專利名稱：Dna疫苗－pcv的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼和表達(dá)豬circovirus免疫原(豬CircoVirus的PCV)質(zhì)粒構(gòu)建體，豬circovirus免疫原與PMWS綜合癥(豬全身消瘦綜合癥或斷奶后全身消瘦綜合癥)有關(guān)，也涉及免疫接種的方法和DNA疫苗，還涉及生產(chǎn)和制備這些疫苗的方法。本文引用的所有文件，以及本文引用的文件中引用的所有文件本文一并參考。
PCV最初作為豬腎細(xì)胞系PK/15中非細(xì)胞病原性污染物檢測(cè)，這種病毒與雞貧血癥病毒(雞貧血癥病毒CAV)和PBFDV病毒(Pscittacine Beak和羽毛疾病病毒)一起分在Circoviridae中。這些是小的非包膜病毒(15至24nm)，其共同特征是含有一種1.76至2.31千堿基對(duì)(kb)的環(huán)形單鏈DNA形式的基因組。開(kāi)始認(rèn)為這一基因組編碼大約30kDa多肽(Todd等，Arch.Virol.，1991，117129-135)。然而最近的工作顯示存在更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄(Meehan B.M.等，J.Gen.Virol.，1997，78221-227)。此外，在三種已知的circoviruses中，已知在核苷酸序列或共同抗原決定簇中沒(méi)有明顯的同源性。
來(lái)源于PK/15細(xì)胞的PCV被認(rèn)為不是致病性的。從B.M.Meehan等J.Gen.Virol.1997(78)221-227已知其序列。僅在最近一些作者認(rèn)為PCV毒株可能是病原性的，并且與PMWS綜合癥有關(guān)(G.P.S.Nayar等，Can.Vet.J.，1997，38385-387和Clark E.G.，Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997499-501)。Nayar等利用PCR技術(shù)在患有PMWS綜合癥的豬中已檢測(cè)到PCV DNA。
針對(duì)具有PMWS綜合癥癥狀的豬中所發(fā)現(xiàn)的circoviruse的單克隆和多克隆抗體能夠說(shuō)明這些circoviruses和從PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物分離的豬circoviruses之間的區(qū)別(Allan G.M.等Vet Microbiol.，1999，66115-123)。
在加拿大，美國(guó)和法國(guó)所發(fā)現(xiàn)的PMWS綜合癥以重量逐漸喪失和以例如呼吸急促、呼吸困難和黃疸表現(xiàn)為臨床特征。根據(jù)病理觀點(diǎn)，它由淋巴細(xì)胞或肉芽腫滲入，淋巴結(jié)病，少數(shù)情況下由肝炎和淋巴細(xì)胞或肉芽腫腎炎證明(Clark E.G.，Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997499-501；La Semaine Veterinaire No.26，La Semaine Veterinaire 1996(834)增刊；La Semaine Veterinaire 1997(857)54；G.P.S.Nayer等，Can.Vet.J.，1997，38385-387)。
從北美和歐洲獲得的這些circoviruses非常近緣相關(guān)，它們的核苷酸序列具有96％的等同程度，而當(dāng)這些circoviruses的核苷酸序列與從PK-15細(xì)胞分離的豬circoviruses比較時(shí)，等同性程度不到80％。因此，有人提出了兩個(gè)病毒子群，PCV-1用于與PMWS綜合癥相關(guān)的circoviruses，PCV-2用于從PMWS細(xì)胞分離的circoviruses(Meehan B.M.等，J.Gen.Virol.，1998，792171_2179；WO-A9918214)申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)編碼和表達(dá)PCV-2免疫原的質(zhì)粒構(gòu)建體可以用來(lái)針對(duì)PMWS綜合癥免疫豬。
PCV-2免疫原可以與PCV-1免疫原結(jié)合使用，也可針對(duì)PCV-2免疫這些動(dòng)物。
根據(jù)不太優(yōu)選的方式，PCV-1免疫原可以單獨(dú)地使用。
本發(fā)明的主體是編碼和表達(dá)PCV-1或PCV-2免疫原，特別是PCV-1的開(kāi)放讀框(ORFs)1和/或2，PVC-2的ORFs 1和/或2(ORF意思是開(kāi)放讀框)的質(zhì)粒構(gòu)建體。
不言而喻，本發(fā)明自動(dòng)覆蓋編碼和表達(dá)等同核苷酸序列的質(zhì)粒，所說(shuō)的等同核苷酸序列是這樣的序列既非改變所考慮的基因或這一基因編碼的多肽的功能性，也非改變它們的毒株特異性(即1型毒株和2型毒株)。當(dāng)然會(huì)包括因密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生的不同的序列。
用于實(shí)施例的PCV-2序列來(lái)源于Meehan等，同上(毒株Imp.1010 ORF1核苷酸398-1342；ORF2核苷酸1381-314；分別符合1998年9月25日的US 09/161,092中的ORF4和ORF13和WO-A-9918214中的COL4和COL13)。其它PCV-2毒株和它們的序列在以下文獻(xiàn)中已出版WO-A-9918214(稱為Imp1008，Imp999，Imp1011-48285和Imp1011-48121)；A.L.Hamel等J.Virol.June 1998，vol72，65262-5267(GenBankAF027217)；I.Norozov等J.ClinicalMicrob.Sept.1998 vol.36，92535-2541；以及GenEank AF086834，AF086835和AF086836，并且給出等同的ORF序列索取號(hào)。
本發(fā)明也覆蓋了這種意義上的等價(jià)序列，它們?cè)诟邍?yán)格條件下能夠與所考慮的基因的核苷酸序列雜交。在所說(shuō)的等價(jià)序列中，也可以是所提到的基因的保留完整序列免疫原性的片段。
1型和2型之間全基因組的同源性約75％。對(duì)于ORF1，大約86％，對(duì)于ORF2，大約66％。相反，基因組之間和2型內(nèi)ORFs之間的同源性一般高于95％。
根據(jù)本發(fā)明，以下的序列也是等價(jià)的序列，對(duì)于ORF1，與毒株Imp1010的ORF1具有等于或大于88％，特別是90％，優(yōu)選地是92％或95％同源性的那些序列，對(duì)于ORF2，與毒株Imp1010的ORF2具有等于或大于80％，特別是85％，優(yōu)選地是90％或95％同源性的那些序列。
根據(jù)Meehan 1998的ORF1和ORF2分別具有編碼具37.7kD和27.8kD之預(yù)料分子量的蛋白質(zhì)的潛力。ORF3和ORF4(根據(jù)Meehan等1998，分別符合WO-A-9918214中ORF7和ORF10)分別具有編碼具11.9和6.5kD之預(yù)料分子量的蛋白質(zhì)的潛力。這些ORFs序列也可以從Genbank AF055392中獲得。它們也可以摻入質(zhì)粒中，并且按照本發(fā)明單獨(dú)或者與例如ORF1和/或ORF2組合使用。
1998年9月25日的US 09/161,092中的其它ORFs1-3和5，6，8-9，11-12(WO-A-9918214中的COLs 1-3和5，6，8-9，11-12)，在這里所描述的條件下，可以組合或相互或與這里定義的ORFs1和2一起使用。
以上敘述也是圍繞等價(jià)序列的使用，特別是來(lái)源于本文所引用的各種PCV-2毒株的那些ORFs。
對(duì)于同源性，人們可以精確說(shuō)明那些等同的序列，其來(lái)源于具有ORF2和/或ORF1的PCV毒株，與毒株1010相應(yīng)ORFs具有本文所限定的同源性。對(duì)于根據(jù)Meehan的ORF3，也可以說(shuō)，與毒株Imp1010的ORF3具有等于或大于80％，特別是85％，優(yōu)選地是90％或95％的同源性。對(duì)于根據(jù)Meehan 1998的ORF4，與毒株Imp1010的ORF4具有等于或大于86％，特別是90％，優(yōu)選地是95％的同源性。
從基因組核苷酸序列，在WO-A-99 18214中公開(kāi)的那些序列，采用標(biāo)準(zhǔn)軟件，MacVector確定ORFs是常規(guī)技術(shù)。同時(shí)，與毒株1010基因組的序列對(duì)比和與毒株1010 ORFs的比較使得本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定另一毒株的基因組ORFs(例如在WO-A-99 18214中所公開(kāi)的那些)。利用軟件或進(jìn)行序列對(duì)比不是過(guò)度實(shí)驗(yàn)，直接給出等價(jià)的ORFs。
術(shù)語(yǔ)質(zhì)粒在這里意欲包括多核苷酸序列形式的任何DNA轉(zhuǎn)錄單位，包含待表達(dá)的PCV序列和其體內(nèi)表達(dá)必需的元件。環(huán)形質(zhì)粒形式，超卷曲的或其它方式的，是優(yōu)選的。線性形式也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的主題更具體地說(shuō)是被稱為pJP109(包含PCV-2的ORF2基因，
圖1)，pJP111(包含PCV-2的ORF1基因，圖2)，pJP120(包含PCV-1的ORF2基因，圖3)和pJP121(包含PCV-1的ORF1基因，圖4)的質(zhì)粒。
每一質(zhì)粒包含在其控制下能夠確保所插入的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。一般來(lái)說(shuō)它是一個(gè)強(qiáng)大的真核啟動(dòng)子，特別是巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子CMV-IE，人或鼠源的，也可以是其它來(lái)源的，如大鼠或天竺鼠。更一般地，啟動(dòng)子或是病毒來(lái)源的或是細(xì)胞來(lái)源的。作為病毒的啟動(dòng)子而不是CMV-IE，可以提及的是SV40病毒早期或晚期啟動(dòng)子或Rous肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子。它也可以是基因所來(lái)源的病毒的啟動(dòng)子，例如，對(duì)基因特異性的啟動(dòng)子。作為細(xì)胞啟動(dòng)子，可以提及的是細(xì)胞支架基因啟動(dòng)子，例如結(jié)蛋白啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。當(dāng)幾個(gè)基因在相同的質(zhì)粒中存在時(shí)，它們可以在相同的轉(zhuǎn)錄單位或兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄單位中提供。
質(zhì)粒也可以包含其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，例如，內(nèi)含子型的穩(wěn)定序列，優(yōu)選的是兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II(van Ooyen等科學(xué)，1979，206337-344)，由組織纖溶酶原活化基因編碼的蛋白質(zhì)的信號(hào)序列(tPA；Montgomery等，Cell.Nol.Biol.1997，43235-292)，以及多聚腺苷酸化信號(hào)(polyA)，特別是牛生長(zhǎng)激素(bGH)基因(US-A-5,122,458)的或兔β-珠蛋白基因的。
本發(fā)明的主題也是免疫原性制劑和DNA疫苗，它們包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的編碼和表達(dá)PCV-1或PCV-2免疫原中的一個(gè)，優(yōu)選地是以上提到的ORFs的質(zhì)粒，以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，可以也可以不包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
本發(fā)明的主題更具體地說(shuō)是包含至少一種編碼和表達(dá)PCV-1或PCV-2免疫原的質(zhì)粒的免疫原性制劑和疫苗，與佐劑配制的組合物，所說(shuō)的佐劑特別是含有下式的季銨鹽的陽(yáng)離子脂 其中R1是一個(gè)具有12至18個(gè)碳原子的飽和的或不飽和的線性脂肪族基團(tuán)，R2是另一個(gè)包含2至3個(gè)碳原子的脂肪族基團(tuán)，并且X是羥基或氨基。
優(yōu)選的是DMRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四烷氧基)-1-丙銨(WO-A-9634109)，最好與中性脂，例如優(yōu)選的是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)連接，形成DMRIE-DOPE。優(yōu)選的，與這一佐劑的質(zhì)?；旌衔锞驮谑褂弥爸瞥桑詈檬窃谑┯糜趧?dòng)物之前制成。由此產(chǎn)生的混合物使得可以形成復(fù)合物，例如在10至60分鐘，特別是30分鐘時(shí)間內(nèi)。
當(dāng)DOPE存在時(shí)，DMRTE∶DOPE摩爾比例優(yōu)選的范圍是95∶5到5∶95，更優(yōu)選的是1∶1。
質(zhì)粒DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑的重量比范圍是50∶1到1∶10，優(yōu)選的是10∶1到1∶5，更優(yōu)選的是1∶1到1∶2。
根據(jù)另一個(gè)本發(fā)明的有利的方式，可能的是利用作為佐劑的佐劑化合物，其選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，順丁烯二酸酐的共聚物和鏈烯基衍生物的共聚物。特別是與糖的或多元醇的聚鏈烯基醚連接的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物是優(yōu)選的。這些混合物被稱作carbomer(Pharmeuropa vol.8，No.2，June 1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以參考US-A-2,909,462(本文一并參考)，該文獻(xiàn)描述了與聚羥基化的化合物交聯(lián)的這樣的丙烯酸聚合物，所說(shuō)的化合物具有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選地不多于8個(gè)羥基，至少3個(gè)羥基的氫原子由具有至少2個(gè)碳原子的不飽和脂肪族基團(tuán)取代。優(yōu)選的的基團(tuán)是那些包含2至4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯基，丙烯基和其它烯鍵不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)本身可以包含其它取代基，如甲基。以名稱Carbopol(GF Goodrich，俄亥俄，美國(guó))出售的產(chǎn)品特別適當(dāng)。它們與丙烯基蔗糖或者與丙烯基季戊四醇交聯(lián)，在它們中，可以提到的是Carbopol974P，934P和971P。
在順丁烯二酸酐的共聚物和鏈烯基衍生物的共聚物中，EMAs(Monsanto)是優(yōu)選的，它是順丁烯二酸酐和乙烯的共聚物，線性或交聯(lián)的，例如與二乙烯基醚交聯(lián)的，可以參見(jiàn)J.Fields等，自然，186778-780，4 June 1960(本文一并參考)。從它們的結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)看，丙烯酸或甲基丙烯酸和EMAs的聚合物優(yōu)選地含有下式的基本單位 其中-R1和R2，相同或不同，代表氫或甲基。-X＝0或1，優(yōu)選的X＝1-Y＝1或2，當(dāng)X+Y＝2時(shí)對(duì)于EMAs，X＝0，Y＝2。對(duì)carbomers，X＝Y(jié)＝1。
這些聚合物在水中的分解形成酸性溶液，其會(huì)被中和，優(yōu)選的是至生理pH，以給出佐劑溶液，實(shí)際的疫苗將摻入其中。聚合物的羧基部分以COO-形式。
對(duì)于這種類型的佐劑，較好的是制備佐劑，特別是carbomer在蒸餾水中的溶液，優(yōu)選的是氯化鈉存在下，所獲得的溶液在酸性pH下。通過(guò)添加至所需的數(shù)量稀釋該儲(chǔ)備溶液(由此獲得所需的最終濃度)或其溶解有氯化鈉的水，優(yōu)選的是生理鹽水(NaCl 9g/l)的實(shí)質(zhì)性部分，具有伴隨的或后續(xù)中和(pH 7.3至7.4)，優(yōu)選的是用氫氧化鈉中和的一個(gè)或多個(gè)部分。當(dāng)其與質(zhì)?；旌蠒r(shí)，就使用這種在生理pH下的溶液，特別是以冷凍干燥，液體或凍結(jié)形式貯存。
在最終疫苗組合物中的聚合物濃度將是0.01％至2％w/v，特別是0.06至1％w/v，優(yōu)選的是0.1至0.6％w/v。
在一特定的實(shí)施方案中，免疫原性或疫苗制劑包含一種質(zhì)?；蚓幋a和表達(dá)PCV-20RF1和ORF2的質(zhì)粒的混合物。
本發(fā)明也提供了將針對(duì)豬circovirus的免疫接種和針對(duì)其它豬病原體的免疫接種聯(lián)合的方法，所說(shuō)的病原體特別是可能與PMWS綜合癥相關(guān)的那些。舉例來(lái)說(shuō)，可以指出奧耶斯基氏病毒，豬流感病毒，PRRS，豬細(xì)小病毒，豬霍亂病毒，大葉性肝炎的線桿菌。
因此，本發(fā)明的主題是含有至少一種按照本發(fā)明的質(zhì)粒和至少另一種編碼和表達(dá)豬免疫原的質(zhì)粒的質(zhì)?；旌衔?，所說(shuō)的免疫原選自，例如，奧耶斯基氏病毒(假狂犬病毒或PRV)的糖蛋白gB和gD，豬流感病毒H1N1的血細(xì)胞凝集素和核蛋白，豬流感病毒H3N2的血細(xì)胞凝集素和核蛋白，Lelystad與美國(guó)毒株的PRRS病毒的ORF5和ORF3基因，豬細(xì)小病毒的VP2蛋白質(zhì)，豬霍亂病毒(HCV)的E1和E2蛋白質(zhì)，從大葉性肝炎的線桿菌缺失的apxI，apxII以及apxIII基因(參見(jiàn)例如WO-A-9803658的質(zhì)粒)。
這些質(zhì)粒混合物夾帶在獸醫(yī)學(xué)上可接受載體或稀釋劑，可有可無(wú)的前面描述的獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑中，由此形成免疫原性制劑或多價(jià)DNA疫苗。這些免疫原性制劑或多價(jià)DNA疫苗用以上描述的陽(yáng)離子脂(特別是DMRIE，最好是與中性脂，DOPE連接，形成DMRIE-DOPE)配制可以特別有利。
所配制的或者用以上描述的佐劑配制的根據(jù)本發(fā)明的制劑或單價(jià)或多價(jià)DNA疫苗用細(xì)胞因子(優(yōu)選的是豬來(lái)源的，特別是豬GM-CSF)補(bǔ)充也可以是有利的。這種豬GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；Clark S.C.等科學(xué)1987，2301229；Grant S.TA.等藥物，1992，53516)的添加可以通過(guò)摻入到制劑中或者摻入到疫苗中實(shí)現(xiàn)，可以是豬GN-CSF蛋白質(zhì)，也可以是編碼和表達(dá)豬GN-CSF基因的質(zhì)粒(Inumaru S.和TakamatsuH.免疫細(xì)胞生物學(xué)，1995，73474-476)。
尤其是，編碼和表達(dá)豬GM-CSF的質(zhì)?？梢允琴|(zhì)粒pJP058(圖5)。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性制劑和多價(jià)或多價(jià)DNA疫苗也可以與針對(duì)至少一種不同的或相同的豬病原體的至少一種常規(guī)的疫苗(減毒的活疫苗，滅活的疫苗或亞單位疫苗)或重組疫苗(病毒載體)組合使用。本發(fā)明特別提供了與含佐劑的常規(guī)疫苗(減毒的活疫苗，滅活的疫苗或亞單位疫苗)組合的方法。對(duì)于滅活的疫苗或亞單位疫苗，可以提到特別包含單獨(dú)的氧化鋁凝膠或與作為佐劑的皂角甙混合的那些，或者以水包油乳劑形式配制的那些。
本發(fā)明的主題也是免疫方法，其使得可能在豬中針對(duì)按照本發(fā)明的circoviruses誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。其主題具體地說(shuō)是在豬中有效的免疫接種的方法。這些免疫和免疫接種的方法包括施用以上描述的制劑的一種或者單價(jià)或多價(jià)DNA疫苗的一種。這些免疫和免疫接種的方法包括施用一個(gè)或多個(gè)這些制劑或DNA疫苗的后續(xù)劑量。在這種免疫或免疫接種方法的上下文中，可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中提出的用于多核苷酸免疫接種的各種施用路線施用所說(shuō)的制劑和DNA疫苗。特別是肌內(nèi)和真皮內(nèi)路線，并且借助已知的施用技術(shù)，特別是施用有針的注射器進(jìn)行液體推注式的注射(Furth等，分析生物化學(xué)，1992，205365-368)或者通過(guò)涂布有一層DNA的金微粒投射注射(Tang等，自然，1992，356152-154)。
這種方法不僅使得可以施用到成年豬，而且也可以施用到幼年和懷孕豬；在后一種情況下，其使得可以將被動(dòng)免疫賦予新生豬(母性的抗體)。優(yōu)選的，雌性豬在飼養(yǎng)前和/或出欄前和/或在妊娠期間接種。有利地，在出欄之前至少接種一次，在妊娠期間(例如在妊娠中期，在妊娠的約6-8周)和/或在妊娠的最后(妊娠的約11-13周)完成后續(xù)接種是優(yōu)選的。這樣，一種有利的用藥辦法是在出欄之前接種，妊娠期間加強(qiáng)接種。此后，在每一次出欄前和/或在約妊娠中期和/或在妊娠的最后再接種。優(yōu)選的，在妊娠期間再接種。
小豬(piglet)，例如免疫接種過(guò)的雌性豬(如按照本文的討論接種的)來(lái)源的小豬在出生后的頭幾周接種，例如，在出生后的第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五周。優(yōu)選的，小豬在出生后的第一周或出生后的第三周內(nèi)接種(例如，在斷奶時(shí))。有利地，這樣的接種在兩到四周進(jìn)行加強(qiáng)。
用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗的DNA的數(shù)量在約10μg和約2000μg之間，優(yōu)選的約50μg和大約1000μg之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力精確限定用于每一免疫或免疫接種方案的DNA的有效劑量。
劑量體積可以在0.5和5ml之間，優(yōu)選的在2和3ml之間。
免疫和免疫接種的優(yōu)選方法包括通過(guò)肌內(nèi)路線施用根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗。
現(xiàn)在將參照附圖，借助非限制性例證性實(shí)施方案詳細(xì)的描述本發(fā)明。
對(duì)克隆ORFs有用的PCV-2毒株是例證性毒株，保藏在ECACC，具有以下保藏號(hào)V97100219(Imp1008)，V97100218(Imp1010)和V97100217(Imp 999)(其于1997年10月2日保藏)，V98011608(Imp1011-48285)和V98011609(Imp1011-48121)(其于1998年1月16日保藏)。
這些實(shí)施例采用毒株Imp1010構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將該過(guò)程用于其它PCV-2毒株。
用由自連接的EcoRI-EcoRI片段組成的的模板，以使用下列寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增PCV-2病毒株1010-Stoon的ORF2基因(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179；GenBank序列登記號(hào)AF055392)Jp779(SEQ ID NO 1)(35聚體)5’CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3’JP780(SEQ ID NO 2)(36聚體)5’TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3’以產(chǎn)生730bp PCR片段。將該片段以SalI與BglII消化，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離715bp SalI-BglII限制片段。將該片段事先用SalI和BglII消化，然后與質(zhì)粒pVR1012(Hartikka J.等，人類基因治療，1996.7.1205-1217)連接，給出質(zhì)粒pJ 109(5567pb)(圖1)。
用由自連接的PstI-PstI片段組成的的模板，以使用下列寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增PCV-1病毒株P(guān)K-15(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997，78，221-227；GenBank序列登記號(hào)U49186)JF785(SEQ ID NO 7)(35聚體)5’CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3’JP786(SEQ ID NO 8)(36聚體)5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3’以產(chǎn)生包含PCV-1病毒(毒株P(guān)K-15)的ORF1基因的965bp PCR片段。將該片段以SalI與BglII消化，以便在瓊脂糖凝膠電泳后，分離946bpSalI-BglII限制片段。然后將該片段與質(zhì)粒pVR1012(實(shí)施例1)連接，給出質(zhì)粒pJP121(5804bp)(圖4)
采用對(duì)PCV-2病毒特異性的多克隆血清觀察到相同的表達(dá)結(jié)果。在這種情況下，熒光標(biāo)記的抗-豬IgG綴合物用于檢測(cè)特定熒光。采用以質(zhì)粒pVR1012單獨(dú)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的這種多克隆血清檢測(cè)不到任何熒光。
小豬用單獨(dú)的質(zhì)粒pJP109或質(zhì)粒pJP109與pJP111的混合物或質(zhì)粒pJP109與pJP058的混合物或質(zhì)粒pJP109，pJP111和pJP058的混合物接種。
疫苗溶液含有每一質(zhì)粒500μg。
體積疫苗溶液經(jīng)肌內(nèi)路線以2ml總體積注射疫苗溶液。在實(shí)施中，給定接種小豬的年齡(1-2天)，在頸兩側(cè)的每一邊給予1毫升的一次注射(＝2×1ml)。
兩次疫苗注射在兩周間隔進(jìn)行，這就是說(shuō)在方案的D2天和D14天進(jìn)行。
在方案的D21天用口鼻施用毒性PCV-2毒株病毒懸液進(jìn)行激發(fā)。然后監(jiān)測(cè)小豬三周，觀察小豬斷奶后全身消瘦綜合癥的特定臨床征候的出現(xiàn)。觀測(cè)的的癥候是直腸溫度頭14天每日測(cè)量，然后，在激發(fā)后的第三周測(cè)量?jī)纱?。重量就在激發(fā)之前稱量小豬，在激發(fā)后的3周期間每周稱量一次。試驗(yàn)病毒血癥和抗體之血樣的收集在D2，D14，D21，D28，D35和D42天采集血樣。尸體解剖在D42天，溫和地處死存活的小豬，進(jìn)行尸體解剖，以研究病理解剖學(xué)損傷，并從肝臟，淋巴結(jié)，脾，腎以及胸腺進(jìn)行組織學(xué)制備，以研究在這些組織中的損傷。8.2.5-7周大豬崽不再具有對(duì)PCV-2病毒特異性的母性抗體的5-7周大豬崽經(jīng)肌內(nèi)路線接種單獨(dú)質(zhì)粒pJP109，或者質(zhì)粒pJP109與pJP111的混合物，或者質(zhì)粒pJP109與pJP058的混合物或者質(zhì)粒pJP109，pJP111和pJP058的混合物。
接種劑量與實(shí)施例8.1中所指出的那些相同(每個(gè)質(zhì)粒500μg)。以2ml體積經(jīng)肌內(nèi)路線注射疫苗溶液(一次施用2ml到頸肌肉)。
兩次免疫接種間隔21天。通過(guò)肌內(nèi)施用毒性PCV-2毒株的病毒懸液，在最后一次接種后的14天(D35)進(jìn)行激發(fā)。
監(jiān)測(cè)小豬八周，觀察小豬斷奶后全身消瘦綜合癥的特定臨床征候的出現(xiàn)。激發(fā)后小豬的臨床監(jiān)測(cè)與實(shí)施例8.1中描述的相同，只是總的觀察期是8周這一時(shí)間。
通過(guò)用0.9％NaCl中的1mg/ml DNA溶液等份稀釋0.75mM DMRIE-DOPE溶液達(dá)到形成質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂復(fù)合物。借助裝有26G針的注射器，沿著包含陽(yáng)離子脂溶液的藥瓶的壁，慢慢引入DNA溶液，避免形成泡沫。兩種溶液混合，迅速輕輕振蕩。最終獲得包含0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml DNA的組合物。
對(duì)在以上描述的所有操作，在室溫下使用溶液是合乎需要的。在免疫豬之前30分鐘，在室溫下形成DNA/DMRIE-DOPE復(fù)合物。
然后根據(jù)實(shí)施例8.1和8.2中描述的條件接種豬。
在log10轉(zhuǎn)化之后，所給出的數(shù)據(jù)相應(yīng)于組織勻漿中的病毒滴度。PCV-2滴度組支氣管LN 腸系膜LN平均值 Std 平均值 StdNpJP109 0.90.8 0.9 0.84pJP109+ 0.70.6 0.2 0.23pJP111對(duì)照2.01.1 1.8 1.14支氣管淋巴結(jié)似乎包含最大感染性的病毒。在以pJP109或pJP109+pJP111質(zhì)?；旌衔锩庖叩男∝i的支氣管和腸系膜淋巴結(jié)中，觀察到病毒載量的降低。對(duì)質(zhì)粒混合物，這種降低是明顯的(P≤0.05)。●病毒的排泄經(jīng)基于PCV-2 ORF2擴(kuò)增的PCR就PCV-2評(píng)估后激發(fā)糞便擦棒。每一次試驗(yàn)用2毫升樣品的三次重復(fù)完成。未接種的對(duì)照激發(fā)前為PCV-2陰性，激發(fā)后為陽(yáng)性，證實(shí)PCR試驗(yàn)的有效性。
測(cè)定值以log10(2μl樣品中PCV-2 DNA的分子數(shù)量)表示。
log10PCV-2 DNA分子數(shù)量組 平均值 std NpJP109 3.3 0.3 4pJP109+pJP111 2.9 0.7 3對(duì)照 3.6 0.6 4組之間的差異不明顯。第2實(shí)驗(yàn)14天齡的常規(guī)小豬在第0天和第20天兩次用由DMRIE DOPE配制的pJP109和pJP111質(zhì)粒混合物免疫。對(duì)每一次施用，經(jīng)肌內(nèi)路線在耳后頸側(cè)面注射2毫升。疫苗組合物是每毫升生理溶液(0,9％ NaCl)250μg各種質(zhì)粒和0.375mM DMRIE DOPE。
對(duì)對(duì)照組小豬注射生理溶液。
第32天，小豬經(jīng)口鼻路線激發(fā)，在每個(gè)鼻孔中用注射器引入5毫升每毫升滴度105.8TCID50的PCV-2病毒懸液。
監(jiān)測(cè)小豬的臨床癥狀，虛脫，嘔吐，氣促，咳嗽，厭食以及過(guò)熱(在激發(fā)后28天期間內(nèi)每天記錄直腸溫度)，減慢生長(zhǎng)(在第32，40，46，53，60天稱量小豬)。按照下列標(biāo)準(zhǔn)記錄癥狀附錄1(每一小豬的得分等于相應(yīng)于不同觀察天數(shù)得分的總和)。
第60天，進(jìn)行尸體剖檢，按照下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行損傷計(jì)分附錄2(每一小豬的得分等于相應(yīng)于各觀察器官得分的總和)。
收集組織樣品，特別是淋巴結(jié)。
在病毒排泄后第32，39，42，46，49，53，56，60天，收集直腸擦棒。●臨床癥狀與對(duì)照比較，在免疫小豬組中觀察到臨床癥狀的明顯減弱。在對(duì)照組中，一頭小豬死于PMWS，而在接種組中沒(méi)有。
臨床得分組 平均值 std N接種組 13.57.1 8對(duì)照組 29.315.6 8(P＜0.01 Kruskal-Wallis檢驗(yàn))在免疫小豬組觀察到后激發(fā)過(guò)熱延續(xù)時(shí)間明顯縮短(P＜0.05)。
直腸溫度≥40℃的天數(shù)組 平均值 std N接種組 1.9 2.0 8對(duì)照組 8.4 3.9 8在接種組和對(duì)照組之間，激發(fā)后每日重量增長(zhǎng)沒(méi)有明顯區(qū)別?！袷w剖檢損傷與對(duì)照組比較，在免疫小豬中觀察到損傷明顯降低，特別是淋巴結(jié)病(P≤0.05)。
綜合損傷和淋巴結(jié)病得分組平均值 stdN綜合損傷接種組7.6 3.38對(duì)照組13.1 7.58淋巴結(jié)得分接種組3.1 2.78對(duì)照組5.7 2.98●淋巴結(jié)組織中病毒載量通過(guò)免疫化學(xué)確定腸系膜和縱隔淋巴結(jié)中的病毒載量。
下列標(biāo)準(zhǔn)用于計(jì)分-0＝缺乏熒光-1＝在某些器官切片上有一些熒光點(diǎn)-2＝每次拍攝一個(gè)熒光點(diǎn)-3＝全部熒光器官在免疫組中觀察到病毒載量的明顯降低(P≤0.05)。
病毒載量組 腸系膜LN 縱隔LNN平均值 std 平均值 std -接種組 0.5 0.6 1.3 0.2 8對(duì)照組 1.8 0.8 2.0 0.8 8●病毒排泄經(jīng)PCR估測(cè)糞便擦棒的PCV-2排泄。按照下列標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量結(jié)果0＝?jīng)]有PCV-21＝存在PCV-2在免疫小組中，38％的小豬在糞便中排泄PCV-2，對(duì)照組中為88％排泄。與對(duì)照組比較，在接種組中病毒排泄的期限明顯縮短。
病毒排泄平均期限(天)組平均值std N接種組1.2 2.1 8對(duì)照 11.4 6.3 8應(yīng)該清楚，由權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明不受以上說(shuō)明書(shū)所提出的特定實(shí)施方案的限制，并且包括不偏離本發(fā)明范圍和精神的各種變化的情況。
附錄1臨床癥候得分癥候 得分虛脫 0無(wú)，1有，2不能確定嘔吐 0無(wú)，1有呼吸困難 0無(wú)，1中度，2重度咳嗽 0無(wú)，1有厭食 0無(wú)，1有過(guò)熱 0無(wú)，1≥40℃，2≥41℃生長(zhǎng) 0無(wú)，1周DWGx≤周DWGx-1并且＞100克/天2周DWG≤100克/天死亡 0無(wú)，x死亡前一天的得分對(duì)一天而言，得分是每次癥候得分的總和附錄2目視損傷得分皮膚 正常 0(顏色) 白色 1黃色 2肥胖 正常 0瘦 1非常瘦 2惡病質(zhì)性 3粘液 正常 0白色 1黃色 2sub.cut.conjonctif 正常 0發(fā)亮 1黃色 2神經(jīng)節(jié)(gg) 正常 0I大的和或充血 1＞I大的和或充血2＞I非常大 3胸液 正常 0發(fā)亮 1可見(jiàn) 2心臟 正常 0損傷 1肺 正常 0損傷≤41損傷＞4≤6 2損傷＞63胸膜 正常 0損傷 1腹水 正常0發(fā)亮1可見(jiàn)2腹膜 正常0可見(jiàn)1胃正常0損傷1潰瘍2小腸 正常0損傷1大腸 正常0損傷1派伊爾氏淋巴集結(jié) 正常0在小腸的1部分可見(jiàn) 1在小腸的2部分可見(jiàn) 2非常明顯3肝正常0損傷1腎正常0損傷1膀胱 正常0損傷1
序列表<110>MERIAL<120>DNA疫苗-PCV<130>DNA疫苗PCV<140>numéro brevet<141>date dépót brevet<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>1catcatcatg tcgacatgac gtatccaagg aggcg 35<210>2<211>36<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>2tactactaca gatctttagg gtttaagtgg ggggtc36<210>3<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>3catcatcatg tcgacatgcc cagcaagaag aatgg 35<210>4<211>36<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>4tactactaca gatcttcagt aatttatttc atatgg36<210>5<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>5catcatcatg tcgacatgac gtggccaagg aggcg 35<210>6<211>40<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>6tactactaca gatctttatt tatttagagg gtcttttagg40<210>7<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>7catcatcatg tcgacatgcc aagcaagaaa agcgg 35<210>8<211>36<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>8tactactaca gatcttcagt aatttatttt atatgg36<210>9<211>33<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg 33<210>10<211>34<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>10tatgcggccg ctacgtatca cttctgggct ggtt 3權(quán)利要求
1.一種免疫原性制劑或疫苗，它們一方面包含編碼和表達(dá)選自PCV-2的ORF1、PCV-2的ORF2、PCV-1的ORF1以及PCV-1的ORF2的基因的質(zhì)粒，另一方面包含能夠增強(qiáng)針對(duì)所說(shuō)基因表達(dá)產(chǎn)物之免疫反應(yīng)的元件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的元件包括作為佐劑的下式的陽(yáng)離子脂 其中R1是一個(gè)具有12至18個(gè)碳原子的飽和的或不飽和的線性脂肪族基團(tuán)，R2是另一個(gè)包含2至3個(gè)碳原子的脂肪族基團(tuán)，并且X是羥基或氨基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于陽(yáng)離子脂是DMRIE。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于DMRIE連接到一中性脂上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于DMRIE連接到DOPE上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的元件包括作為佐劑的carbomer。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的元件包括豬細(xì)胞因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于其中所說(shuō)的豬細(xì)胞因子是GM-CSF。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于其包含編碼和表達(dá)豬細(xì)胞因子的質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的元件包括作為佐劑的豬細(xì)胞因子和選自由DMRIE，DMRIE/DOPE和carbomer組成的組的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10之任一的免疫原性制劑或疫苗，其特征在于其包含編碼和表達(dá)另一個(gè)豬免疫原的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫原性制劑或疫苗,它們一方面包含編碼和表達(dá)來(lái)源于PCV的基因(特別是選自PCV－2的ORF1、PCV－2的ORF2、PCV－1的ORF1以及PCV－1的ORF2)的質(zhì)粒,另一方面包含能夠增強(qiáng)針對(duì)所說(shuō)基因表達(dá)產(chǎn)物之免疫反應(yīng)的元件,其可以是carbomer,豬細(xì)胞因子(如GM－CSF)或式(1)的陽(yáng)離子脂:其中R
文檔編號(hào)A61K48/00GK1376200SQ00809668
公開(kāi)日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月10日
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