一療法同時(shí)和先后聯(lián)合使用，可以對(duì)免疫力低下的神經(jīng)母細(xì)胞瘤同源基因模型的自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移具有有效地根治作用。在與之相對(duì)照的對(duì)照組，不論單獨(dú)應(yīng)用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑還是抗體-IL-2融合蛋白，在使用劑量下只有部分作用。
而且，在三種模型，諸如惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤同源基因鼠腫瘤模型中，抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗體-IL-2融合蛋白同時(shí)使用時(shí)，可以顯著地引起原發(fā)腫瘤萎縮。但是當(dāng)這些療法單獨(dú)使用時(shí)，每種試劑只能延緩腫瘤的生長(zhǎng)。
伴隨著抗腫瘤反應(yīng)的是腫瘤血管密度減少50％同時(shí)腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞增加5倍。隨后，只在接受聯(lián)合治療的動(dòng)物中觀察到腫瘤壞死，而應(yīng)用每種制劑作為單一療法時(shí)則沒(méi)有此現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示，這些協(xié)同治療形式為將來(lái)轉(zhuǎn)移癌的治療提供了一種新穎而有效的工具。
本發(fā)明描述了腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶的處理方法，在此還描述了用于此協(xié)同治療實(shí)踐的治療的組合物和治療的試劑盒(便攜系統(tǒng))。
1.治療的組合物詳述了在本發(fā)明方法實(shí)踐中有益的多種治療組合物。組合物包括諸如αvβ3拮抗劑的(抗血管生成)血管生成抑制劑和諸如腫瘤抗原/細(xì)胞因子融合蛋白的抗腫瘤藥物，它們不但可單獨(dú)應(yīng)用，也可以不同形式聯(lián)合應(yīng)用。
A.血管生成抑制劑血管生成抑制劑可以抑制其處理過(guò)的組織的血管生成，因此這些制劑可以在本發(fā)明的組合物和方法中得以利用。一種優(yōu)選的血管生成抑制劑是αv拮抗劑，特別是αvβ3拮抗劑。一種抑制血管生成(抗血管生成)的αvβ3拮抗劑可能是一種肽、一種含RGD的肽、一種抗αvβ3抗體、一種抗αvβ3受體的抗體或者一種擬態(tài)αvβ3。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,753,230(Brooks和Cheresh)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,766,591(Brooks和Cheresh)的教程中詳述了典型的αvβ3拮抗劑。這些和αvβ3拮抗劑的準(zhǔn)備和應(yīng)用有關(guān)的公開(kāi)內(nèi)容在此特別引入作為參考。
優(yōu)選的拮抗劑是含RGD的肽，例如環(huán)肽環(huán)(RGDfN-MeV)(序列號(hào)11)。在文獻(xiàn)中詳述了包括有機(jī)擬態(tài)劑和具有αvβ3拮抗劑功能的不含RGD的環(huán)形肽在內(nèi)的其它拮抗劑。見(jiàn)例如Brooks等的國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO97/45137(PCT/US97/09158)。
用于確定一種αvβ3拮抗劑適用于用作拮抗劑的檢驗(yàn)方法在參考的美國(guó)專(zhuān)利中有詳述，因此可以認(rèn)為，能容易地鑒定用于本發(fā)明實(shí)踐的另外的拮抗劑。
可以將適當(dāng)?shù)目功羦β3單克隆抗體修改，使之包括抗原結(jié)合片段，其包括F(ab)2、Fab、設(shè)計(jì)的Fv或單鏈抗體蛋白(SCA)。用于制備這些片段的方法是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996)。描述抗體應(yīng)用的本發(fā)明方法也將適宜修飾的全抗體摻入到其抗原結(jié)合片段中。一種合適的單克隆抗體被確定為L(zhǎng)M609(ATCC保藏號(hào)HB9537)。
還觀察到其它的αvβ3受體拮抗劑對(duì)抑制血管生成有效，并適用于本發(fā)明。例如在多種哺乳動(dòng)物模型中測(cè)試了諸如10，11-二氫-3-[3-(吡啶-2-基氨基)-1-丙基氧基]-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-10-乙酸(稱(chēng)為SB-265123)(見(jiàn)例如Keenan RM等(1998)，Bioorg Med ChemLett 8(22)3171-6；Ward KW等(1999)，Drug Metab Dispos 27(11)1232-41)。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)被認(rèn)為是一種具有選擇性的血管生長(zhǎng)因子，因此，替代的或附加的血管生成抑制劑就可能是對(duì)血管生長(zhǎng)有足夠抑制作用的VEGF活性抑制劑。這樣的抑制劑可能是競(jìng)爭(zhēng)抑制劑或是VEGF結(jié)合/失活分子，或者是VEGF受體拮抗劑。例如，可能的抑制劑可以是一種和VEGF靶/受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的非血管生成VEGF化學(xué)擬態(tài)劑，一種修飾的非血管生成VEGF衍生物，一種和VEGF特異結(jié)合后能足夠抑制血管生成活性的抗體，或者可能是另一種和VEGF結(jié)合的特異性蛋白(例如分離的VEGF受體蛋白)，或者是和VEGF受體結(jié)合以阻斷與VEGF相互作用的抗體。
基于化合物的抑制血管生成的能力鑒定了其它化合物，例如分離的腫瘤相關(guān)的抗原PSA。
B.抗腫瘤免疫治療劑在本發(fā)明方法中應(yīng)用的方法和組合物預(yù)計(jì)要聯(lián)合使用至少一種抗腫瘤免疫治療劑和至少一種血管生成抑制劑(抗血管生成作用)。優(yōu)選的抗腫瘤治療劑同時(shí)具有細(xì)胞效應(yīng)器部分和腫瘤靶部分，諸如細(xì)胞因子、免疫毒素、放射性制劑等。優(yōu)選的腫瘤靶部分至少包含抗體的抗原結(jié)合部分，它直接針對(duì)一種腫瘤相關(guān)的抗原。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，效應(yīng)部分是一種細(xì)胞因子。
a)與腫瘤相關(guān)的抗原在本發(fā)明的使用方法、組合物和試劑盒中，腫瘤相關(guān)抗原是應(yīng)用免疫治療劑的靶子，最終針對(duì)的是腫瘤細(xì)胞。在本領(lǐng)域中，認(rèn)為腫瘤相關(guān)抗原和某些類(lèi)型的癌有關(guān)。在幾乎所有的情況下，腫瘤相關(guān)抗原是細(xì)胞表面抗原，在和癌腫起源有關(guān)的正常細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以一種異常的方式表達(dá)。其它的腫瘤相關(guān)抗原是分泌的分子或細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)成分，其不存在于成熟正常組織中。
一些腫瘤相關(guān)抗原是這些組織在發(fā)育早期階段表達(dá)的蛋白質(zhì)，和成熟組織沒(méi)有正常聯(lián)系(有時(shí)稱(chēng)為腫瘤胚胎蛋白)。其他腫瘤相關(guān)抗原在正常成熟細(xì)胞中有表達(dá)，但是癌細(xì)胞表達(dá)量更大。腫瘤相關(guān)抗原可以是正常細(xì)胞標(biāo)志物或細(xì)胞外基質(zhì)的變異體。盡管如此，其它腫瘤相關(guān)抗原與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或細(xì)胞外成分或碳水化合物的糖基化改變或異常結(jié)構(gòu)有關(guān)。
因此，腫瘤相關(guān)抗原可以有很大不同，至少部分上可以決定用本發(fā)明治療的腫瘤類(lèi)型。腫瘤類(lèi)型和表達(dá)的腫瘤抗原的變化因此是多種多樣的，而且已在癌癥領(lǐng)域中得到充分研究。
許多另外的腫瘤標(biāo)志物正在研究之中，一旦確認(rèn)并表征為一種腫瘤相關(guān)抗原，它們也就成為對(duì)某一種腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的特異性免疫治療的合適的靶抗原。
已經(jīng)有人報(bào)道利用抗Lewis-Y抗原的單克隆抗體作為癌細(xì)胞的靶向基因治療載體。(Kurane S等，Jpn J.Cancer Res 89(11)1212-9(1998)。同時(shí)還報(bào)道了利用抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM3抗體或抗Lewis-X抗原抗體的靶向脂質(zhì)體。(Nam，S.M.等Oncol Res 11(1)9-16(1999)。
正如下文討論的，用識(shí)別的抗原產(chǎn)生與此抗原特異結(jié)合的合適抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在此方式中，可以識(shí)別腫瘤抗原，并且可以制造在本發(fā)明中有用的單克隆抗體。制備腫瘤抗原的綜述參見(jiàn)Human Cancer Markers，The Human Press Inc.，eds.Sell andWahren，1982中的教程。可以利用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)制備抗原和/或細(xì)胞因子等，例如，Sambrook等(1989)MolecularCloning 2nded(Cold Spring Harbor Press，CSH NY)。
腫瘤細(xì)胞表面抗原可以是對(duì)一類(lèi)腫瘤特異性的，或者是對(duì)個(gè)別類(lèi)型腫瘤特異性的。和腫瘤相關(guān)抗原有關(guān)及編碼的許多核酸和/或氨基酸序列可以通過(guò)多種途徑經(jīng)過(guò)互聯(lián)網(wǎng)從公眾計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，例如NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心；www3.ncbi.nlm.nih.gov)；并且通常以名稱(chēng)和保藏編號(hào)標(biāo)識(shí)(一些可保藏的序列信息的類(lèi)型的非限制實(shí)例見(jiàn)注釋“保藏編號(hào)”)優(yōu)選的腫瘤相關(guān)抗原靶包括，且不限于，AFP(見(jiàn)保藏號(hào)NP001125)、CA125(見(jiàn)保藏號(hào)NP005890)、CEA(見(jiàn)保藏號(hào)AAA62835)、CD19(見(jiàn)保藏號(hào)P15391)、CD20(見(jiàn)保藏號(hào)P11836)、CD44(見(jiàn)保藏號(hào)P16070)、CD45(見(jiàn)保藏號(hào)P08575)、EGF受體(見(jiàn)保藏號(hào)P00533)、GD2、GD3、GM1、GM2、Her-2/Neu(見(jiàn)保藏號(hào)AAA58637)、Ep-CAM(KSA)(見(jiàn)保藏號(hào)P16422，AAA36151)、IL-2受體(見(jiàn)保藏號(hào)P14784，NP000197，P01589)、Lewis-Y、Lewis-X(CD15)、惡性黑色素瘤相關(guān)蛋白多糖MCSP(見(jiàn)保藏號(hào)NP001888)、PSA(見(jiàn)保藏號(hào)P07288)、PMSA、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(見(jiàn)保藏號(hào)NP003218，NP003225，AAF04564)、胰腺癌標(biāo)記蛋白GA733-1((見(jiàn)保藏號(hào)P09758)、葉酸鹽受體(見(jiàn)保藏號(hào)NP000793)、L6(見(jiàn)保藏號(hào)P30408)和C0-029(見(jiàn)保藏號(hào)A36056，P19075)。
用來(lái)于靶向免疫治療的特別優(yōu)選的腫瘤相關(guān)抗原靶是如本說(shuō)明書(shū)所描述的GD2，KSA(Ep-CAM；KS1/4抗原)。
腫瘤相關(guān)抗原可以商購(gòu)獲得，或者用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組和細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白表達(dá)技術(shù)制造。例如Sigma公司(St.Louis，MO)目錄中有二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD2(G0776)、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD3(G5904)、單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GM1(G7641)、單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GM2(G4651)、胃腸腫瘤抗原Ca19-9(G8660，G8535)、癌胚抗原CEA(C4835)、Lewis-X三糖(L5152)、和Lewis-Y(L7401)。
對(duì)許多這些腫瘤相關(guān)抗原特異性結(jié)合的抗體可以商購(gòu)獲得(Eg.USB，RDI，精細(xì)化學(xué)和科技公司，Zymed實(shí)驗(yàn)室)。例如Sigma公司(St.Louis，MO)銷(xiāo)售許多單克隆抗體，例如抗AFP(A8452)、抗CEA(C2331)、抗EGF受體(E3138)、抗IL-2溶解受體(I5652、I5777、I5902)、抗-CD19(F3899)、抗-CD20(C8080)、抗-CD44(C7923)和抗CD45(C7556)。
即使不能商購(gòu)獲得時(shí)，用已知的單克隆抗體制備方法，用抗原作為免疫原，可以制備和腫瘤相關(guān)抗原特異結(jié)合的抗體。例如已經(jīng)描述了抗Lewis-Y抗原鼠抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)域(見(jiàn)保藏號(hào)AAB25798和AAB25799)。同樣，抗缺乏唾液酸基的GM1神經(jīng)節(jié)甘酯鼠抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)域(見(jiàn)保藏號(hào)AAD9194和AAD9195)。已經(jīng)獲得了抗GD2神經(jīng)節(jié)甘酯單克隆抗體重鏈和輕鏈的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)保藏號(hào)2554841和2554842)。葉酸鹽受體結(jié)合抗體(結(jié)合蛋白)，被確定為卵巢癌的一種標(biāo)志物，也已經(jīng)有報(bào)道(見(jiàn)保藏號(hào)NP000793)。還報(bào)道了抗CA125單克隆抗體可變區(qū)域重鏈和輕鏈的核酸序列，并用來(lái)插入盒式載體(見(jiàn)保藏號(hào)AAB33454，33455)。
特別優(yōu)選的抗體是在此描述的ch14.18和KS1/4抗體。
b)單克隆抗體及其抗原結(jié)合部分等自從Kohler和Milstein首次報(bào)道了單克隆抗體制備方法以來(lái)，在本領(lǐng)域中有許多改進(jìn)方法變得眾所周知(見(jiàn)例如，Dean，C.J.在Methods in Molecular Biology Vol.80ImmunochemicalProtocols，2nded.(Pound，J.D.編輯，Humana Press，Inc.，TotowaNJ，1998)第四章，和Ausbel，F(xiàn).M.等Short Protocols in MolecularBiology，2nded.(Current Protocols，John Wiley&Sons，NY NY，1992)第11章)。現(xiàn)在制備和特異抗原結(jié)合的單克隆抗體已經(jīng)成為常規(guī)方法。如果需要，還可以改進(jìn)篩選方案以選擇高度親和力的抗體。
典型的產(chǎn)生雜交瘤的宿主來(lái)源于鼠類(lèi)或其它嚙齒動(dòng)物。
以鼠單克隆抗體重復(fù)用于病人治療的一個(gè)障礙是HAMA(人類(lèi)抗鼠抗體)，HAMA是病人對(duì)此治療的反應(yīng)所產(chǎn)生的。用來(lái)克服此障礙的方法包括通過(guò)以人體蛋白序列替換具有抗原性的鼠類(lèi)蛋白的氨基酸以將鼠抗體蛋白人體化，這假定會(huì)降低抗原性。其它方法涉及到將決定結(jié)合特異性的氨基酸殘余部分或區(qū)域移植于人體蛋白結(jié)構(gòu)。
在噬菌體表現(xiàn)系統(tǒng)表達(dá)抗體蛋白的能力允許選擇進(jìn)行了誘變后或者增加結(jié)合力，或者減少免疫原性的抗體。(見(jiàn)例如AntibodyEngineering(McCafferty，J.等編輯，Oxford University Press，1996)。最近，將人類(lèi)免疫球蛋白基因置換到轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)，允許利用鼠類(lèi)宿主產(chǎn)生抗體，而且這些單克隆抗體具有人類(lèi)核酸序列源性。
還可以通過(guò)破碎技術(shù)減小抗體的大小，以便減少抗原性，或產(chǎn)生更小的治療分子。例如，不論通過(guò)以恰當(dāng)?shù)拿赶€是通過(guò)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生更小的蛋白，一個(gè)完整的抗體分子都可以縮小。適當(dāng)?shù)钠伟ㄖ辽僖粋€(gè)完整抗體分子的抗原結(jié)合部分，并可以包含F(xiàn)ab、F(ab)2、F(ab)3、Fv或單鏈Fv(單鏈抗體，SCA)結(jié)構(gòu)。
可以想象，在本發(fā)明方法中用于人類(lèi)治療的治療劑的所有單克隆抗體基本組成部分，都可以通過(guò)修飾以降低免疫源性而受益，如上文所述的潛在的HAMA。
也可能利用與特定腫瘤相關(guān)抗原特異結(jié)合的特異受體蛋白，如上文所述的免疫治療劑的靶部分。從功能上看，對(duì)于依賴(lài)受體的特異性和對(duì)于靶腫瘤相關(guān)抗原親和力的靶向，特異性受體可以和特異性抗體一樣有用。需要小心的是，要減少不必要的相關(guān)腫瘤的相似蛋白的交叉反應(yīng)結(jié)合的影響。
c)細(xì)胞因子在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗腫瘤免疫治療結(jié)構(gòu)結(jié)合了一種優(yōu)選為細(xì)胞因子細(xì)胞效應(yīng)器成分。
本發(fā)明的抗腫瘤免疫治療效應(yīng)器成分包含任何一種細(xì)胞因子，以通過(guò)細(xì)胞支撐細(xì)胞因子受體產(chǎn)生細(xì)胞因子特異性生物學(xué)反應(yīng)。細(xì)胞因子已被充分特征，并且因此對(duì)本發(fā)明的解釋并不僅限于此。細(xì)胞因子包括稱(chēng)為趨化因子的子集合分子。在本發(fā)明的上下文中，趨化因子被認(rèn)為是細(xì)胞因子超級(jí)家族中的一員，因此本文中所用術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子一般指細(xì)胞因子和趨化因子。細(xì)胞因子領(lǐng)域的描述，見(jiàn)Callard和Gearing，The Cvtokine Facts Book，Academic Press，Inc.，1994。對(duì)趨化因子領(lǐng)域的描述，見(jiàn)Vaddi等The Chemokine Facts Book，Academic Press，Inc.，1997。和細(xì)胞因子有關(guān)的許多核酸和/或氨基酸序列可以通過(guò)多種途徑經(jīng)過(guò)互聯(lián)網(wǎng)從公眾計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)，即NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心；www3.ncbi.nlm.nih.gov)獲得；并且通常以名稱(chēng)和保藏號(hào)碼標(biāo)識(shí)(一些保藏的序列信息的類(lèi)型的非限制實(shí)例見(jiàn)注釋“保藏號(hào)碼”)。
從哺乳動(dòng)物獲得的細(xì)胞因子具有種屬特異性，并可以由于突變和/或等位改變而在種屬內(nèi)改變。合適的細(xì)胞因子可以從需要治療的哺乳動(dòng)物種屬中選擇使用。由于多重等位基因存在，可以根據(jù)細(xì)胞因子活性選擇，或等位變體混合物作為選定的細(xì)胞因子。因此，可以根據(jù)需要治療的動(dòng)物種屬，或者，如果目標(biāo)種屬的細(xì)胞因子無(wú)法得到，可以從更接近的相關(guān)種屬選擇一種細(xì)胞因子，制定本發(fā)明方法在獸醫(yī)中的應(yīng)用方法。在人類(lèi)治療中，已知的與人類(lèi)相同的細(xì)胞因子是優(yōu)選的。
適于在本發(fā)明中使用的細(xì)胞因子包括，并不僅限于，BDNF(見(jiàn)保藏號(hào)4502393)、CNTF(見(jiàn)保藏號(hào)4758020)、EGF(見(jiàn)保藏號(hào)p01133)、Epo(見(jiàn)保藏號(hào)4503589)、FGF(見(jiàn)保藏號(hào)CAB61690)、Flt3L、G-CSF(見(jiàn)保藏號(hào)CAA27290)、GM-CSF(見(jiàn)保藏號(hào)4503077)、I-309/TCA-3、gamma-IP-10(見(jiàn)保藏號(hào)P02778)、IFN alpha(見(jiàn)保藏號(hào)P01563)、IFN beta(見(jiàn)保藏號(hào)P01574)、IFN gamma(見(jiàn)保藏號(hào)P01579)、IL-1到IL-18(見(jiàn)保藏號(hào)P01583、P01584、P01585、P08700、P05112、P05113、P05231、P13232、P41324、P15248、P22301、P20809、P29459、P46658、P35225、P40222、P40933、Q14005、NP002181、Q14116)、LIF(見(jiàn)保藏號(hào)AAC05174)、LT(見(jiàn)保藏號(hào)4504031)、MCP-1到MCP-3、M-CSF(見(jiàn)保藏號(hào)4503075)、MIF(見(jiàn)保藏號(hào)4505185)、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NGF(見(jiàn)保藏號(hào)4505391)、NT-3(見(jiàn)保藏號(hào)P20783)、NT-4(見(jiàn)保藏號(hào)P34130)、OSM(見(jiàn)保藏號(hào)P13725)、PBP(見(jiàn)保藏號(hào)4505621)、PBSF、PGFD、PF-4、RANTES、SCF(見(jiàn)保藏號(hào)P21583)、TGF alpha(見(jiàn)保藏號(hào)P01135)、TGF beta(見(jiàn)保藏號(hào)P01137)、TNF alpha(見(jiàn)保藏號(hào)P01375)、Tpo(見(jiàn)保藏號(hào)P40225)或VEGF(見(jiàn)保藏號(hào)AAD03710)。
適于在本發(fā)明中使用的細(xì)胞因子包括，并不僅限于，C10(見(jiàn)保藏號(hào)P33861)、EMF-1(見(jiàn)保藏號(hào)P08317)、ENA-78(見(jiàn)保藏號(hào)A55010)、Eotaxin(見(jiàn)保藏號(hào)BAA84579)、GCP-2(見(jiàn)保藏號(hào)P80162)、HCC-1(見(jiàn)保藏號(hào)g1004267)、I-309(見(jiàn)保藏號(hào)g4506833)、IL-8(見(jiàn)保藏號(hào)AAA59158)、IP-9(見(jiàn)保藏號(hào)CAA75510)、IP-10(見(jiàn)保藏號(hào)4504701)、Lymphotactin(見(jiàn)保藏號(hào)4506853)、MCP-1(見(jiàn)保藏號(hào)4506841)、MCP-2(見(jiàn)保藏號(hào)P80075)、MCP-3(見(jiàn)保藏號(hào)CAB59723.1)、MCP-4(見(jiàn)保藏號(hào)Q99616)、MGSA(見(jiàn)保藏號(hào)P09341)、MIG(見(jiàn)保藏號(hào)P35625)、MIP-1alpha(見(jiàn)保藏號(hào)P10855)、MIP-1beta(見(jiàn)保藏號(hào)P13236)、MIP-2、NAP-2(見(jiàn)保藏號(hào)P20775)、PF-4(見(jiàn)保藏號(hào)4505733)、RANTES(見(jiàn)保藏號(hào)4506847)、SCM-1(見(jiàn)保藏號(hào)P47992)或SDF-1(見(jiàn)保藏號(hào)P48061)。在本發(fā)明中優(yōu)選應(yīng)用的細(xì)胞因子包括IL-2和IL-12，或它們的生物活性片段，即至少保留完整分子的效應(yīng)器活性部分。
在本發(fā)明中優(yōu)選的細(xì)胞因子是IL-2。
適合于在本發(fā)明方法中應(yīng)用的細(xì)胞因子可以通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以合適的核酸序列制備。基因表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是已知的(例如參見(jiàn)Goeddel，D.V.editor，Methods in EnzymologyVol.185Gene Expression Techology(Academic Press，Inc.，NY NY，1991)。細(xì)胞因子也可以商購(gòu)獲得(即Sigma公司，St.LouisMO)。
d)抗腫瘤/細(xì)胞因子免疫治療適合在本發(fā)明實(shí)踐中應(yīng)用的這些抗腫瘤免疫治療劑包含一種優(yōu)選為細(xì)胞因子的細(xì)胞效應(yīng)器組分連接到一種腫瘤靶部分?？梢酝ㄟ^(guò)許多方法將腫瘤靶部分連接到細(xì)胞效應(yīng)器組分。
1)抗體融合蛋白描述了免疫治療抗癌劑對(duì)攜帶有腫瘤抗原的細(xì)胞或組織的靶向細(xì)胞因子作用并通過(guò)使用細(xì)胞因子補(bǔ)充對(duì)細(xì)胞承載的或者與細(xì)胞有關(guān)的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。這些免疫治療劑被稱(chēng)為抗腫瘤抗原/細(xì)胞因子融合蛋白，因?yàn)榇巳诤系鞍装艘粋€(gè)細(xì)胞因子和重量組免疫球蛋白(Ig)多肽鏈的融合，此多肽鏈與預(yù)選的腫瘤相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。
正如在此使用的，免疫治療的抗腫瘤抗原/細(xì)胞因子融合蛋白制劑包括抗體蛋白片段和細(xì)胞因子之間的融合結(jié)構(gòu)，抗體蛋白片段包含至少一個(gè)抗原結(jié)合部分，細(xì)胞因子包含至少一個(gè)具有足夠的細(xì)胞因子生物信號(hào)功能的細(xì)胞因子效應(yīng)器組分。本發(fā)明的融合蛋白可以是直接連接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)多肽橋接。
在本領(lǐng)域，抗腫瘤抗原/細(xì)胞因子融合蛋白是已知的，而且是被具體描述的，例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,650,150(Gillies)中，其公開(kāi)的有關(guān)融合蛋白制備和使用的內(nèi)容在此特別引入做為參考。
融合蛋白可以與任何一種屬于細(xì)胞表面抗原的腫瘤抗原直接連接，因此，本發(fā)明不受到限制。例如，正如從單克隆抗體制備重組免疫球蛋白重鏈的過(guò)程一樣，用細(xì)胞因子和免疫球蛋白重鏈來(lái)制備融合蛋白的過(guò)程是已知的。另外，單克隆抗體的制備過(guò)程是一種已經(jīng)確定的方法，而且，如何制備針對(duì)那些腫瘤抗原的抗體也是已知的。關(guān)于單克隆抗體制備的教程見(jiàn)《Monclonal Antibodies and CancerTherapy》，Alan R.Liss，Inc.，eds，Reisfeld and Sell，1985。
典型的免疫球蛋白多肽鏈?zhǔn)且粋€(gè)免疫球蛋白重鏈或輕鏈多肽，它含有一個(gè)N端可變區(qū)域，該區(qū)域?qū)Τ休d細(xì)胞表面腫瘤抗原的細(xì)胞是特異的。典型的融合蛋白具有Ig多肽，該多肽在其羧基端基上通過(guò)肽鍵連接到細(xì)胞因子氨基酸的氨基端基上。當(dāng)免疫球蛋白多肽鏈?zhǔn)侵劓湥瑒t此免疫球蛋白重鏈更典型的包含CH1和CH2區(qū)域，并且可任選含有CH3區(qū)域。但是，如果有必要，可將這些穩(wěn)定區(qū)域除去以減少免疫源性、減少體積或與產(chǎn)生的融合蛋白結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)合。為了使有關(guān)的重鏈和輕鏈區(qū)域更加容易結(jié)合，可以要求構(gòu)建一個(gè)連接的Fv分子，其中，把一個(gè)重鏈Fv分子連接到一個(gè)輕鏈Fv分子上。連接位于一個(gè)鏈的羧基端到另一個(gè)鏈的氨基端，并且足夠長(zhǎng)，以免在再折疊/區(qū)域締合后較大的空間上改變抗原結(jié)合口袋。
一種優(yōu)選的融合蛋白包含細(xì)胞因子IL-2和一個(gè)與腫瘤相關(guān)抗原GD2發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種優(yōu)選的融合蛋白包含細(xì)胞因子IL-2和一個(gè)與腫瘤相關(guān)抗原Ep-CAM(也稱(chēng)為KSA、KS1/4抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈。這些實(shí)施方案中，融合蛋白的實(shí)例在下文中分別描述為ch14.18-IL-2和KS1/4-IL-2。
2)抗體綴合物還有一種免疫治療結(jié)構(gòu)可用于本發(fā)明方法和組合物。例如，利用具有高度親和力的生物素--抗生物素系統(tǒng)，可以利用適當(dāng)?shù)倪B接構(gòu)建含有腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體鏈連接到生物素(或抗生物素)的獨(dú)立的生物素化蛋白，和連接到適當(dāng)綴合物(抗生物素或生物素)的細(xì)胞因子。在應(yīng)用中，在服藥前或后，為了創(chuàng)造具有一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合組分和一個(gè)效應(yīng)器細(xì)胞因子組分的雙功能免疫治療劑，生物素化抗體蛋白可以在體外或在體內(nèi)與細(xì)胞因子蛋白經(jīng)生物素--抗生物素復(fù)合體結(jié)合。
在本領(lǐng)域中，生物素化抗體和蛋白是已知的，而且可以通過(guò)商購(gòu)試劑制備。應(yīng)用生物素化腫瘤抗原靶向抗體的一個(gè)特點(diǎn)是此生物素分子有多個(gè)抗生物素結(jié)合位點(diǎn)，這將允許該效應(yīng)器組分，例如抗生物素連接的細(xì)胞因子，與每一個(gè)抗體結(jié)合增強(qiáng)或不止一個(gè)效應(yīng)器組分聯(lián)合應(yīng)用。在本領(lǐng)域，其它的直接化學(xué)綴合方法和試劑也是已知的，并且直接或通過(guò)一個(gè)間接的連接，將抗體與效應(yīng)器分子綴合。(見(jiàn)例如Haugland and You，in Methods in Molecular Biology Vol.80Immunochemical Protocols，2nded.(Pound，J.D.editor，HumanaPress，Inc.，Totowa NJ，1998)chapter 17；and Hermanson，G.T.Bioconjugate Techniques(Academic Press，NY NY，1996)。因此正如上文所描述，本發(fā)明的免疫治療劑還包括生物素基化結(jié)構(gòu)，位于含有至少一個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體蛋白片段和細(xì)胞因子之間，細(xì)胞因子至少包含一個(gè)具有足夠的細(xì)胞因子生物信號(hào)功能的細(xì)胞因子效應(yīng)器部分。
e)其他免疫治療劑適用于本發(fā)明方法、組合物和試劑盒的抗腫瘤免疫治療劑包括一個(gè)不是細(xì)胞因子的效應(yīng)器部分。可以想象，細(xì)胞效應(yīng)器部分也可以是一種毒素或可以是破壞腫瘤細(xì)胞毒劑。因此，其它有效的抗腫瘤治療劑可包括含有至少一個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體蛋白片段和放射性同位素、免疫毒素、細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性藥物之間的構(gòu)建體。
1)放射性標(biāo)記抗體放射性免疫綴合物包括腫瘤靶向單克隆抗體和放射性標(biāo)記的同位素被用作抗癌藥。單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性提供了確定腫瘤位點(diǎn)的靶向能力，而放射性標(biāo)記提供了細(xì)胞毒性作用(見(jiàn)Hermanson，G.T.Bioconjugate Techniques(Academic Press，NY NY，1996)chapter 8)。這些放射性免疫綴合物可以適用于本發(fā)明方法中抗腫瘤治療劑。
2)免疫毒性抗體還檢測(cè)了通過(guò)多種來(lái)源提取的單克隆抗體的綴合物和蛋白毒素在抗腫瘤治療中的作用(見(jiàn)Hermanson，G.T.BioconjugateTechniques(Academic Press，NY NY，1996)chapter 8)，這些綴合物可以適用于本發(fā)明方法。
3)藥物細(xì)胞毒性抗體單克隆抗體和通過(guò)化學(xué)合成和/或從多種來(lái)源純化的藥物毒素的綴合物也可用于抗腫瘤治療(見(jiàn)Hermanson，G.T.BioconjugateTechniques(Academic Press，NY NY，1996)chapter 8)，這些綴合物可以適用于本發(fā)明方法。
4)多重特異性抗體通過(guò)酶消化產(chǎn)生的抗體片段或編碼DNA序列的操作可產(chǎn)生雙重特異性抗體(BsAbs)，即結(jié)合兩種具有不同結(jié)合特異性的抗體的雜合分子。在這種方法中，對(duì)腫瘤靶的特異性結(jié)合可與對(duì)細(xì)胞效應(yīng)器藥物(例如細(xì)胞因子、藥物或毒素)的結(jié)合相聯(lián)合，以對(duì)腫瘤細(xì)胞定位治療。(見(jiàn)例如French，R.R.，in Methods in Molecular Biology Vol.80 Immunochemical Protocols，2nded.(Pound，J.D.editor，Humana Press，Inc.，Totowa NJ，1998)chapter12)。這些雙重或其它多重抗體可以適用于本發(fā)明方法。
2.治療方法在本發(fā)明中，用于治療腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞的治療方法基于聯(lián)合應(yīng)用血管生成抑制劑(抗血管生成)治療和抗腫瘤免疫治療。不止一種血管生成抑制劑可以和不止一種抗腫瘤免疫治療劑聯(lián)合使用，這種聯(lián)合應(yīng)用可以是同時(shí)的、先后的或在治療當(dāng)中的間隔一段時(shí)間進(jìn)行。在一個(gè)療程中，任何一種特異性治療都可以使用不止一次。本發(fā)明方法提供了血管生成抑制治療和抗腫瘤免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用，其結(jié)果使每一種單獨(dú)療法的腫瘤細(xì)胞繁殖的抑制效果得到協(xié)同加強(qiáng)，提供了比單獨(dú)使用任一組成成分更加有效的治療。因此，在一方面來(lái)看，本發(fā)明方法包括給一個(gè)病人聯(lián)合服用一定量的一種血管生成抑制劑和一種抗腫瘤免疫治療劑，當(dāng)這些劑量的藥物單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，它們可能沒(méi)有有效的抑制血管生成和抗腫瘤細(xì)胞作用。
本發(fā)明方法包括許多形式，可以在發(fā)明中按步驟實(shí)施，例如，拮抗劑和抗腫瘤免疫治療劑(如在一種優(yōu)選實(shí)施方案中的一種腫瘤抗原/細(xì)胞因子融合蛋白)可以在混合后使用即同時(shí)使用、或先后使用即分開(kāi)使用。進(jìn)一步，拮抗劑和融合蛋白可以在一個(gè)大約3周的間隔時(shí)間內(nèi)分開(kāi)使用，即基本上從第一個(gè)活性藥物服用后的即刻到第一個(gè)藥物服用后大約3周。另外，預(yù)計(jì)順序是可以變化的，即αvβ3拮抗劑可以在使用融合蛋白之前使用，也可以按相反的順序使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還包括給一個(gè)需要治療腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的病人使用血管生成抑制劑量的一種血管生成抑制劑，例如αvβ3拮抗劑，以及使用足夠引出生物學(xué)應(yīng)答的一定劑量的抗腫瘤免疫治療劑。例如足夠引出一個(gè)細(xì)胞因子特異性生物學(xué)應(yīng)答，如雙功能融合蛋白有一個(gè)細(xì)胞因子和一個(gè)重建免疫球蛋白(Ig)多肽鏈，其中免疫球蛋白鏈包含一個(gè)可變區(qū)域與攜帶有腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，而其中的免疫球蛋白鏈和細(xì)胞因子通過(guò)一個(gè)肽鍵結(jié)合。而且當(dāng)一種免疫治療劑包括一種細(xì)胞毒性劑，這種劑量可以在腫瘤靶細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞毒性生物學(xué)應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以和把將腫瘤部分或全部切除的外科手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，從這個(gè)角度看，本方法可以在外科手術(shù)后使用，另外，外科手術(shù)可以在第一次有效藥物使用后到第二次有效藥物使用前的間隔內(nèi)實(shí)施。此方法的實(shí)例是現(xiàn)有方法和如下文所述的外科切除腫瘤的聯(lián)合應(yīng)用。
根據(jù)此方法的治療將包含在一個(gè)或多個(gè)使用循環(huán)中使用的治療組合物，例如當(dāng)采用同時(shí)服藥方法時(shí)，在一個(gè)循環(huán)中，從2天到大約3周的時(shí)間內(nèi)服用既含有αvβ3拮抗劑又含有抗腫瘤免疫治療劑的治療組合物，其后，根據(jù)醫(yī)師的判斷，可以根據(jù)需要重復(fù)此療程。同樣，當(dāng)預(yù)計(jì)采用先后服藥方法時(shí)，每一種單獨(dú)治療劑的服藥時(shí)間可以調(diào)整以典型地包括此相同時(shí)間，循環(huán)之間的間隔可以在0-2月間變化。
可以通過(guò)周期性單位劑量、連續(xù)灌注、持續(xù)灌輸、快速注射等完成。給藥途徑包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、常位注射、常位灌輸、口腔應(yīng)用等。
眾所周知，本發(fā)明方法應(yīng)用的治療組合物包含在可藥用載體內(nèi)的活性制劑，因此，關(guān)于本發(fā)明的解釋不僅限于此組合物，還包括在組合物內(nèi)的活性藥物濃度足夠用于釋放出所述劑量的活性藥物，典型的抗腫瘤免疫治療劑，諸如一種抗原靶向/細(xì)胞因子融合蛋白的劑量是每公斤體重每天0.01mg到10mg，優(yōu)選約0.1到1mg，更優(yōu)選約0.6mg。
抗腫瘤免疫治療劑，如抗原靶向細(xì)胞毒性藥物的劑量可以典型的從每公斤體重每天0.01mg到10mg，任選約0.1到1mg，更任選約0.6mg；而放射性藥物劑量可以根據(jù)需要的放射量相應(yīng)的調(diào)整。發(fā)現(xiàn)適用于放射治療的同位素包括鈷-57、銅-67、锝-99m、碘-123、碘-131和銦-111等。放射性藥物和劑量隨放射性同位素和靶組織而變化。惡性腫瘤的免疫放射治療可以用比傳統(tǒng)放療更高的劑量，因?yàn)槊庖咧委焺┦轻槍?duì)腫瘤局部和/或細(xì)胞。例如，以放射免疫治療劑來(lái)治療B-細(xì)胞型非何杰金氏淋巴瘤，發(fā)現(xiàn)靶B細(xì)胞的最大耐受劑量是0.4mCui/kg體重(1mCui＝37Mbq)(Witzig，TE等(1999)“Phase I/IItrial of IDEC-Y2B8 radioimmunotherapy for treatement ofrelapsed or refractory CD20(+)B-cell non-Hdgkin’e lymphoma”J.Clin.Oncol.17(12)3793-803)。但是靶向放射免疫治療劑對(duì)特殊的腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶可能比淋巴瘤的治療允許更高的耐受劑量。在裸鼠，可耐受使用兩個(gè)劑量為18.5Mbq的銦-111標(biāo)記抗體(SagaT等(1999)“Radioimmunotherapy of human glioma xenograftes innude mice by indium-111 labelled internalising monoclonalantibody”Eur.J.Cancer 35(8)1281-5)。
典型的αvβ3拮抗劑的劑量是每公斤體重每天10mg到1000mg，任選約20到100mg，更任選約50mg。
可以理解，腫瘤在所有動(dòng)物領(lǐng)域均可發(fā)現(xiàn)，在此描述的原則適用于所有通過(guò)αvβ3拮抗劑抑制血管生成和免疫系統(tǒng)存在細(xì)胞因子的動(dòng)物。因此，可以認(rèn)為本發(fā)明適用于所有動(dòng)物，尤其適用于人類(lèi)。
此外，眾所周知，有多種的腫瘤需要血管化以供其生長(zhǎng)，因此，是本發(fā)明的聯(lián)合治療形式的對(duì)象。包括起源于神經(jīng)外胚層、表皮等組織的腫瘤在內(nèi)，腫瘤誘導(dǎo)血管生成導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)。典型的腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶包括腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形細(xì)胞瘤、上皮癌、生殖細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血腫、肝胚細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、神經(jīng)管母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、畸胎瘤等腫瘤。
3.治療系統(tǒng)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)計(jì)(contemplate)系統(tǒng)包括包裝和/或試劑盒以提供實(shí)施本發(fā)明方法必需的試劑。一個(gè)用來(lái)治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞試劑盒包括一個(gè)包裝a)一種血管生成抑制劑，例如能夠在腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶中抑制血管生成的αvβ3拮抗劑。
b)一種抗腫瘤免疫治療劑，例如具有一個(gè)細(xì)胞因子和一個(gè)重構(gòu)免疫球蛋白(Ig)多肽鏈的一個(gè)雙功能融合蛋白，其中免疫球蛋白鏈包含一個(gè)可變區(qū)域與攜帶有腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，而其中的免疫球蛋白鏈和細(xì)胞因子經(jīng)一個(gè)肽鍵結(jié)合。以及c)在本方法中用來(lái)治療腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶的試劑使用說(shuō)明書(shū)。
在本發(fā)明的試劑盒內(nèi)的制劑被典型配制成在此所描述的治療組合物，因此，此制劑可以是適于分配在此試劑盒中的任何形式之一。這些形式可包括液體、粉末、藥片、混懸液等制劑，以提供本發(fā)明所用的拮抗劑和/或融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明方法，在該包裝中，這些制劑可以裝在分離的容器中，以適用于分別服藥；或在另一種情況下，也可以在一個(gè)容器中結(jié)合成一種組合物。
同樣地，此包裝可以含有任何其它的如上文所描述的抗腫瘤免疫治療劑，以替代或補(bǔ)充上文所描述的組分。
根據(jù)在此描述的治療方法，此包裝可以含有足夠一次或多次使用劑量的制劑。作為典型，一個(gè)包裝將含有足夠于一次按在此描述的治療周期所需的劑量。根據(jù)本發(fā)明方法，包裝的標(biāo)簽可以顯示其中的用于治療腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移灶的制劑是供聯(lián)合使用的還是先后使用的。此包裝的標(biāo)簽可以粘貼在每一種制劑瓶上，和/或粘貼在材料的完整包裝上。
本發(fā)明的一個(gè)試劑盒還含有包裝于內(nèi)部的“使用說(shuō)明書(shū)”，此說(shuō)明書(shū)涉及了根據(jù)本發(fā)明的方法，用來(lái)治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶的拮抗劑和融合蛋白的聯(lián)合使用方法。根據(jù)腫瘤、病人和疾病條件，此方法可以在一定范圍內(nèi)有很大程度的變化，此說(shuō)明書(shū)可以據(jù)此相應(yīng)調(diào)整為特定的程序。本發(fā)明并不僅限于說(shuō)明書(shū)內(nèi)容之內(nèi)考慮，還考慮到關(guān)于此發(fā)明方法的拮抗劑和融合蛋白聯(lián)合使用的特殊性。
同樣地，此制劑可以包括抗腫瘤免疫治療細(xì)胞毒性劑，例如連接到放射性標(biāo)記的同位素的腫瘤抗原結(jié)合抗體或例如細(xì)胞毒性肽或細(xì)胞毒性藥物等的細(xì)胞毒性劑。
4.合成肽的制備a.合成方法在下表1中列出的線形和環(huán)形多肽利用標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)合成，例如在下列文獻(xiàn)中有描述Merrifield，RB(1969)“Solid-PhasePeptide Synthesis”，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol Biol.，32221-96；Merrifield，RB(1969)“The Synthesis ofbiologically active peptides and proteins”，JAMA 210(7)1247-54；Fields，G.B.and Noble，R.L.，(1990)”Solid phasepeptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl aminoacids”，Int.J.Peptide Protein Res.，35(3)161-214。
首先將2克(g)BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe(SEQ IDNO 1)溶解在60毫升(ml)甲醇中，向其中中加入1.5ml 2N氫氧化鈉溶液形成混合物。此混合物在20度(20℃)下攪拌3小時(shí)，蒸發(fā)后用水處理殘留物，以稀鹽酸酸化到pH＝3，再用乙酸乙酯提取，提取物用Na2SO4干燥，再次蒸發(fā)，得到的BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 2)與20ml 2N HCl二噁烷在20℃攪拌2小時(shí)，將得到的混合物蒸發(fā)，得到H-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 3)，隨后將后者溶解在1800ml二氯甲烷和200ml二甲基甲酰氨的混合物中，隨即將其冷卻到0℃。然后，在攪拌下依次加入0.5g二環(huán)己基碳在二亞胺(DCCI)、0.3g 1-羥基苯并三唑(HOBt)和0.23ml N-甲基嗎啡。
得到的混合物再在0℃下攪拌24小時(shí)，然后在20℃下攪拌48小時(shí)，將溶液濃縮，用混合床離子交換劑處理以將其從鹽中游離出來(lái)。將得到的樹(shù)脂過(guò)濾后，將澄清的溶液蒸發(fā)，殘余物用色譜法純化，得到環(huán)(Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 4)。
在表1中列出的其它肽用單個(gè)字母編碼氨基酸殘基縮略語(yǔ)，并用肽數(shù)字名稱(chēng)標(biāo)識(shí)，這些肽用類(lèi)似方法得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val)(SEQ ID NO 5)、環(huán)(Arg-Ala-Asp-DPhe-Val)(SEQ ID NO6)、環(huán)(Arg-DAla-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 8)、環(huán)(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal)(SEQ ID NO 7)和環(huán)形(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(甲基化位于Val殘基的酰胺鍵的alpha氨基氮原子上)(SEQ ID NO11)。
按66203設(shè)計(jì)的肽，具有一個(gè)和肽62184相同序列，與后者唯一的不同是它含有鹽酸鹽而不是在62184(SEQ ID NO 5)中含有的TFA鹽。對(duì)于肽69601和62185(SEQ ID NO 6)及對(duì)于肽85189和121974(SEQ ID NO 11)來(lái)說(shuō)，都是同樣情況。
b.另一種合成方法
i.環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)TFA鹽(SEQ ID NO 11)的合成Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa(SEQ ID NO14)是用Merrifield型固相方法合成的，是通過(guò)逐步的方式向4-羥甲基-苯氧基甲基聚苯乙烯樹(shù)脂(Wang型樹(shù)脂)中先后加入NMeVal、DPhe、Asp(OBut)、Gly和Fmoc-Arg(Mtr)(通常應(yīng)用的肽合成Merrifield型方法)。聚苯乙烯樹(shù)脂和氨基酸殘基的前體可以從Aldrich、Sigma或Fluka化學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)到。當(dāng)氨基酸殘基順序增加完成后，用TFA/二氯甲烷1∶1比例的混合物，從肽鏈中消除樹(shù)脂，得到Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH(SEQ ID NO15)產(chǎn)物。然后用哌啶/DMF 1∶1的混合物將Fmoc基團(tuán)除去，得到Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH(SEQ ID NO 16)粗產(chǎn)品，然后通常用HPLC進(jìn)行純化。
為了環(huán)化，用85ml二氯甲烷(Aldrich)稀釋0.6gArg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH(在上面合成的)(SEQ ID NO 16)的15ml DMF(二甲基甲酰胺，Aldrich)溶液，并加入50mg NaHCO3。在干冰/丙酮混合物中冷卻后，加入40μl聯(lián)苯磷?；B氮化物(Aldrich)，在室溫放置16小時(shí)后，將溶液濃縮。濃縮液經(jīng)凝膠過(guò)濾(在異丙醇/水8∶2中Sephadex G10柱)，然后按常規(guī)方式進(jìn)行HPLC純化。用TFA(三氟乙酸)/水(98∶2)處理得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(在此還稱(chēng)為“環(huán)(RGDfN-MeV)”SEQ ID NO 11)xTFA，然后按常規(guī)方式用HPLC純化。RT＝19.5，F(xiàn)AB-MS(M+H)589。
ii.內(nèi)鹽的合成通過(guò)將環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQ ID NO 11)xTFA懸浮在水中，然后在真空下蒸發(fā)以去除TFA，從前面產(chǎn)生的環(huán)肽中去除TFA鹽。形成的環(huán)肽被稱(chēng)為一種“內(nèi)鹽”并被標(biāo)識(shí)為環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQ ID NO 11)。用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)鹽”是因?yàn)榄h(huán)肽含有兩個(gè)相反的電荷，內(nèi)部電子的相互平衡形成一個(gè)完全不帶電荷的分子。其中一個(gè)帶電殘基包含一個(gè)酸部分，而另一個(gè)帶電荷的殘基包含一個(gè)氨基部分。當(dāng)此酸性部分和此氨基部分互相緊密接近時(shí)，酸性部分可以被氨基部分去質(zhì)子化，形成一個(gè)有完全中性電荷的羧基/銨鹽類(lèi)。
iii.用鹽酸處理得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQ IDNO 11)xHCl將80mg環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQ ID NO 11)溶解在的0.01M HCl中5-6次，每次溶解操作后均冷凍干燥，隨后用HPLC純化得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQ ID NO 11)xHCl。FAB-MS(M+H)589。
iv.用甲烷磺酸處理得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQID NO 11)xMeSO3H將80mg環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQ ID NO 11)溶解在的0.01M MeSO3H(甲烷磺酸)中5-6次，每次溶解操作后均冷凍干燥，隨后用HPLC純化得到環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(SEQID NO 11)xMeSO3H。FAB-MS(M+H)589。
環(huán)化的替代方法包括用硫氫基對(duì)無(wú)環(huán)肽前體側(cè)鏈衍生化，并且，當(dāng)暴露在比正常生理pH條件(pH7.5)略高的環(huán)境中，該硫氫基與分子內(nèi)另一個(gè)硫氫基形成分子內(nèi)二硫鍵而形成環(huán)肽。另外，無(wú)環(huán)肽前體的C-端羧酸酯部分可以與此分子內(nèi)存在的游離硫氫基反應(yīng)以產(chǎn)生硫酯環(huán)形肽。
表1肽名稱(chēng) 氨基酸序列 SEQ ID NO62181環(huán)(GrGDFV) 462184(66203*)環(huán)(RGDfV) 562185(69601*)環(huán)(RADfV) 662187環(huán)(RGDFv) 762186環(huán)(RaDFV) 862175環(huán)(ARGDfL) 962179環(huán)(GRGDfL) 10121974(85189*) 環(huán)(RGDfN-MeV) 11112784 環(huán)(RGEfN-MeV) 12135981 環(huán)(RADfN-MeV) 13*帶一個(gè)星號(hào)命名的肽是在鹽酸中制備的，并且和同一行的肽在序列上是相同的；沒(méi)有星號(hào)的肽是在TFA中制備的。小寫(xiě)字母表示為D氨基酸，大寫(xiě)字母表示為L(zhǎng)氨基酸。
5.腫瘤特異性抗體-細(xì)胞因子融合蛋白和血管特異性αv拮抗劑的產(chǎn)生和特征Ch14.18-IL-2和huKS1/4-IL-2抗體-細(xì)胞因子融合蛋白的構(gòu)造和特征在先前已經(jīng)描述了(Xiang，R.，等(1997)；Gillies，S.，等(1992)同前)。兩種結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合特性與它們相應(yīng)抗體的此特性相同，并且其特異的IL-2活性與商購(gòu)獲得的rhIL-2相同。合成并表征了整聯(lián)蛋白αvβ3拮抗劑環(huán)肽121974(環(huán)(RGDfN-MeV))(SEQ ID NO11)和對(duì)照肽135981(環(huán)(RADfN-MeV))(SEQ ID NO 13)。
6.細(xì)胞系和動(dòng)物模型所有的細(xì)胞系和相應(yīng)的動(dòng)物模型均基本上按前文描述的方法建立(Becker，J.C.等(1996)；Xiang，R.，等(1996)；Lode，H.N.等(1998)見(jiàn)前文)。用抗鼠CD61(整聯(lián)蛋白β3鏈)抗體(Pharmingen，La Jolla，CA)證明在NXS2和CT26-KSA細(xì)胞上缺乏整聯(lián)蛋白αvβ3。當(dāng)以整聯(lián)蛋白αvβ3陽(yáng)性的B16FG3和B78-D14鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，兩種細(xì)胞系顯示與對(duì)照相比沒(méi)有FACS分析信號(hào)1μg抗小鼠CD61 mAb/106個(gè)細(xì)胞。而且，當(dāng)以抗GD2抗體ch14.18(10μg/ml4℃，24小時(shí))作為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，NXS2細(xì)胞不能在涂有抗小鼠CD61mAb(10μg/ml 4℃，24小時(shí))的塑料上粘附。但是所有腫瘤細(xì)胞通過(guò)FACS表達(dá)整聯(lián)蛋白αv，并粘附在玻璃體結(jié)合蛋白上，表明整聯(lián)蛋白αvβ5的存在。
對(duì)于所有的外科手術(shù)而言，小鼠是以注射氯胺酮(100mg/kgi.p.)和同時(shí)吸入甲氧氟烷(Pitman-Moore，Mundelein，IL)進(jìn)行麻醉。服用整聯(lián)蛋白αvβ3拮抗劑和對(duì)照肽所利用的是滲透泵(Alzet，model 2001，Palo Alto，CA)，以17.5μg/h的給藥量用藥。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)控制這些泵并且在無(wú)菌條件下將泵植入動(dòng)物背部的皮下組織。所有的泵在植入后第7天替換并在抗血管治療的第10天取出。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照NIH關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和應(yīng)用指南實(shí)施。
7.組織學(xué)與免疫組織化學(xué)原發(fā)腫瘤的丙酮固定、冷凍切片在4％山羊血清中孵育以阻斷非特異性結(jié)合。用抗小鼠CD31和抗小鼠CD45mAbs(Pharmingen，LaJolla，CA)(1∶100)孵育，然后在一個(gè)潮濕房間內(nèi)室溫下以羅丹明標(biāo)記的山羊抗大鼠抗體(1∶300)孵育。在每次孵育后用PBS(x3)洗滌，高倍視野(HPF)的血管和白細(xì)胞計(jì)數(shù)是在200x放大情況下顯微計(jì)數(shù)(Brooks，P.C.等(1995)“Anti-integrin alpha v beta 3blocks human breast cancer growth and angiogenesis in humanskin”，J.Clin.Inves.96，1815-1822)。分別在200x(血管)和800x(白細(xì)胞)將典型區(qū)域照相。
8.只有在用整聯(lián)蛋白αv拮抗劑和抗體IL-2融合蛋白聯(lián)合應(yīng)用時(shí)原發(fā)腫瘤才有減小在所有的三種共基因模型中，在小鼠中用已經(jīng)建立的皮下腫瘤(110-130μl)分別測(cè)定了血管生成抑制治療(整聯(lián)蛋白αv拮抗劑)和免疫治療(抗體IL-2融合蛋白)的協(xié)同效應(yīng)。
圖1以圖表形式描述了用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和用抗體-IL-2融合蛋白的抗腫瘤腔隙特異性免疫療法聯(lián)合之后對(duì)原發(fā)腫瘤的治療效果。圖1A描述了通過(guò)皮下注射(2×106)NXS2神經(jīng)母細(xì)胞瘤誘發(fā)的原發(fā)腫瘤的治療效果。圖1B描述了通過(guò)皮下注射(2×106)CT26-KSA結(jié)腸癌誘發(fā)的原發(fā)腫瘤的治療效果。圖1C描述了通過(guò)皮下注射(2×106)B78-D14惡性黑色素瘤細(xì)胞誘發(fā)的原發(fā)腫瘤的治療效果。對(duì)已經(jīng)建立的腫瘤(110-130mm3)的治療是以每天靜脈注射腫瘤特異性抗體-IL-2融合蛋白huKS1/4-IL-2(10μg，結(jié)腸癌)和ch14.18-IL-2(5μg，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，10μg，惡性黑色素瘤)(x5)作為開(kāi)始，并用一個(gè)滲透泵以17.5μg/h(最高)的劑量連續(xù)7天皮下灌注血管特異性整聯(lián)蛋白αv拮抗劑或?qū)φ针摹ｉ_(kāi)始治療的時(shí)間以一個(gè)黑色箭頭表示，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n＝6)中小鼠原發(fā)腫瘤的大小用顯微卡鉗測(cè)量(寬×長(zhǎng)×寬/2)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。接受聯(lián)合治療的小鼠原發(fā)腫瘤體積縮小的程度與此治療開(kāi)始時(shí)原有腫瘤的體積比較，在三個(gè)不同的共基因腫瘤模型中與所有對(duì)照形成相比比(P＞0.05)，具有統(tǒng)計(jì)顯著性(P＜0.001，Wilcoxon Rand-Sum試驗(yàn))。
首先，建立了每一種治療形式的亞理想劑量，并且開(kāi)始了隨后的聯(lián)合應(yīng)用。只有以抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗體-IL-2融合蛋白治療小鼠后，在所有的三種模型中腫瘤縮小了50到90％(P＜0.001)。事實(shí)上，沒(méi)有給出那些接種了神經(jīng)母細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞的半數(shù)動(dòng)物完全抵制了原發(fā)腫瘤。這和作為單獨(dú)治療方法的每一種療法分別相比，單獨(dú)治療最多比對(duì)照組延緩了生長(zhǎng)。每一種治療形式和聯(lián)合治療對(duì)血管和腫瘤腔隙的效果將隨后分析。
對(duì)已建立的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗血管生成和腫瘤特異性免疫治療聯(lián)合治療，在接種腫瘤細(xì)胞20天后外科切除腫瘤，進(jìn)行了組織學(xué)觀察。簡(jiǎn)要的說(shuō)，福爾馬林固定原發(fā)腫瘤，以石蠟包埋，隨后以蘇木精/伊紅染色，就可以確定壞死區(qū)域和白細(xì)胞滲出。
圖2以圖表形式描述了聯(lián)合應(yīng)用抗血管和抗腫瘤治療對(duì)血管化和抗腫瘤免疫應(yīng)答的效果。正如圖1所描述的建立了原發(fā)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的小鼠(n＝6)接受以血管特異性整聯(lián)蛋白cc、拮抗劑、非特異性肽對(duì)照和腫瘤特異性ch14.18-IL-2融合蛋白，包括接受每一種單獨(dú)治療的對(duì)照。在治療結(jié)束時(shí)，手術(shù)去除皮下腫瘤，對(duì)每一個(gè)腫瘤冰凍切片，分別用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有特異性的抗體(CD31)和對(duì)白細(xì)胞滲出有特異性的抗體(CD45)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。CD45是一種對(duì)ch14.18-IL-2融合蛋白誘導(dǎo)的腫瘤腔隙有特異性免疫應(yīng)答的滿(mǎn)意的標(biāo)志物，(Becker，J.C.，等(1996)見(jiàn)上文；Xiang，R.，等，(1997)見(jiàn)上文；Lode，H.N.，等(1998)見(jiàn)上文)。
圖2A描述的是用αv整聯(lián)蛋白拮抗劑、ch14.18-IL-2融合蛋白或者二者聯(lián)合對(duì)血管及腫瘤間質(zhì)治療(*P＜0.001，Student’s T試驗(yàn))，對(duì)原發(fā)腫瘤的血管密度的治療效果。圖2B描述了分別進(jìn)行血管和腫瘤腔隙治療后原發(fā)腫瘤的白細(xì)胞滲出結(jié)果(*P＜0.001，Student’s T試驗(yàn))。
接受整聯(lián)蛋白αv拮抗劑的小鼠顯示出血管化降低50％(圖2)，伴隨著原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)延遲，顯示出對(duì)血管腔隙有效。在這種情況下，腫瘤腔隙沒(méi)有受到直接影響(圖1)。作為對(duì)照，只接受抗GD2-IL-2融合蛋白治療的小鼠顯示出清楚的白細(xì)胞滲出，這是抗腫瘤腔隙直接治療的明確特征(Becker，J.C.，等(1996)見(jiàn)上文；Xiang，R.，等，(1997)見(jiàn)上文；Lode，H.N.，等(1998)見(jiàn)上文)，導(dǎo)致基本上減慢了皮下腫瘤的生長(zhǎng)(圖1)。
然而，和只接受抗GD2-IL-2融合蛋白治療的小鼠相比，只有聯(lián)合應(yīng)用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗GD2-IL-2融合蛋白治療小鼠時(shí)，才顯示出在白細(xì)胞滲出到腫瘤增加5倍，并顯示出血管化有同樣倍數(shù)的減少。炎癥細(xì)胞的增加可以通過(guò)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查證實(shí)，并歸因于巨噬細(xì)胞的流入，一種在壞死組織中清除細(xì)胞殘骸時(shí)經(jīng)常見(jiàn)到的現(xiàn)象。事實(shí)上，這些壞死區(qū)域只在接受了聯(lián)合治療后的腫瘤中出現(xiàn)，和分別用每一種治療組合物治療的對(duì)照組形成對(duì)照。
9.先后和同時(shí)血管和腫瘤靶誘導(dǎo)對(duì)自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移的根除除成功治療原發(fā)腫瘤外，一個(gè)更加中肯的問(wèn)題是這樣一種聯(lián)合抗血管和抗腫瘤特異性治療策略對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶有無(wú)影響。這在以自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移為特征的神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型中得到證實(shí)。針對(duì)此目的，以抗血管生成的整聯(lián)蛋白αv拮抗劑先后與以抗體IL-2融合蛋白進(jìn)行抗腫瘤免疫治療的聯(lián)合，以治療原發(fā)腫瘤。
圖3以圖表形式描述的是應(yīng)用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗體-IL-2融合蛋白進(jìn)行的抗腫瘤腔隙特異性免疫治療，二者先后聯(lián)合對(duì)自發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤肝轉(zhuǎn)移的治療效果。在建有原發(fā)腫瘤的小鼠中開(kāi)始抗血管治療，如圖1所示，共治療10天，原發(fā)腫瘤切除后，以每天靜脈注射5μg ch14.18-IL-2融合蛋白(x5)用于對(duì)小鼠腫瘤腔隙特異性免疫治療，自發(fā)肝轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量通過(guò)肝臟病灶的顯微計(jì)數(shù)方法確定(n＝8)(**P＜0.01，Wilcoxon Rank-Sum試驗(yàn))。
只有當(dāng)小鼠先后接受了兩種制劑，才會(huì)與所有對(duì)照相比引起肝轉(zhuǎn)移灶的1.5-2對(duì)數(shù)下降，對(duì)照只采用任一種制劑作為單獨(dú)治療是無(wú)效的(P＜0.01)(圖3)。事實(shí)上，接受了聯(lián)合治療小鼠有4/8顯示出肝轉(zhuǎn)移灶的完全消失，而其他動(dòng)物顯示出只有1-5個(gè)小轉(zhuǎn)移病變。實(shí)質(zhì)上，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和ch14.18-IL-2融合蛋白也有相同的結(jié)果(圖4上圖)。
圖4以圖表形式描述的是同時(shí)聯(lián)合用抗血管生成的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗體-IL-2融合蛋白進(jìn)行的抗腫瘤腔隙特異性免疫治療對(duì)自發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤肝轉(zhuǎn)移的治療效果。通過(guò)皮下注射2×106NXS2神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘發(fā)原發(fā)腫瘤，然后誘發(fā)自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移。在原發(fā)腫瘤切除前(圖4A)或切除后(圖4B)用整聯(lián)蛋白或拮抗劑(17.5μg/h)和腫瘤特異性的ch14.18-IL-2融合蛋白(5μgx5)治療。肝轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量通過(guò)肝臟病灶的顯微計(jì)數(shù)方法確定(n＝8)(**P＜0.01，Wilcoxon Rank-Sum試驗(yàn))。
依靠原發(fā)腫瘤切除前或后用藥，只有用兩種制劑治療小鼠，才顯示出肝轉(zhuǎn)移灶不僅完全消失(圖4A)，而且有1.5對(duì)數(shù)下降(圖4B)(P＜0.01)。這和所有只接受任何一種制劑作為單獨(dú)治療的對(duì)照組的無(wú)效形成對(duì)照。
10.聯(lián)合及有效治療的協(xié)同作用對(duì)惡性腫瘤的血管腔隙的血管進(jìn)行破壞是抗癌的一個(gè)有效策略。通過(guò)針對(duì)腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞，可以成功地治療腫瘤。通過(guò)血管生成的血管上表達(dá)的αv整聯(lián)蛋白相互作用(Brooks，P.C.，等，(1994)，Science supra；Friedlander，M.，等(1995)見(jiàn)上文)，針對(duì)血管的一種肽拮抗劑抑制血管形成并顯著地使腫瘤后來(lái)的生長(zhǎng)退化。這可以通過(guò)對(duì)三種侵襲性生長(zhǎng)的原發(fā)腫瘤和一種自發(fā)性轉(zhuǎn)移腫瘤的治療得以證明。當(dāng)所使用的αv整聯(lián)蛋白拮抗劑是主要針對(duì)αvβ3時(shí)，它也和密切相關(guān)的αvβ3整聯(lián)蛋白結(jié)合。已經(jīng)檢測(cè)的結(jié)腸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤明顯地缺乏αvβ3，但是可能表達(dá)一些αvβ5，惡性黑色素瘤模型也表達(dá)αvβ3。但是此整聯(lián)蛋白拮抗劑的效應(yīng)明顯地被限制于所有的這三種動(dòng)物模型的腫瘤血管，如在神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型所顯示的那樣(圖2)。重要的是，通過(guò)對(duì)腫瘤腔隙的同時(shí)攻擊，針對(duì)腫瘤血管的抗腫瘤效果得以放大，而對(duì)腫瘤腔隙的同時(shí)攻擊對(duì)抗原發(fā)腫瘤和抗自發(fā)性轉(zhuǎn)移均有效。這是特別相關(guān)的，因?yàn)樵谥委熐扒谐l(fā)腫瘤加快了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)及播散，這一發(fā)現(xiàn)由于在原發(fā)腫瘤切除后血管生成抑制劑循環(huán)水平的降低在其它腫瘤模型中被詳細(xì)地記錄(Holmgren，L.，等(1995)見(jiàn)上文；Folkman，J.(1995)見(jiàn)上文)。對(duì)血管和腫瘤腔隙的同時(shí)靶向治療被證明很有效，因?yàn)樗鼓[瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)下降和腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)破壞相結(jié)合，導(dǎo)致原發(fā)腫瘤的的退縮和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的根治。這和利用兩種不同的抗血管生成治療策略只是導(dǎo)致共基因模型中的皮下腫瘤生長(zhǎng)抑制的單獨(dú)的血管腔隙直接治療形成對(duì)照(Mauceri，H.J.等(1998)‘Combined effects of angiostatinionizing radiation in antitumor therapy”，Nature 394287-291)。
在本策略中，腫瘤腔隙特異性應(yīng)答是由炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的，炎癥細(xì)胞通過(guò)腫瘤特異性抗體-IL-2融合蛋白激活并針對(duì)腫瘤微環(huán)境。重要的是，雖然抗血管生成策略對(duì)抑制已經(jīng)建立血管供應(yīng)的原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)相當(dāng)有效，但當(dāng)其作為單獨(dú)治療方法時(shí)，對(duì)遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶的抑制則缺乏相同的效力(圖3、4)。但是，在以弱血管化作用為特征的一個(gè)有小腫瘤負(fù)荷的最小的特定殘余病變中，在此聯(lián)合治療中(arm)應(yīng)用的抗腫瘤腔隙治療在作為單獨(dú)治療方法時(shí)是相當(dāng)有效的(Xiang，R.，等，(1997)見(jiàn)上文；Lode，H.N.，等(1998)見(jiàn)上文)。在此情況下，抑制微轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的新血管形成和繼發(fā)的轉(zhuǎn)移灶的增大是抗血管生成治療的一個(gè)任務(wù)(Volpert，O.V.，等(1998)見(jiàn)上文)。反過(guò)來(lái)通過(guò)腫瘤腔隙針對(duì)性治療促進(jìn)了此微轉(zhuǎn)移灶的根治這種針對(duì)性治療對(duì)最小的殘余病變的著床(setting)有最佳療效的(Becker，J.C.，等(1996)見(jiàn)上文)。
對(duì)原發(fā)腫瘤和播散轉(zhuǎn)移灶的有效治療仍是臨床腫瘤學(xué)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。在本報(bào)告中的結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用特異性的抗血管生成和免疫治療在原發(fā)腫瘤的退縮和微轉(zhuǎn)移灶的根治中有協(xié)同作用。雖然兩種治療形式，即αv整聯(lián)蛋白拮抗劑和抗體-白細(xì)胞介素-2融合蛋白，作為單獨(dú)治療方法現(xiàn)正在進(jìn)行臨床評(píng)估，二者聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用為癌癥治療提供了一種新的有效的工具。
描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案的上述實(shí)施例是作為例證用的，當(dāng)然不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的特殊限制。而且，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的視界中的本發(fā)明已有的或后來(lái)開(kāi)發(fā)的這些變體都落在此后要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于治療病人體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括給該病人服用抑制腫瘤細(xì)胞增殖所需劑量的a)一種血管生成抑制劑，和b)一種抗腫瘤免疫治療劑，該治療劑包含一個(gè)細(xì)胞效應(yīng)器部分和一個(gè)與腫瘤相關(guān)的抗原靶向部分。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑基本上同時(shí)服用。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑在大約3周的時(shí)間間隔內(nèi)先后服用。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述血管生成抑制劑在抗腫瘤免疫治療劑前服用。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述該抗腫瘤免疫治療劑在血管生成抑制劑前服用。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述的服藥在所述時(shí)間間隔內(nèi)，當(dāng)通過(guò)手術(shù)從該病人切除腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶的同時(shí)實(shí)施。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的服藥在通過(guò)手術(shù)從該病人切除腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶之后實(shí)施。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的血管生成抑制劑是一種αvβ3拮抗劑。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的血管生成抑制劑是按每公斤體重每天10mg到1000mg的劑量服用。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑是按每公斤體重每天0.01mg到10mg的劑量服用。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述的αvβ3拮抗劑選自肽、含RGD肽、抗αvβ3單克隆抗體、αvβ3受體單克隆抗體和αvβ3擬態(tài)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的含RGD肽具有氨基酸殘基序列環(huán)(RGDfN-MeV)(SEQ ID NO.11)。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑的細(xì)胞效應(yīng)器組分是細(xì)胞因子。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述細(xì)胞因子選自BDNF、CNTF、EGF、Epo、FGF、Flt3L、G-CSF、GM-CSF、I-309/TCA-3、gamma-IP-10、IFN alpha、IFN beta、IFN gamma、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、LT、MCP-1、MCP-2、MCP-3、M-CSF、MIF、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NGF、NT-3、NT-4、OSM、PBP、PBSF、PGFD、PF-4、RANTES、SCF、TGF alpha、TGF beta、TNF alpha、Tpo和VEGF。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述的細(xì)胞因子是趨化因子，并且選自C10、EMF-1 ENA-78、Eotaxin、GCP-2、HCC-1、I-309、IL-8、IP-10、Lymphotactin、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MGSA、MIG、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NAP-2、PF-4、RANTES、SCM-1和SDF-1。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑的腫瘤相關(guān)抗原靶向組分是免疫球蛋白(Ig)多肽，該多肽含有一個(gè)和腫瘤相關(guān)抗原靶結(jié)合的可變區(qū)域。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的腫瘤相關(guān)抗原靶選自AFP、CA125、CEA、CD19、CD20、CD44、CD45、EGF受體、GD2、GD3、GM1、GM2、Her-2/Neu、Ep-CAM(KSA；KS1/4抗原)、IL-2受體、Lewis-Y、Lewis-X(CD15)、惡性黑色素瘤相關(guān)的蛋白多糖MCSP、PSA和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑包含細(xì)胞因子IL-2和一個(gè)與腫瘤相關(guān)的抗原GD2發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑包含細(xì)胞因子IL-2和一個(gè)與腫瘤相關(guān)的抗原KSA(Ep-CAM；KS1/4抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞是神經(jīng)外胚層或上皮細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞選自腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形細(xì)胞瘤、上皮癌、生殖細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血腫、肝胚細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、神經(jīng)管母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。
22.一種治療組合物，其中包含至少一種血管生成抑制劑，和至少一種抗腫瘤免疫治療劑，該抗腫瘤免疫治療劑包含一個(gè)細(xì)胞效應(yīng)器組分連接到一個(gè)與腫瘤相關(guān)抗原的靶向部分。
23.權(quán)利要求22的治療組合物，其中包含a)一定劑量的足以在腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶內(nèi)抑制血管生成的至少一種血管生成抑制劑；和b)一定劑量的足以引出一個(gè)生物學(xué)應(yīng)答的至少一種抗腫瘤免疫治療劑。
24.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的血管生成抑制劑是αvβ3拮抗劑。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述的αvβ3拮抗劑選自肽、含RGD肽、抗αvβ3單克隆抗體、抗αvβ3受體單克隆抗體和αvβ3擬態(tài)。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述的拮抗劑是具有環(huán)(RGDfN-MeV)(SEQ ID NO.11)氨基酸殘基序列的含RGD肽。
27.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑的細(xì)胞效應(yīng)器組分是細(xì)胞因子。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述的細(xì)胞因子選自BDNF、CNTF、EGF、Epo、FGF、Flt3L、G-CSF、GM-CSF、I-309/TCA-3、gamma-IP-10、IFN alpha、IFN beta、IFN gamma、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、LT、MCP-1、MCP-2、MCP-3、M-CSF、MIF、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NGF、NT-3、NT-4、OSM、PBP、PBSF、PGFD、PF-4、RANTES、SCF、TGF alpha、TGF beta、TNF alpha、Tpo和VEGF。
29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述的細(xì)胞因子是趨化因子，并且選自C10、EMF-1 ENA-78、Eotaxin、GCP-2、HCC-1、I-309、IL-8、IP-10、Lymphotactin、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MGSA、MIG、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NAP-2、PF4、RANTES、SCM-1和SDF-1。
30.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑的與腫瘤相關(guān)的抗原靶向組分是免疫球蛋白(Ig)多肽鏈，其包含一個(gè)和腫瘤相關(guān)的抗原靶結(jié)合的可變區(qū)域。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述的腫瘤相關(guān)抗原靶選自AFP、CA125、CEA、CD19、CD20、CD44、CD45、EGF受體、GD2、GD3、GM1、GM2、Her-2/Neu、Ep-CAM(KSA)、IL-2受體、Lewis-Y、Lewis-X(CD15)、與惡性黑色素瘤相關(guān)的蛋白多糖MCSP、PSA和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
32.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑是包含細(xì)胞因子IL-2和與腫瘤相關(guān)的抗原GD2發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈的融合蛋白。
33.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑是包含細(xì)胞因子IL-2和與腫瘤相關(guān)抗原KSA(Ep-CAM、KS1/4抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈的融合蛋白。
34.權(quán)利要求30的組合物，其中所述的與腫瘤相關(guān)的抗原靶是來(lái)自于神經(jīng)外胚層或上皮細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。
35.權(quán)利要求30的組合物，其中所述的與腫瘤相關(guān)的抗原靶來(lái)自選自下列的腫瘤細(xì)胞腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形細(xì)胞瘤、上皮癌、生殖細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血腫、肝胚細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、神經(jīng)管母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。
36.用于治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括a)一種能夠在該腫瘤或該腫瘤轉(zhuǎn)移灶中抑制血管生成的血管生成抑制劑；b)一種包含細(xì)胞效應(yīng)器組分和與腫瘤相關(guān)的抗原靶向組分的抗腫瘤免疫治療劑；和c)用該試劑治療腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶的應(yīng)用方法說(shuō)明書(shū)。
37.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的血管生成抑制劑是αvβ3拮抗劑。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述的αvβ3拮抗劑選自肽、含RGD肽、抗αvβ3單克隆抗體、抗αvβ3受體單克隆抗體和αvβ3擬態(tài)。
39.權(quán)利要求38的試劑盒，其中所述的含RGD肽是有氨基酸殘基序列為環(huán)(RGDfN-MeV)(SEQ ID NO.11)的肽。
40.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑的細(xì)胞效應(yīng)器組分是細(xì)胞因子。
41.權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述的細(xì)胞因子選自BDNF、CNTF、EGF、Epo、FGF、Flt3L、G-CSF、GM-CSF、I-309/TCA-3、gamma-IP-10、IFN alpha、IFN beta、IFN gamma、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、LT、MCP-1到MCP-3、M-CSF、MIF、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NGF、NT-3、NT-4、OSM、PBP、PBSF、PGFD、PF-4、RANTES、SCF、TGF alpha、TGF beta、TNF alpha、Tpo和VEGF。
42.權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述的細(xì)胞因子是趨化因子，并選自C10、EMF-1 ENA-78、Eotaxin、GCP-2、HCC-1、I-309、IL-8、IP-10、Lymphotactin、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MGSA、MIG、MIP-1alpha、MIP-1beta、MIP-2、NAP-2、PF-4、RANTES、SCM-1和SDF-1。
43.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑的與腫瘤相關(guān)的抗原靶組分是免疫球蛋白(Ig)鏈，其含有一個(gè)和腫瘤相關(guān)的抗原靶結(jié)合的可變區(qū)域。
44.權(quán)利要求43的試劑盒，其中所述的與腫瘤相關(guān)的抗原靶選自AFP、CA125、CEA、CD19、CD20、CD44、CD45、EGF受體、GD2、GD3、GM1、GM2、Her-2/Neu、Ep-CAM(KSA)、IL-2受體、Lewis-Y、Lewis-X(CD15)、與惡性黑色素瘤相關(guān)的蛋白多糖MCSP、PSA和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
45.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑是包含細(xì)胞因子IL-2和與腫瘤相關(guān)的抗原GD2發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈的融合蛋白。
46.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的抗腫瘤免疫治療劑是包含細(xì)胞因子IL-2和與腫瘤相關(guān)的抗原KSA(Ep-CAM、KS1/4抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)的免疫球蛋白重鏈的融合蛋白。
47.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶是神經(jīng)外胚層或上皮細(xì)胞。
48.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶選自腺瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、星形細(xì)胞瘤、上皮癌、生殖細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血腫、肝胚細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、神經(jīng)管母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。
49.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑在該包裝中以分別的容器提供。
50.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑在該包裝中結(jié)合在一個(gè)容器中。
51.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述的血管生成抑制劑和抗腫瘤免疫治療劑在該包裝中結(jié)合在一個(gè)容器中，并做出標(biāo)記以供聯(lián)合使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中用來(lái)治療腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移灶的方法,該方法包括給需要治療的哺乳動(dòng)物服用足以抑制血管生成的治療劑量的拮抗劑,并聯(lián)合服用治療劑量的抗腫瘤免疫治療劑,例如,具有細(xì)胞因子和足以引出細(xì)胞因子特異性生物學(xué)應(yīng)答的重構(gòu)免疫球蛋白多肽鏈的抗腫瘤抗原抗體/細(xì)胞因子融合蛋白。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1346279SQ00806134
公開(kāi)日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年2月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月12日
發(fā)明者H·N·洛德, R·A·雷斯菲爾德, D·A·徹雷斯, S·D·吉利斯 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院, 利思進(jìn)藥品公司