專利名稱：修飾的exendin和exendin激動劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型修飾的exendin和exendin激動劑，所述新型修飾的exendin和exendin激動劑具有與一個或更多個聚乙二醇聚合物(或其它增加分子量的試劑)連接的一個exendin或exendin激動劑肽，還涉及相關(guān)制品和方法，所述新型修飾的exendin和exendin激動劑及相關(guān)制品和方法可用于例如治療糖尿病(包括I型糖尿病和II型糖尿病)、可用于治療通過調(diào)節(jié)血漿葡萄糖水平的藥物而受益的疾病、并且可用于治療通過給予可用于調(diào)節(jié)胰高血糖素水平或甘油三酯水平或胃排空速率或進食量的藥物而受益的疾病，包括肥胖癥、進食障礙和胰島素抵抗綜合征。
背景技術(shù)：
以下描述包括可以有助于理解本發(fā)明的信息。但并不是承認本文提供的任一信息對現(xiàn)在要求保護的發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)，也不是承認具體或內(nèi)含的引用的任何出版物對于本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)。
所述exendin是在毒蜥和珠毒蜥(Mexican Bearded Lizard)(是美國亞利桑那州(Arizona)和北墨西哥州(Northern Mexico)內(nèi)陸(endogenous)爬行動物)的唾液分泌物中發(fā)現(xiàn)的肽。exendin-3[SEQ.ID.NO.1]存在于珠毒蜥(Heloderm horridum)(墨西哥毒蜥)的唾液分泌物中，而exendin-4[SEQ.ID.NO.2]存在于毒蜥(Helodlerm suspectum)的唾液分泌物中(Eng，J.等，J.Biol.Chem.，26520259-62，1990；Eng，J.等，J.Biol.Chem.，2677402-05，1992)。exendin-3的氨基酸序列示于

圖1中。exendin-4的氨基酸序列示于圖2中。首先認為exendin-4是毒液的一種(潛在有毒的)成分。現(xiàn)在看來exendin-4沒有毒性，并且它并不是在鈍尾毒蜥中的唾液腺內(nèi)產(chǎn)生。
所述exendin與胰高血糖素樣肽家族的數(shù)個成員具有某些序列相似性，與GLP-1[7-36]NH2[SEQ.ID.NO.3](Goke等，J.Biol.Chem.，26819650-55，1993)有最高同源性-53％。GLP-1[7-36]NH2，有時也稱為原胰高血糖素(proglucagon)[78-107]或者簡稱為“GLP-1”，有一種促胰島素(insulinotropic)效應(yīng)，刺激胰腺β細胞分泌胰島素；還報道GLP-1抑制胰腺α細胞分泌胰高血糖素(Φrsov等，Diabetes，42658-61，1993；D’Alessio等，J.Clin.Invest.，97133-38，1996)。已經(jīng)報道GLP-1抑制胃排空(Willms B等，J.Clin.Endocrinol. Metab.81(1)327-32，1996；Wettergren A等，Dig.Dis.Sci.38(4)665-73，1993)和胃酸分泌(Schjoldager BT等，Dig.Dis.Sci.34(5)703-8，1989；O’Halloran DJ等，J.Endocrinol.126(1)169-73，1990；Wettergren A等，Dig.Dis.Sci.38(4)665-73，1993)。據(jù)報道在其羧基末端有一個額外的甘氨酸殘基的GLP-1[7-37]，刺激人類胰島素分泌(Φrsov等，Diabetes，42658-61，1993)。其它報道涉及抑制胰高血糖素分泌(Creutzfeldt WOC等，在I型糖尿病患者中由外源胰高血糖素樣肽I(7-36)酰胺引起的胰高血糖素抑制作用(glucagonostatic actions)和禁食高血糖癥減少(Glucagonostatic actionsand reduction of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-likepeptide I(7-36)amide in Type 1 diabetic patients)，Diabetes Care 1996；19(6)580-6)和食欲控制中的意欲作用(Truton MD等，胰高血糖素樣肽-1在進食的中心調(diào)節(jié)中的作用(A role for glucagon-like peptide-1 in thecentral regulation of feeding)，Nature 1996年1月；379(6560)69-72)。據(jù)說至少部分負責GLP-1的促胰島素效應(yīng)的跨膜G蛋白腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)受體，據(jù)報道已將其從β-細胞系中克隆出來(Thorens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898641-45，1992)。近年來，由于報道GLP-1在放大刺激胰島素產(chǎn)生方面的作用，因此GLP-1一直是重要研究的焦點(ByrneMM，Goke B.Lessons from human studies with glucagon-like peptide-1Potential of the gut hormone for clinical use，載于Fehmann HC，Goke B.Insulinotropic Gut Hormone Glucagon-Like Peptide-1.Basel，瑞士Karger，1997219-33)。
還報道GLP-1恢復(fù)衰老大鼠的胰島葡萄糖敏感性，恢復(fù)其對更年幼大鼠的胰島葡萄糖敏感性的葡萄糖耐量(Egan JM等，Diabetologia1997年6月；40(增刊1)A130)。然而，GLP-1在體內(nèi)的生物作用時間短是所述肽的一種特征，這防礙了它作為治療藥物的開發(fā)。已嘗試了各種方法來延長GLP-1或GLP-1(7-37)的半壽期，包括試圖改變其氨基酸序列以及試圖采用某些制劑來傳遞它們(參見，例如，Darley等的歐洲專利申請，題目是“延長的肽傳遞，”公布號0 619 322 A2，關(guān)于在含有GLP-1(7-37)的制劑中包括聚乙二醇)。
藥理學研究已經(jīng)報道exendin-4可以在體外作用于某些分泌胰島素的細胞上的GLP-1受體、作用于來自豚鼠胰臟的散布腺泡細胞和作用于來自胃的壁細胞；也報道所述肽刺激促生長素抑制素釋放并且抑制分離的胃中的胃泌素釋放(Goke等，J.Biol.Chem.，26819650-55，1993；Schepp等，Eur.J.Pharmacol.，69183-91，1994；Eissele等，LifeSci.，55629-34，1994)。據(jù)報道發(fā)現(xiàn)exendin-3和exendin-4在胰腺腺泡細胞中刺激cAMP產(chǎn)生并且刺激從胰腺腺泡細胞中釋放淀粉酶(Malhotra，R.等，Regulatory Peptides，41149-56，1992；Raufman等，J.Biol.Chem.26721432-37，1992；Singh等，Regul.Pept.5347-59，1994)。exendin-4明顯比GLP-1的作用時間長。例如，在一個實驗中，已報道在糖尿病小鼠中exendin-4引起葡萄糖降低持續(xù)數(shù)小時，并且依賴于劑量，可持續(xù)多達24小時(Eng，J.exendin-4對db/db小鼠的高血糖癥的延長效應(yīng)(Prolonged effect of exendin-4 on hyperglycemia of db/dbmice)，Diabetes 1996年5月；45(增刊2)152A(摘要554))。根據(jù)它們的促胰島素活性，已提出應(yīng)用exendin-3和exendin-4治療糖尿病和預(yù)防高血糖癥(Eng，美國專利第5,424,286號)。
Chen和Drucker(他們從鈍尾毒蜥中克隆出exendin基因)報道了顯示exendin不是哺乳動物GLP-1的種同系物的研究結(jié)果(J.Biol.Chem.272(7)4108-15(1997))。觀察到鈍尾毒蜥還具有原胰高血糖素的分離的基因(由所述基因加工出GLP-1)，所述原胰高血糖素比exendin更類似于哺乳動物原胰高血糖素，這一觀察表明exendin不是GLP-1的唯一種同系物。
使用exendin激動劑調(diào)節(jié)胃腸能動性的方法描述于1997年8月8日申請的、共同擁有的美國專利申請順序號08/908,867，題目是“調(diào)節(jié)胃腸能動性的方法，”所述申請是1996年8月8日申請的美國專利申請順序號08/694,954的部分連續(xù)申請。
使用exendin激動劑減少進食量的方法描述于1998年1月7日申請的、共同擁有的美國專利申請順序號09/003,869，題目是“應(yīng)用exendin及其激動劑減少進食量，”所述專利申請要求以下美國臨時申請?zhí)柕臋?quán)益1997年1月7日申請的60/034,905、1997年8月7日申請的60/055,404、1997年11月14日申請的60/065,442和1997年11月14日申請的60/066,029。
新型exendin激動劑化合物描述于1998年8月6日申請的、共同擁有的PCT申請順序號PCT/US98/16387，題目是“新型exendin激動劑化合物，”所述PCT申請要求1997年8月8日申請的美國專利申請順序號60/055,404的權(quán)益。
其它新型exendin激動劑描述于1998年11月13日申請的、共同擁有的PCT申請順序號PCT/US98/24210，題目是“新型exendin激動劑化合物，”所述PCT申請要求1997年11月14日申請的美國臨時申請?zhí)?0/065,442的權(quán)益。
還有的其它新型exendin激動劑描述于1998年11月13日申請的、共同擁有的PCT申請順序號PCT/US98/24273，題目是“新型exendin激動劑化合物，”所述PCT申請要求1997年11月14日申請的美國臨時申請?zhí)?0/066,029的權(quán)益。
exendin相關(guān)技術(shù)方面的其它最新進展描述于1998年2月13日申請的美國臨時專利申請順序號60/075,122，題目是“exendin和GLP-1的收縮能效應(yīng)和利尿效應(yīng)”；以及描述于1998年1月14日申請的美國臨時專利申請順序號60/116,380，題目是“新型exendin激動劑制劑及其給藥方法”。
治療肽和治療蛋白的聚乙二醇(PEG)修飾可以既產(chǎn)生優(yōu)點又產(chǎn)生缺點。PEG修飾可以導(dǎo)致肽的循環(huán)時間增加、抗原性和免疫原性降低、溶解度增加、抵抗蛋白酶水解、生物利用度增加、毒性降低、穩(wěn)定性增加并且更易配制(參見，F(xiàn)rancis等，International Journal of Hematology，681-18，1998)，而在大多數(shù)情況下使用PEG化(PEGylation)的問題是生物活性顯著降低(出處同前)。另外，大多數(shù)方法涉及應(yīng)用具有數(shù)種類型副作用(包括免疫原性、不穩(wěn)定性、毒性和反應(yīng)性)的連接物(出處同前)。
本文描述了并且要求保護修飾的exendin和exendin激動劑及相關(guān)制劑、給藥制劑以及解決這些問題的方法和可用于傳遞治療有效量的exendin和exendin激動劑的方法。
上述文章、專利和專利申請以及所有其它本文提及或引用的文件的內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。本發(fā)明人保留將得自任何這類文章、專利、專利申請或其它本文提及或引用的任何文件的所有材料和信息實際上加入到本申請中的權(quán)利。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新型修飾的exendin和exendin激動劑，所述新型修飾的exendin和exendin激動劑具有與一個或更多個增加分子量的化合物(其中有聚乙二醇聚合物(或其它增加分子量的試劑))連接的exendin或exendin激動劑，還涉及相關(guān)制品和方法。這樣的制品和方法可用于許多應(yīng)用，包括例如可用于治療糖尿病，包括I型糖尿病和II型糖尿病、妊娠糖尿病(參見1999年6月1日申請的美國專利申請順序號09/323,867，題目是“應(yīng)用exendin及其激動劑治療妊娠糖尿病，”)；可用于治療通過調(diào)節(jié)血漿葡萄糖水平的藥物而可能受益的疾??；可用于治療通過給予可用于調(diào)節(jié)胃排空速率或進食量的藥物而可能受益的疾病，包括肥胖癥、進食障礙和胰島素抵抗綜合征；可用于調(diào)節(jié)甘油三酯水平以及治療患有血脂異常(即，LDL膽固醇增加、VLDL膽固醇增加和/或HDL膽固醇減少)的受治療者(參見2000年1月10日申請的美國臨時專利申請順序號60/175,365，題目是“應(yīng)用exendin及其激動劑調(diào)節(jié)甘油三酯水平以及治療血脂異?！?。所述方法還可用于使受治療者的血脂水平降低、心臟病危險性減少、食欲降低和體重減輕。再一些實施方案涉及抑制胰高血糖素分泌的方法(參見1999年4月30日申請的、共同擁有的美國臨時專利申請順序號60/132,017，題目是“胰高血糖素的抑制方法”)。還公開了用于本發(fā)明方法的藥用組合物。
本發(fā)明涉及從血漿中清除exendin幾乎全部通過腎臟濾過而不是主要通過蛋白酶解降解的意外發(fā)現(xiàn)，因為存在許多其它生物活性肽，例如GLP-1。這個意外發(fā)現(xiàn)支持以下觀點對exendin或exendin激動劑進行PEG化或其它修飾以增加分子大小的決定，將有藥用益處。
因此，本發(fā)明提供修飾的exendin或exendin激動劑，所述修飾的exendin或exendin激動劑具有與一個或更多個聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的化合物連接的exendin或exendin激動劑?！霸黾臃肿恿康幕衔铩笔强梢耘cexendin或exendin激動劑綴合并由此增加所得綴合物的分子量的化合物。除PEG外，增加分子量的化合物的代表性實例是聚氨基酸(例如，聚賴氨酸、聚谷氨酸和聚天冬氨酸；參見Gombotz等(1995)，Bioconjugate Chem.，第6卷332-351；Hudecz等(1992)，Bioconjugate Chem.，第3卷，49-57；Tsukada等(1984)，J.Natl.CancerInst.第73卷721-729；Pratesi等(1985)，Br.J.Cancer，第52卷841-848)、尤其是L構(gòu)象的那些聚氨基酸、藥理學上無活活的蛋白質(zhì)(例如，清蛋白；參見Gombotz等(1995)和其中引用的參考文獻)、明膠(參見Gombotz等(1995)和其中引用的參考文獻)、琥珀酰明膠(參見Gombotz等(1995)和其中引用的參考文獻)、(羥丙基)-甲基丙烯酰胺(參見Gombotz等(1995)和其中引用的參考文獻)、脂肪酸、olysaccaride、脂質(zhì)氨基酸(lipid amino acid)和葡聚糖。
在優(yōu)選的實施方案中，修飾的exendin或exendin激動劑的分子量比exendin或exendin激動劑的分子量高(最好是高約10％、50％或90％)，修飾的exendin或exendin激動劑的負電荷比exendin或exendin激動劑的負電荷高(最好是高約10％、50％或90％)，修飾的exendin或exendin激動劑的腎臟清除率比exendin或exendin激動劑的腎臟清除率低(最好是低約10％、50％或90％)，修飾的exendin或exendin激動劑的半壽期比exendin或exendin激動劑的半壽期長(最好是長約10％、50％或90％)，修飾的exendin或exendin激動劑的免疫原性/抗原性比exendin或exendin激動劑的免疫原性/抗原性低，修飾的exendin或exendin激動劑的溶解度比exendin或exendin激動劑的溶解度高(最好是高約10％、50％或90％)，修飾的exendin或exendin激動劑的蛋白水解速率比exendin或exendin激動劑的蛋白水解速率低(最好是低約10％、50％或90％)，修飾的exendin或exendin激動劑的毒性比exendin或exendin激動劑的毒性低，修飾的exendin或exendin激動劑的穩(wěn)定性比exendin或exendin激動劑的穩(wěn)定性高，和/或修飾的exendin或exendin激動劑的通透性/生物學功能比exendin或exendin激動劑的通透性/生物學功能高或低(最好是高或低約10％、50％或90％)。
所述exendin或exendin激動劑可以與一個、兩個或三個聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的試劑連接。所述聚乙二醇聚合物(或其它增加分子量的試劑)的分子量可能最好為500-20,000。在一個優(yōu)選實施方案中，所述修飾的exendin或exendin激動劑是化合物201-240中的其中一種，更優(yōu)選是化合物209、210和213中的其中一種，或者化合物201和202中的其中一種，或者化合物216和217中的其中一種(參見下文實施例4)。
所述聚乙二醇聚合物(或其它增加分子量的試劑)最好與氨基、羧基或硫代基連接，并且可以通過賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的N末端或C末端連接，或者，所述聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的試劑可以用雙胺和二羧基連接。所述exendin或exendin激動劑最好是通過所述exendin或exendin激動劑的賴氨酸氨基酸上的ε氨基與所述聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的試劑連接。
本發(fā)明也提供一種制備修飾的exendin或exendin激動劑的方法。所述方法包括將一個或更多個聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的試劑與一個exendin或exendin激動劑連接。在優(yōu)選的實施方案中，所述連接通過固相合成進行。
本發(fā)明也提供一種治療通過給予exendin或exendin激動劑而受益的疾病的方法。所述方法包括將本發(fā)明的修飾的exendin或exendin激動劑提供給患有這樣一種疾病的患者，并由此治療所述疾病。典型的疾病包括餐后傾倒綜合征、餐后高血糖癥、葡萄糖耐受不良、可以通過減少進食量而緩解的病癥或疾病、肥胖癥、進食障礙、胰島素抵抗綜合征、糖尿病和高血糖癥。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述餐后高血糖癥是II型糖尿病的結(jié)果。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述餐后高血糖癥是I型糖尿病或葡萄糖耐受不良的結(jié)果。
本發(fā)明也描述了一種藥用組合物的特征。所述組合物含有一種修飾的exendin或exendin激動劑以及一種藥學上可接受的載體。
本發(fā)明也提供一種試劑盒。所述試劑盒含有一種修飾的exendin或exendin激動劑以及使用說明和/包裝。所述試劑盒也可以包括指出所述試劑盒、其組分或使用它們的方法已得到管理部門批準的文件。
本發(fā)明也提供一種有益地調(diào)節(jié)受治療者胃腸能動性的方法。所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種本發(fā)明修飾的exendin或exendin激動劑。
也描述了治療攝食毒素的方法的特征。所述方法包括(a)給予一定量的本發(fā)明修飾的exendin或exendin激動劑，以有效預(yù)防或減少胃內(nèi)容物傳遞到腸；和(b)抽吸出胃的內(nèi)容物。
本發(fā)明也提供使受治療者的食欲降低或體重減輕、或血脂降低的方法以及治療妊娠糖尿病的方法。本發(fā)明也提供使受治療者的食欲降低或體重減輕、或血脂降低的方法以及治療妊娠糖尿病的方法。其它的方法包括調(diào)節(jié)甘油三酯水平、和治療患有血脂異常的受治療者、以及抑制胰高血糖素水平。本發(fā)明的這些方法和其它方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種本發(fā)明修飾的exendin或exendin激動劑。
修飾的exendin或exendin激動劑例如可用作治療例如糖尿病和肥胖癥的胃排空的抑制劑。因此，本發(fā)明也涉及降低胃動力和減慢胃排空的新方法。所述方法包括給予一種修飾的exendin或exendin激動劑，例如一種或更多種PEG聚合物連接于與exendin-3[SEQ.ID.NO.1]、exendin-4[SEQ.ID.NO.2]或其它化合物連接，其中所述其它化合物可與exendin在其上發(fā)揮其對胃動力和胃排空作用的受體有效地結(jié)合。這些方法將可用于治療例如餐后高血糖癥、與I型(胰島素依賴性)糖尿病和II型(非胰島素依賴性)糖尿病有關(guān)的并發(fā)癥、以及妊娠糖尿病、血脂異常，可用于調(diào)節(jié)甘油三酯水平以及抑制胰高血糖素分泌。
所謂“exendin激動劑”是指例如模擬exendin對胃動力和胃排空作用的化合物(即與exendin發(fā)揮其對胃動力和胃排空作用的受體有效結(jié)合的化合物，最好是exendin的類似物或衍生物)或例如通過與一種或多種受體結(jié)合而在減少進食量方面模擬exendin作用的化合物，其中在所述受體上exendin引起這種效應(yīng)。優(yōu)選的exendin激動劑化合物包括在1998年1月7日申請的美國專利申請順序號90/003,869(及其優(yōu)先申請)中描述的那些化合物，所述專利申請的題目是“應(yīng)用exendin及其激動劑減少進食量”，所述專利申請與本申請共享共同所有權(quán)，并且所述專利申請通過引用結(jié)合到本申請中，恰如在本文中全面陳述的一樣?？梢圆捎帽疚拿枋龅姆椒ɑ虮绢I(lǐng)域已知的用于測定exendin例如在進食量或食欲方面作用的其它方法，鑒定、評價或篩選exendin或exendin激動劑在減少進食量方面的效應(yīng)。
另一方面，也將治療有效量的一種糊精激動劑給予所述受治療者。在一個優(yōu)選方面，所述糊精激動劑是一種糊精或一種糊精激動劑的類似物，例如25，28，29Pro-人糊精(25，28，29Pro-human-amylin)。應(yīng)用糊精激動劑治療餐后高血糖癥以及有益地調(diào)節(jié)胃腸能動性描述于1995年3月16日公開的國際申請?zhí)朠CT/US94/10225，所述國際申請已經(jīng)通過引用結(jié)合到本文中。
再一方面，也將治療有效量的一種胰島素或胰島素類似物與一種修飾的exendin或exendin激動劑分開給予或一起給予所述受治療者。
所述受治療者優(yōu)選是脊椎動物、更優(yōu)選是哺乳動物、最優(yōu)選是人。在優(yōu)選的方面，胃腸外給予、更優(yōu)選通過注射給予本發(fā)明的修飾的exendin或exendin激動劑。在一個最優(yōu)選的方面，所述注射是外周注射。優(yōu)選每天給予本發(fā)明的修飾的exendin或exendin激動劑約1μg-30μg至約5mg。更優(yōu)選每天給予本發(fā)明的修飾的exendin或exendin激動劑約1-30μg至約2mg、或約1-30μg至約1mg。最優(yōu)選每天給予本發(fā)明的修飾的exendin或exendin激動劑約3μg至約500μg。
用于修飾及應(yīng)用的優(yōu)選exendin或exendin激動劑包括exendin-4(1-30)[SEQ ID NO 4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr SerAsp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly]；exendin-4(1-30)酰胺[SEQ ID NO 5His Gly Glu Gly Thr Phe ThrSer Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly-NH2]；exendin-4(1-28)酰胺[SEQ ID NO 6His Gly Glu Gly Thr Phe ThrSer Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn-NH2]；14Leu、25Phe exendin-4酰胺[SEQ ID NO 7His Gly Glu Gly ThrPhe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe IleGlu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]；14Leu、25Phe exendin-4(1-28)酰胺[SEQ ID NO 8His Gly Glu GlyThr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH2]；和14Leu、22Ala、25Phe exendin-4(1-28)酰胺[SEQ ID NO 9His GlyGlu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala ValArg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH2]。
在本發(fā)明的方法中，可以將所述修飾的exendin或exendin激動劑與一種或更多種表現(xiàn)出長期或短期飽滿感作用的其它化合物和組合物分開給予或一起給予，所述其它化合物和組合物包括但不限于包括糊精激動劑、縮膽囊素(CCK)或leptin(ob蛋白)的其它化合物和組合物。合適的糊精激動劑包括例如[25，28，29Pro-]-人糊精(也稱為“pramlintide”，而先前稱為“AC-137”)(如描述于“糊精激動肽及其應(yīng)用，”1997年11月11日公開的美國專利第5,686,511號)和鮭魚降鈣素。所用的CCK最好是CCK八肽(CCK-8)。在例如Pelleymounter，M.A.等，Science 269540-43(1995)；Halaas，J.L.等，Science 269543-46(1995)；和Campfield，L.A.等，Eur.J.Pharmac.262133-41(1994)中討論了leptin.
本發(fā)明也提供用于提供治療有效量的本發(fā)明的修飾的exendin或exendin激動劑的組合物和方法，以便增加個體的尿流量、減少個體尿中的鉀量、預(yù)防或緩解個體與循環(huán)血容量過多或中毒性循環(huán)血容量過多有關(guān)的病癥或疾病、誘導(dǎo)快速利尿、使個體準備好進行手術(shù)、增加腎血漿流量和腎小球濾過率、或治療前兆子癇或妊娠驚厥。定義按照本發(fā)明以及如此中所用的，以下術(shù)語定義為具有以下含義，除非另有說明。
術(shù)語“氨基酸”是指天然氨基酸、非天然氨基酸、和氨基酸類似物、所有它們的D和L立體異構(gòu)體(如果它們的結(jié)構(gòu)充許有這類立體異構(gòu)形式的話)。天然氨基酸包括丙氨酸(Aa)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于氮雜環(huán)丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基異丁酸、鎖鏈賴氨素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羥賴氨酸、別-羥賴氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈賴氨素、別-異亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基纈氨酸、萘丙氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、戊基甘氨酸、2-哌啶酸和硫代脯氨酸。氨基酸類似物包括在其N末端氨基或其側(cè)鏈基團可逆或不可逆化學封閉的、或修飾的天然氨基酸和非天然氨基酸，例如甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亞砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。
術(shù)語“氨基酸類似物”是指其中或者C-末端羧基、N-末端氨基或側(cè)鏈官能團已被化學編纂成另一官能團的氨基酸。例如，天冬氨酸-(β-甲酯)是天冬氨酸的氨基酸類似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸類似物；或者丙氨酸甲酰胺是丙氨酸的氨基酸類似物。
術(shù)語“氨基酸殘基”是指具有以下結(jié)構(gòu)的基團(1)-C(O)-R-NH-，其中R通常為-CH(R’)-，其中R’為一種氨基酸側(cè)鏈，通常是H或含取代基的碳；或(2) ，其中p為1、2或3，分別代表氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸或2-哌啶酸殘基。
與有機基團例如烷基有關(guān)的、本文所指的術(shù)語“低級”定義為這樣的具有至多6個并且包括6個、最好是至多4個并且包括4個、有利的是1個或2個碳原子的基團。這樣的基團可以是直鏈或支鏈。
“藥學上可接受的鹽”包括由本發(fā)明化合物和有機酸或無機酸化合而衍生的本發(fā)明化合物的鹽。實際上，應(yīng)用鹽形式相當于應(yīng)用堿形式。本發(fā)明的化合物既可以游離堿形式使用又可以鹽形式使用，這兩種形式均認為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外，以下縮寫代表如下“ACN”或“CH3CN”是指乙腈。
“Boc”、“tBoc”或“Tboc”是指叔-丁氧羰基。
“DCC”是指N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺。
“Fmoc”是指芴基甲氧羰基。
“HBTU”是指六氟合磷氫酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓。
“HOBt”是指1-羥基苯并三唑一水合物。
“homoP”或“hPro”是指高脯氨酸。
“MeAla”或“Nme”是指N-甲基丙氨酸。
“naph”是指萘丙氨酸。
“pG”或“pGly”是指戊基甘氨酸。
“tBuG”是指叔丁基甘氨酸。
“ThioP”或“tPro”是指硫代脯氨酸。
“3Hyp”是指3-羥基脯氨酸。
“4Hyp”是指4-羥基脯氨酸。
“NAG”是指N-烷基甘氨酸。
“NAPG”是指N-烷基戊基甘氨酸。
“Norval”是指正纈氨酸。
“Norleu”是指正亮氨酸。
根據(jù)以下優(yōu)選實施方案的描述并且根據(jù)權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。
附圖簡述圖1描述了exendin-3的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.1]。
圖2描述了exendin-4的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.2]。
圖3描述了可用于本發(fā)明的某些exendin激動劑化合物的氨基酸序列[SEQ.ID.NO.10-40]。
圖4描述了本發(fā)明的某些化合物-化合物1-174的氨基酸序列。
圖5為顯示功能性腎切除術(shù)對exendin-4清除率方面影響的圖。
圖6為顯示在腎切除受治療者和假受治療者中exendin-4血漿水平的終末衰變的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有與一個或更多個聚乙二醇聚合物連接的exendin或exendin激動劑的新型修飾的exendin和exendin激動劑、及相關(guān)制品和可用于以下的方法例如治療糖尿病(包括I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病)、治療通過調(diào)節(jié)血漿葡萄糖水平或抑制胰高血糖素分泌的藥物而可能受益的疾病、治療通過給予可用于調(diào)節(jié)胃排空速率或進食量的藥物而可能受益的疾病(包括肥胖癥、進食障礙、胰島素抵抗綜合征)、和調(diào)節(jié)甘油三酯水平以及治療患有血脂異常的受治療者。所述方法還可用于使受治療者的血脂水平降低、心臟病危險性減少、食欲降低和體重減輕。還公開了用于本發(fā)明方法的藥用組合物。修飾的exendin和exendin激動劑本發(fā)明的修飾的exendin和exendin激動劑包括與exendin或exendin激動劑(例如天然存在的exendin、合成的exendin或exendin激動劑)連接的一種或更多種PEG聚合物。exendin-4exendin-4是一種天然存在的肽，分離自鈍尾毒蜥的唾液分泌物。exendin-4的動物試驗表明它降低血液葡萄糖的能力持續(xù)數(shù)小時。如本文所述，采用固相合成法合成exendin-4，一種39個氨基酸的多肽。
如本文所述，一直在研究exendin-4的非臨床藥理學。在腦中，exendin-4主要與后腦中的最后區(qū)(area postrema)和孤束核區(qū)(nucleustractus solitarius region)并且與前腦中的穹窿下器(subfornical organ)結(jié)合。在大鼠和小鼠的腦和腎臟中已觀察到exendin-4結(jié)合。exendin-4在腎臟中結(jié)合的結(jié)構(gòu)是未知的。
各種實驗對exendin-4和GLP-1的生物學作用進行了比較，證明對exendin-4更為有利的特性范圍。一次皮下劑量的exendin-4就在db/db(糖尿病)小鼠和ob/ob(糖尿病性肥胖)小鼠中降低血漿葡萄糖高達40％。在糖尿病性Fatty Zucker(ZDF)大鼠中，用exendin-4治療5周降低HbA1c(一種用于評價血漿葡萄糖水平的糖基化血紅蛋白的度量)高達41％。治療肥胖ZDF大鼠5周后，胰島素敏感性也提高了76％。在葡萄糖不耐性靈長類中，還觀察到血漿葡萄糖中的劑量依賴性減少。
在嚙齒類動物中，還觀察到exendin-4的促胰島素作用，在非禁食Harlan Sprague Dawley(HSD)大鼠中改善對葡萄糖的胰島素應(yīng)答達100％以上，而在非禁食db/db小鼠中改善對葡萄糖的胰島素應(yīng)答多達約10倍。治療前血漿葡萄糖濃度較高與葡萄糖降低效應(yīng)較高有關(guān)。因此，看來所觀察到的exendin-4的葡萄糖降低效應(yīng)是葡萄糖依賴性的，并且如果動物已經(jīng)血糖正常，則效應(yīng)最小。
在HSD大鼠中，exendin-4劑量依賴性地減慢胃排空，并且就該作用而言比GLP-1有效約90倍。還已經(jīng)顯示，exendin-4在外周給藥后在NIH/Sw(Swiss)小鼠中減少進食量，并且就該作用而言比GLP-1有效至少1000倍。在麻醉的ZDF大鼠中在胰島素過多、高血糖鉗制條件期間，exendin-4降低血漿胰高血糖素濃度約40％，但是在正常小鼠中的正常血糖條件期間卻不影響血漿胰高血糖素濃度。已經(jīng)顯示在肥胖ZDF大鼠中，exendin-4劑量依賴性地減輕體重，而在瘦ZDF大鼠中，看來所觀察到的體重減輕是暫時的。
含exendin-4的修飾的exendin或exendin激動劑通過對增加和恢復(fù)胰島素分泌的影響，例如將可用于保持分泌胰島素能力的II型糖尿病病人。exendin-4對進食量、胃排空、調(diào)節(jié)營養(yǎng)吸收的其它機制和胰高血糖素分泌的效應(yīng)，也支持這樣的例如含exendin-4的修飾的exendin和exendin激動劑在治療例如肥胖癥、I型糖尿病和已減少胰島素分泌的II型糖尿病患者中的效用。
在小鼠、大鼠和猴的單劑量研究中、在大鼠和猴的重復(fù)劑量(多達28個連續(xù)日劑量)研究中以及誘變性和染色體改變的體外試驗中，已經(jīng)對exendin-4的毒理學進行了研究。迄今為止，無死亡發(fā)生，在血液學、臨床化學、或肉眼觀察到的組織變化或顯微組織變化方面，沒有觀察到療法相關(guān)的變化。已證明exendin-4是一種非誘變劑，并且在受試濃度(多達5000μg/mL)下也不引起染色體畸變。
為了支持exendin-4的非臨床藥物代謝動力學和新陳代謝的研究，已開發(fā)出大量的免疫測定。將靈敏度有限(約100pM)的放射免疫測定用于初步藥物代謝動力學研究。隨后驗證了一種exendin-4的二位(two-site)IRMA測定，其定量下限為15pM。采用該放射免疫測定，發(fā)現(xiàn)皮下給予的exendin-4的生物利用度約為50-80％。這與腹膜內(nèi)給藥后所觀察到的生物利用度(48-60％)相似。最高血漿濃度(Cmax)發(fā)生在30分鐘和43分鐘(Tmax)之間。Cmax和AUC值均與劑量單調(diào)相關(guān)。皮下給予的exendin-4的表觀終末半壽期約為90-110分鐘。這明顯比靜脈給藥后觀察到的14-41分鐘長。采用IRMA測定，得到相似結(jié)果。用exendin-4與GLP-1相比的降解研究表明，exendin-4相對抵抗降解。exendin激動劑exendin激動劑包括exendin肽類似物，其中一個或更多個天然存在的氨基酸被消除或用另外一個或多個氨基酸取代。優(yōu)選的exendin激動劑是exendin-4的激動劑類似物。特別優(yōu)選的exendin激動劑描述于1998年8月6日申請的、共同擁有的PCT申請順序號PCT/US98/16387，題目是“新型exendin激動劑化合物，”所述申請要求1997年8月8日申請的美國專利申請順序號60/055,404的權(quán)益；1998年11月13日申請的、共同擁有的PCT申請順序號PCT/US98/24210，題目是“新型exendin激動劑化合物”，所述PCT申請要求1997年11月14日申請的美國臨時申請?zhí)?0/065,442的權(quán)益；和1998年11月13日申請的、共同擁有的PCT申請順序號PCT/US98/24273，題目是“新型exendin激動劑化合物，”所述PCT申請要求1997年11月14日申請的美國臨時申請?zhí)?0/066,029的權(quán)益，所有所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中(包括任何附圖)。
作為exendin激動劑的活性可以由例如下文所述測定中的活性來指示。exendin或exendin激動劑對胃動力和胃排空的作用可以采用本文所述方法或其它本領(lǐng)域已知用于測定胃動力的方法或等同方法進行鑒定、評價或篩選。例如，參見1999年11月22日申請的美國專利申請順序號60/166,899，題目是“高親和性exendin受體”。用于exendin激動劑化合物或候選exendin激動劑化合物的陰性受體測定或篩選，例如為采用糊精受體制劑的糊精受體測定/篩選，例如描述于1993年11月23日授予的美國專利第5,264,372號，所述專利的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中；采用例如含有與腺苷酸環(huán)化酶活性刺激偶聯(lián)的鈣受體的T47D和MCF7乳腺癌細胞的一種或更多種降鈣素受體測定/篩選；和/或采用例如SK-N-MC細胞的CGRP受體測定/篩選。
一種用于鑒定或評價化合物減慢胃動力能力的這種方法包括(a)將一種試驗樣品和一種試驗系統(tǒng)組合在一起，所述試驗樣品含有一種或更多種試驗化合物，所述試驗系統(tǒng)含有一個評價胃動力的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)的特征在于它表現(xiàn)出例如對葡萄糖或食物加入系統(tǒng)而應(yīng)答的血漿葡萄糖升高；和(b)測定所述系統(tǒng)中血漿葡萄糖的存在或上升的量。也可以使用陽性對照和/或陰性對照。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括所述結(jié)構(gòu)式(I-VIII)的修飾化合物的藥學上可接受的鹽以及包括所述化合物及其鹽在內(nèi)的藥用組合物。結(jié)構(gòu)式Iexendin激動劑化合物也包括描述于美國臨時申請?zhí)?0/065,442的那些化合物，包括式(I)[SEQ ID NO.41]化合物Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1為His、Arg或Tyr；Xaa2為Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3為Asp或Glu；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly ASD-149564.1Gly Xaa31Ser Ser Gly AlaXaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地為Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、
硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala。優(yōu)選N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸的N-烷基包括低級烷基，最好是具有1個至約6個碳原子的烷基，更優(yōu)選為具有1個至4個碳原子的烷基。
優(yōu)選的exendin激動劑化合物包括其中Xaa1為His或Tyr的那些化合物。更優(yōu)選Xaa1為His。
優(yōu)選的是其中Xaa2為Gly的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met的那些化合物。
優(yōu)選的化合物是其中Xaa25為Trp或Phe的那些化合物。
優(yōu)選的化合物是其中Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa22為Phe或萘丙氨酸和Xaa23為Ile或Val的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸的化合物。
優(yōu)選Z1為-NH2。
優(yōu)選Z2為-NH2。
根據(jù)一個方面，優(yōu)選的是式(I)的化合物，其中Xaa1為His或Tyr，更優(yōu)選Xaa1為His；Xaa2為Gly；Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸。更優(yōu)選Z1為-NH2。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，尤其優(yōu)選的化合物包括式(I)的那些化合物，其中Xaa1為His或Arg；Xaa2為Gly或Ala；Xaa3為Asp或Glu；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp或Phe；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、Gly Gly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31Ser-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2、Gly GlyXaa31Ser Ser Gly Ala-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2、GlyGly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly AlaXaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地為Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala。尤其優(yōu)選的化合物包括1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24210中陳述的、其中鑒定為化合物2-23的那些化合物。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，提供如下化合物其中Xaa14為Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更優(yōu)選為Leu或戊基甘氨酸，而Xaa25為Phe、Tyr或萘丙氨酸，更優(yōu)選為Phe或萘丙氨酸。這些化合物無論在體外還是在體內(nèi)以及在所述化合物的合成期間都將對氧化性降較不敏感性低。結(jié)構(gòu)式IIexendin激動劑化合物也包括描述于美國臨時申請?zhí)?0/066,029中的那些化合物，包括式(II)[SEQ ID NO.42]的化合物Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1為His、Arg、Tyr、Ala、Norval、Val或Norleu；Xaa2為Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3為Ala、Asp或Glu；Xaa4為Ala、Norval、Val、Norleu或Gly；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Ala、Norval、Val、Norleu、Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2；Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地為Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala；并且也前提是，如果Xaa1為His、Arg或Tyr，則Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少1個為Ala。
優(yōu)選N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸的N-烷基包括低級烷基，優(yōu)選為具有1個至約6個碳原子的烷基，更優(yōu)選為具有1個至4個碳原子烷基。合適的式(II)化合物包括在1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的申請順序號PCT/US98/24273中描述的、在其實施例1-89(分別為“化合物1-89”)中鑒定的那些化合物，以及其中在實施例104和105中鑒定的那些相應(yīng)的化合物。
優(yōu)選的這樣的exendin激動劑化合物包括其中Xaa1為His、Ala或正纈氨酸的那些化合物。更優(yōu)選Xaa1為His或Ala。最優(yōu)選Xaa1為His。
優(yōu)選的是其中Xaa2為Gly的式(II)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa3為Ala的式(II)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa4為Ala的式(II)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa9為Ala的式(II)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met的式(II)的那些化合物。
式(II)的優(yōu)選化合物是其中Xaa25為Trp或Phe的那些化合物。
式(II)的優(yōu)選化合物是其中Xaa6為Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；和Xaa23為Ile或Val的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸的式(II)化合物。
優(yōu)選Z1為-NH2。
優(yōu)選Z2為-NH2。
根據(jù)一個方面，優(yōu)選的是式(II)的化合物，其中Xaa1為Ala、His或Tyr，更優(yōu)選為Ala或His；Xaa2為Ala或Gly；Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa14為Ala、Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸；和Xaa39為Ser或Tyr，更優(yōu)選為Ser。更優(yōu)選Z1為-NH2。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，尤其優(yōu)選的化合物包括式(II)的那些化合物，其中Xaa1為His或Ala；Xaa2為Gly或Ala；Xaa3為Ala、Asp或Glu；Xaa4為Ala或Gly；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Ala、Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp或Phe；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、GlyGly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31Ser-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2、Gly GlyXaa31Ser Ser Gly-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2、Gly Gly Xaa31SerSer Gly Ala Xaa36-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2、GlyGly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31Ser SerGly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地為Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala；并且另外前提是，如果Xaa1為His、Arg或Tyr，則Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少1個為Ala。尤其優(yōu)選的式(II)化合物包括1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的申請順序號PCT/US98/24273中描述的具有其中的SEQ.ID.NO.5-93氨基酸序列的那些化合物。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，提供如下式(II)的化合物其中Xaa14為Ala、Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更優(yōu)選為Leu或戊基甘氨酸，而Xaa25為Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸，更優(yōu)選為Phe或萘丙氨酸。這些化合物無論在體外還是在體內(nèi)以及在所述化合物的合成期間都將對氧化性降解不太敏感。結(jié)構(gòu)式III本發(fā)明的范圍內(nèi)也有具有各種長度的肽的較窄種類的化合物，例如不包括長度分別為28、29或30個氨基酸殘基的肽的化合物種類。另外，本發(fā)明包括描述于1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24210中并且具有特定的氨基酸序列的較窄種類的化合物，例如式(III)[SEQ.ID.NO.43]的化合物Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1為His或Arg；Xaa2為Gly或Ala；Xaa3為Asp或Glu；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為IIe、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp或Phe；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2；或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-甲基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala；及其藥學上可接受的鹽。結(jié)構(gòu)式IV另外，本發(fā)明包括描述于1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24273中具有特定的氨基酸序列的較窄種類的肽化合物，例如式[IV][SEQ.ID.NO.44]的化合物Xaa1Xaa2Xaa3Xaa5Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1為His或Ala；Xaa2為Gly或Ala；Xaa3為Ala、Asp或Glu；Xaa4為Ala或Gly；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Ala、Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp或Phe；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Ser-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地為Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala；并且前提是，如果Xaa1為His、Arg或Tyr，則Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少1個為Ala；及其藥學上可接受的鹽。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa1為His、Ala、正纈氨酸或4-咪唑基丙酰的那些化合物。優(yōu)選Xaa1為His、或4-咪唑基丙?；駻la，更優(yōu)選His或4-咪唑基丙酰。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa2為Gly的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa4為Ala的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa9為Ala的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa25為Trp或Phe的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa6為Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；和Xaa23為Ile或Val的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Z1為-NH2的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa39為Ser或Tyr、最好是Ser的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Z2為-NH2的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Z1為-NH2的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa21為Lys-NHε-R(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷酰基)的那些化合物。
式(IV)的優(yōu)選化合物包括其中X1為Lys Asn、Lys-NHε-R Asn或Lys-NHε-RAla(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷?；?的那些化合物。式(IV)的優(yōu)選化合物包括具有1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24273中描述的氨基酸序列的那些化合物，如選自其中SEQ.ID.NO.95-110的那些化合物。結(jié)構(gòu)式V也提供描述于1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請PCT/US98/24210的化合物，包括式(V)[SEQ.ID.NO.45]的化合物510Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26X1-Z1；其中Xaa1為His、Arg或Tyr或咪唑基丙酰；Xaa2為Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3為Asp或Glu；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala、Leu或Lys-NHε-R，其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷酰基或環(huán)烷基烷?；籜aa22為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26為Ala或Leu；X1為Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、Asn Lys-NHε-R、Lys-NHε-RAla、Ala Lys-NHε-R，其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷?；颦h(huán)烷基烷?；?；Z1為-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25和Xaa26中不超過3個為Ala。此外，本發(fā)明范圍內(nèi)有式(V)化合物的藥學上可接受的鹽和包括所述化合物及其鹽的藥用組合物。
式(V)的優(yōu)選exendin激動劑化合物包括其中Xaa1為His、Tyr、或4-咪唑基丙酰的那些化合物。更優(yōu)選Xaa1為His。
優(yōu)選的是其中Xaa1為4-咪唑基丙酰的式(V)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa2為Gly的式(V)的那些化合物。
式(V)的優(yōu)選化合物是其中Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met的那些化合物。
式(V)的優(yōu)選化合物是其中Xaa25為Trp或Phe的那些化合物。
根據(jù)一個方面，優(yōu)選的是式(V)的化合物，其中Xaa6為Phe或萘丙氨酸；和Xaa22為Phe或萘丙氨酸；和Xaa23為Ile或Val。更優(yōu)選Z1為-NH2。根據(jù)一個方面，尤其優(yōu)選的是這樣的式(V)的化合物，其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸。更優(yōu)選的是，Z2為-NH2。
式(V)的優(yōu)選化合物包括其中X1為Lys Asn、Lys-NHε-R Asn、或Lys-NHε-R Ala(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷酰基)的那些化合物。式(V)的優(yōu)選化合物包括在1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24210中描述的并且其中鑒定為化合物第62-69號的化合物。
優(yōu)選的這種exendin激動劑化合物包括其中Xaa1為His、Ala或正纈氨酸的那些化合物。更優(yōu)選Xaa1為His或Ala。最優(yōu)選Xaa1為His。
優(yōu)選的是其中Xaa2為Gly的式(V)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa3為Ala的式(V)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa4為Ala的式(V)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa9為Ala的式(V)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met的式(V)的那些化合物。
式(V)的優(yōu)選化合物是其中Xaa25為Trp或Phe的那些化合物。
式(V)的優(yōu)選化合物是其中Xaa6為Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；和Xaa23為Ile或Val的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸的式(V)的化合物。
優(yōu)選Z1為-NH2。
優(yōu)選Z2為-NH2。
根據(jù)一個方面，優(yōu)選的是式(V)的化合物，其中Xaa1為Ala、His或Tyr，更優(yōu)選Xaa1為Ala或His；Xaa2為Ala或Gly；Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa14為Ala、Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸；和Xaa39為Ser或Tyr，更優(yōu)選Ser。更優(yōu)選Z1為-NH2。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，尤其優(yōu)選的化合物包括式(V)的那些化合物，其中Xaa1為His或Ala；Xaa2為Gly或Ala；Xaa3為Ala、Asp或Glu；Xaa4為Ala或Gly；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Phe或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Ala、Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp或Phe；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、GlyGly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31Ser-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2、Gly GlyXaa31Ser Ser Gly-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2、Gly Gly Xaa31SerSer Gly Ala Xaa36-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2、GlyGly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31Ser SerGly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地為Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala；并且另外前提是，如果Xaa1為His、Arg或Tyr，則Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少1個為Ala。式(V)的尤其優(yōu)選化合物包括在1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24210中描述的并且具有其中鑒定為SEQ.ID.NO.5-93的氨基酸序列的那些化合物。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，提供式(V)的化合物，其中Xaa14為Ala、Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更優(yōu)選為Leu或戊基甘氨酸，和Xaa25為Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸，更優(yōu)選為Phe或萘丙氨酸。這些化合物無論在體外還是在體內(nèi)以及在所述化合物的合成期間都將對氧化性降解不太敏感。結(jié)構(gòu)式VI也提供1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24273中描述的肽化合物，包括式(VI)[SEQ.ID.NO.46]的化合物5 10Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26X1-Z1；其中Xaa1為His、Arg、Tyr、Ala、Norval、Val、Norleu或4-咪唑基丙酰；Xaa2為Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3為Ala、Asp或Glu；Xaa4為Ala、Norval、Val、Norleu或Gly；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala、Ser或Thr；Xaa9為Ala、Norval、Val、Norleu、Asp或Glu；Xaa10為Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala、Leu或Lys-NHε-R，其中R為Lys、Arg、C1-10直鏈或支鏈烷?；颦h(huán)烷基(cycloalleyl)-烷?；籜aa22為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23為Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24為Ala、Glu或Asp；Xaa25為Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26為Ala或Leu；X1為Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、Asn Lys-NHε-R、Lys-NHε-RAla、Ala Lys-NHε-R，其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷酰基或環(huán)烷基烷?；鵝1為-OH，-NH2，Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2，
Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸；和Z2為-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26中不超過3個為Ala；并且另外前提是，如果Xaa1為His、Arg、Tyr或4-咪唑基丙酰，則Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少1個為Ala；及其藥學上可接受的鹽。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa1為His、Ala、Norval或4-咪唑基丙酰的那些化合物。優(yōu)選Xaa1為His、或4-咪唑基丙?；駻la，更優(yōu)選His或4-咪唑基丙酰。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa2為Gly的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa4為Ala的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa9為Ala的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa14為Leu、戊基甘氨酸或Met的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa25為Trp或Phe的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa6為Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22為Phe或萘丙氨酸；和Xaa23為Ile或Val的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Z1為-NH2的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa39為Ser或Tyr、最好是Ser的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Z2為-NH2的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Z1為-NH2的那些化合物42。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中Xaa21為Lys-NHε-R(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷酰基)的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括其中X1為Lys Asn、Lys-NHε-R Asn、或Lys-NHε-R Ala(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷?；?的那些化合物。
式(VI)的優(yōu)選化合物包括在1998年11月13日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/24273中描述的具有選自其中鑒定為SEQ.ID.NO.95-110的氨基酸序列的那些化合物。結(jié)構(gòu)式VII按照本發(fā)明的特別有用的化合物是在1998年1月7日申請的、題目是“應(yīng)用exendin及其激動劑減少進食量”的美國專利申請順序號09/003,869中描述的exendin激動劑化合物，包括式(VII)[SEQ.ID.NO.47]的化合物1 510Xaa1Xaa2Xaa3Gly Thr Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa815 20Ser Lys Gln Xaa9Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu25 30Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Leu Lys Asn Gly Gly Xaa14
35Ser Ser Gly Ala Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18-Z其中Xaa1為His、Arg或Tyr；Xaa2為Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3為Asp或Glu；Xaa4為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa5為Thr或Ser；Xaa6為Ser或Thr；Xaa7為Asp或Glu；Xaa8為Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa9為Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa10為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa11為Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa12為Glu或Asp；Xaa13為Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地為Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；Xaa18為Ser、Thr或Tyr；和Z為-OH或-NH2；前提是所述化合物不具有或者SEQ.ID.NO.1或者SEQ.ID.NO.2的結(jié)構(gòu)式。N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸的優(yōu)選N-烷基包括優(yōu)選具有1個至約6個碳原子、更優(yōu)選具有1-4個碳原子的低級烷基。合適的化合物包括具有SEQ.ID.NO.10-40的氨基酸序列的那些化合物。也可用于本發(fā)明的有式(VII)化合物的藥學上可接受的鹽。
優(yōu)選的exendin激動劑化合物包括其中Xaa1為His或Tyr的那些化合物。更優(yōu)選Xaa1為His。
優(yōu)選的是其中Xaa2為Gly的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa9為Leu、戊基甘氨酸或Met的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa13為Trp或Phe的那些化合物。
也優(yōu)選的是其中Xaa4為Phe或萘丙氨酸；Xaa11為Ile或Val以及Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸的化合物。最好是N-烷基丙氨酸具有1個至約6個碳原子的N-烷基。
按照一個尤其優(yōu)選的方面，Xaa15、Xaa16和Xaa17為相同的氨基酸殘基。
優(yōu)選的是其中Xaa18為Ser或Tyr、更優(yōu)選Ser的化合物。
最好是，Z為-NH2。
根據(jù)一個方面，優(yōu)選的是式(VII)的化合物，其中Xaa1為His或Tyr，更優(yōu)選His；Xaa2為Gly；Xaa4為Phe或萘丙氨酸；Xaa9為Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa10為Phe或萘丙氨酸；Xaa11為Ile或Val；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸；和Xaa18為Ser或Tyr、更優(yōu)選Ser。更優(yōu)選Z為-NH2。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，尤其優(yōu)選的化合物包括式(VII)的那些化合物，其中Xaa1為His或Arg；Xaa2為Gly；Xaa3為Asp或Glu；Xaa4為Phe或萘丙氨酸；Xaa5為Thr或Ser；Xaa6為Ser或Thr；Xaa7為Asp或Glu；Xaa8為Leu或戊基甘氨酸；Xaa9為Leu或戊基甘氨酸；Xaa10為Phe或萘丙氨酸；Xaa11為Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa12為Glu或Asp；Xaa13為Trp或Phe；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地為Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸；Xaa18為Ser或Tyr；以及Z為-OH或-NH2；前提是所述化合物不具有或者SEQ.ID.NO.1或者SEQ.ID.NO.2的結(jié)構(gòu)式。更優(yōu)選Z為-NH2。尤其優(yōu)選的化合物包括具有SEQ.ID.NO.10、11、22、23、24、27、29、36、37和40的氨基酸序列的那些化合物。
根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，提供其中Xaa9為Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更優(yōu)選Leu或戊基甘氨酸以及Xaa13為Phe、Tyr或萘丙氨酸，更優(yōu)選Phe或萘丙氨酸的化合物。認為這些化合物表現(xiàn)出有利的作用持續(xù)時間，并且無論在體外還是在體內(nèi)以及在所述化合物的合成期間都將較少經(jīng)歷氧化性降解。結(jié)構(gòu)式VIII也提供1998年8月6日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/16387中描述的化合物，包括式(VIII)[SEQ.ID.NO.48]的化合物
15 10Xaa1Xaa2Xaa3Gly Thr Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa815 20Ser Lys Gln Xaa9Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu25 30Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Leu X1Gly Gly Xaa1435Ser Ser Gly Ala Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18-Z其中Xaa1為His、Arg、Tyr或4-咪唑基丙酰；Xaa2為Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3為Asp或Glu；Xaa4為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa5為Thr或Ser；Xaa6為Ser或Thr；Xaa7為Asp或Glu；Xaa8為Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa9為Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa10為Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa11為Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa12為Glu或Asp；Xaa13為Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；X1為Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、或Asn Lys-NHε-R，其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷?；颦h(huán)烷基烷?；?；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地為Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；Xaa18為Ser、Thr或Tyr；和Z為-OH或-NH2；前提是所述化合物不具有或者SEQ.ID.NO.1或者SEQ.ID.NO.2的結(jié)構(gòu)式。式(VIII)的合適化合物包括在1998年8月6日申請的、題目是“新型exendin激動劑化合物”的PCT申請順序號PCT/US98/16387中描述的、具有其中SEQ.ID.NO.37-40氨基酸序列的化合物。
式(VIII)的優(yōu)選exendin激動劑化合物包括其中Xaa1為His、Tyr或4-咪唑基丙酰的那些化合物。更優(yōu)選Xaa1為His或4-咪唑基丙酰。
優(yōu)選的是其中Xaa2為Gly的式(VIII)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa9為Leu、戊基甘氨酸或Met的式(VIII)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中Xaa13為Trp或Phe的式(VIII)的那些化合物。
優(yōu)選的是其中X1為Lys Asn或Lys-NHε-R Asn(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷酰基)的式(VIII)的那些化合物。
也優(yōu)選的是其中Xaa4為Phe或萘丙氨酸；Xaa10為Phe或萘丙氨酸；Xaa11為Ile或Val以及Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸的式(VIII)的化合物。根據(jù)一個尤其優(yōu)選的方面，Xaa18為Ser或Tyr。優(yōu)選的是其中Xaa18為Ser那些這樣的化合物。最好是，Z為-NH2。
根據(jù)一個優(yōu)選的方面，優(yōu)選的是式(VIII)的化合物，其中Xaa4為Phe或萘丙氨酸；Xaa10為Phe或萘丙氨酸；Xaa11為Ile或Val，X1為Lys Asn或Lys-NHε-R Asn(其中R為Lys、Arg、C1-C10直鏈或支鏈烷?；?以及Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17獨立地選自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸。修飾的exendin和exendin激動劑的制備本發(fā)明的修飾的exendin和exendin激動劑可以通過將一個或更多個聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的試劑與一個exendin或exendin激動劑連接來制備。因此，首先描述exendin和exendin激動劑的合成，然后描述將所述聚乙二醇聚合物與所述exendin或exendin激動劑連接的方法學。
exendin和exendin激動劑的制備此中描述的exendin和exendin激動劑化合物例如exendin類似物和exendin衍生物可以通過肽純化法來制備，如在例如Eng等，J.Biol.Chem.26520259-62，1990；和Eng等，J.Biol.Chem.2677402-05，1992中描述的肽純化法，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中。或者，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如描述于Raufman等(J.Biol.Chem.26721432-37，1992)中的方法(所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)，采用標準固相肽合成技術(shù)并且最好是采用自動或半自動肽合成儀，制備exendin和exendin激動劑肽。可以采用標準固相肽合成技術(shù)并且最好是采用自動或半自動肽合成儀，制備構(gòu)成本發(fā)明制劑中有效成分和劑量的化合物。通常，采用這類技術(shù)，在室溫下在惰性溶劑例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷中，在偶聯(lián)劑例如二環(huán)己基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑存在下，在堿例如二異丙基乙胺存在下，將α-N-甲氨酰保護的氨基酸和與樹脂上生長中的肽鏈連接的一個氨基酸進行偶聯(lián)。用一種試劑例如三氟乙酸或哌啶，從所得肽-樹脂中除去所述α-N-甲氨酰保護基，然后，用待加入到所述肽鏈的下一個所需的N-保護的氨基酸重復(fù)所述偶聯(lián)反應(yīng)。合適的N-保護基是本領(lǐng)域眾所周知的，此中優(yōu)選的是叔-丁氧羰基(tBoc)和芴基甲氧羰基(Fmoc)。
用于所述肽合成儀中的溶劑、氨基酸衍生物和4-甲基二苯甲胺樹脂可以購自Applied Biosystems Inc.(Foster City，CA)。以下側(cè)鏈保護的氨基酸可以購自Applied Biosystems，Inc.BSD-112344.1-Arg(Pmc)、Boc-Thr(Bzl)、Fmoc-Thr(t-Bu)、Boc-Ser(Bzl)、Fmoc-Ser(t-Bu)、Boc-Tyr(BrZ)、Fmoc-Tyr(t-Bu)、Boc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Lys(Boc)、Boc-Glu(Bzl)、Fmoc-Glu(t-Bu)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Asn(Trt)和Fmoc-Gln(Trt)。Boc-His(BOM)可以購自Applied Biosystems，Inc.或Bachem Inc.(Torrance，CA)。茴香醚、甲硫醚、苯酚、乙二硫醇和苯甲硫醚可以得自Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)。Air Products和Chemicals(Allentown，PA)供應(yīng)HF。乙醚、乙酸和甲醇可以購自FisherScientific(Pittsburgh，PA)。
運用NMP/HOBt(Option 1)系統(tǒng)和tBoc或Fmoc化學(參見，AppliedBiosystems User’s Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer，1.3B版本，1988年7月1日，第6節(jié)，第49-70頁，Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)與封端，可以用自動肽合成儀(430A型，AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進行固相肽合成。Boc-肽-樹脂可以用HF裂解(-50℃至0℃，1小時)?？梢越惶嬗盟鸵宜釋⑺鲭膹乃鰳渲休腿〕鰜?，然后將濾液凍干。所述Fmoc-肽樹脂可以按照標準方法(Introduction to Cleavage Techniques，Applied Biosystems，Inc.，1990.第6-12頁)裂解。也可以采用Advanced Chem Tech合成儀(MPS 350型，Louisville，Kentucky)裝配肽。
采用Waters Delta Prep 3000系統(tǒng)，可以通過RP-HPLC(制備型和分析型)純化肽。C4、C8或C18制備柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，CA)可以用來分離肽，純度可以使用C4、C8或C18分析柱(5μ，0.46×25cm；Vydac)進行測定?？梢砸粤魉?.0ml/分鐘將溶劑(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/CH3CN)傳遞至分析柱，而以流速15ml/分鐘將所述溶劑傳遞至制備柱。氨基酸分析可以在Waters Pico Tag系統(tǒng)上進行并且用Maxima程序進行加工。肽可以通過汽相酸水解進行水解(115℃，20-24小時)。水解物可以通過標準方法(Cohen等，ThePico Tag MethodA Manual of Advanced Techniques for Amino AcidAnalysis，第11-52頁，Millipore Corporation，Milford，MA(1989))進行衍生化和分析?？焖僭愚Z擊分析可以通過M-Scan，Incorporated(WestChester，PA)進行。質(zhì)量校準可以用碘化銫或碘化銫/甘油進行。使用飛行時間檢測的等離子體解吸電離分析可以在Applied Biosystems Bio-Ion 20質(zhì)譜儀上進行。電噴射質(zhì)譜法可以在VG-Trio儀上進行。
采用本領(lǐng)域目前已知的方法，可用于本發(fā)明制劑和劑量的肽有效成分化合物也可用重組DNA技術(shù)制備。參見，例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(1989)?；蛘撸@樣的化合物可以通過均相肽合成法來制備。可用于本發(fā)明的非肽化合物可以通過本領(lǐng)域已知的方法來制備。例如，含磷酸的氨基酸和含這類氨基酸的肽可以用本領(lǐng)域已知的方法來制備。參見，例如，Bartlett和Landen，Biorg.Chem.14356-377(1986)。
聚乙二醇聚合物(或其它增加分子量的試劑)的綴合有幾種策略用于將PEG偶聯(lián)至肽/蛋白。參見，Int.J.Hematology681(1998)；Bioconjugate Chem.6150(1995)；和Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Sys.9249(1992)，所有所述文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用這類眾所周知的技術(shù)，將一個或更多個聚乙二醇聚合物連接到此中描述的exendin和exendin激動劑。合適的聚乙二醇聚合物通常市售的，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來制備。所述聚乙二醇聚合物或其它增加分子量的試劑的分子量最好為500-20,000，并且可以為支鏈或直鏈聚合物。
PEG在完整肽或蛋白上的連接可以通過與氨基、羧基或巰基偶聯(lián)來完成。這些基團通常將位于這樣的天然存在的氨基酸(如賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸)的N末端和C末端和側(cè)鏈上。由于exendin-4和其它exendin和exendin激動劑可以通過固相肽化學技術(shù)來制備，因此可以引入各種各樣含有具有垂直(orthogonal)保護基的二氨基和二羧基的部分，用于與PEG綴合。
本發(fā)明也提供類似于聚乙二醇的方式將exendin或exendin激動劑與一種或更多種可以調(diào)節(jié)腎臟清除率的非聚乙二醇的聚合物綴合。這類聚合物的實例包括清蛋白和明膠。參見，Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.，6332-351，1995，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中。實用性此中所述制劑和劑量就其藥理學特性而言是有效的。具體地說，本發(fā)明的化合物具有作為減少進食量的藥物和作為調(diào)節(jié)胃動力和減慢胃排空的藥物的活性，如根據(jù)在哺乳動物中抑制胃排空水平的能力所證明的。它們可以用來治療通過減少進食量或調(diào)節(jié)胃動力來緩解的病癥或疾病。本發(fā)明的制劑和劑量作為exendin和exendin激動劑也是有效的，并且具有作為降低液血葡萄糖和調(diào)節(jié)胃動力和減慢胃排空的藥物的活性，正如在哺乳動物中降低餐后葡萄糖水平的能力所證明的。本發(fā)明的化合物可用于體外和體內(nèi)研究exendin和exendin激動劑的科學方法，例如可用于諸如此中描述的那些方法中。
上述化合物可以與各種無機和有機酸和堿形成鹽。這類鹽包括用有機酸和無機酸制備的鹽，所述有機酸和無機酸例如HCl、HBr、H2SO4、H3PO4、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、馬來酸、富馬酸和樟腦磺酸。用堿制備的鹽包括銨鹽、堿金屬鹽(例如鈉鹽和鉀鹽)和堿土金屬鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)。優(yōu)選乙酸鹽、鹽酸鹽和三氟乙酸鹽。通過常規(guī)方法，例如通過在所述鹽不溶于其中的溶劑或介質(zhì)、或在隨后可真空除去或通過經(jīng)冷凍干燥除去的溶劑(例如水)中，使所述產(chǎn)物的游離酸或堿形式與一種或更多種適當堿或酸的等同物反應(yīng)，或通過在合適離子交換樹脂上用另一種離子交換現(xiàn)有鹽的離子，可以制備所述鹽。制劑和給藥鑒于本發(fā)明的修飾的exendin和exendin激動劑的exendin樣效應(yīng)，因此所述修飾的exendin和exendin激動劑制劑和劑量是有效的，并且可以方便地以適于胃腸外(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下)給藥的劑型提供。此中也描述了可用于替代傳遞途徑(包括經(jīng)口、鼻、口腔含化、舌下和肺的途徑)的制劑和劑量。
已經(jīng)通過測量循環(huán)中的exendin-4以及觀察給藥后的生物反應(yīng)(例如糖尿病動物中血漿葡萄糖的降低)，研究傳遞exendin-4的替代途徑的可行性。已經(jīng)研究exendin-4穿過幾種表面(呼吸道(鼻、氣管和肺途徑)和腸(舌下、管飼法和十二指腸內(nèi)途徑))的傳遞，用通過呼吸道的每種給藥途徑和用通過胃腸道的舌下和管飼法給予的肽，已經(jīng)觀察到exendin-4在血液中的生物效應(yīng)和出現(xiàn)。已經(jīng)全面描述了氣管內(nèi)給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)腸給藥和舌下給藥。
在某些情況下，方便的是在一種組合物或溶液中提供一起給予的修飾的exendin或exendin激動劑和另一種抗胃排空藥(例如胰高血糖素、糊精或糊精激動劑)。在其它情況下，可能更有利的是將所述修飾的exendin或exendin激動劑與另一種抗排空藥分開給予。在另外的情況下，可能有益的是提供或者與其它降糖藥(例如胰島素)共同配制的或者與其它降糖藥(例如胰島素)分開的修飾的exendin或exendin激動劑。合適給藥方案最好由執(zhí)業(yè)醫(yī)師根據(jù)每個患者單獨確定。合適的藥學上可接受的載體及其制劑描述于標準制劑專集，例如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences。也參見， Wang，Y.J.和Hanson，M.A.“蛋白和肽的胃腸外制劑穩(wěn)定性和穩(wěn)定劑，”Journal of ParenteralScience and Technology，Technical Report第10期，增刊422S(1988)。
可用于本發(fā)明的化合物可以作為用于注射或輸注的胃腸外組合物提供。它們可以例如被懸浮在惰性油，適當?shù)氖菓腋∮谥参镉?例如芝麻油、花生油、橄欖油)或其它可接受的載體中。它們最好懸浮在pH為約4.0至約7.4的水基載體中，例如在等滲緩沖溶液中。這些組合物可以通過常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌或者可以過濾除菌。所述組合物可以含有需要的近似生理條件的藥學上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH緩沖劑。有效的緩沖液包括例如乙酸鈉/乙酸緩沖液?？梢允褂盟▌┬问胶汀熬忈屝汀甭尫胖苿┑男问剑沟弥委熡行Я康闹苿┰诮?jīng)皮注射或傳遞后許多小時或許多天內(nèi)被傳遞至血流中。
可以用氯化鈉或其它藥學上可接受的試劑，例如葡萄糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨糖醇)或其它無機溶質(zhì)或有機溶質(zhì)，達到所需的等滲性。對于含鈉離子的緩沖液特別優(yōu)選氯化鈉。
所述要求保護的化合物也可以配制成藥學上可接受的鹽(例如酸加成鹽)和/或它們的絡(luò)合物。藥學上可接受的鹽在給予它們時的濃度下是無毒的鹽。這類鹽制劑可以通過改變所述組合物的物理-化學特性而有助于藥理學應(yīng)用，但是不防礙所述組合物發(fā)揮其生理學效應(yīng)。物理特性方面有用改變的實例包括降低熔點，以易于經(jīng)粘膜給藥；以及增加溶解度，以易于給予更高濃度的所述藥物。
藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽，例如含有硫酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽、氨基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環(huán)己氨基磺酸鹽和奎尼酸鹽的那些酸加成鹽。藥學上可接受的鹽可以得自酸例如鹽酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)己氨基磺酸和奎尼酸。例如通過在所述鹽不溶于其中的溶劑或介質(zhì)、或在隨后可真空除去或通過經(jīng)冷凍干燥除去的溶劑(例如水)中，使所述產(chǎn)物的游離酸或堿形式與一種或更多種適當堿或酸的等同物反應(yīng)，或通過在合適離子交換樹脂上用另一種離子交換現(xiàn)有鹽的離子，可以制備所述鹽。
也可以使用載體或賦形劑，以易于給予所述化合物。載體和賦形劑的實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)或各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和生理上相容的溶劑?？梢酝ㄟ^不同的途徑，包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、和肌內(nèi)、口服、局部或經(jīng)粘膜途徑，給予所述組合物或藥用組合物。
如有需要，上述組合物的溶液可以用增稠劑(例如甲基纖維素)增稠。它們可以以乳化形式(或者油包水或者水包油)制備?？梢允褂酶鞣N各樣的藥學上可接受的乳化劑中的任一種，包括例如金合歡膠粉、非離子型表面活性劑(例如吐溫)、或離子型表面活性劑(例如堿性聚醚醇硫酸酯或磺酸酯，例如Triton)。
根據(jù)普遍接受的方法，通過將多種組分混合，制備可用于本發(fā)明的組合物。例如，可以將所選組分在配料器或其它標準裝置中簡單混合，產(chǎn)生濃縮混合物，然后可以通過加入水或增稠劑，可能的話，加入控制pH的緩沖劑或控制張力的額外溶質(zhì)，將其調(diào)節(jié)至終濃度和粘度。
關(guān)于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的用法，所述化合物將以含有一定量的exendin激動劑、含有或不含有另一種抗排空藥的單位劑型提供。用于控制胃排空和用于胃排空被有益地減慢或調(diào)節(jié)的病癥中的exendin激動劑的治療有效量，是降低餐后血葡萄糖水平(最好是不超過約8mM或9mM)或使得血葡萄糖水平按需降低的量。糖尿病個體或葡萄糖不耐受個體比正常個體的血漿葡萄糖水平高。在這樣的個體中，可以達到有益降低或“改善(smoothing)”餐后血葡萄糖水平。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，治療藥物的有效量將隨許多因素而變化，所述因素包括患者的年齡和體重、患者的身體條件、血糖水平或?qū)⑦_到胃排空抑制的水平以及其它諸多因素。
這樣的藥用組合物可用于引起受治療者的胃運動減少以及可用于有益地減少胃動力的其它疾病。
對于一名70kg患者而言，所述化合物的有效抗排空日用量通常的范圍是0.01mg/天或0.03mg/天至約5mg/天，優(yōu)選約0.01或0.5-2mg/天，更優(yōu)選約0.01或0.1-1mg/天，以單劑量或分次劑量給予。將給予的精確劑量由主治醫(yī)師確定，并且依賴于所述特定化合物是否在上述提供的范圍內(nèi)以及取決于個體的年齡、體重和病癥。給藥應(yīng)在糖尿病剛出現(xiàn)癥狀時開始，或在診斷糖尿病后立即開始?？梢酝ㄟ^注射、最好是皮下或肌內(nèi)注射給藥。口服有活性的化合物可以采用口服，然而，劑量應(yīng)增加5-10倍。
一般而言，在治療或預(yù)防不適當或不需要的餐后血葡萄糖水平升高時，可以在類似于上述劑量的劑量范圍內(nèi)，將本發(fā)明的化合物給予需要這種治療的患者，然而，給予所述化合物頻率更多，例如，一天一次、二次或三次。
對于患者而言，本申請化合物的最佳制劑和給藥模式取決于本領(lǐng)域已知的諸多因素，例如患者的特定疾病或病癥、所需效應(yīng)和類型。雖然通常將所述化合物用于治療人類患者，但也可以用它們治療其它脊椎動物例如其它靈長類、家畜(例如豬、牛和家禽)以及運動用動物和寵物(例如馬、狗和貓)中的相似疾病和相同疾病。
為了有助于理解本發(fā)明，包括描述了一系列實驗結(jié)果的以下實施例。當然，與本發(fā)明有關(guān)的實驗不應(yīng)認為是具體限制本發(fā)明，而是認為對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)現(xiàn)在已知的或以后將開發(fā)的本發(fā)明的這類變化屬于本文描述的和下文要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例1-exendin-3的制備His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu GluAla Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly AlaPro Pro Pro Ser-NH2[SEQ.ID NO.1]采用Fmoc保護的氨基酸(Applied Biosystems，Inc.)，在4-(2’-4’-二甲氧苯基)-Fmoc氨甲基苯氧基乙酰胺正亮氨酸MBHA樹脂(Novabiochem，0.55mmole/g)上裝配上述酰胺化肽。一般而言，在整個合成中使用單偶聯(lián)循環(huán)并且使用Fast Moc(HBTU活化)化學。采用哌啶達到生長中的肽鏈的去保護(除去Fmoc基團)。采用三乙基硅烷(0.2mL)、乙二硫醇(0.2mL)、茴香醚(0.2mL)、水(0.2mL)和三氟乙酸(15mL)的混合物，按照標準方法(Introduction to Cleavage Techniques，AppliedBiosystems，Inc.)，達到全部肽樹脂的最終去保護。所述肽在乙醚/水(50mL)中沉淀，然后離心。所述沉淀物在冰醋酸中重建，然后凍干。將所述凍干的肽溶于水中。粗制品的純度約為75％。
在純化步驟和分析中所用的是溶劑A(0.1％TFA水溶)和溶劑B(0.1％TFA的ACN溶液)。
將含肽的溶液加樣到制備型C-18柱上，然后純化(在40分鐘內(nèi)在溶劑A中10％-40％溶劑B)。采用C-18分析柱，恒溶劑測定流分的純度。將純的流分合并，提供以上鑒定的肽。所述凍干肽的分析型RP-HPLC(在30分鐘內(nèi)，梯度在溶劑A中30％-60％溶劑B)得到具有觀測到的保留時間為19.2分鐘的產(chǎn)物肽。
實施例2-exendin-4的制備His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu GluAla Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly AlaPro Pro Pro Ser-NH2[SEQ.ID NO.2]
以與實施例1中所述的exendin-3類似的方法，采用Fmoc保護的氨基酸(Applied Biosystems，Inc.)，在4-(2’-4’-二甲氧苯基)-Fmoc氨甲基苯氧基乙酰胺正亮氨酸MBHA樹脂(Novabiochem，0.55mmole/g)上裝配上述酰胺化肽，將其從所述樹脂中切割，去保護以及純化。在分析中所用的是溶劑A(0.1％ TFA水溶液)和溶劑B(0.1％ TFA的ACN溶液)。所述凍干肽的分析型RP-HPLC(在30分鐘內(nèi)，梯度在溶劑A中36％-46％溶劑B)得到具有觀測到的保留時間為14.9分鐘的產(chǎn)物肽。電噴射質(zhì)譜法(M)計算值4186.6；實測值4186.0-4186.8(4批)。
實施例3腎臟清除率腎臟可以在消除某些分子(藥物、肽、蛋白質(zhì))中起主要作用。對于某些分子，當腎臟在腎小球上濾過血液時這一過程就開始了，產(chǎn)生下述的超濾液。腎小球濾器不僅根據(jù)分子量進行辨別，而且通過作為負電荷選擇性屏障進行辨別，促進陰離子化合物的保留。血漿中分子量小于5kD并且有效半經(jīng)小于15_的分子的游離部分(沒有結(jié)合蛋白質(zhì))容易被濾過。對于較大分子量的分子，它們在更限制性和有限的基礎(chǔ)上被濾過，主要是根據(jù)分子大小、結(jié)構(gòu)和凈電荷。腎小球濾過的截止點位于保留的清蛋白(67kD)和被濾過的血紅蛋白(68kD)之間。有效半經(jīng)約為36_的清蛋白在腎小球上的濾過量低于1％。
一旦在腎小球中分子移動至近端小管，在近端小管中分子或者被重吸收或者它通過亨利氏袢移動至遠端小管，在遠端小管中集合管將濾液排到膀胱中。濾過的蛋白質(zhì)和肽通常在近端小管中由刷狀緣酶切割，然后它們被鈉/氨基協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(清除泵)有效地回收。換句話說，極性、離子化和大分子量的分子將不被重吸收。在整個過程中，腎皮質(zhì)(近端小管)中的代謝酶也可以將所述分子降解為極性更強的分子，從而增加排泄到尿中的概率。許多肽類激素(例如糊精、降鈣素和GLP-1)通過腎循環(huán)降解，推測可能是被能接近血漿的血管胞外酶降解，而與腎小球濾過過程無關(guān)。在那些實施中，肽從血漿中的清除速率與腎臟血漿的流率相似，它比腎小球濾過速率高約3倍。
為了測試腎臟濾過是否可能是exendin消除的主要模式，在以恒速輸注exendin-4的過夜禁食的腎切除的雄性大鼠中進行多項研究。腎切除的大鼠與其腎完整的大鼠相比，其exendin-4的穩(wěn)態(tài)血漿水平大大提高了。該數(shù)據(jù)表明，腎臟負責清除至少80％的exendin-4(參見圖5和圖6)。完整大鼠中的exendin-4清除速率類似于那些大鼠預(yù)期的腎小球濾過速率(4.2mL/分鐘)。將這些結(jié)果綜合在一起表明，看來系統(tǒng)發(fā)生非常少的新陳代謝，并且exendin-4的清除大多數(shù)是通過腎臟濾過(而不是通過腎血管內(nèi)的蛋白酶解)。尿中少量的免疫反應(yīng)性全長exendin-4符合其濾過后在近端小管中被刷狀緣酶切割的結(jié)果。這些結(jié)果也與以下事實一致進行研究以鑒定exendin-4的血漿循環(huán)代謝物的研究，得到非常少的蛋白酶解降解的證據(jù)；在動物中采用靜脈內(nèi)大劑量后，血漿的HPLC分析顯示只有完整exendin的存在，而指示降解產(chǎn)物構(gòu)成的“子體”峰的出現(xiàn)可被忽略。這與其它肽的研究(例如糊精和GLP-1)正好相反，其中“母體”HPLC峰的消失與隨后鑒定為亞肽降解物的“子體”HPLC峰的出現(xiàn)相關(guān)。
實施例4PEG修飾的exendin-4可以通過在合適的位置加入PEG基團，來選擇exendin-4的不同生物活性譜。對于PGE化的蛋白質(zhì)而言，已經(jīng)報道了生物活性的損失或改變，這可能是由于所述PEG鏈本身的存在引起的，即PEG鏈占據(jù)了特定部位或者偶聯(lián)條件對蛋白質(zhì)有負作用。
鑒于在腎臟上濾過exendin和exendin激動劑，因此對于PEG修飾，主要考慮的是大小和電荷。未修飾的exendin-4的分子量約為4.2kD，并且本質(zhì)上為陰離子，在生理pH下具有的總凈電荷約為-2。可以將1-10個、最好是1個、2個或3個PEG組分與exendin-4或exendin-4的類似物共價連接，例如，優(yōu)選1個PEG組分。每個獨立的PEG組分的分子量大小可以為500-20,000、最好在5,000-12,000之間變化。
用于共價連接PEG的許多方法涉及賴氨酸上的ε-氨基。exendin-4具有2個可以通過連接PEG修飾的賴氨酸(參見下文的化合物201和202)。另外，在這些位置上的ε-氨基可以被遮蔽，從而增加所述肽的陰離子性質(zhì)。(201)HGEGTFTSDLSK(PEG)QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(202)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK(PEG)NGGPSSGAPPPS-NH2可以通過Lys-PEG或等同物的取代修飾的其它位置例如是(203)HK(PEG)EGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(204)HGEGK(PEG)FTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(205)HGEGTFTK(PEG)DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(206)HGEGTFTSDK(PEG)SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(207)HGEGTFTSDLK(PEG)KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(208)HGEGTFTSDLSKK(PEG)MEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(209)*HGEGTFTSDLSKQMEK(PEG)EAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(210)*HGEGTFTSDLSKQMEEK(PEG)AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(211)HGEGTFTSDLSKQMEEEAK(PEG)RLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(212)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRK(PEG)FIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(213)*HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIK(PEG)WLKNGGPSSGAPPPS-NH2(214)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEK(PEG)LKNGGPSSGAPPPS-NH2(215)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKK(PEG)GGPSSGAPPPS-NH2以上用星號標記的三種分子含有一個在特定位置上取代了谷氨酸的PEG化賴氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，在這些位置上非-K(PEG)取代的分子可以不通過PEG部分與谷氨酸側(cè)鏈羧基的綴合來修飾，這種修飾本文稱為E(PEG)。
其中可以取代Lys-PEG的其它類似物包括(216)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNK(PEG)GPSSGAPPPS-NH2(217)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGK(PEG)PSSGAPPPS-NH2用于實施例5-10的包括K(PEG)修飾的和精氨酸取代的exendin在內(nèi)的各種分子示于以下表I中。
表Iexendin- HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH24(218) (CH3)-COHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(219)(CH3)-CH2HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(220) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLK(PEG)NGGPSSGAPPPS-NH2(221) HGEGTFTSDLSK(PEG)QMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-NH2(222) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-NH2(223) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPK(PEG)-NH2(224) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGK(PEG)PSSGAPPPS-NH2(225) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLK(PEG)NGGPSSGAPPPS-NH2(226) HGEGTFTSDLSK(PEG)QMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-NH2(227)(PEG)COHGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-NH2(228) (PEG)CH2HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPS-NH2(229) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGGPSSGAPPPK(PEG)-NH2(230) HGEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWLRNGK(PEG)PSSGAPPPS-NH2用于以下實施例5-10中的各種PEG修飾的exendin在表I中提供，而相應(yīng)的結(jié)果在表II中提供(參見實施例9的最后一段)。GLP-1[7-36]NH2(GLP-1)購自Bachem(Torrance，CA)。所有其它肽均采用合成法(例如此中描述的那些方法)制備。所有化學藥品均為最高商品級。cAMP SPA免疫測定購自Amersham。放射性配體購自New EnglandNuclear(Boston，MA)。RINm5f細胞(美國典型組織保藏中心(AmericanType Tissue Collection)，Rockville，MD)在含10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DME/F12培養(yǎng)基中生長。細胞在37℃和5％CO2/95％潮濕空氣下生長，每2-3天更換培養(yǎng)基。讓細胞生長至匯合，然后收獲，并用Polytron勻漿器進行勻漿。將細胞勻漿冷凍貯存在-70℃待用。
實施例5-GLP-1受體結(jié)合研究可以通過測量來自RINm5f膜的[125I]GLP-1或[125I]exendin(9-39)的置換，評價受體結(jié)合。測定緩沖液在20mM HEPES中含有5μg/ml苯丁抑制素、1μg/ml膦酰二肽、1mg/ml牛血清白蛋白(fraction V)、1mg/ml桿菌肽和1mM MgCl2，pH7.4。為了測定結(jié)合，將30μg膜蛋白(Bradford protein assay)再懸浮于200μl測定緩沖液中，并與60pM[125I]GLP-1或[125I]exendin(9-39)以及未標記的肽于23□C在96孔板(Nagle Nunc，Rochester，NY)中一溫孵育120分鐘。通過聚乙烯亞胺處理的GF/B玻璃纖維濾膜(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)，采用TomtecMach II板收獲器(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)，通過用冷磷酸緩沖鹽水pH7.4的快速過濾終止溫育。將濾膜干燥，與閃爍體結(jié)合，并且在Betaplate液體閃爍計數(shù)器(Wallac Inc.)中測定放射性。
測定中采用二個復(fù)份點、6個稀釋度、濃度范圍為10-6M-10-12M，測定肽樣品，產(chǎn)生響應(yīng)曲線。樣品的生物活性可以以IC50值表示，運用迭代曲線擬合程序，采用4參數(shù)邏輯斯諦方程(Prizm，GraphPAD軟件)從原始數(shù)據(jù)計算出IC50值。
實施例6-環(huán)化酶活化研究測定緩沖液在50mM HEPES中含有10μM GTP、0.75mM ATP、2.5mM MgCl2、0.5mM磷酸肌酸、12.5 U/ml肌酸激酶、0.4mg/ml抑蛋白酶肽、1μM IBMX，pH7.4。在96孔濾膜底平板(Millipore Corp.，Bedford，MA)中，在100ml測定緩沖液中，將膜和肽混合。于37℃溫育20分鐘后，采用Millipore多頭抽真空裝置，通過過濾，將上清液轉(zhuǎn)移至新鮮96孔板中，終止所述測定。上清液cAMP含量通過SPA免疫測定進行定量。測定中采用三個復(fù)份點、7個稀釋度、濃度范圍為10-6M-10-12M，測定肽樣品，產(chǎn)生反應(yīng)曲線。特定樣品的生物活性以EC50值表示，如上所述進行計算。
實施例7-db/db小鼠中血葡萄糖水平的測定本研究使用至少3月齡的C57BLKS/J-m-db小鼠。所述小鼠可以得自Jackson實驗室，并且在使用之前讓所述小鼠適應(yīng)至少1周。小鼠可以在22℃±1℃、1212光照黑暗周期下以10只一組關(guān)養(yǎng)，光照從上午6點鐘開始。所有動物可以在采基線血樣之前2小時，停止供給食物。在用metophane輕度麻醉后，通過眼部穿刺，從每只小鼠抽取約70μl血液。收集基線血樣之后，為了測量血漿葡萄糖濃度，所有動物都接受皮下注射或者溶媒(10.9％ NaCl)、溶媒中的exendin-4或者試驗化合物(1μg)。從注射起恰好1小時后，運用相同方法再次抽取血樣，然后測量血漿葡萄糖濃度。對于每只動物，根據(jù)基線值，計算出血漿值變化的百分比。
實施例8-db/db小鼠中血葡萄糖水平的劑量反應(yīng)測定使用至少3月齡的C57BLKS/J-m-db/db小鼠。所述小鼠得自Jackson實驗室，并且在使用之前讓所述小鼠適應(yīng)至少1周。小鼠在22℃±1℃、1212光照黑暗周期下以10只一組關(guān)養(yǎng)，光照從上午6點鐘開始。所有動物在采基線血樣之前2小時，停止供給食物。在用metophane輕度麻醉后，通過眼部穿刺，從每只小鼠抽取約70μl血液。收集基線血樣之后，為了測量血漿葡萄糖濃度，所有動物都接受皮下注射或者溶媒、exendin-4或者試驗化合物。從注射起恰好1小時后，運用相同方法再次抽取血樣，然后測量血漿葡萄糖濃度。對于每只動物，根據(jù)基線值，計算出血漿值變化的百分比，并且運用GraphpadPrizmTM軟件，評價劑量依賴關(guān)系。
實施例9-胃排空也進行胃排空研究，以檢查exendin-4和/或exendin激動劑化合物對大鼠胃排空的影響。這樣的實驗通常采用Scarpignato等方法(Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.246286-94，1980)的改進方法。使用Harlan Sprague Dawley(HSD)雄性大鼠。所有動物均在22.7±0.8℃、1212小時光照黑暗周期(實驗在光照周期期間進行)下關(guān)養(yǎng)，并且食物和水不限量(Diet LM-485，Teklad，Madison，WI)。為了確保胃中不含可能干擾分光光度吸光度測定的食糜，可以在禁食約20小時后，根據(jù)下文描述的方法，進行胃排空的測定。
神志清醒的大鼠通過管飼法接受1.5ml含有1.5％甲基纖維素(M-0262，Sigma Chemical Co，St Louis，MO)和0.05％酚紅指示劑的acaloricgel。管飼法后20分鐘，使用5％氟烷麻醉大鼠，將胃暴露并且在幽門括約肌和食管下部括約肌處用動脈鉗夾住，將胃取出并且打開，然后放入已制成固定體積的堿性溶液中。根據(jù)通過在波長為560nm的吸光度測定的堿性溶液中酚紅的強度，推導(dǎo)出胃的含量。在對幾只其它大鼠的獨立實驗中，可以將胃和小腸都切除，并打開放進堿性溶液中。然后可以測定可以在管飼法20分鐘內(nèi)從胃腸道上部回收的酚紅量。根據(jù)胃腸腔表面不可回收地結(jié)合的染料計算出剩余部分。為了計算小于100％的最大染料回收，20分鐘后的胃內(nèi)容物保留的百分比，以從同一實驗中管法后立即處死的對照大鼠回收的胃內(nèi)容物的百分數(shù)表示。胃內(nèi)容物保留的百分比＝(20分鐘時的吸光度)/(0mm時的吸光度)×100。
實施例10-正常小鼠中注射試驗化合物減少進食量所有小鼠(NIHSwiss小鼠)都關(guān)在22(±2)℃、60(±10)％濕度和1212光照黑暗周期的穩(wěn)定環(huán)境中；光照從0600開始。在實驗之前小鼠以4只為一組關(guān)在標準籠中至少2周，不限制食物(TekladLM 485；Madison，WI)和水，除非另有說明。
所有實驗均在時間0700-0900之間進行。所述小鼠禁食(在實驗前一天的1600時拿走所有動物的食物)，并在此后將所述小鼠單獨關(guān)養(yǎng)。所有小鼠接受腹膜內(nèi)注射(5μl/kg)或者鹽水或者劑量為0.1μg/kg、1.0μg/kg、10μg/kg和100μg/kg的試驗化合物，然后立即給予預(yù)稱量的食物塊(TekladLM485)。以30分鐘、1小時、2小時和6小時的間隔，將食物塊稱量，以測定所吃的食物量。測定幾種試驗化合物30分鐘內(nèi)抑制進食量的ED50，結(jié)果示于以下表II中。
表IIGLP-1 食欲環(huán)化酶 抑制EC50nMED50μg/kgexendin4 0.270.21218 ＞10001.80219 1.110.08220 0.8 0.12221 0.696.70222 2.70 弱223 0.462.40224 3.22 弱22523 弱226 102 2.40227 149 NA228 458 NA229 60.414.50230 157 NA本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地認識到，本發(fā)明很好地適于達到所述目的，并且得到所提及的結(jié)果和優(yōu)點以及其中固有的那些特性。此中描述的分子絡(luò)合物以及所述方法、步驟、療法、分子、特定化合物是目前代表性的優(yōu)選實施方案，是示例性的，并且不是用來限制本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會想到的、包括在本發(fā)明的精神范圍內(nèi)的其中的改變和其它應(yīng)用由權(quán)利要求書的范圍限定。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可以對本文公開的發(fā)明進行許多不同的取代和修改。
本說明書中提及的所有專利和出版物表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物通過引用全部結(jié)合到本文中，其程度同每個單獨出版物具體而單獨地通過引用結(jié)合到本文中的程度一樣。
此中適當說明性地描述的本發(fā)明可以在缺少不是此中具體公開的任何一種或多種要素、一種或多種限制下實施。因此，例如，在此中的每種情況下，任何所述術(shù)語“包含”、“基本上含有”和“含有(consistingof)”可以用其它兩個術(shù)語中的任一個替代。已使用的術(shù)語和表達用作描述的范圍而不是限制的范圍，沒有打算用這類術(shù)語和表達來排除說明和描述所述特征或其部分的任何等同術(shù)語和表達，但是人們會認識到，在要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因此，不用說，雖然本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方案具體地公開，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員對此中公開概念的任選特征、修改和變化可以再分類，并且這樣的修改和變化被認為是在由所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外，在利用馬庫什組(Markush group)描述了本發(fā)明的特征或方面的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，本發(fā)明也由此在馬庫什組中的任一單個成員或成員亞組方面進行了描述。例如，如果將X描述為選自溴、氯和碘，則全面描述了對X為溴的要求以及對X為溴和氯的要求。
本文已經(jīng)概括地在屬類上描述了本發(fā)明。屬于屬類(generic)公開內(nèi)容的每個更窄的種類和亞屬類分組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的屬類的描述，并且從所述屬類中去除任何主題的附有條件或者否定有這類限制，而與所去掉的材料是否是此中具體引用無關(guān)。
其它實施方案在以下權(quán)利要求書內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種修飾的exendin或exendin激動劑，所述修飾的exendin或exendin激動劑包含與一個或更多個聚乙二醇聚合物連接的一個exendin或exendin激動劑。
2.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述exendin或exendin激動劑是exendin-4。
3.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述exendin或exendin激動劑與一個聚乙二醇聚合物連接。
4.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述exendin或exendin激動劑與兩個聚乙二醇聚合物連接。
5.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述exendin或exendin激動劑與三個聚乙二醇聚合物連接。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述一個或更多個聚乙二醇聚合物每個的分子量在500和20,000之間。
7.權(quán)利要求1-5中任一項的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述exendin或exendin激動劑通過所述exendin或exendin激動劑的賴氨酸氨基酸上的ε氨基與所述一個或更多個聚乙二醇聚合物連接。
8.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑選自由化合物201-230組成的一組化合物。
9.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑選自由化合物209、210和213組成的一組化合物。
10.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑選自由化合物201和202組成的一組化合物。
11.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑選自由化合物216和217組成的一組化合物。
12.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述一個或更多個聚乙二醇聚合物與所述exendin或exendin激動劑的氨基、羧基或硫代基團連接。
13.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述一個或更多個聚乙二醇聚合物與所述exendin或exendin激動劑的一個或更多個氨基酸側(cè)鏈的N末端或C末端、或者N末端和C末端連接，其中所述氨基酸選自賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸。
14.權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，其中以一個或更多個具有胺基或羧基或者具有胺基和羧基的氨基酸側(cè)鏈部分，使所述一個或更多個聚乙二醇聚合物與所述exendin或exendin激動劑連接。
15.一種制備權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑的方法，所述方法包括將所述一個或更多個聚乙二醇聚合物與所述exendin或exendin激動劑連接。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述連接通過固相合成進行。
17.一種治療通過給予一種exendin或exendin激動劑而受益的疾病的方法，所述方法包括將一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑提供給患有所述疾病的患者的步驟，從而治療所述疾病。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述疾病選自餐后傾倒性綜合征、餐后高血糖癥、葡萄糖耐受不良、可以通過抑制胰高血糖素分泌、調(diào)節(jié)甘油三酯水平、減少進食量而緩解的病癥或疾病、肥胖癥、進食障礙、胰島素抵抗綜合征、糖尿病、高血糖癥和低血糖癥。
19.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑和一種藥學上可接受的載體。
20.一種試劑盒，所述試劑盒包含一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑以及使用說明或包裝。
21.一種有益地調(diào)節(jié)受治療者胃腸動力的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑。
22.一種治療攝食毒素的方法，所述方法包括(a)給予一定量的權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑，以有效預(yù)防或減少胃內(nèi)容物傳遞至腸；和(b)抽吸出所述胃的所述內(nèi)容物。
23一種使受治療者的食欲降低或體重減輕、或血脂降低的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑。
24.一種調(diào)節(jié)受治療者甘油三酯水平的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑。
25.一種抑制受治療者胰高血糖素分泌的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑。
26.一種治療受治療者的糖尿病的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑。
27.一種權(quán)利要求26的方法，其中所述糖尿病選自I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。
28.一種藥用組合物，所述藥用組合物用于治療與營養(yǎng)過度相關(guān)的病癥或疾病、或者用于降低受治療者食欲或體重、或者用于抑制受治療者胰高血糖素分泌、或者用于調(diào)節(jié)受治療者甘油三酯水平、或者用于降低受治療者血脂水平，所述藥用組合物包含治療有效量的一種權(quán)利要求1的修飾的exendin或exendin激動劑以及一種藥學上可接受的載體。
29.一種修飾的exendin或exendin激動劑，所述修飾的exendin或exendin激動劑包含一種與一種或更多種增加分子量的化合物連接的exendin或exendin激動劑。
30.一種權(quán)利要求29的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述增加分子量的化合物中的至少一種選自聚乙二醇聚合物、清蛋白、聚氨基酸、明膠、琥珀酰明膠、聚((羥丙基)-甲基丙烯酰胺)、脂肪酸、olysaccaride、脂質(zhì)氨基酸和葡聚糖。
31.權(quán)利要求30的修飾的exendin或exendin激動劑的用途，用于制備藥物。
32.一種治療受治療者的方法，所述方法包括給予需要治療的所述受治療者一種藥學上可接受形式的權(quán)利要求30的修飾的exendin或exendin激動劑。
33.一種權(quán)利要求29的修飾的exendin或exendin激動劑，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑是一種修飾的exendin-4。
34.權(quán)利要求31的用途，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑是一種修飾的exendin-4。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述修飾的exendin或exendin激動劑是一種修飾的exendin-4。
全文摘要
本發(fā)明提供具有與例如一個或更多個聚乙二醇聚合物連接的exendin或exendin激動劑的新型修飾的exendin或exendin激動劑及其有關(guān)制劑和劑量和給藥方法。這些修飾的exendin或exendin激動劑、組合物和方法可用于治療糖尿病和通過降低血漿葡萄糖或延遲和/或減慢胃排空或抑制進食量而受益的多種病癥。His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp LeuSer Lys Gln Met Glu Glu1 51015Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 202530Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser－NH
文檔編號A61P3/08GK1372570SQ00809516
公開日2002年10月2日 申請日期2000年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者A·楊, K·普里克特 申請人:安米林藥品公司