專利名稱：新的抗真菌劑和殺真菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
描述本發(fā)明涉及可由酵母獲得的新的抗真菌劑和殺真菌劑，及其制備方法和應(yīng)用。
由于最近幾年真菌和/或酵母感染人的事件大大增加，而且還繼續(xù)導(dǎo)致非期望的食品和動(dòng)物飼料污染，因此選擇性抗真菌劑顯得極其重要。真菌病在細(xì)胞和體液防御系統(tǒng)必須保持在非完全功能水平的免疫抑制患者中具有特別嚴(yán)重的后果(Anaissie，1992；Meunier等人，1992；Wingard，1995)。真菌病極度危及感染了HIV-1(AIDS)的患者，他們非常頻繁的死于由對(duì)人致病性的真菌和/或酵母引起的機(jī)會(huì)性傳染疾病的晚期(Levy，1993)。目前用于治療這些傳染病的抗真菌劑(諸如兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑)引起相當(dāng)大的副作用，因?yàn)樗鼈兤茐恼婧思?xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)完整性，由此也損害受感染的宿主生物體(Hector，1993)。此外，傳統(tǒng)抗真菌劑的應(yīng)用在很短時(shí)間內(nèi)即導(dǎo)致氟康唑抗性的快速增加，并在對(duì)人致病性的微生物中快速傳播，甚至構(gòu)成不斷增加的問(wèn)題(Cameron等人，1993；Chavenet等人，1994；Maenza等人，1996；Pfaller等人，1994；Rex等人，1995；Troillet等人，1993)。因此，非常需要開(kāi)發(fā)像細(xì)菌抗生素那樣根據(jù)高度選擇性而有所區(qū)別且如果有可能只攻擊對(duì)人致病性的真菌和酵母的抗真菌劑。然而，既然高等生物體所有細(xì)胞過(guò)程中的大多數(shù)受在真核生物中具有高度功能同源性的基因產(chǎn)物的控制，因此“特異性抗真菌抗生素”的開(kāi)發(fā)至今尚未成功(Kurz，1998；Komiyama等人，1998)。
選擇性抗真菌劑的一個(gè)靶子是酵母細(xì)胞壁的β-1，3-D-葡聚糖，它對(duì)于細(xì)胞的機(jī)械和滲透穩(wěn)定性是必不可少的，但是不存在于高等真核生物中，由此構(gòu)成“唯一致命的弱點(diǎn)”，可用于控制致病酵母(Roemer等人，1994)。即使由此對(duì)選擇性參與酵母和真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的物質(zhì)非常感興趣，仍沒(méi)有抗生素樣抑制劑用于控制真菌病。早在本世紀(jì)初就發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌抗生素生產(chǎn)者，而直到60年代初才通過(guò)鑒定所謂的放毒者酵母觀察到酵母中的相似效果(Bevan和Makower，1963)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的毒素生成放毒者菌株生成并分泌稱為“放毒者毒素”的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)以受體依賴過(guò)程破壞敏感酵母(Bussey，1991；Tipper和Schmitt，1991)。在釀酒酵母中，生成毒素的能力基于呼腸孤病毒樣雙鏈RNA病毒的感染，這種病毒以高拷貝數(shù)穩(wěn)定存在于酵母細(xì)胞質(zhì)中，而不顯著損害真核宿主細(xì)胞(Tipper和Schmitt，1991)。至今為止已知的釀酒酵母的三類放毒者毒素(K1、K2、K28)是非糖基化的α/β異二聚體，由被感染細(xì)胞翻譯成高分子前毒素原(preprotoxin)，并在胞內(nèi)分泌途徑中通過(guò)復(fù)雜修飾加工成有生物活性的放毒者蛋白質(zhì)(Hanes等人，1986；Dignard等人，1991；Schmitt和Tipper，1995)。釀酒酵母毒素的毒性作用基于破壞膜完整性(毒素K1、K2)或通過(guò)直接抑制DNA合成而阻滯細(xì)胞循環(huán)(毒素K28)(Bussey，1991；Schmitt和Compain，1995；Schmitt等人，1996)。即使K1、K2、和K28類的放毒者毒素在作用模式和物理化學(xué)特性方面彼此顯著不同，它們?nèi)匀痪哂泄餐卣髯饔米V窄，主要破壞密切相關(guān)物種的敏感酵母。這種有限的作用譜依據(jù)的是迄今為止已表征的啤酒酵母放毒者毒素必須與酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜水平上不同受體群相互作用從而得以破壞敏感靶細(xì)胞這一事實(shí)。酵母細(xì)胞壁的主要毒素受體是高度分支的β-1，6-D-葡聚糖或細(xì)胞壁甘露糖蛋白質(zhì)的外層甘露三糖側(cè)鏈(Bussey，1991；Schmitt和Radler，1987，1988)。
除了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄酒有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)、和玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的病毒蛋白質(zhì)毒素，在德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)、和擬威爾酵母屬(Williopsis)中也有放毒者菌株的描述(McCracken等人，1994；Park等人，1996；Schmitt和Neuhausen，1994；Walker等人，1995)。但是，在這些酵母中，放毒者現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)不是病毒基因組，而是線性dsDNA質(zhì)粒或染色體酵母基因(Schründer等人，1994)。
關(guān)于多種生成毒素的“放毒者酵母”的分子生物學(xué)的深入研究顯示，毒性蛋白質(zhì)(“放毒者毒素”)的分泌在酵母中是普遍的，并構(gòu)成不可低估的選擇性抗真菌劑開(kāi)發(fā)潛力(Walker等人，1995；Hodgson等人，1995；Polonelli等人，1986；Schmitt和Neuhausen，1994；Neuhausen和Schmitt，1996；Schmitt等人，1997)，但是至今還不可能提供這種蛋白質(zhì)毒素。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供適用于控制對(duì)人和植物致病性的酵母和/或真菌的抗真菌或殺真菌蛋白質(zhì)毒素。
令人驚訝的是，來(lái)自野生型加州擬威爾酵母(Williopsiscalifornica)3/57菌株(DSM 12865)、以高效方式生成并分泌的放毒者毒素WICALTIN(也是蛋白質(zhì)毒素)和來(lái)自拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)(DSM 12864)、由病毒編碼的ZYGOCIN(也是蛋白質(zhì)毒素)，這兩種毒素證明特別適用于控制對(duì)人和植物致病性的酵母和/或真菌。此外，還可破壞食品和動(dòng)物飼料中危險(xiǎn)的真菌和有害酵母。因此，這兩種蛋白質(zhì)毒素都具有作為抗真菌劑和/或殺真菌劑用于控制酵母和/或真菌感染(特別是真菌病)的潛力。本發(fā)明通過(guò)對(duì)作用模式的研究證實(shí)了這些跡象。為了本發(fā)明的目的，以適當(dāng)方式克隆了毒素基因并測(cè)序，由此建立了用于在培養(yǎng)物中重組生產(chǎn)并過(guò)度表達(dá)WICALTIN和ZYGOCIN的方法。
因此，本發(fā)明的主題涉及可由加州擬威爾酵母(尤其優(yōu)選DSM12865菌株)和拜列氏接合糖酵母(尤其優(yōu)選DSM 12864菌株)獲得的蛋白質(zhì)毒素。依照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于1999年6月9日將這兩種菌株保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，38124 Braunschweig，Mascheroder Weg 1b(www.dsmz.de)。
為了本發(fā)明的目的，特別是DSM 12864和DSM 12865分泌生物學(xué)有效的蛋白質(zhì)毒素，由于其廣譜作用(見(jiàn)實(shí)施例4和7)，能破壞大量對(duì)人和植物致病性的酵母和真菌。本發(fā)明由此還涉及在蛋白質(zhì)毒素意義上潛在生物藥物的選擇性抗真菌劑或殺真菌劑(以及下文的本發(fā)明多肽和本發(fā)明編碼核酸，特別是毒素基因的功能單位)，由于其特異的受體-介質(zhì)生成因而專一破壞真菌和/或真菌，由此對(duì)高等真核生物(對(duì)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞也是如此)和對(duì)植物(優(yōu)選農(nóng)作物)完全無(wú)害(參見(jiàn)Pfeiffer等人，1988)。
可選擇性破壞下列對(duì)人和植物而言不致病的或致病的酵母和/或真菌對(duì)ZYGOCIN敏感的酵母物種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色假絲酵母(Candida albicans)、克魯斯氏假絲酵母(Candida krusei)、光滑球假絲酵母(Candida glabrata)、酸酒假絲酵母(Candida vinii)、葡萄酒有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromyces marxianus)、美極梅奇酵母(Methschnikowia pulcherrima)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagemaydis)、漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)、Pichiaanomala、Pichia jadinii、膜醭畢赤酵母(Pichia membranefaciens)、Yarrowia lipolytica、和魯氏接合糖酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。
對(duì)WICALTIN敏感的酵母物種白色假絲酵母(Candida albicans)、光滑球假絲酵母(Candida glabrata)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)、乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、Pichia anomala、Pichia jadinii、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、側(cè)孢屬之種(Sporthrixsp.)、戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、Torulasporapretoriensis、Yarrowia lipolytica、和拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
生成WICALTIN的酵母菌株DSM 12865的特高活性大概基于其顯著的分泌效率，與相同酵母物種的其它菌株相比明顯更顯著。生成ZYGOCIN的酵母菌株DSM 12864的“放毒者”特性基于編碼毒素的雙鏈RNA病毒(MZb-dsRNA)的感染，這種病毒以高拷貝數(shù)穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中并使所述酵母(菌株DSM 12864)生成并分泌ZYGOCIN(參見(jiàn)Schmitt和Neuhausen，1994)。既然相同物種的其它菌株的細(xì)胞質(zhì)中不容納編碼毒素的dsRNA病毒，那么它們也不顯示毒性生成，因而在表型上歸為“非放毒者”。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題是編碼蛋白質(zhì)毒素(所述蛋白質(zhì)毒素具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列，并具有葡聚糖酶活性)的核酸及其功能變體，以及具有至少8個(gè)核苷酸的片段，優(yōu)選至少15-20個(gè)核苷酸，特別是至少100個(gè)核苷酸，尤其是至少300個(gè)核苷酸的片段(下文稱為“本發(fā)明核酸”)。
完整核酸編碼的蛋白質(zhì)毒素在胞內(nèi)加工并分泌后具有309個(gè)氨基酸的大小和34kDa的分子量(SEQ ID NO1)或具有99個(gè)氨基酸的大小和10kDa的分子量(SEQ ID NO2)。核酸SEQ ID NO1在釀酒酵母中的表達(dá)產(chǎn)生重組WICALTIN，其被分泌進(jìn)入酵母培養(yǎng)物上清液，成為具有顯著β-1，3-D-葡聚糖酶活性的糖基化蛋白質(zhì)(參見(jiàn)實(shí)施例10)。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了本發(fā)明核酸編碼具有葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)毒素(在SEQ ID NO1的情況中)，或大概在體內(nèi)O-糖基化并被稱為ZYGOCIN的蛋白質(zhì)毒素(在SEQ ID NO2的情況中)?？捎蒁SM 12865(SEQ ID NO1)和DSM 12864(SEQ ID NO2)獲得本發(fā)明核酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸是DNA或RNA，優(yōu)選雙鏈DNA，特別是具有SEQ ID NO1第1-947位和SEQ ID NO2第1-713位核酸序列的DNA。根據(jù)本發(fā)明，這兩個(gè)位置決定了編碼區(qū)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，即在這兩種情況中討論的讀碼框的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“功能變體”，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)理解為指功能上與本發(fā)明核酸相關(guān)的核酸。相關(guān)核酸的范例是來(lái)自不同酵母細(xì)胞或菌株的核酸和培養(yǎng)物或等位基因變體。本發(fā)明還涵蓋可衍生自多種酵母/酵母菌株或其它病原體(諸如皮膚真菌和霉菌)的核酸變體(根據(jù)DHS系統(tǒng))。
術(shù)語(yǔ)“變體”，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)理解為指展示大約60％，優(yōu)選大約75％，特別是大約90％，尤其是大約95％的同源性(特別是序列同一性)的核酸。
可使用本發(fā)明核酸的片段，例如，用于產(chǎn)生各種表位，作為鑒定其它功能變體的探針，或作為反義核酸。例如，至少大約8個(gè)核苷酸的核酸作為反義核酸是合適的，至少大約15個(gè)核苷酸的核酸可作為PCR引物，至少大約20個(gè)核苷酸的核酸可用于鑒定其它變體，而至少大約100個(gè)核苷酸的核酸可作為探針。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸包含一種或多種非編碼序列和/或poly(A)序列、一種或多種Kex2p內(nèi)肽酶識(shí)別序列(胞內(nèi)蛋白原加工要求的)、和一個(gè)或多個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)。非編碼序列是調(diào)控序列，諸如用于含本發(fā)明核酸的毒素編碼基因的受控表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸包含于載體中，優(yōu)選表達(dá)載體或基因療法的有效載體。
在本發(fā)明核酸SEQ ID NO2的情況中，表達(dá)載體的范例可以是原核和/或真核表達(dá)載體；而在本發(fā)明核酸SEQ ID NO1的情況中，表達(dá)載體的范例可以是專門(mén)的真核表達(dá)載體。既然異源表達(dá)的蛋白質(zhì)毒素對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有毒，那么毒素編碼核酸SEQ ID NO1不可能在大腸桿菌中表達(dá)。WICALTIN編碼核酸SEQ ID NO1在大腸桿菌中的克隆只有在使用不攜帶啟動(dòng)子的質(zhì)粒時(shí)才有可能，例如可借助質(zhì)粒pBR322的衍生物。能夠異源表達(dá)ZYGOCIN編碼核酸SEQ ID NO2的原核載體的范例是商品化載體pGEX-4T-1，它能夠在大腸桿菌中表達(dá)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶/ZYGOCIN融合蛋白質(zhì)。用于在大腸桿菌中表達(dá)ZYGOCIN的另一種載體是例如T7表達(dá)載體pGM10(Martin，1996)，它編碼N端Met-Ala-His6標(biāo)簽，便于經(jīng)Ni2+-NTA柱純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。適用于在釀酒酵母中表達(dá)的真核表達(dá)載體的范例是載體p426Met25或p426GAL1(Mumberg等人，1994，核酸研究(Nucl.Acids Res.)225767)；適用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的是桿狀病毒載體，諸如EP-B1-0127839或EP-B1-0549721中公開(kāi)的；而適用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的是SV40載體，可自由獲取。
一般而言，表達(dá)載體還包含適合于宿主細(xì)胞的調(diào)控序列，諸如用于在大腸桿菌中表達(dá)的trp啟動(dòng)子(參閱例如EP-B1-0154133)、用于在酵母中表達(dá)的ADH-2啟動(dòng)子(Russel等人，1983，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2582674)、用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子(參閱例如EP-B1-0127839)、或早期SV40啟動(dòng)子、或LTR啟動(dòng)子，例如MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)的啟動(dòng)子(Lee等人，1981，自然(Nature)214228)。
基因療法的有效載體的范例是病毒載體，優(yōu)選腺病毒載體，特別是復(fù)制缺陷型腺病毒載體，或者腺伴隨病毒載體，例如由兩個(gè)插入的末端重復(fù)序列(ITR)轉(zhuǎn)移構(gòu)成的腺伴隨病毒載體。
例如W.J.McGrory等人，1988，病毒學(xué)(Virol.)163614；Y.Gluzman等人，1982，在《真核病毒載體》中，Y.Gluzman編，第187頁(yè)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約；J.Chroboczek等人，1992，病毒學(xué)(Virol.)186280；S.Karlsson等人，1986，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J)52377；或WO95/00655描述了合適的腺病毒載體。
N.Muzyczka，1992，微生物學(xué)和免疫學(xué)現(xiàn)行主題(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)15897；WO95/23867；R.J.Samulski，1989，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)633822；WO95/23867；J.A.Chiorini等人，1995，人類基因療法(Human Gene Therapy)61531；或R.M.Kotin，1994，人類基因療法(Human Gene Therapy)5793描述了合適的腺伴隨病毒載體的范例。
還可以通過(guò)將本發(fā)明核酸與脂質(zhì)體復(fù)合來(lái)獲得基因療法的有效載體。P.L.Felgner等人，1987，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)847413；J.P.Behr等人，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)866982；J.H.Felgner等人，1994，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2692550；或X.Gao和L.Huang，1991，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochim.Biophys.Acta)1189195描述了用于該目的的合適脂質(zhì)混和物。在生成脂質(zhì)體時(shí)，通過(guò)離子作用以保持凈余正電荷并使DNA完全與脂質(zhì)體復(fù)合的比例使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體表面。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸包含于載體中，優(yōu)選用于生成轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)載體。既然上述放毒者毒素WICALTIN和ZYGOCIN具有廣譜作用而且還破壞致植物病性酵母和真菌，那么有可能提供例如針對(duì)致玉米病的病原體玉蜀黍黑粉菌感染具有抗性行為方式的轉(zhuǎn)基因植物。在煙草植株上早就進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)，由于玉蜀黍黑粉菌放毒者毒素KP4(由病毒天然編碼)的外源表達(dá)，煙草植株能夠分泌討論中的蛋白質(zhì)毒素，由此建立了針對(duì)某些致植物病性玉蜀黍黑粉菌菌株的特異防護(hù)(Park等人，1996；Kinal等人，1995；Bevan，1984)。由基于天然根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti質(zhì)粒經(jīng)修飾衍生物的商品化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)開(kāi)始，可將本發(fā)明核酸(也可以毒素基因WCT和ZBT表示)克隆到所謂的雙向pBI載體(CLONTECH)中，并用于生成轉(zhuǎn)基因植株。為此目的，分別將毒素基因WCT和ZBT置于花椰菜花葉病毒強(qiáng)啟動(dòng)子(CaMV-P)的轉(zhuǎn)錄控制之下。實(shí)施例9示意性顯示了待構(gòu)建載體更詳細(xì)的構(gòu)建過(guò)程。
例如，可遵循磷酸三酯法，參照SEQ ID NO1和SEQ ID NO2公開(kāi)的核酸序列，或參照SEQ ID NO1和SEQ ID NO2公開(kāi)的肽序列同時(shí)考慮到遺傳密碼，化學(xué)合成本發(fā)明核酸(參閱例如E.Uhlman和A.Peyman，1990，化學(xué)評(píng)論(Chemical Reviews)90543，No.4)。獲得本發(fā)明核酸的另一種可能性是借助合適探針?lè)蛛x合適基因文庫(kù)(參閱例如J.Sambrook等人，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版，冷泉港，紐約)。合適探針是例如序列可由核酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO3推斷出且長(zhǎng)度為大約100-1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選大約200-500個(gè)核苷酸，特別是大約300-400個(gè)核苷酸的雙鏈DNA片段。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是具有氨基酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的多肽或其功能變體，以及具有至少6個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少12個(gè)氨基酸，特別是至少65個(gè)氨基酸，尤其是309個(gè)氨基酸(SEQ ID NO1)和99個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)的片段(下文稱為體發(fā)明多肽”)。例如，長(zhǎng)度為大約6-12個(gè)(優(yōu)選大約8個(gè))氨基酸的多肽可包含表位，當(dāng)將其偶聯(lián)至支持物后可用于生成特異性多克隆或單克隆抗體(參閱例如US 5,656,435)。長(zhǎng)度為至少大約65個(gè)氨基酸的多肽也可直接(無(wú)需支持物)用于制備多克隆或單克隆抗體。
術(shù)語(yǔ)“功能變體”，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)理解為指功能上與本發(fā)明肽相關(guān)的多肽，即展示葡聚糖酶活性的多肽。變體還可理解為指可衍生自多種酵母/酵母菌株或其它感染因子(諸如皮膚真菌和霉菌)的等位基因變體或多肽(根據(jù)DHS系統(tǒng))。
在廣義上，它們還可理解為指與圖2所示氨基酸序列具有大約70％，優(yōu)選大約80％，特別是大約90％，尤其是大約95％的序列同源性(特別是序列同一性)的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括多肽中大約1-60個(gè)氨基酸，優(yōu)選大約1-30個(gè)氨基酸，特別是大約1-15個(gè)氨基酸，尤其是大約1-5個(gè)氨基酸區(qū)域的刪除。例如，第一個(gè)氨基酸甲硫氨酸可不存在，而不顯著改變多肽的功能。另外，該術(shù)語(yǔ)還包括包含上述本發(fā)明多肽的融合蛋白質(zhì)，融合蛋白質(zhì)自身可能具有葡聚糖酶功能，或者只在切掉融合部分后具有特異功能。具體的說(shuō)，這些包括包含大約1-200個(gè)，優(yōu)選大約1-150個(gè)，特別是大約1-100個(gè)，尤其是大約1-50個(gè)氨基酸的非人序列的融合蛋白質(zhì)。非人肽序列的范例是原核肽序列，例如來(lái)自大腸桿菌半乳糖苷酶或所謂的組氨酸標(biāo)簽(例如Met-Ala-His6標(biāo)簽)。包含所謂組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)特別適用于經(jīng)含金屬離子的柱純化表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如經(jīng)Ni2+-NTA柱?！癗TA”指螯合劑次氮基三乙酸(Qiagen GmbH，Hilden)。在這方面，本發(fā)明還涵蓋在蛋白原的意義上或在更廣意義上(如藥物前體)掩蔽的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽片段，例如是可由抗體特異性識(shí)別的表位。
可通過(guò)熟練技術(shù)人員通常知道的方法制備本發(fā)明多肽，例如通過(guò)在諸如上文所述的合適表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明核酸。適用于制備正確加工因而具有生物活性的蛋白質(zhì)毒素的宿主細(xì)胞專門(mén)是真核生物體，優(yōu)選芽殖酵母—釀酒酵母和裂殖酵母—粟酒裂殖糖酵母。
特別的，還可借助傳統(tǒng)肽合成法(Merrifield技術(shù))合成上述多肽片段。它們特別適用于獲得抗血清，借助它，可篩選合適的基因表達(dá)文庫(kù)從而獲得本發(fā)明多肽的進(jìn)一步功能變體。
本發(fā)明的另一個(gè)主題涉及用于制備本發(fā)明多肽的方法，其中在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明核酸，并根據(jù)需要進(jìn)行分離。
非常優(yōu)選的是裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母，因?yàn)檫@種酵母天生具有WICALTIN和ZYGOCIN抗性，而且早已多次成功用于異源表達(dá)外源蛋白質(zhì)(Giga-Hama和Kumagai，1997，在《裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母中的外源基因表達(dá)》中，Springer Verlag)。正如實(shí)施例11所例示的，可將毒素編碼核酸SEQ ID NO1和SEQ ID NO2克隆到例如粟酒裂殖糖酵母載體pREP1中(Maundrell，1990，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26510857-10864)，并置于裂殖酵母的硫胺調(diào)控nmtl啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下(nmt即無(wú)硫胺信息)。用這種載體轉(zhuǎn)化的酵母，其作為酵母培養(yǎng)基中相應(yīng)硫胺濃度的函數(shù)，表達(dá)討論中的外源基因。如果需要，這能夠在時(shí)間上將酵母生長(zhǎng)期與外源蛋白質(zhì)生成期分開(kāi)，從而在原理上有可能表達(dá)對(duì)酵母有毒的蛋白質(zhì)。為了同時(shí)分泌并由此顯著便于純化在粟酒裂殖糖酵母中異源表達(dá)的毒素WICALTIN和ZYGOCIN，我們?cè)缇蜆?gòu)建了包含病毒K28前毒素原基因(Schmitt和Tipper，1995)的分泌和加工信號(hào)、由此能夠有效分泌以相同讀碼框置于下游的相應(yīng)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)/分泌載體(載體pTZα/γ；見(jiàn)實(shí)施例11)。
本發(fā)明的另一個(gè)主題涉及與本發(fā)明多肽特異反應(yīng)的抗體，上述多肽片段有可能自身具有免疫原性或使之具有免疫原性，或者通過(guò)偶聯(lián)合適載體(諸如牛血清清蛋白)改進(jìn)其免疫原性。
抗體或是多克隆的或是單克隆的?？贵w的制備也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)主題，例如可通過(guò)通常慣用的方法，用本發(fā)明多肽或上述多肽片段，根據(jù)需要在存在例如弗氏佐劑和/或氫氧化鋁凝膠時(shí)，免疫哺乳動(dòng)物，例如兔子，由此而進(jìn)行(參閱例如B.A.Diamond等人，1981，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New England Journal of Medicine)1344)。隨后可容易的通過(guò)通常慣用的方法由血液分離由于免疫學(xué)反應(yīng)而在動(dòng)物體內(nèi)形成的多克隆抗體，并通過(guò)例如柱層析純化。優(yōu)選將抗體進(jìn)行親和純化，例如將討論中的抗原(ZYGOCIN或WICALTIN)共價(jià)偶聯(lián)可自由獲取的CnBr激活Sepharose基質(zhì)，并用于純化在每種情況中都是毒素特異的抗體。
可通過(guò)已知的Winter和Milstein法(G.Winter和C.Milstein，1991，自然(Nature)349293)制備單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是包含本發(fā)明核酸或本發(fā)明多肽(個(gè)別的或聯(lián)合的)以及(根據(jù)需要)合適的添加劑或佐劑的藥物產(chǎn)品，和制備用于治療真菌病(諸如淺表、皮膚、和皮下皮膚真菌病、粘膜真菌病、和全身性真菌病，尤其優(yōu)選假絲酵母真菌病)的藥物產(chǎn)品的方法，其中將本發(fā)明核酸或本發(fā)明多肽與制藥學(xué)可接受的添加劑和/或佐劑配制在一起。
實(shí)施例12例示了，由菌株DSM 12865生產(chǎn)并純化的毒素WICALTIN，其對(duì)酵母的毒性甚至比為了比較而測(cè)試并常常用于治療真菌病的局部抗真菌劑克霉唑和霉抗唑顯著更強(qiáng)。
本發(fā)明由此還涉及在上述意義上的藥物產(chǎn)品，其包含可得自菌株DSM 12864和/或DSM 12865的抗真菌劑或蛋白質(zhì)毒素和/或本發(fā)明有抗真菌活性的多肽。
包含裸露形式、上述基因療法有效載體形式之一、或脂質(zhì)體復(fù)合物形式的本發(fā)明核酸的藥物產(chǎn)品尤其適用于人類基因療法。
合適添加劑和/或佐劑的范例是生理鹽水、穩(wěn)定劑、蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、等等。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是包含本發(fā)明核酸、本發(fā)明多肽、或本發(fā)明抗體以及(根據(jù)需要)合適添加劑和/或佐劑的診斷劑，和制備用于診斷真菌病(諸如淺表、皮膚、和皮下皮膚真菌病、粘膜真菌病、和全身性真菌病，尤其優(yōu)選假絲酵母真菌病)的診斷劑的方法，其中本發(fā)明核酸、本發(fā)明多肽、或本發(fā)明抗體與合適的添加劑和/或佐劑聯(lián)合使用。
例如，可參照本發(fā)明并借助本發(fā)明核酸制備基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR診斷劑，例如EP-0200362)或Northern和/或Southern印漬的診斷劑，實(shí)施例13將更為詳細(xì)的描述。這些測(cè)試基于本發(fā)明核酸與互補(bǔ)鏈(通常是對(duì)應(yīng)的mRNA)的特異性雜交。如EP-0063879所述，還可修飾本發(fā)明核酸。優(yōu)選通過(guò)通常知道的方法用合適的試劑標(biāo)記本發(fā)明DNA片段，例如用α-32P-dATP進(jìn)行放射性標(biāo)記或提供非放射性的生物素標(biāo)記物，并與優(yōu)選結(jié)合于合適膜(例如硝酸纖維素或尼龍)上的分離RNA一起溫育。另外，在雜交和結(jié)合膜之前根據(jù)大小將分離RNA分開(kāi)是有利的，例如通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳。若來(lái)自各個(gè)組織樣品的待測(cè)RNA的量是相同的，則由此可測(cè)定通過(guò)探針特異性標(biāo)記的mRNA的量。
另一種診斷劑包含本發(fā)明多肽或其免疫原性部分，上文已更為詳細(xì)的描述。優(yōu)選將多肽或其部分結(jié)合于固相例如硝酸纖維素或尼龍上，并在體外接觸例如待測(cè)體液，諸如血液，從而與例如抗體發(fā)生反應(yīng)。隨后可檢測(cè)抗體/肽復(fù)合物，例如借助經(jīng)標(biāo)記的抗人IgG或抗人IgM抗體。標(biāo)記物是例如酶，諸如催化顯色反應(yīng)的過(guò)氧化物酶。由此經(jīng)顯色反應(yīng)可容易且快速的檢測(cè)自身免疫抗體的存在與量。
另一種診斷劑包含本發(fā)明抗體自身。這些抗體可例如容易且快速檢驗(yàn)人組織樣品中是否存在討論中的多肽。在這種情況中，本發(fā)明抗體是經(jīng)標(biāo)記的，例如標(biāo)記了上文所述的酶。由此經(jīng)酶促顯色反應(yīng)可容易且快速的檢測(cè)特異抗體/肽復(fù)合物。
本發(fā)明的另一個(gè)主題涉及包含本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明多肽(個(gè)別的或聯(lián)合的)以及(根據(jù)需要)合適的添加劑和/或佐劑的殺真菌劑，和制備用于控制有害酵母和有害真菌的殺真菌劑的方法，其中本發(fā)明核酸或本發(fā)明多肽與農(nóng)業(yè)可接受的添加劑和/或佐劑配制在一起。
如上所述，在優(yōu)選實(shí)施方案中生成表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)毒素的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明由此還涉及包含本發(fā)明多肽和/或蛋白質(zhì)毒素的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的另一個(gè)主題還涉及用于鑒定功能相互作用物的測(cè)定法，諸如包含本發(fā)明核酸、本發(fā)明多肽、或本發(fā)明抗體以及(根據(jù)需要)合適的添加劑和/或佐劑的抑制劑或刺激劑。
用于鑒定功能相互作用物(特別是在敏感酵母細(xì)胞中與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)毒素ZYGOCIN相互作用的功能相互作用物)的合適測(cè)定法，是例如雙雜交系統(tǒng)(S.Field和R.Sternglanz，1994，遺傳學(xué)趨勢(shì)(Trends in Genetics)10286)。在這種測(cè)定法中，用一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞)，所述表達(dá)載體表達(dá)包含本發(fā)明多肽和已知蛋白質(zhì)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如來(lái)自大腸桿菌的Gal4或LexA)的融合蛋白質(zhì)，和/或表達(dá)包含未知多肽和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(例如Gal4、皰疹病毒VP16、或B42來(lái)源的)的融合蛋白質(zhì)。另外，細(xì)胞包含報(bào)道基因，例如大腸桿菌LacZ基因、綠色熒光蛋白、或酵母氨基酸生物合成基因His3或Leu2，這些報(bào)道基因受調(diào)控序列，諸如LexA啟動(dòng)子/操作子或酵母上游激活序列(UAS)的控制。未知多肽由例如起源于基因文庫(kù)，例如人基因文庫(kù)的DNA片段編碼。通常，首先在酵母中借助上述表達(dá)載體生成cDNA基因文庫(kù)，從而能夠立即進(jìn)行這種測(cè)定法。
例如，在一種酵母表達(dá)系統(tǒng)中，將本發(fā)明核酸克隆到編碼LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸功能單位中，從而在轉(zhuǎn)化酵母中表達(dá)本發(fā)明多肽與LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)。在另一種酵母表達(dá)載體中，將cDNA基因文庫(kù)的cDNA片段克隆到編碼Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的核酸功能單位上，從而在轉(zhuǎn)化酵母中表達(dá)未知多肽與Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)。用兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如Leu2-)另外包含編碼Leu2且受LexA啟動(dòng)子/操作子控制的核酸。在本發(fā)明多肽與未知多肽之間的功能相互作用事件中，Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域經(jīng)LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合LexA啟動(dòng)子/操作子，由此激活LexA啟動(dòng)子/操作子并表達(dá)Leu2基因。結(jié)果，Leu2-酵母能夠在不含亮氨酸的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
當(dāng)使用LacZ或綠色熒光蛋白報(bào)道基因而非氨基酸生物合成基因時(shí)，可通過(guò)發(fā)藍(lán)色或綠色熒光的菌落的形成來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄激活。然而，還可在分光光度計(jì)中容易的對(duì)藍(lán)色或綠色熒光染色定量，例如在藍(lán)色染色的情況下在585nm下測(cè)定。
在這種方式中，可容易且快速對(duì)表達(dá)基因文庫(kù)篩選與本發(fā)明多肽相互作用的多肽。隨后可分離并表征發(fā)現(xiàn)的新多肽。
雙雜交系統(tǒng)的另一種可能應(yīng)用在于通過(guò)其它物質(zhì)(諸如化學(xué)藥品)影響本發(fā)明多肽與已知或未知多肽之間的相互作用。這也能夠發(fā)現(xiàn)可化學(xué)合成并作為治療劑的新的有價(jià)值的活性成分。本發(fā)明由此不僅意欲包含用于尋找多肽樣相互作用物的方法，還延伸包含用于尋找能夠與上述蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用的物質(zhì)的方法。根據(jù)本發(fā)明，這種肽樣和化學(xué)相互作用物由此稱為功能性相互作用物，它們可具有抑制性或刺激性作用。
本發(fā)明的另一個(gè)主題涉及用于通過(guò)培養(yǎng)并將蛋白質(zhì)毒素分泌到培養(yǎng)基中來(lái)制備蛋白質(zhì)毒素的方法，培養(yǎng)基包括合成培養(yǎng)基(BAVC培養(yǎng)基)，這相當(dāng)便于層析純化分泌的毒素，例如通過(guò)超濾和陽(yáng)離子交換層析和/或在昆布多糖-Sepharose和/或甘露糖蛋白質(zhì)-Sepharose上進(jìn)行的親和層析(參見(jiàn)實(shí)施例1和實(shí)施例附錄)。在由菌株DSM 12865生成并分泌的WICALTIN的情況中，可通過(guò)在培養(yǎng)基中添加額外的由植物衍生(且易于獲取)的β-1，3-D-葡聚糖昆布多糖至終濃度1％，由此進(jìn)一步增加毒素產(chǎn)量。正如實(shí)施例14所例示的，在培養(yǎng)基中添加昆布多糖能夠誘導(dǎo)WICALTIN生成，經(jīng)Northern分析發(fā)現(xiàn)這是由于轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)所致。
合成B培養(yǎng)基可用于生產(chǎn)毒素ZYGOCIN，它是DSM12864所分泌的[參見(jiàn)Radler等人，1993]。
實(shí)施例下列實(shí)施例意欲例示本發(fā)明，而非將本發(fā)明限制于這些實(shí)施例。實(shí)施例1由放毒者酵母加州擬威爾酵母3/57菌株(DSM 12865)的培養(yǎng)物上清液分離、濃縮、和純化抗假絲酵母毒素WICALTIN在亞甲基藍(lán)瓊脂上針對(duì)敏感酵母的瓊脂擴(kuò)散測(cè)試中，由放毒者酵母加州擬威爾酵母3/57菌株分泌的放毒者毒素WICALTIN在pH4.7和20℃顯示最佳抑制作用。在合成液體培養(yǎng)基中，當(dāng)在BAVC培養(yǎng)基(pH4.7)中培養(yǎng)時(shí)，放毒者酵母加州擬威爾酵母3/57菌株顯示最大毒素產(chǎn)量。為進(jìn)行毒素濃縮，首先將放毒者酵母在5ml YEPD培養(yǎng)基中于30℃振搖溫育24小時(shí)，然后全都轉(zhuǎn)移到200ml BAVC培養(yǎng)基中，并于20℃在搖床(140rpm)上再次培養(yǎng)48小時(shí)。用次級(jí)預(yù)培養(yǎng)物(1％接種物)接種4份主要培養(yǎng)物(每一份在5L錐形瓶中裝有2.5L BAVC培養(yǎng)基，pH4.7)，并于20℃輕輕振搖(60rpm)溫育5天。為了濃縮分泌的放毒者毒素，用排阻極限10kDa的聚磺酸膜(“EasyFlow”，F(xiàn)a.Sartorius)于4℃和壓力1巴超濾，將無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液濃縮200倍至50ml。為了除去低分子量的化合物并使由此獲得的濃縮液脫鹽，將毒素在排阻極限10-20kDa的透析管中對(duì)5mM檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH4.7)透析。為了保存毒素濃縮液，將透析產(chǎn)物用0.2μm濾膜過(guò)濾除菌，并以1ml分裝凍存于-20℃。
在亞甲基藍(lán)瓊脂(MBA；pH4.7)上針對(duì)敏感指示酵母釀酒酵母192.2d的瓊脂擴(kuò)散測(cè)試中檢測(cè)毒素活性并將其標(biāo)準(zhǔn)化。為此目的，在0.1M檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH4.7)中進(jìn)行毒素濃縮液的對(duì)數(shù)稀釋，并將100μl稀釋液轉(zhuǎn)移至接種了敏感指示酵母(2×105細(xì)胞/ml)的MBA板上的孔(孔徑9mm)中。將平板于20℃保溫3天后，測(cè)量清晰可見(jiàn)的抑制圈。發(fā)現(xiàn)抑制圈的直徑與毒素濃度的對(duì)數(shù)之間存在線性關(guān)系。將20mm(已做孔徑校正)的抑制圈直徑人為指定為1×104U/ml的毒素活性。
通過(guò)在Bioscale-S(FPLC)上進(jìn)行的陽(yáng)離子交換層析，或在事先偶聯(lián)了由植物衍生的β-1，6-D-葡聚糖石耳素的環(huán)氧激活的Sepharose-B基質(zhì)(Pharmacia)上進(jìn)行的親和層析，純化濃縮的WICALTIN。由此比活富集了625倍的毒素制劑(表1)在凝膠電泳上顯示是純的，SDS-PAGE(10-22％梯度凝膠)后只顯示考馬斯藍(lán)(蛋白質(zhì)染色)和高碘酸Schiff染色(PAS；碳水化合物染色)都可檢測(cè)到的大約37kDa的單一條帶。陽(yáng)性PAS染色說(shuō)明抗假絲酵母毒素WICALTIN具有潛在N-糖基化。用內(nèi)切糖苷酶H處理純化毒素確認(rèn)了WICALTIN具有N-糖基化連接的大約3kDa碳水化合物部分，在酵母中的大小說(shuō)明蛋白質(zhì)毒素中存在單一N-糖基化位點(diǎn)。既然脫糖基化WICALTIN顯示顯著受限的毒性，那么可以推論WICALTIN的碳水化合物部分大概是結(jié)合敏感靶細(xì)胞所需要的，由此間接影響毒素的生物活性。
表1由放毒者酵母加州擬威爾酵母培養(yǎng)物上清液濃縮WICALTIN[UF，超濾]制劑體積 總蛋 總毒素 毒素 活性純化因(ml) 白質(zhì) 活性比活 產(chǎn)率 子(mg) (E) (E/mg) ％培養(yǎng)物上清液10,000 24,6007.9×1053.2×101100 1超濾滯留物50 162 6.3×1053.9×10380 122凍干透析液25 45.8 3.1×1056.8×10339 213Bioscale-S64 1.28 2.5×1042.0×1043.2 625(陽(yáng)離子交換)實(shí)施例2測(cè)定WICALTIN的氨基末端氨基酸序列并檢測(cè)β-1，3-葡聚糖酶活性通過(guò)經(jīng)純化的放毒者毒素的N端氨基酸測(cè)序，測(cè)定了最初10個(gè)氨基酸。如

圖1所示，WICALTIN的N端顯示與由釀酒酵母BGL2基因編碼的β-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的氨基末端有顯著同源性。
既然確定了WICALTIN與Bgl2的同源性，那么調(diào)查在未純化毒素濃縮液中和在已純化毒素制劑中檢測(cè)到葡聚糖酶活性的可能性。在WICALTIN制劑中，在以β-1，3-D-葡聚糖昆布多糖作為底物的酶測(cè)定法中和在以4-甲基-傘形基-β-D-葡糖苷(4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucoside，MUC)作為底物的熒光測(cè)定法中都檢測(cè)到顯著的β-1，3-D-葡聚糖酶活性；還測(cè)試了β-1，6-D-葡聚糖石耳素，它不被WICALTIN水解。實(shí)施例3在存在或不存在細(xì)胞壁葡聚糖時(shí)WICALTIN處理的酵母細(xì)胞的存活率競(jìng)爭(zhēng)分析在YEPD液體培養(yǎng)基(pH4.7)中于20℃在存在1×105U/ml純化WICALTIN時(shí)培養(yǎng)釀酒酵母192.2d菌株的敏感酵母細(xì)胞，圖2顯示了殺傷動(dòng)力學(xué)。加入由植物衍生的β-1，6-D-葡聚糖石耳素能夠顯著增加毒素處理的酵母細(xì)胞的存活率，且在濃度達(dá)到10mg/ml時(shí)完全逆轉(zhuǎn)WICALTIN毒性。與石耳素相反，β-1，3-D-葡聚糖昆布多糖不能增加毒素所處理酵母的存活率(圖2)。
由所示發(fā)現(xiàn)能夠推斷，WICALTIN的作用需要結(jié)合作為酵母細(xì)胞壁的主要?？课稽c(diǎn)(毒素受體)的β-1，6-葡聚糖。與此發(fā)現(xiàn)一致的是，染色體KRE1基因座中具有刪除的酵母顯示毒素抗性，但是當(dāng)用攜帶KRE1的附加型載體重新轉(zhuǎn)化后恢復(fù)毒素敏感性(圖3)。kre1突變體的毒素抗性基于的是顯著降低了β-1，6-D-葡聚糖含量，由此降低毒素與酵母細(xì)胞表面的結(jié)合，而這恰是致死作用所要求的。實(shí)施例4WICALTIN的作用譜和殺傷譜在瓊脂擴(kuò)散測(cè)試中，純化加州擬威爾酵母毒素WICALTIN展示針對(duì)表2所示酵母有顯著毒性。除了克魯斯氏假絲酵母的3種菌株之外，WICALTIN以高效方式破壞測(cè)試的所有22個(gè)臨床患者分離物和對(duì)人致病性的的假絲酵母屬物種所有其它對(duì)照菌株。WICALTIN顯示了對(duì)來(lái)自總共10個(gè)不同屬的14種毒素敏感酵母物種能產(chǎn)生作用，因而具有對(duì)放毒者毒素而言異常寬廣的作用譜。
表2WICALTIN對(duì)致病和不致病的不同屬酵母的作用譜。在瓊脂擴(kuò)散測(cè)試(MBA；pH4.7)中針對(duì)純化WICALTIN測(cè)試了所有菌株。應(yīng)用的毒素活性是1×106U/ml。熱帶假絲酵母菌株(患者編號(hào)541965)得自美因茲醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和衛(wèi)生學(xué)系。(Department of MedicalMicrobiology and Hygiene of the University Hospital Maine)
實(shí)施例5加州擬威爾酵母3/57菌株(DSM 12865)中編碼WILCALTIN的WCT基因的克隆、測(cè)序、和分子表征由WICALTIN的N端氨基酸序列開(kāi)始，生成用于鑒定和克隆位于染色體中的毒素基因WCT以及用于表征其分子生物學(xué)的特異DNA寡核苷酸。WCT的DNA序列(SEQ ID NO1)顯示了單一開(kāi)放讀碼框，它所編碼的潛在N-糖基化蛋白質(zhì)具有309個(gè)氨基酸，計(jì)算分子量為34,017Da。關(guān)于WCT編碼的放毒者毒素作用的研究顯示W(wǎng)ICALTIN是對(duì)酵母極其有毒且以在酵母中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞壁β-1，3-D-葡聚糖為主要靶的糖蛋白。WICALTIN針對(duì)酵母和真菌的選擇性毒性基于它在敏感靶細(xì)胞中破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和/或完整性，并由此在最敏感部位攻擊酵母，最后殺死它們。實(shí)施例6由放毒者酵母拜列氏接合糖酵母412菌株(DSM 12864)的培養(yǎng)物上清液濃縮和純化病毒毒素ZYGOCIN通過(guò)Radler等人(1993)所述方法，由此放毒者酵母的培養(yǎng)物上清液分離拜列氏接合糖酵母412菌株的病毒編碼放毒者毒素ZYGOCIN，通過(guò)超濾濃縮，最后通過(guò)親和層析純化。此研究中開(kāi)發(fā)的ZYGOCIN的一步純化法利用了毒素與敏感酵母細(xì)胞壁甘露糖蛋白質(zhì)的天然親和力。將通過(guò)Schmitt和Radler(1997)所述方法由釀酒酵母192.2d菌株分離和部分純化的甘露糖蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)至環(huán)氧激活的Sepharose-6B基質(zhì)(Pharmacia)，并經(jīng)FPLC方法用于柱層析純化毒素。SDS-PAGE后，以這種方式純化的高生物活性的ZYGOCIN顯示表觀分子量大約10kDa的單一蛋白質(zhì)條帶(圖4)。實(shí)施例7ZYGOCIN的作用譜和殺傷譜在瓊脂擴(kuò)散測(cè)試中測(cè)定的拜列氏接合糖酵母412菌株(DSM 12864)的病毒ZYGOCIN的作用譜包含致病和不致病的酵母屬，其中白色假絲酵母和中克側(cè)孢(Sporothrix schenkii)是重要的對(duì)人和動(dòng)物致病的病原體，而玉蜀黍黑粉菌和漢遜氏德巴利氏酵母是農(nóng)業(yè)和食品部門(mén)的重要有害酵母(表3)。
表3ZYGOCIN對(duì)致病和不致病的不同屬酵母的作用譜。在瓊脂擴(kuò)散測(cè)試(MBA；pH4.5)中測(cè)試了所有菌株抵抗1×104U/ml活性的ZYGOCIN制劑的情況。ZYGOCIN敏感酵母 相對(duì)敏感程度釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)++白色假絲酵母(Candida albicans)+克魯斯氏假絲酵母(Candida krusei) ++光滑球假絲酵母(Candida glabrata) ++酒酸假絲酵母(Candida vinii) +葡萄酒有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum) ++馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromyces marxianus) +美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima) +玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis) ++漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii) ++Pichia anomala++Pichia jadinii+膜醭畢赤酵母(Pichia membranefaciens) +Yarrowia lipolytica +魯氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii) ++實(shí)施例8拜列氏接合糖酵母412菌株(DSM 12864)中編碼ZYGOCIN的ZBT基因的克隆和測(cè)序通過(guò)與Schmitt(1995)所述相似的方法，以用氫氧化甲基汞變性的純化M-dsRNA作為模板，以多種六核苷酸作為引物，合成放毒者酵母拜列氏接合糖酵母412的毒素編碼雙鏈RNA基因組的cDNA。連接到經(jīng)EcoRI消化的載體pUC18、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、并分離經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒后，分離幾個(gè)cDNA克隆并測(cè)序。編碼ZYGOCIN的讀碼框的cDNA序列(SEQ IDNO2)包含238個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)前體(毒素原)的遺傳信息，它在氨基酸位置RR139攜帶潛在Kex2內(nèi)肽酶可切割位點(diǎn)。通過(guò)在體內(nèi)發(fā)生于高爾基體晚期的Kex2介導(dǎo)的ZYGOCIN原加工，形成分子量10kDa、99個(gè)氨基酸、N端氨基酸序列與由純化ZYGOCIN測(cè)定的資料完全一致的生物活性ZYGOCIN。
由于ZYGOCIN的毒性，ZBT-cDNA在釀酒酵母中的異源表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化酵母通過(guò)其自身毒素殺傷自身。將來(lái)的目標(biāo)是在毒素抗性裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母中異源表達(dá)ZYGOCIN，因?yàn)檎缱鳛榉独牟《綤28毒素早已證明的，裂殖酵母特別適用于表達(dá)或分泌外源蛋白質(zhì)。實(shí)施例9在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)毒素基因WCT和ZBT。
既然上述放毒者毒素WICALTIN和ZYGOCIN具有寬廣的作用譜，而且還破壞致植物病的酵母和真菌，那么應(yīng)當(dāng)有可能構(gòu)建顯示對(duì)例如致玉米病病原體玉蜀黍黑粉菌的感染有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。早已在煙草植株上進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)，其中由于玉蜀黍黑粉菌放毒者毒素KP4(由病毒天然編碼)的外源表達(dá)，能夠分泌所述放毒者毒素，由此建立了針對(duì)某些致植物病性玉蜀黍黑粉菌菌株的特異防護(hù)(Park等人，1996；Kinal等人，1995；Bevan，1984)。由基于天然根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒經(jīng)修飾衍生物的商品化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)開(kāi)始，有可能將我們已經(jīng)克隆的毒素基因WCT和ZBT克隆到所謂的雙向pBI載體(CLONTECH)中，并用于生成轉(zhuǎn)基因植株。為此目的，將所述毒素基因WCT和ZBT置于強(qiáng)花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(CaMV-P)的轉(zhuǎn)錄控制之下。圖5示意性顯示了待構(gòu)建載體的構(gòu)建過(guò)程。實(shí)施例10加州擬威爾酵母3/57菌株(DSM 12865)中編碼WICALTIN的WCT基因在釀酒酵母中的異源表達(dá)為了在釀酒酵母中異源表達(dá)WCT基因，將編碼WICALTIN的WCT基因以930bp EcoRI/SmaI片段克隆到通?？色@得的2μ載體pYX242中。獲得的載體pSTH2(圖6)包含在酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下的毒素基因，由此能夠在轉(zhuǎn)化到酵母(釀酒酵母)中后組成性表達(dá)WICALTIN。對(duì)以這種方式獲得的酵母轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行凝膠電泳分析顯示，重組WICALTIN被分泌到外部培養(yǎng)基中，并具有對(duì)應(yīng)于同源WICALTIN(來(lái)自野生型菌株DSM 12865)的β-1，3-D-葡聚糖酶活性(圖6)。實(shí)施例11在裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母中異源表達(dá)WICALTIN和ZYGOCIN的實(shí)驗(yàn)既然裂殖酵母顯示對(duì)WICALTIN和ZYGOCIN有抗性，那么作為完整細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞壁原生質(zhì)球，它都適合作為宿主用于異源表達(dá)討論中的毒素。為了確保重組毒素不僅由裂殖酵母表達(dá)，而且還同時(shí)進(jìn)入胞內(nèi)分泌途徑，并由此分泌到外部培養(yǎng)基中，構(gòu)建了攜帶在粟酒裂殖糖酵母中有功能且衍生自釀酒酵母病毒性K28前毒素原基因cDNA的分泌和加工信號(hào)(S/P)的載體(pTZα/γ；圖7)(參見(jiàn)Schmitt，1995；Schmitt和Tipper，1995)。分泌和加工信號(hào)確保了置于相同讀碼框下游的外源蛋白質(zhì)在裂殖酵母中進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，并由此進(jìn)入酵母的分泌途徑。位于S/P區(qū)C端的Kex2p切割位點(diǎn)引起在晚期高爾基體由酵母Kex2p內(nèi)肽酶將期望的外源蛋白質(zhì)由其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)載體上切下，并可最終作為生物活性蛋白質(zhì)(ZYGOCIN和/或WICALTIN)分泌進(jìn)入外部培養(yǎng)基。實(shí)施例12比較純化WICALTIN與局部抗真菌劑克霉唑和霉抗唑的生物活性既然純化WICALTIN具有寬廣的作用譜且有效殺傷對(duì)人致病性的酵母和/或真菌，那么它就是重要的候選抗真菌劑。因此，在WICALTIN與目前廣泛使用的局部抗真菌劑克霉唑和霉抗唑之間進(jìn)行了比較性研究。首先，在MBA瓊脂擴(kuò)散測(cè)試中測(cè)試了克霉唑和霉抗唑?qū)ψ鳛橹甘窘湍傅膫?cè)孢屬之種的毒性作用。為此目的，將克霉唑以10mg/ml的濃度溶于96％乙醇；將該儲(chǔ)液用ddH2O稀釋，并以0.1-10mg/ml的濃度用于MBA測(cè)試，每種取100μl。當(dāng)所用克霉唑的量為10-50μg時(shí)，抑制圈的直徑為12-32mm。在100％DMSO中制備100μg/ml的霉抗唑儲(chǔ)液，并以與克霉唑相同的方式在MBA測(cè)試中測(cè)試對(duì)側(cè)孢屬之種的生物活性。在生物測(cè)定法中，0.08-0.3μg的霉抗唑用量導(dǎo)致抑制圈為22-36mm。因此，10μg克霉唑和0.08μg霉抗唑的生物活性相當(dāng)于2μg純化WICALTIN的毒性。基于這三種測(cè)試化合物分子量的比較顯示，甚至在0.07pmol的濃度，WICALTIN顯示與0.2pmol霉抗唑和29pmol克霉唑相同的活性；因此，WICALTIN是極強(qiáng)的抗真菌劑(圖8)。實(shí)施例13通過(guò)與基因特異的DNA探針進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)加州擬威爾酵母3/57菌株(DSM 12865)中編碼WICALTIN的WCT基因?yàn)榱俗C明SEQ ID NO1的核酸可用于生成WICALTIN特異性DNA探針用于隨后的Southern雜交，將DIG標(biāo)記的930bp DNA探針用于檢測(cè)已經(jīng)克隆到載體pSTH1中的WCT基因。構(gòu)建的載體pSTH1是通?？色@得的原核克隆載體pBR322的衍生物。
圖9所示瓊脂糖凝膠電泳和相應(yīng)Southern印漬毫無(wú)疑問(wèn)顯示核酸探針可用于檢測(cè)編碼WICALTIN的WCT基因。實(shí)施例14Northern印漬分析檢測(cè)β-1，3-D-葡聚糖對(duì)加州擬威爾酵母3/57菌株(DSMl2865)中編碼WICALTIN的WCT基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)為了檢測(cè)β-1，3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的WCT轉(zhuǎn)錄，在300ml BAVC培養(yǎng)基中或在添加0.03％由植物衍生的β-1，3-D-葡聚糖昆布多糖的BAVC培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌株DSM 12865于20℃輕輕搖動(dòng)(60rpm)48小時(shí)，并在不同時(shí)間間隔用于制備總RNA。在分離RNA前，將所有樣品(10ml)調(diào)至相同細(xì)胞密度1.8×108細(xì)胞/ml，并通過(guò)變性瓊脂糖甲醛凝膠電泳分離。如圖10所示，在未誘導(dǎo)條件(無(wú)添加物的BAVC培養(yǎng)基)中和在添加昆布多糖的BAVC培養(yǎng)基中都檢測(cè)到1100堿基大小的WCT轉(zhuǎn)錄本。在未加葡聚糖的情況中，在接近指數(shù)生長(zhǎng)期終點(diǎn)(19小時(shí)后)達(dá)到最大WCT表達(dá)；雜交信號(hào)在穩(wěn)定生長(zhǎng)期顯著變?nèi)?，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄降低。在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件(存在昆布多糖)下，WCT轉(zhuǎn)錄本在10小時(shí)后顯示比未誘導(dǎo)培養(yǎng)高得多的強(qiáng)度，從而得出結(jié)論，加入β-1，3-D-葡聚糖可誘導(dǎo)編碼WICALTIN的WCT基因的轉(zhuǎn)錄。
AlCl3200mg/LCuSO4·5H2O 100mg/LNa2MoO4·2H2O 100mg/LLi2SO4·H2O100mg/LKI 100mg/L酒石酸氫鉀 2g/Ld)維生素儲(chǔ)液(100x)4-氨基苯甲酸 20mg/L生物素 2mg/L葉酸 2mg/L尼克酸 100mg/L吡哆素氫氯化物 100mg/L核黃素 50mg/L硫胺素二氯化物 50mg/LD-泛酸鈣 100mg/L生物素溶于5g KH2PO4/50ml蒸餾水。
葉酸溶于加了幾滴稀NaOH的50ml蒸餾水。
核黃素溶于加了幾滴HCl并加熱的500ml蒸餾水。
其余維生素可溶于少許雙蒸水。
用KOH將BAVC培養(yǎng)基的pH調(diào)至pH4.7。將葡萄糖和儲(chǔ)液分開(kāi)滅菌。將氨基酸、維生素、和微量元素儲(chǔ)液于100℃開(kāi)閥滅菌20分鐘，然后加到高壓滅菌的BAVC培養(yǎng)基中。
圖和最重要的序列SEQ ID NO-加州擬威爾酵母3/57菌株中WCT編碼的蛋白質(zhì)毒素WICALTIN的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
SEQ ID NO2-拜列氏接合糖酵母中ZBT編碼的蛋白質(zhì)毒素ZYGOCIN的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖1加州擬威爾酵母毒素WICALTIN和釀酒酵母內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶Bgl2的N端氨基酸序列。粗體顯示了亞序列的唯一差異，而其它部分相同(Bgl2序列與Klebl和Tanner，1989一致)。
圖2在存在(2a)和不存在(2b)β-D-葡聚糖昆布多糖(L)和石耳素(P)時(shí)，WICALTIN處理敏感酵母釀酒酵母192.2d細(xì)胞的殺傷動(dòng)力學(xué)。所用毒素具有4.0×105U/ml的總活性，4.2×105U/ml蛋白質(zhì)的比活。
圖3(a、b、c、d)用于檢測(cè)WICALTIN在Kre1+和Kre1-釀酒酵母菌株中的靈敏性/抗性的瓊脂擴(kuò)散測(cè)試。用攜帶KRE1的載體pPGK[KRE1]轉(zhuǎn)化WICALTIN抗性kre1零突變株釀酒酵母SEY6210[Δkre1]，完全恢復(fù)了WICALTIN靈敏性。
圖4(A)在甘露糖蛋白質(zhì)-Sepharose上親和層析后，由拜列氏接合糖酵母412菌株(DSM 12864)生成并分泌的ZYGOCIN的凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。(B)用于檢測(cè)純化放毒者毒素ZYGOCIN的生物活性的瓊脂擴(kuò)散測(cè)試。
圖5用于生成轉(zhuǎn)基因植物的攜帶ZBT或WCT的表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。(備注RB、LB根癌土壤桿菌天然Ti質(zhì)粒的右邊界和左邊界序列；CaMV-P花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；NOS-P、NOS-T胭脂堿合酶轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子；kanR用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇的鏈球菌卡那霉素抗性基因；NPT-II用于在植物中進(jìn)行選擇的來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)圖6(A)用于在釀酒酵母中異源表達(dá)編碼WICALTIN的WCT毒素基因的附加型載體pSTH2的部分限制性圖譜。載體pSTH2是基于商品化2μ多拷貝載體pYX242構(gòu)建的質(zhì)粒，其中以930bp EcoRI/SmaI片段形式克隆了來(lái)自菌株DSM 12865的WCT基因。所述毒素基因被置于酵母TP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下，由此能夠在轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中后強(qiáng)烈且組成性表達(dá)WICALTIN。(B)用構(gòu)建的WICALTIN表達(dá)載體pSTH2(1道)和基本的載體pYX242(2道)轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母濃縮培養(yǎng)物上清液的凝膠電泳(10-22.5％梯度SDS-PAGE)分析。箭頭指示在釀酒酵母中異源表達(dá)的WICALTIN。(C)檢測(cè)用WICALTIN表達(dá)酵母載體pSTH2轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母的胞外β-1，3-D-葡聚糖酶活性。為了測(cè)定外切-β-1，3-D-葡聚糖酶活性，向在無(wú)亮氨酸SC瓊脂上生長(zhǎng)的酵母菌落噴灑溶于50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.2)的0.04％4-甲基傘形基-β-D-葡糖苷(MUG)。于37℃溫育30分鐘后，用紫外線(波長(zhǎng)254nm)照射瓊脂平板。通過(guò)MUG水解產(chǎn)生的熒光檢測(cè)葡聚糖酶活性。(備注1和4，用在其自身啟動(dòng)子下表達(dá)編碼WICALTIN的WCT基因的載體pEP-WCT轉(zhuǎn)化的釀酒酵母；2，野生型加州擬威爾酵母3/57(DSM 12865)；3，野生型加州擬威爾酵母3/111；5，用表達(dá)WICALTIN的載體pYX-WCT轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母；6，用基本的載體pYX242(不含毒素基因)轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母)圖7用于在粟酒裂殖糖酵母中異源表達(dá)并分泌外源蛋白質(zhì)(特別是WICALTIN和ZYGOCIN)的載體pTZα/γ的結(jié)構(gòu)示意圖。(備注Pnmt1、Tnmt1，粟酒裂殖糖酵母中硫胺素調(diào)控的nmt1基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子；S/P，芽殖酵母釀酒酵母病毒性K28前毒素原的分泌和加工序列；ars1，來(lái)自裂殖酵母1號(hào)染色體的自主復(fù)制序列；leu2，用于選擇亮氨酸原養(yǎng)型粟酒裂殖糖酵母轉(zhuǎn)化體的亮氨酸-2標(biāo)記基因)圖8純化WICALTIN、克霉唑、和霉抗唑的生物活性的比較；在針對(duì)敏感指示酵母?jìng)?cè)孢屬之種的生物測(cè)定法(瓊脂擴(kuò)散測(cè)試)中，所示摩爾量產(chǎn)生直徑12mm的抑制圈。
圖9通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(A)和使用DIG標(biāo)記WCT基因探針的Southern雜交(B)檢測(cè)已克隆到pSTH1(pBR322衍生物)中的加州擬威爾酵母3/57(DSM 12865)中編碼WICALTIN的WCT基因。(備注M，DIG標(biāo)記的DNA大小標(biāo)準(zhǔn)II；1道，經(jīng)EcoRI和SalI消化的pSTH1；2道，精確梯度的DNA標(biāo)記物)圖10在非誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下在BAVC培養(yǎng)基中(A)和在誘導(dǎo)條件下在添加0.03％昆布多糖的BAVC培養(yǎng)基中(B)，加州擬威爾酵母3/57(DSM 12865)中編碼WICALTIN的WCT基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的Northern分析。通過(guò)7V/cm恒壓變性瓊脂糖/甲醛凝膠電泳分離由菌株DSM 12865分離的總RNA。在尼龍膜上將RNA與WICALTIN特異性DIG標(biāo)記的DNA探針(630bp)雜交并通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。(備注M，DIG標(biāo)記的RNA大小標(biāo)準(zhǔn)I；1-8道對(duì)應(yīng)于分離總RNA的取樣時(shí)間；1道，10小時(shí)；2道，15小時(shí)；3道，19小時(shí)；4道，24小時(shí)；5道，33小時(shí)；6道，38小時(shí)；7道，43小時(shí)；8道，48小時(shí))文中所用縮寫(xiě)
保藏物用于本發(fā)明的下列微生物保藏于Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig，德意志聯(lián)邦共和國(guó)，這是依照布達(dá)佩斯條約關(guān)于國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏規(guī)定認(rèn)可的國(guó)際保藏處。
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85 90 95gac gct ttg aaa act tat ttg cca aag att aag aga tcc aca gtg gag336Asp Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Pro Lys Ile Lys Arg Ser Thr Val Glu100 105 110gcc ttc act gtt ggt tct gag gcc ttg tat aga gat gat atg act gct384Ala Phe Thr Val Gly Ser Glu Ala Leu Tyr Arg Asp Asp Met Thr Ala115 120 125caa gag ttg gct gac aga atc aaa act att aga gag ttg gtt gcc act432Gln Glu Leu Ala Asp Arg Ile Lys Thr Ile Arg Glu Leu Val Ala Thr130 135 140att gac gac tcc gaa ggt aac tca tat gct ggt att cca gtt ggt ttc480Ile Asp Asp Ser Glu Gly Asn Ser Tyr Ala Gly Ile Pro Val Gly Phe145 150 155 160gtt gac tcc tgg aac gtt ttg gtt gat ggt gct tct cac cca gct att528Val Asp Ser Trp Asn Val Leu Val Asp Gly Ala Ser His Pro Ala Ile165 170 175gtt gag gct gat gtt gtg ttc gcc aat gct ttc tct tac tgg caa ggt576Val Glu Ala Asp Val Val Phe Ala Asn Ala Phe Ser Tyr Trp Gln Gly180 185 190cag act cag cag aac tcg tca tac tct ttc ttt gac gac att atg caa624Gln Thr Gln Gln Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Phe Asp Asp Ile Met Gln195 200 205gct ttg caa acc att caa act gct aag ggt gag aca gat atc act ttc672Ala Leu Gln Thr Ile Gln Thr Ala Lys Gly Glu Thr Asp Ile Thr Phe210 215 220tgg gtt ggt gag acc ggc tgg cca acc gat ggt act cac ttt gaa gac720Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Asp Gly Thr His Phe Glu Asp225 230 235 240tct gtc cca tct gtt gag aat gct cag acc ttc tgg aaa gat gcc gtc768Ser Val Pro Ser Val Glu Asn Ala Gln Thr Phe Trp Lys Asp Ala Val245 250 255tgt gcc att aga ggt tgg ggt atc aat gtt att gcc ttt gag gcc ttt816Cys Ala Ile Arg Gly Trp Gly Ile Asn Val Ile Ala Phe Glu Ala Phe260 265 270gac gaa gct tgg aag cca gat acc tct ggt acc tct gat gtg gaa aag864Asp Glu Ala Trp Lys Pro Asp Thr Ser Gly Thr Ser Asp Val Glu Lys
275 280 285tac tgg ggt gtt tgg gac tct aac agc aag ttg aag tat gat ttg tcc 912Tyr Trp Gly Val Trp Asp Ser Asn Ser Lys Leu Lys Tyr Asp Leu Ser290 295 300tgt gac ttt acc tct tag 930Cys Asp Phe Thr Ser305 310<210>2<211>309<212>PRT<213>加州擬威爾酵母(Williopsis californica)<400>2Met Arg Phe Thr Thr Leu Val Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ser Ser Val1 5 10 15Gln Ala Ile Gly Gln Leu Ala Phe Asn Leu Gly Val Lys Asp Asn Ser20 25 30Gly Gln Cys Lys Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Asp Asp Leu Ser Thr Leu35 40 45Ser Gly Tyr Thr Ser Lys Val Arg Val Tyr Ala Ala Ser Asp Cys Asn50 55 60Thr Leu Gln Thr Leu Gly Pro Val Val Glu Glu Ala Gly Phe Ser Phe65 70 75 80Phe Val Gly Ile Trp Pro Asn Asp Asp Ala His Phe Gln Glu Glu Gln85 90 95Asp Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Pro Lys Ile Lys Arg Ser Thr Val Glu100 105 110Ala Phe Thr Val Gly Ser Glu Ala Leu Tyr Arg Asp Asp Met Thr Ala115 120 125Gln Glu Leu Ala Asp Arg Ile Lys Thr Ile Arg Glu Leu Val Ala Thr130 135 140Ile Asp Asp Ser Glu Gly Asn Ser Tyr Ala Gly Ile Pro Val Gly Phe145 150 155 160Val Asp Ser Trp Asn Val Leu Val Asp Gly Ala Ser His Pro Ala Ile
165 170 175Val Glu Ala Asp Val Val Phe Ala Asn Ala Phe Ser Tyr Trp Gln Gly180 185 190Gln Thr Gln Gln Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Phe Asp Asp Ile Met Gln195 200 205Ala Leu Gln Thr Ile Gln Thr Ala Lys Gly Glu Thr Asp Ile Thr Phe210 215 220Trp Val Gly Glu Thr Gly Trp Pro Thr Asp Gly Thr His Phe Glu Asp225 230 235 240Ser Val Pro Ser Val Glu Ash Ala Gln Thr Phe Trp Lys Asp Ala Val245 250 255Cys Ala Ile Arg Gly Trp Gly Ile Asn Val Ile Ala Phe Glu Ala Phe260 265 270Asp Glu Ala Trp Lys Pro Asp Thr Ser Gly Thr Ser Asp Val Glu Lys275 280 285Tyr Trp Gly Val Trp Asp Ser Asn Ser Lys Leu Lys Tyr Asp Leu Ser290 295 300Cys Asp Phe Thr Ser305<210>3<211>717<212>DNA<213>拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)<220><22l>CDS<222>(1)..(717)<400>3atg aaa gca gcc caa ata tta aca gca agt ata gta agc tta ttg cca 48Met Lys Ala Ala Gln Ile Leu Thr Ala Ser Ile Val Ser Leu Leu Pro1 5 10 15ata tat act agt gct aga aac ata tta gac aga gaa tac aca gca aac 96Ile Tyr Thr Ser Ala Arg Asn Ile Leu Asp Arg Glu Tyr Thr Ala Asn20 25 30gaa tta aaa act gct ttt gga gat gaa gaa att ttt aca gat ttg acg144Glu Leu Lys Thr Ala Phe Gly Asp Glu Glu Ile Phe Thr Asp Leu Thr35 40 45tat cac att cac gtt aac gtc agt ggc gaa att gac tct tac tat cat192Tyr His Ile His Val Asn Val Ser Gly Glu Ile Asp Ser Tyr Tyr His50 55 60aat tta gtc aat ttt gtc gat aac gct cta gca aac aaa gat att aat240Asn Leu Val Asn Phe Val Asp Asn Ala Leu Ala Asn Lys Asp Ile Asn65 70 75 80aga tat ata tac gct ata ttt aca cag cag aca aac tat aca gag gat288Arg Tyr Ile Tyr Ala Ile Phe Thr Gln Gln Thr Asn Tyr Thr Glu Asp85 90 95ggg ctc att gag tac tta aat cat tac gat tca gag act tgc aaa gat336Gly Leu Ile Glu Tyr Leu Asn His Tyr Asp Ser Glu Thr Cys Lys Asp100 105 110atc att act cag tat aat gtt aac gta gac act agt aac tgt ata agc384Ile Ile Thr Gln Tyr Asn Val Asn Val Asp Thr Ser Asn Cys Ile Ser115 120 125aat act aca gat caa gct aga ctc caa cgt cgc gga ggg tgg gtg aac432Asn Thr Thr Asp Gln Ala Arg Leu Gln Arg Arg Gly Gly Trp Val Asn130 135 140cca cat tgt agt ggt gat aac tta gcc gat act agc gat tgt tgt aac480Pro His Cys Ser Gly Asp Asn Leu Ala Asp Thr Ser Asp Cys Cys Asn145 150 155 160ttg gct tat aac aag att aac ccc tct tca aac tta cag tca tgg aat528Leu Ala Tyr Asn Lys Ile Asn Pro Ser Ser Asn Leu Gln Ser Trp Asn165 170 175tat gtt gtc ggg cag tgt cac tat att tct cac gct aat gga aag gta576Tyr Val Val Gly Gln Cys His Tyr Ile Ser His Ala Asn Gly Lys Val180 185 190tgt agt ggt gct gac agg caa cag tta gct gaa aat gta tgt aac tgg624Cys Ser Gly Ala Asp Arg Gln Gln Leu Ala Glu Asn Val Cys Asn Trp195 200 205tgt cag gtt aac ggt ggt gtt agc gct ttt gct agc agt agt tct gca672Cys Gln Val Asn Gly Gly Val Ser Ala Phe Ala Ser Ser Ser Ser Ala210 215 220cat cca ggt gct tgc atg agt gat gta ggg ttc tgc tat gct tag 717His Pro Gly Ala Cys Met Ser Asp Val Gly Phe Cys Tyr Ala225 230 235<210>4<211>238<212>PRT<213>拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)<400>4Met Lys Ala Ala Gln Ile Leu Thr Ala Ser Ile Val Ser Leu Leu Pro1 5 10 15Ile Tyr Thr Ser Ala Arg Asn Ile Leu Asp Arg Glu Tyr Thr Ala Asn20 25 30Glu Leu Lys Thr Ala Phe Gly Asp Glu Glu Ile Phe Thr Asp Leu Thr35 40 45Tyr His Ile His Val Asn Val Ser Gly Glu Ile Asp Ser Tyr Tyr His50 55 60Asn Leu Val Asn Phe Val Asp Asn Ala Leu Ala Asn Lys Asp Ile Asn65 70 75 80Arg Tyr Ile Tyr Ala Ile Phe Thr Gln Gln Thr Asn Tyr Thr Glu Asp85 90 95Gly Leu Ile Glu Tyr Leu Asn His Tyr Asp Ser Glu Thr Cys Lys Asp100 105 110Ile Ile Thr Gln Tyr Asn Val Asn Val Asp Thr Ser Asn Cys Ile Ser115 120 125Asn Thr Thr Asp Gln Ala Arg Leu Gln Arg Arg Gly Gly Trp Val Asn130 135 140Pro His Cys Ser Gly Asp Asn Leu Ala Asp Thr Ser Asp Cys Cys Asn145 150 155 160Leu Ala Tyr Asn Lys Ile Asn Pro Ser Ser Asn Leu Gln Ser Trp Asn165 170 175Tyr Val Val Gly Gln Cys His Tyr Ile Ser His Ala Asn Gly Lys Val180 185 190Cys Ser Gly Ala Asp Arg Gln Gln Leu Ala Glu Asn Val Cys Asn Trp195 200 205Cys Gln Val Asn Gly Gly Val Ser Ala Phe Ala Ser Ser Ser Ser Ala210 215 220His Pro Gly Ala Cys Met Ser Asp Val Gly Phe Cys Tyr Ala225 230 23權(quán)利要求
1.可由加州擬威爾酵母和/或拜列氏接合糖酵母獲得的蛋白質(zhì)毒素。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)毒素，其可由DSM 12864和/或DSM 12865獲得。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)毒素，其具有抗真菌和/或殺真菌作用。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)毒素，其具有葡聚糖酶活性。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)毒素，其可結(jié)合β-1，6-D-葡聚糖并具有β-1，3-D-葡聚糖酶和/或β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性。
6.編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述具有氨基酸序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的葡聚糖酶和/或蛋白質(zhì)毒素或其功能性變體的核酸及其至少8個(gè)核苷酸的部分，其中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2是本權(quán)利要求的一部分。
7.權(quán)利要求6的核酸，其中核酸是DNA或RNA，優(yōu)選雙鏈DNA。
8.權(quán)利要求6或7的核酸，是具有SEQ ID NO1第1-951位堿基或SEQ ID NO2第1-717位堿基的核酸序列的DNA，其中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2是本權(quán)利要求的一部分。
9.權(quán)利要求8的核酸，其包含一種或多種調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子)和/或3’端polyA序列和/或胞內(nèi)毒素原加工所需Kex2p內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)和/或一個(gè)或多個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求8或9的核酸，可由DSM 12864和/或DSM 12865獲得。
11.權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸，其包含于載體，優(yōu)選表達(dá)載體或基因療法有效的載體中。
12.用于制備權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸的方法，其中核酸是化學(xué)合成的或借助探針由基因文庫(kù)分離的。
13.具有氨基酸序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或其功能變體的多肽及其至少6個(gè)氨基酸的部分。
14.用于制備權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽的方法，其中在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)的核酸。
15.針對(duì)權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽的抗體。
16.用于制備權(quán)利要求15的抗體的方法，其中用權(quán)利要求7的多肽免疫哺乳動(dòng)物，并在合適時(shí)分離形成的抗體。
17.一種藥物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求15的抗體，合適時(shí)還包含制藥學(xué)可接受的添加劑和/或佐劑。
18.制備用于治療真菌病諸如淺表、皮膚、和皮下皮膚真菌病、粘膜真菌病、和全身性真菌病，尤其優(yōu)選假絲酵母真菌病的藥物產(chǎn)品的方法，其中權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求15的抗體與制藥學(xué)可接受的添加劑和/或佐劑配制在一起。
19.一種診斷劑，其包含權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸或 1-5和13任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求15的抗體，并在合適時(shí)還包含合適的添加劑和/或佐劑。
20.制備用于診斷真菌病諸如淺表、皮膚、和皮下皮膚真菌病、粘膜真菌病、和全身性真菌病，尤其優(yōu)選假絲酵母真菌病的診斷劑的方法，其中權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求15的抗體與制藥學(xué)可接受的載體一起聯(lián)用。
21.用于鑒定功能相互作用物的測(cè)定法，其包含權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求15的抗體，并在適當(dāng)時(shí)包含合適的添加劑和/或佐劑。
22.權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽用于鑒定功能性相互作用物的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的核酸用于尋找變體的應(yīng)用，包括用上述核酸篩選基因文庫(kù)并分離找到的變體。
24.權(quán)利要求1-5和13任一項(xiàng)的多肽用于控制食品和動(dòng)物飼料中有害酵母和真菌的應(yīng)用。
25.用于培養(yǎng)DSM 12864和DSM 12865的方法，包括在合成B和/或BAVC培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們。
26.權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)的核酸用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株和植物細(xì)胞的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用基因技術(shù)由酵母即所謂的放毒者酵母制備蛋白質(zhì)毒素,用于控制對(duì)人和植物致病性的酵母和/或真菌,即選擇性殺傷酵母和/或真菌。這種高特異性使得能夠使用蛋白質(zhì)毒素作為抗真菌劑和/或殺真菌劑。此外,這種蛋白質(zhì)毒素可用于農(nóng)作物防護(hù)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1361825SQ00809677
公開(kāi)日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月5日
發(fā)明者K·勒費(fèi)爾德, S·賽森, F·維勒, M·施密特 申請(qǐng)人:阿溫提斯研究技術(shù)兩合公司