專利名稱：新型5－嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的藥物組合物。更具體地，涉及本發(fā)明下列式1所表示的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可藥用鹽，它們對乙肝病毒和人免疫缺陷型病毒的繁殖具有顯著的抑制作用。本發(fā)明還涉及式1化合物的制備方法以及含有作為抗病毒有效成分的所述衍生物的藥物組合物。
式1 其中，R1是H、羥基、C1-C5直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C1-C5直鏈或支鏈烷氧基團(tuán)、C2-C6直鏈或支鏈羥基烷基團(tuán)、C2-C6二烷基氨基團(tuán)、以羥基或C2-C6烷氧羰基取代的C2-C6直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C3-C6環(huán)烷基團(tuán)，或飽和或不飽和的含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元雜環(huán)化合物，該化合物可以是未取代的或用C1-C3烷基取代；R1可含有或不含有不對稱碳原子；R2是H或C1-C4直鏈或支鏈烷基團(tuán)；或R1和R2兩者組成含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元飽和雜環(huán)，該雜環(huán)未取代或以C1-C5直鏈或支鏈烷基或C2-C5直鏈或支鏈羥基烷基取代；n是介于0-4間的整數(shù)；R3是吲唑-5-基，或吲唑-6-基。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV，下文簡稱“HBV”)引發(fā)急性或慢性肝炎，其可發(fā)展成肝硬化和肝癌。據(jù)估計(jì)全世界有3億人感染HBV(Tiollais和Buendia，Sci.Am.，264，48，1991)。為尋找預(yù)防和治療乙肝的方法，對HBV的分子生物學(xué)特性已有許多研究。現(xiàn)已開發(fā)出了各種疫苗和診斷藥物，并正努力開辟研究治療乙肝的新途徑。
HBV基因組由編碼聚合酶(P)、表面蛋白(pre-S1、pre-S2和S)、核心蛋白(pre-C和C)和X蛋白的基因組成。在這些HBV基因表達(dá)的蛋白中，聚合酶、表面蛋白和核心蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白，而X蛋白具有調(diào)控功能。
HBV聚合酶基因包含全部病毒基因組的80％，可生成94kD大小由845個氨基酸組成的蛋白，該基因在病毒基因組復(fù)制中有幾種功能。該多肽包括許多序列，這些序列負(fù)責(zé)蛋白引物、RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶和核糖核酸酶H(RNase H)的活性。Kaplan和其同事首先發(fā)現(xiàn)了聚合酶的反轉(zhuǎn)錄酶的活性，這導(dǎo)致在HBV復(fù)制機(jī)理方面更多的研究。
當(dāng)病毒粒體表面的抗原蛋白被肝細(xì)胞特異性受體識別后，HBV就進(jìn)入肝臟。在肝細(xì)胞內(nèi)，DNA由HBV聚合酶作用合成并附著到短鏈上從而形成HBV基因組完整的雙螺旋。完整的HBV雙螺旋DNA基因組由于RNA聚合酶的作用產(chǎn)生前基因組mRNA以及核心蛋白、表面蛋白和調(diào)控蛋白的mRNA。使用這些mRNA合成病毒蛋白。聚合酶在病毒基因組產(chǎn)生、與核心蛋白和前基因組mRNA形成稱為復(fù)制體的結(jié)構(gòu)方面具有重要功能。該過程稱為包殼作用。聚合酶在3’末端有谷氨酸重復(fù)單位，其對核酸有高親和性，有利于包殼作用。當(dāng)復(fù)制體形成時，(-)DNA由HBV聚合酶的反轉(zhuǎn)錄作用合成，而(+)DNA則通過DNA依賴的DNA聚合酶作用制成，其反過來又產(chǎn)生前基因組mRNA。重復(fù)全過程直到池中保持200-300以上基因組(Tiollais和Buendia，Scientific American，26448-54，1991)。
盡管HBV和HIV是不同的病毒，但它們增殖過程中的復(fù)制機(jī)理具有一些相同步驟，即病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄形成DNA以及從隨后形成的RNA-DNA雜合體去除RNA鏈。
近來，已報道核苷化合物如lamivudine和泛苜洛弗(famvir)對HBV增殖是有用的抑制劑，雖然它們初始已經(jīng)開發(fā)成治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS，下文簡稱“AIDS”)和帶狀皰疹感染的療法(Gerin，J.L.，Hepatology，14198-199，1991；Lok，A.S.P.，J.Viral Hepatitis，1105-124，1994；Dienstag，J.L.等，New England Journal of Medicine，3331657-1661，1995)。但是由于高耗費(fèi)和副作用如毒性、耐藥性病毒的產(chǎn)生以及停止治療后疾病的復(fù)發(fā)，這些核苷化合物被當(dāng)作治療乙肝不好的選擇。在非核苷化合物范圍內(nèi)尋找乙肝療法的努力一直持續(xù)著，并且對喹諾酮化合物(EPO 563732，EPO 563734)、三價銥(iridos)化合物(KR 94-1886)和對苯二胺衍生物(KR 96-72384，KR 97-36589，KR 99-5100)已有抗HBV的抗病毒效果報道。盡管付出很多努力，然而治療乙肝的有效藥物仍未開發(fā)成功，療法還主要依賴于癥狀治療。
AIDS病誘導(dǎo)體細(xì)胞中的免疫功能顯著下降并誘發(fā)各種正常人罕見的感染癥狀，并擴(kuò)散到全身。對AIDS負(fù)責(zé)的人免疫缺陷病毒(HIV，下文簡稱“HIV”)已知主要進(jìn)攻輔助T細(xì)胞，該細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞之一。當(dāng)輔助T細(xì)胞感染HIV病毒并遭受壞死后，人免疫系統(tǒng)就不能合適發(fā)揮作用。隨后免疫功能的損傷導(dǎo)致致命的感染和惡性腫瘤的發(fā)展。從AIDS病人在美國1981年第一次被發(fā)現(xiàn)，但1993年的AIDS病人數(shù)在187個國家已增長到85萬以上(WHO1993年報道)。WHO預(yù)測到2000年將有3千萬到4千萬以上人口感染HIV，并且他們中的1千萬至2千萬將發(fā)展成疾病。
目前，藥物控制HIV的增殖已廣泛應(yīng)用于治療AIDS。在這些藥物中，疊氮胸苷(zidovudine)以前稱為Azidothymidine，是1987年開發(fā)的藥物。當(dāng)疊氮胸苷無效或由于副作用不能使用時，1991年開發(fā)出二脫氧肌苷(didanosine)作為AIDS病人的選擇替代藥。此外，1992年許可扎西他賓(zalcitabine)和疊氮胸苷同時使用。這些藥減輕了癥狀，拖延了受感染個體的疾病發(fā)展成典型的AIDS，由此某種程度上延長了患者的生命。但是這些藥物不能完全治愈病人，而且經(jīng)常出現(xiàn)一些諸如抗性和副作用的問題。
根據(jù)這些問題，本發(fā)明人試圖開發(fā)治療乙肝時毒性、副作用和誘發(fā)病毒菌株抗性都小的療法。我們發(fā)現(xiàn)了具有極好的抗HBV抗病毒效果的化合物，合成了式1表示的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物，并通過其對HIV和HBV的增殖顯示了明顯的抑制作用，從而完成了本發(fā)明。
為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了以下式1表示的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物以及它們的可藥用鹽。
式1 其中，R1是H、羥基、C1-C5直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C1-C5直鏈或支鏈烷氧基團(tuán)、C2-C6直鏈或支鏈羥基烷基團(tuán)、C2-C6二烷基氨基團(tuán)、以羥基或C2-C6烷氧羰基團(tuán)替代的C2-C6直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C3-C6環(huán)烷基團(tuán)，或飽和或不飽和的含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元雜環(huán)化合物，該化合物可以是未取代或用C1-C3烷基取代；R1可含有或不含有不對稱碳原子；R2是H或C1-C4直鏈或支鏈烷基團(tuán)；或R1和R2兩者組成含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元飽和雜環(huán)，該雜環(huán)未取代或以C1-C5直鏈或支鏈烷基取代或C2-C5直鏈或支鏈羥基烷基取代；R3是吲唑-5-基，或吲唑-6-基；n是介于0-4間的整數(shù)。
當(dāng)R1和R2代表含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元雜環(huán)化合物時，n等于0。該雜環(huán)可以是未取代或被C1-C5直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C2-C5直鏈或支鏈羥基烷基取代或羥基取代；當(dāng)式1的R1含有不對稱碳原子時，它們可以R或S光學(xué)異構(gòu)體存在，本發(fā)明覆蓋了光學(xué)異構(gòu)體以及外消旋混合物。
本發(fā)明中R3的吲唑-5-基和吲唑-6-基基團(tuán)分別以式2和式3表示。
式2 式3
本發(fā)明式1的化合物可以鹽的形式使用，通過加入可藥用游離酸制備的酸加成鹽是有用的。根據(jù)本領(lǐng)域的一般方法可將式1的化合物變成對應(yīng)的酸加成鹽。在這種情況下，無機(jī)酸和有機(jī)酸均可用作游離酸。在無機(jī)酸中，可采用鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸。在有機(jī)酸中，可采用檸檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、富馬酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、甘醇酸(glycolic acid)、琥珀酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、embonic acid、谷氨酸和天門冬氨酸。
進(jìn)一步，如下列流程

圖1中所示，本發(fā)明提供了5-嘧啶甲酰胺衍生物的制備方法。
反應(yīng)方案1 其中，R1、R2、R3和n如式1所定義。
制備本發(fā)明式1化合物的方法包含下列兩個步驟
1)式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物的制備是將式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯與式5(5代表式2和式3兩個化合物，下文簡稱式5)的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在合適溶劑、合適溫度及堿性條件下反應(yīng)(步驟1)；2-A)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制備是將步驟1中制備的式6的化合物與式7的胺化合物在合適溶劑、合適溫度下反應(yīng)，或2-B)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制備首先是將步驟1中合成的式6的化合物水解形成式8的5-嘧啶羧酸衍生物，然后在N，N-二甲基甲酰胺和SOCl2存在下將其活化成Vilsmeier中間產(chǎn)物，并使之與式7的胺化合物反應(yīng)。
流程圖1中所使用的化學(xué)試劑，即式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯、式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑和式7的胺化合物都有商品提供可方便購買。
下文更詳細(xì)描述式1化合物的制備方法。
對于式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯與式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑反應(yīng)合成式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物，有機(jī)化合物可用作堿。優(yōu)選使用叔胺如三乙胺、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、N-甲基哌啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺、2，6-二甲基吡啶和吡啶。
優(yōu)選反應(yīng)溫度為20-40℃，優(yōu)選反應(yīng)時間為1-6小時。
優(yōu)選單一試劑，選自醇如甲醇和乙醇、氯仿、二氯甲烷和乙腈，或上述溶劑的混合物。
式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物由步驟1中合成的式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物與式7的胺混合物反應(yīng)來制備可采用兩種方法中的一種進(jìn)行。
如步驟2-A，式7中合適的胺化合物可用來生成高產(chǎn)率的式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物，而不需首先將式6的氨基吲唑5-嘧啶羧酸乙酯水解。
在這種情況下，式7的胺化合物用以引入R1和R2取代基，并根據(jù)所需取代基的種類選擇合適的胺。對于胺化合物，可使用甲醇氨溶液、甲醇甲胺溶液、乙胺水溶液、異丙胺、環(huán)丙胺、乙醇胺或丙醇胺，這些物質(zhì)都有現(xiàn)成商品提供。
對于堿，與式7的中間產(chǎn)物比較，優(yōu)選過量使用如制備式6的化合物中所用的有機(jī)堿，以增加反應(yīng)效率。
溶劑優(yōu)選單一溶劑，選自醇如水、甲醇、乙醇和異丙醇或氯仿、二氯甲烷和乙腈以及上述溶劑的混合溶劑。
反應(yīng)溫度優(yōu)選25-60℃，這依賴于所使用的胺化合物。
至于步驟2-B中的反應(yīng)，用于水解式6的化合物的堿化合物優(yōu)選氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀。水解反應(yīng)中5-嘧啶羧酸衍生物幾乎是定量形成的。
反應(yīng)中的溶劑優(yōu)選使用水和醇如甲醇或乙醇的混合物。
反應(yīng)溫度和時間分別優(yōu)選30-60℃和0.5-3小時。
5-嘧啶羧酸衍生物采用加熱N，N-二甲基甲酰胺和亞硫酰二氯在30-50℃所形成的Vilsmeier試劑活化，然后與合適的式7的胺化合物在0-20℃下反應(yīng)制備本發(fā)明的目的化合物5-嘧啶甲酰胺衍生物。
本反應(yīng)的溶劑優(yōu)選非質(zhì)子溶劑如氯仿、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或乙醚。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了預(yù)防和治療乙肝的藥物組合物，該組合物包含了作為有效成分的式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可藥用鹽。
本發(fā)明還提供了預(yù)防和治療AIDS的藥物組合物，該組合物包含了作為有效成分的式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可藥用鹽。
本發(fā)明式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物在HIV和HBV增殖中是有效的抑制劑，這是因?yàn)樗鼈兏蓴_了從病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA時所形成的RNA-DNA雜合體中去除了RNA鏈。該反轉(zhuǎn)錄對HBV和HIV的復(fù)制過程是共同的。
式1的化合物可以口服及通過其它臨床使用途徑給藥；例如，可以靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部施用和以一般藥物形式使用。
對于含有本發(fā)明藥物組合物藥物的臨床使用，式1的化合物能與可藥用賦形劑混合并制成各種可藥用形式；例如，口服片劑、膠囊、trochise、溶液、懸浮液；和注射溶液、懸浮液，或與蒸餾水混合制成速溶的注射溶液的干粉。
式1的化合物的有效量一般為成人10-500mg/kg，優(yōu)選50-300mg/kg，其可分成數(shù)個劑量，優(yōu)選分成每天1-6個劑量，以及遵照醫(yī)囑施用。
然而，如果本領(lǐng)域的技術(shù)人員參考本發(fā)明內(nèi)容后在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出修改和改進(jìn)，這將是可理解的。<制備實(shí)施例1>4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯的制備在含有4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)和5-氨基吲唑(3.15g)的甲醇溶液(70ml)中加入三乙胺(3.5ml)，然后將溶液30℃反應(yīng)3小時。反應(yīng)混合物放置室溫冷卻后，20℃攪拌1小時。然后將反應(yīng)混合物過濾并用甲醇(20ml)洗滌。所獲得的固體40-50℃真空干燥得到所需的化合物(6.15g，87％)。
熔點(diǎn)199-201℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.34(t，3H)，2.42(s，3H)，4.34(m，2H)，7.48(d，1H)，7.53(d，1H)，8.06(d，2H)，8.70(s，1H)，10.18(s，1H)，13.10(brs，1H)<制備實(shí)施例2>4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯的制備在含有4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)和6-氨基吲唑(3.15g)的甲醇溶液(70ml)中加入N，N-二異丙基乙胺(4.2ml)，然后將溶液30-35℃反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合物放置室溫冷卻后，20℃攪拌1小時。然后將反應(yīng)混合物過濾并用甲醇(20ml)洗滌。所獲得的固體40-50℃真空干燥得到所需的化合物(5.8g，82％)。
熔點(diǎn)212-214℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.33(t，3H)，2.53(s，3H)，4.33(m，2H)，7.10(d，1H)，7.70(d，1H)，8.00(s，1H)，8.22(s，1H)，8.72(s，1H)，10.40(s，1H)，13.09(br s，1H)<制備實(shí)施例3>4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸的制備在甲醇溶液(80ml)中加入制備實(shí)施例1所獲得的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)，并在該溶液中再加入H2O(30ml)和3N NaOH水溶液(15ml)，40-50℃水解1小時。反應(yīng)混合物冷卻后，于20℃緩慢加入3N HCl水溶液直至pH5。然后在反應(yīng)混合物中緩慢加入H2O(100ml)，20℃攪拌1小時，過濾，用H2O(30ml)洗滌，得到固體產(chǎn)物。該固體產(chǎn)物在50℃真空干燥得到所需的化合物(4.44g，97％)。
熔點(diǎn)＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.45(s，3H)，7.49(d，1H)，7.53(d，1H)，8.05(s，1H)，8.10(s，1H)，8.68(s，1H)，10.50(s，1H)，13.09(br s，1H)<制備實(shí)施例4>4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸的制備除了使用由制備實(shí)施例2得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)作為初始反應(yīng)物以外，所需化合物(95％)采用制備實(shí)施例3的相同方法獲得。
熔點(diǎn)＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.56(s，3H)，7.10(d，1H)，7.72(d，1H)，8.01(s，1H)，8.25(s，1H)，8.73(s，1H)，10.81(br s，1H)，13.06(br s，1H)<實(shí)施例1>4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備在從制備實(shí)施例1所制得的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)氯仿溶液(10ml)中加入10％甲醇氨溶液(20ml)，緩慢加熱并在40℃反應(yīng)2天。反應(yīng)混合物減壓蒸餾濃縮并加入甲醇(15ml)后結(jié)晶。含有固體產(chǎn)物的反應(yīng)混合物于20℃攪拌，過濾然后分離固體產(chǎn)物。固體產(chǎn)物用氯仿∶乙醇(1∶1)(v/v)重結(jié)晶，真空干燥后獲得所需化合物(0.62g，68％)。
熔點(diǎn)＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.49(s，3H)，7.47(d，1H)，7.55(d，1H)，7.73(br s，1H)，8.07(s，1H)，8.15(s，1H)，8.28(br s，1H)，8.71(s，1H)，11.46(s，1H)，13.07(br s，1H)<實(shí)施例2>4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備除了使用由制備實(shí)施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(5g)作為初始反應(yīng)物以外，所需化合物(62％)采用實(shí)施例1的相同方法獲得。
1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.56(s，3H)，7.06(d，1H)，7.70(d，1H)，7.81(br s，1H)，7.98(s，1H)，8.28(s，1H)，8.32(br s，1H)，8.73(s，1H)，11.75(s，1H)，13.02(br s，1H)<實(shí)施例3>4-(1H-5-吲唑氨基)-N-甲基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備在40％甲胺的甲醇溶液(30ml)中加入從制備實(shí)施例1得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1.5g)，將該溶液于25-30℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)混合物冷卻至20-25℃，加入H2O(90ml)并攪拌0.5小時，過濾，25％甲醇水溶液(10ml)洗滌，得到固體產(chǎn)物。該產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后得到所需化合物(1.26g，88％)。
熔點(diǎn)259-261℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.46(s，3H)，2.80(d，3H)，7.45(d，1H)，7.52(d，1H)，8.03(s，1H)，8.13(s，1H)，8.61(s，1H)，8.75(br s，1H)，11.28(s，1H)，13.06(br s，1H)<實(shí)施例4>4-(1H-6-吲唑氨基)-N-甲基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備除了使用由制備實(shí)施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯作為初始反應(yīng)物以外，所需化合物(92％)采用實(shí)施例3的相同方法獲得。
熔點(diǎn)263-265℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.56(s，3H)，2.81(d，3H)，7.05(d，1H)，7.69(d，1H)，7.98(s，1H)，8.28(s，1H)，8.67(s，1H)，8.79(br s，1H)，11.57(s，1H)，13.02(br s，1H)<實(shí)施例5>N-乙基-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備在甲醇溶液(20ml)中加入從制備實(shí)施例1得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)，室溫下加入70％乙胺水溶液(25ml)，30-35℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)混合物冷卻后緩慢加入H2O(30ml)并攪拌0.5小時，過濾，30％甲醇水溶液(10ml)洗滌，得到所需化合物(0.8g，80％)。
熔點(diǎn)252-254℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.17(t，3H)，2.49(s，3H)，3.33(m，2H)，7.48(d，1H)，7.55(d，1H)，8.07(s，1H)，8.15(s，1H)，8.65(s，1H)，8.78(br s，1H)，11.29(s，1H)，13.09(br s，1H)<實(shí)施例6>N-環(huán)丙基-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備在甲醇溶液(20ml)中加入從制備實(shí)施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)，室溫下加入環(huán)丙胺(7ml)，50℃反應(yīng)6小時。反應(yīng)混合物冷卻后緩慢加入H2O(20ml)，25℃攪拌0.5小時，過濾，30％甲醇水溶液(10ml)洗滌，得到所需化合物(0.67g，65％)。
熔點(diǎn)＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ0.54(m，2H)，0.67(m，2H)，2.49(s，3H)，2.78(m，1H)，7.00(d，1H)，7.63(d，1H)，7.92(s，1H)，8.21(s，1H)，8.58(s，1H)，8.69(br s，1H)，11.46(s，1H)，12.97(br s，1H)<實(shí)施例7>N-(2-羥基乙基)-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備在甲醇溶液(20ml)中加入從制備實(shí)施例1得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(1g)，室溫下加入乙醇胺(7ml)并回流4小時。反應(yīng)混合物冷卻后于20℃緩慢加入H2O(40ml)，并攪拌0.5小時，過濾，25％甲醇水溶液(10ml)洗滌，得到所需化合物(0.75g，72％)。
熔點(diǎn)＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.45(s，3H)，3.36(m，2H)，3.55(m，2H)，4.81(m，1H)，7.47(d，1H)，7.54(d，1H)，8.06(s，1H)，8.15(s，1H)，8.71(s，1H)，8.77(br s，1H)，11.25(s，1H)，13.07(br s，1H)<實(shí)施例8>N-(2-羥基乙基)-4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備除了使用由制備實(shí)施例2得到的4-(1H-6-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙醚作為初始反應(yīng)物以外，所需化合物(76％)采用實(shí)施例7的相同方法獲得。
熔點(diǎn)269-270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.56(s，3H)，3.33(m，2H)，3.54(m，2H)，4.79(m，1H)，7.04(d，1H)，7.69(d，1H)，7.98(s，1H)，8.27(s，1H)，8.72(s，1H)，8.81(br s，1H)，11.52(s，1H)，13.03(br s，1H)<實(shí)施例9>N-羥基乙基-N-甲基-4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酰胺的制備在二氯甲烷溶液(120ml)中加入N，N-二甲基甲酰胺(1.1ml)和亞硫酰二氯(1.2ml)，并回流2小時。將從制備實(shí)施例3得到的4-(1H-5-吲唑氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯(3g)加入到上述溶液中，并回流10小時。反應(yīng)混合物冷卻后，在0-5℃緩慢加入2-(甲基氨基)乙醇(4ml)，并攪拌1小時。在反應(yīng)混合物中加入甲醇(80ml)，攪拌5分鐘，然后過濾去除雜質(zhì)。過濾液經(jīng)減壓蒸餾濃縮后獲得固體產(chǎn)物。將3N NaOH水溶液(3ml)加入到含上述固體產(chǎn)物的甲醇∶H2O(1∶1)溶液中，攪拌1小時，過濾，用H2O洗滌。通過二氯甲烷∶異丙醚(1∶4)重結(jié)晶獲得所需化合物(1.61g，45％)。
熔點(diǎn)106-114℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.40(s，3H)，2.99(s，3H)，3.43(br s，2H)，3.56(br s，2H)，7.44(d，1H)，7.50(d，1H)，7.93(br s，1H)，8.03(s，1H)，8.14(s，1H)，8.93(br s，1H)，13.03(br s，1H)實(shí)施例10-35中化合物的制備采用實(shí)施例9相同的方法。表1顯示了化合物名稱、產(chǎn)率、重結(jié)晶溶液、實(shí)施例10-35所制備化合物的熔點(diǎn)以及作為初始反應(yīng)物的5-嘧啶羧酸衍生物(8)和胺化合物(7)。表2顯示了實(shí)施例10-35所制備化合物的1H-NMR。
表1a

表1b

表1C

表2a


表2b



<試驗(yàn)1>對反轉(zhuǎn)錄中HBV聚合酶體外活性的抑制作用為了測定式1的化合物對反轉(zhuǎn)錄中HBV聚合酶活性的影響進(jìn)行了下列體外試驗(yàn)。
本發(fā)明人提交了專利申請，有關(guān)在E.coli中重組表達(dá)并從中分離出的HBV聚合酶、其制備方法以及測定酶活性的方法(KR 94-3918，KR 96-33998)。在本試驗(yàn)中采用了如上所述的已在E.coli中表達(dá)的HBV聚合酶。
本發(fā)明所使用的體外測定HBV聚合酶反轉(zhuǎn)錄活性的方法如下?；驹砣缤珽LISA。將附著生物素或洋地黃毒苷基團(tuán)的核苷酸包括在底物中，并以附著在過氧化物酶上的抗-DIG的抗體識別該聚合底物。
在被鏈霉抗生物素包被的孔中加入20μl HBV聚合酶、20μl反應(yīng)混合物(DIG-UTP和生物素-UTP各10μM、46mM Tris-HCl、266mMKCl、27.5mM MgCl2和9.2mM DTT底物/引物雜合體)和20μl測試化合物(添加到1、0.1和0.01μg/ml)，使其在22℃反應(yīng)15小時。在反應(yīng)過程中，HBV聚合酶催化DNA合成，以及附著到核苷酸上的洋地黃毒苷和生物素與包被在孔底部的鏈霉生物素形成鍵。當(dāng)反應(yīng)完成后，每個孔用250μl的清洗緩沖液(pH 7.0)洗滌30秒鐘，重復(fù)5次以去除殘留雜質(zhì)。將200μl抗-DIG-POD抗體加入到每個孔中，37℃反應(yīng)1小時，然后用清洗緩沖液洗滌這些孔以去除雜質(zhì)。然后每孔加入200μl過氧化物酶底物-ABTSTM，室溫反應(yīng)30分鐘。使用ELISA讀數(shù)儀于405nm測定吸光度。
使用沒有測試化合物的組作為對照，計(jì)算反轉(zhuǎn)錄中HBV聚合酶活性降低的百分比，結(jié)果顯示在表3中。
表3a對反轉(zhuǎn)錄中HBV聚合酶活性的影響


表3b對反轉(zhuǎn)錄中HBV聚合酶活性的影響

如表3所示，本發(fā)明的化合物在濃度1μg/ml時對HBV聚合酶活性的抑制作用超過70％，最高達(dá)98％。進(jìn)一步，預(yù)期本發(fā)明的化合物不存在如使用核苷酸所觀察的問題如毒性和病毒抗性的發(fā)展，因此針對作用的不同機(jī)理可與核苷酸化合物一起施用。
總之，本發(fā)明的化合物有效降低了HBV聚合酶的活性，抑制了HBV的復(fù)制和增殖，并可用作預(yù)防和治療乙肝的療法。<試驗(yàn)2>對HBV生成細(xì)胞系中HBV增殖的抑制作用為了測定式1的化合物對HBV生成細(xì)胞系的增殖的抑制效果進(jìn)行了下列試驗(yàn)。
為測試抗病毒效果，HBV的復(fù)制和增殖在一種人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中測定。
將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105細(xì)胞/ml，并在24-孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔中加入1ml，然后放于培養(yǎng)箱中于37℃5％CO2下培養(yǎng)3-4天直到細(xì)胞充分生長，每天更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞足夠成熟時，加入測試化合物至最終濃度0.01、0.1和1μg/ml。測試化合物加入一周后，培養(yǎng)液在5000rpm離心10分鐘。將25μl上清液轉(zhuǎn)移到一個新試管中，并往每個試管中加入5μl裂解液
。試管放置37℃1小時后，加入30μl的中和溶液
作為反應(yīng)溶液用于競爭性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
采用HBV核心蛋白的基因序列作為模板進(jìn)行PCR。將1單位Taq聚合酶加入到25pmol每個引物、250μM dNTP、5μl PCR反應(yīng)液
。
由PCR聚合的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，為了評價本發(fā)明化合物對HBV增殖降低的影響采用成像分析儀(Gel Doc 1000，Bio-Rad)定量分析。
3TC(lamivudine)用作陽性對照，濃度和測試化合物相同。使用沒有測試化合物的組作為對照，計(jì)算HBV增殖降低的百分比，結(jié)果顯示在表4中。
表4對HBV增殖的抑制作用

如表4所示，本發(fā)明的非核苷酸化合物在濃度1μg/ml時對反轉(zhuǎn)錄中HBV聚合酶活性具有極好的抑制作用，HBV增殖降低超過80％，最高達(dá)97％。進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物質(zhì)所觀察的問題如毒性和早期病毒株抗性發(fā)展。既然本發(fā)明化合物作用在變構(gòu)結(jié)合穴，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性區(qū)域，因此也可預(yù)期前者與后者能平行使用。
如上所述，本發(fā)明化合物對HBV聚合酶活性具有很好的抑制效果，而聚合酶活性在HBV復(fù)制反轉(zhuǎn)錄中步驟至關(guān)重要?；谠摍C(jī)理，這些化合物能有效控制HBV增殖并可用作預(yù)防和治療乙肝的療法。<試驗(yàn)3>對反轉(zhuǎn)錄中體外HIV酶活性的抑制作用為了測定式1化合物對反轉(zhuǎn)錄中HIV酶活性降低的影響，進(jìn)行了下列體外試驗(yàn)。
將非放射性反轉(zhuǎn)錄酶分析試劑盒(Boehringer Mannheim)用于體外測定轉(zhuǎn)錄酶的活性。將20μl(40ng)HIV轉(zhuǎn)錄酶和20μl含有模板-引物雜合體、poly(A)oligo(dT)15、DIG(洋地黃毒苷)-dUTP、生物素-dUTP和TTP的反應(yīng)混合物加入到用鏈霉生物素包被的孔中。也將測試化合物加至最終濃度為0.1和1μg/ml，于37℃反應(yīng)1小時。此時，憑借HIV轉(zhuǎn)錄酶的作用，RNA生成DNA，由于洋地黃毒苷和生物素一部分附著到核苷酸上，DNA與包被在孔底部的鏈霉形成鍵。
當(dāng)反應(yīng)完成后，每個孔用250μl的清洗緩沖液(pH7.0)洗滌30秒鐘，重復(fù)5次以去除殘留雜質(zhì)。將200μl抗-DIG-POD抗體加入到每個孔中，37℃反應(yīng)1小時，并如上洗滌去除雜質(zhì)。每孔加入200μl過氧化物酶底物-ABTSTM，室溫反應(yīng)30分鐘。然后使用ELISA讀數(shù)儀于405nm處讀取每個溶液的吸光度，并用于定量測定對HIV轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制效果。使用沒有測試化合物的組作為對照，計(jì)算HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性降低的百分比，結(jié)果顯示在表5中。
表5對HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用

如表5所示，本發(fā)明化合物在濃度1μg/ml時對HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性具有很好的抑制作用，降低超過80％，最高達(dá)89％。進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物質(zhì)所觀察的問題如毒性和早期發(fā)展病毒株抗性。此外，既然本發(fā)明化合物作用在變構(gòu)結(jié)合穴，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性區(qū)域，因此本發(fā)明化合物可與核苷酸化合物一起使用。
如上所述，本發(fā)明化合物對反轉(zhuǎn)錄中HIV酶活性具有很好的抑制效果，而反轉(zhuǎn)錄是HIV復(fù)制中的一步?；谠摍C(jī)理，這些化合物能有效控制HIV增殖并可用作預(yù)防和治療AIDS的療法。<試驗(yàn)4>細(xì)胞毒性試驗(yàn)為了測定式1化合物是否表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，采用HepG2細(xì)胞和公知的MTT方法進(jìn)行體外測試，結(jié)果顯示在以下表6中。
表6對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

如上表6所顯示，試驗(yàn)中所使用化合物的IC50超過100μg/ml，因此可認(rèn)為沒有細(xì)胞毒性。<試驗(yàn)5>通過口服給藥測試大鼠中的急性毒性為了檢驗(yàn)式1的化合物對大鼠是否具有急性毒性，進(jìn)行下列試驗(yàn)。
將6周齡的SPF SD系大鼠用在測試急性毒性中。將實(shí)施例1-35的化合物懸浮在0.5％的甲基纖維素溶液中，并以4g/kg/15ml的劑量給每組6只大鼠口服一次。觀察大鼠的死亡、臨床癥狀和體重變化，進(jìn)行血液的血液學(xué)測試和生物化學(xué)測試，在尸檢過程中用肉眼檢查胸腔和腹部胃腸器官的任何異常癥狀。結(jié)果顯示測試化合物不會導(dǎo)致大鼠中任何特異的臨床癥狀、體重變化和死亡。在血液學(xué)檢驗(yàn)、血液的生化檢驗(yàn)和尸檢中都未發(fā)現(xiàn)任何變化。由于本試驗(yàn)中所用的化合物高達(dá)4g/kg水平未導(dǎo)致大鼠任何毒性變化，因此可確定大鼠的LD50值大大超過4g/kg，因此這些化合物經(jīng)評價確定為安全物質(zhì)。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明式1的新型5-嘧啶甲酰胺衍生物對HBV和HIV的增殖具有顯著的抑制效果而無副作用，可用作預(yù)防和治療乙肝和AIDS的治療劑。
此外，本發(fā)明的化合物為非核苷酸，沒有核苷酸物質(zhì)使用中所觀察的一些問題如毒性和早期發(fā)展的病毒株抗性。進(jìn)一步，由于本發(fā)明化合物似乎作用在變構(gòu)結(jié)合穴，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性區(qū)域，因此本發(fā)明化合物可與核苷酸化合物一起使用。
權(quán)利要求
1.以下列式1表示的5-嘧啶甲酰胺衍生物及其可藥用鹽式1 其中，R1是H、羥基、C1-C5直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C1-C5直鏈或支鏈烷氧基團(tuán)、C2-C6直鏈或支鏈羥基烷基團(tuán)、C2-C6二烷基氨基團(tuán)、以羥基或C2-C6烷氧羰基取代的C2-C6直鏈或支鏈烷基團(tuán)、C3-C6環(huán)烷基團(tuán)，或飽和或不飽和的含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元雜環(huán)化合物，該化合物可以是未取代或用C1-C3烷基取代；R1可含有或不含有不對稱碳原子；R2是H或C1-C4直鏈或支鏈烷基團(tuán)；或R1和R2兩者組成含有1-3個選自N、O和S雜原子的5元或6元飽和雜環(huán)，該雜環(huán)未取代或以C1-C5直鏈或支鏈烷基或以C2-C5直鏈或支鏈羥基烷基取代；R3是吲唑-5-基，或吲唑-6-基；n是介于0-4間的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制備方法，其包含下列步驟1)式6的5-嘧啶羧酸乙酯衍生物的制備是將式4的4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶羧酸乙酯與式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在堿性條件下反應(yīng)(步驟1)；2-A)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制備是將式6的化合物與式7的胺化合物反應(yīng)，或2-B)式1的5-嘧啶甲酰胺衍生物的制備首先是將式6的化合物水解成式8的5-嘧啶羧酸衍生物，然后在N，N-二甲基甲酰胺和SOCl2存在下活化成Vilsmeier中間產(chǎn)物，并使之與式7的胺化合物反應(yīng)(步驟2)，反應(yīng)方案1 其中，R1、R2、R3和n如權(quán)利要求1所限定。
3.用于乙肝的治療劑和預(yù)防劑，其中含有作為有效成分的權(quán)利要求1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可藥用鹽。
4.用于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的治療劑和預(yù)防劑，其中含有作為有效成分的權(quán)利要求1的5-嘧啶甲酰胺衍生物和其可藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型5－嘧啶甲酰胺衍生物和含有所述衍生物的藥物組合物,更具體地,本發(fā)明涉及5－嘧啶甲酰胺衍生物和其可藥用鹽、制備方法以及含有所述化合物作為活性成分的藥物組合物。特別地,本發(fā)明所述5－嘧啶甲酰胺衍生物由于對人免疫缺陷病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)的增殖具有抑制活性,能用作乙肝和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的治療劑和預(yù)防劑。
文檔編號A61K31/506GK1390203SQ00815697
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月27日
發(fā)明者尹晟俊, 李常旭, 金南斗, 樸容均, 李根炯, 金種宇, 樸相振, 樸希庭, 張桓鳳 申請人:同和藥品工業(yè)株式會社