專利名稱：：病毒核心蛋白－陽離子脂質(zhì)－核酸－遞送復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含病毒包裝蛋白的陽離子脂質(zhì)/蛋白/核酸復(fù)合物及其在向細胞，如神經(jīng)細胞有效遞送核酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由于與能夠轉(zhuǎn)染細胞的陽離子脂質(zhì)結(jié)合的合成脂質(zhì)體的產(chǎn)生使非病毒基因轉(zhuǎn)移取得了可喜的進展。但這種復(fù)合物中很少有幾個已通過檢測證明它們具有將DNA有效地轉(zhuǎn)移到CNS細胞并使轉(zhuǎn)基因得以表達的能力。安全有效地轉(zhuǎn)染神經(jīng)細胞的能力能為闡明神經(jīng)細胞的功能提供有力的工具，并可形成治療神經(jīng)性疾病的新方法。遺憾的是，對CNS的基因治療由于缺乏有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后的神經(jīng)細胞的方法而受到阻礙。許多研究是有關(guān)利用病毒載體進行基因遞送。但是許多病毒載體都存在免疫性和細胞毒性的問題，因此對于非病毒學(xué)家來說難于操作1-3。目前出現(xiàn)了非病毒載體，其可作為細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的替代方法。非病毒基因轉(zhuǎn)移取得的最可喜進展在于形成了與能夠轉(zhuǎn)染細胞的陽離子脂質(zhì)(細胞轉(zhuǎn)染劑)結(jié)合的合成脂質(zhì)體。這種脂質(zhì)體相對易于使用、應(yīng)用范圍廣泛且不存在細胞毒性4。新的陽離子脂質(zhì)體制劑仍在不斷研究之中5。但是這些復(fù)合物中很少有幾個已通過檢測證明它們具有將DNA有效地轉(zhuǎn)移到CNS6-9細胞內(nèi)。陽離子脂質(zhì)體通過靜電相互作用與帶負電的DNA反應(yīng)，接下來與細胞膜發(fā)生作用通過一種緩慢的胞吞作用穿越細胞膜6，10，11。它們通常由中性的脂質(zhì)二油酰-L-α-磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成，其對內(nèi)體緩沖和裂解非常有效8，12。由脂質(zhì)體復(fù)合物釋放的經(jīng)轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)由核周隙轉(zhuǎn)運到核并表達。到目前為止只有由N-[1-(2，3二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)和DOPE形成的脂質(zhì)體已表明可以介導(dǎo)在CNS13-16內(nèi)成功地轉(zhuǎn)染。為應(yīng)用于基因治療需要能高效轉(zhuǎn)染CNS細胞的脂質(zhì)體復(fù)合物。非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移主要受限于在產(chǎn)生脂質(zhì)體∶DNA復(fù)合物5的過程中會形成大的凝集分子。這些大的凝集物可能是通過限制復(fù)合物的胞吞作用而降低轉(zhuǎn)染的效率。一種避開這一問題的途徑是在復(fù)合物形成前通過DNA縮合減小DNA分子的體積。DNA的預(yù)縮合可形成較小的復(fù)合物并提高轉(zhuǎn)染效率17-23。已鑒定了多種多聚陽離子可以提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率。這其中，多聚-L-賴氨酸和魚精蛋白所產(chǎn)生的效果最為顯著，在多種非神經(jīng)細胞系17，21中，與未進行預(yù)縮合的復(fù)合物相比，轉(zhuǎn)染效率可以提高30倍以上。魚精蛋白硫酸鹽特別適合于加強脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染。魚精蛋白是一種天然存在于精子頭部的多聚陽離子。魚精蛋白的作用是縮合精液中的DNA并輔助其轉(zhuǎn)移到卵核。魚精蛋白上述的核靶向性特性在基因轉(zhuǎn)移方面特別引人注目。而且與合成的多聚-L-賴氨酸不同，它具有大分子量范圍(18000-19200Da)，魚精蛋白是天然存在的，更小且大小更統(tǒng)一(4000-4250Da)。這些特性意味著在靶組織中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機會較少，使得縮合更易于控制。其他天然存在的DNA縮合蛋白也已用于加強陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。Fritz等，22用整合了核定位信號(nls-H1)的重組人H1組蛋白使得脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法的效率提高了近30倍。另外，已證明非組蛋白染色質(zhì)高移動性組1，2蛋白可改善脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，其已常規(guī)用于HVJ-脂質(zhì)體方法20，24中。發(fā)明概述我們檢測了病毒-DNA相關(guān)蛋白所具有的提高基于脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)移能力。具體說來，我們分別比較了病毒編碼的合成肽Mul和腺病毒和多瘤病毒的重組Vpl蛋白。Mul可在腺病毒染色體中起縮合作用，而VPl僅是多瘤病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，表現(xiàn)DNA結(jié)合活性25-27。Vpl，包含類似于在HMG-1，2和nls-Hl26中發(fā)現(xiàn)的嵌入的典型核定位信號(NLS)，而Mul沒有。我們發(fā)現(xiàn)Mul可以在神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟衍生的細胞中顯著地促進陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，而Vpl不能。我們還發(fā)現(xiàn)Mul增強作用在已分化的細胞中更為顯著，預(yù)示著這一方法在體內(nèi)應(yīng)用于神經(jīng)細胞的可能性。這些發(fā)現(xiàn)預(yù)示可以利用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA遞送到CNS細胞。因此，本發(fā)明提供一種包含縮合的多肽/核酸復(fù)合物和陽離子脂質(zhì)的非病毒核酸遞送載體，其中，所述的復(fù)合物包含(a)所需的核酸序列(NOI)；和(b)一種或多種病毒核酸包裝多肽，或其衍生物，所述的多肽或其衍生物(i)能與NOI結(jié)合；(ii)和能夠縮合所述的NOI；且其中的NOI與所述多肽是異源的。優(yōu)選地，至少一種多肽是腺病毒核酸包裝多肽或其衍生物。更優(yōu)選所述的腺病毒是Mul，pV或pVII或其衍生物。所用的術(shù)語“與所述多肽是異源的”是指排除天然存在的病毒NOIs與所述病毒包裝多肽相結(jié)合的可能。在一個優(yōu)選的實施方案中所述的載體進一步包括一種含核定位序列(NLS)的多肽。更優(yōu)選所述的含核定位序列(NLS)的多肽是腺病毒pV或其衍生物。本發(fā)明還提供一種包含陽離子脂質(zhì)，多肽組分和核酸組分的縮合的多肽/核酸復(fù)合物，其用于向真核細胞的核遞送核酸組分，其中，(i)所述的多肽組分是病毒核酸包裝多肽或其衍生物；(ii)所述的多肽組分或其衍生物能與NOI結(jié)合；和(iii)所述的多肽組分或其衍生物能夠縮合所述的NOI；且其中所述的核酸與所述的多肽是異源的。優(yōu)選地，至少一種多肽是腺病毒核酸包裝蛋白或其衍生物。更優(yōu)選所述的腺病毒多肽是Mul，pV或pVII或其衍生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的復(fù)合物進一步包括含核定位序列(NLS)的多肽。更優(yōu)選地，所述的含核定位序列(NLS)的多肽是腺病毒pV或其衍生物。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生包含陽離子脂質(zhì)和縮合的多肽/核酸復(fù)合物的非病毒核酸遞送載體的方法，該方法包括(a)將所需核酸序列(NOI)與病毒核酸包裝多肽或其衍生物相接觸，所述的多肽組分或其衍生物(i)能與NOI結(jié)合；和(ii)能與NOI縮合；其所述的NOI與所述的多肽是異源的；和(b)將所形成的核酸/多肽復(fù)合物與陽離子脂質(zhì)相接觸。本發(fā)明還提供一種將所需的核酸序列(NOI)引入真核細胞的方法，該方法包括將所述的細胞與本發(fā)明的復(fù)合物相接觸，其中所述的復(fù)合物包含上述NOI。優(yōu)選地，所述的細胞是神經(jīng)細胞，癌細胞或上皮細胞。在一可選擇的實施方案中，病毒核酸定位/遞送多肽可以替代或添加于病毒核酸包裝多肽。事實上，一些病毒多肽兼具這兩種功能。發(fā)明詳述一般來說本發(fā)明所提及的技術(shù)是本領(lǐng)域所公知的，具體可參見Sambrook等，分子克隆實驗手冊(1989)和Ausubel等，分子生物學(xué)簡要方法(1999)第四版，JohnWiley&Sons，公司。A.多肽組分1.病毒核酸包裝多肽術(shù)語＂病毒核酸包裝多肽＂典型地包括由天然存在于病毒顆粒中的病毒基因組編碼的多肽，其功能是包裝，特別是縮合，再將核酸遞送到核中，使病毒基因組組裝到病毒顆粒中。還包括那些同源物和衍生物，如片段，這將在下面進行討論。病毒核酸包裝多肽的例子包括病毒核心蛋白，如乙肝核心抗原和腺病毒核心蛋白Mul，pV和pVII，及其在其他腺病毒如乳腺病毒(哺乳動物腺病毒)和禽腺病毒(鳥腺病毒)中的等價蛋白。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的病毒包裝蛋白是下面SEQI.D.No.1所述的Mul多肽。NH2-Met-Arg-Arg-Ala-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Ser-His-Arg-Arg-Met-Arg-Gly-Gly-OH(SEQI.D.No.1).用于本發(fā)明的病毒核酸包裝多肽能與核酸相結(jié)合，典型地是非特異的方式，優(yōu)選地可引起核酸的縮合。一般來說優(yōu)選縮合的NOI的大小等于或小于200nm，如從50到200nm，以具有向靶細胞的最佳遞送效率。所述的病毒多肽與核酸的結(jié)合能力可以在體外通過下列技術(shù)進行測定，如凝膠電泳包括凝膠阻滯分析(參見材料和方法部分和結(jié)果部分)及電泳條帶轉(zhuǎn)換遷移率分析，溴化乙錠排除分析和親和層析(例如用單或雙鏈DNA纖維素)。病毒多肽縮合核酸的能力可以由例如圓二色譜(CD)(參見例如Sato和Hosokawa，1984，生物化學(xué)雜志.951031-1039)進行確定。一般的病毒多肽，或其同系物或衍生物都包含一些在生理pH(例如pH7.4)帶正電荷的氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述病毒多肽在生理pH下的凈電荷為正。具體地說，優(yōu)選電荷氨基酸的比率至少是+0.3，優(yōu)選至少是+0.4，+0.5或+0.6。優(yōu)選所述的病毒多肽或其同系物或衍生物包含精氨酸殘基而非賴氨酸殘基或其混合物。還特別優(yōu)選所述的病毒多肽或其同系物或衍生物包含一個或多個組氨酸殘基，優(yōu)選兩個或多個組氨酸殘基。另外所述的病毒多肽或其同系物或衍生物將典型地包含一些如丙氨酸一類的高度疏水殘基，例如兩個或多個疏水殘基?？芍糜诒景l(fā)明的氨基酸序列并于局限于天然存在的病毒核酸包裝多肽，還包括任何來源的同源序列，例如相關(guān)的病毒/細菌蛋白，細胞同系物或合成肽，及變異體或衍生物，如其中的片段。在本發(fā)明中同源序列包括與病毒核心多肽例如SEQI.D.No.1.所示的Mul序列，在氨基酸水平上超過至少10個優(yōu)選至少20，30，40或50個氨基酸至少有60，70，80或90％同一性的氨基酸序列，優(yōu)選至少95或98％同一性的氨基酸序列。具體地說，同源典型地應(yīng)被認為是那些與核酸結(jié)合密切相關(guān)的序列而不是那些非必須的鄰接序列。盡管同源性也可以被認為是相似性(也就是說，具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)而在本發(fā)明中優(yōu)選地將同源性表示為序列同一性。同源性比較可以用眼，或更一般地，通過現(xiàn)有的序列比較程序進行。這些可商購的計算機程序可以計算兩或更多序列之間的％同源性。％同源性可在鄰近的序列間計算，也就是說，將一個序列與另一個序列對比，將一個序列中的一個氨基酸直接與另一個序列中的相應(yīng)氨基酸比較，一次一個殘基。這叫作“無gap”對比。一般來說，這種無gap對比在數(shù)量相對少的氨基酸殘基間進行(例如少于50個連續(xù)的氨基酸)。盡管這是一種簡單一致的方法，但其沒有考慮到例如對于其他的同一序列對，在進行整體對比時一個插入或缺失將使后面的序列不能對準，從而使同源性大大降低。因此，大多數(shù)的序列比較方法是設(shè)計為產(chǎn)生優(yōu)化對比，其考慮到可能的插入和缺失，而非從頭到尾嚴格比較同源值。這是通過在所對比的序列中插入一些“gap”力求達到最大限度的局部同源。但是這些較復(fù)雜的方法對每個在對比中出現(xiàn)的gap賦予“gap罰分”因此對于相同數(shù)量的同一氨基酸，在序列對比中盡可能引入最少的gap以反應(yīng)出兩序列之間較高的相關(guān)性，從而比引入很多gap的情況獲得更高的分值。＂Affinegapcosts＂典型地用于控制由于gap存在的一個相對高的值和對所述gap中每一個后續(xù)殘基的較小罰分。這是應(yīng)用最為普遍的gap評價系統(tǒng)。高gap罰分當然地產(chǎn)生具有較少gap的優(yōu)化對比。許多對比程序均允許修改gap罰分。但是當用此種軟件進行序列比較時優(yōu)選使用缺省值。例如當使用GCGWisconsinBestfit軟件包(見下)所述的氨基酸序列缺省gap罰分是每個gap為-12和每次延伸為-4。計算最高％同源性首先需要形成優(yōu)化的對比并考慮到gap罰分。進行此類對比的合適的計算機程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(美國威斯康星大學(xué)；Devereux等，1984，核酸研究12387)。其他可以進行序列比較的軟件包括但不限于BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999出處同上-第18章)，F(xiàn)ASTA(Atschul等，1990，分子生物學(xué)雜志403-410)和適用于脫機和聯(lián)機檢索的GENEWORKSBLAST和FASTA比較工具程序組(參見Ausubel等，1999出處同上，7-58到7-60頁)。但優(yōu)選使用GCGBestfit程序。雖然最終％同源性可以用同一性來測定，但對比的過程本身通常并不是基于全或無的配對比較。而是一般使用基于化學(xué)相似性或進化距離鄰接的相似值矩陣對每一成對比較給出分配數(shù)值。常用的這種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-BLAST程序組的缺省矩陣。GCG威斯康星程序一般使用公共缺省值或在有提供的情況下也可使用自定義比較表(詳細內(nèi)容請參見使用手冊)。優(yōu)選使用GCG軟件包的公共缺省值，如使用其他軟件則為缺省矩陣，如BLOSUM62。軟件生成了優(yōu)化的對比之后，即可計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。上述軟件通常將此作為序列比較的一部分并生成數(shù)字化的結(jié)果。本發(fā)明中所用到的術(shù)語與氨基酸序列相關(guān)的“衍生物”，包括向或從提供具有核酸結(jié)合或縮合活性的最終氨基酸序列任何取代，變異修飾，替代，缺失或添加一個(或多個)氨基酸的序列，優(yōu)選至少與未經(jīng)修飾的多肽具有相同活性。病毒多肽可以經(jīng)修飾后用于本發(fā)明。一般是仍可保持所述序列核酸結(jié)合或縮合特性的修飾。若經(jīng)修飾的核酸保持核酸結(jié)合及縮合特性則可以進行氨基酸取代，例如由1，2或3到10，20或30的取代。氨基酸的取代可以包括應(yīng)用非天然存在的類似物的使用，例如提高治療使用的多肽在血漿中的半衰期。具體地說，可以期望通過氨基酸的取代提高天然存在的病毒包裝多肽在生理pH下的凈正電荷。帶正電荷的氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。精氨酸是天然存在的氨基酸中帶正電荷最多的，因此是特別優(yōu)選的。例如可以依照上面的表進行保守取代。在第二欄同一格中的氨基酸優(yōu)選第三欄同一行中的氨基酸之間進行相互替換可以通過重組的方法獲得用于本發(fā)明的多肽，例如依照下面所描述的。但也可以通過使用本領(lǐng)域所公知的技術(shù)如固相合成技術(shù)合成。用于本發(fā)明的多肽也可以制成融合蛋白如有助于提取和純化。作為融合蛋白組件的例子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白組件和所需的蛋白序列之間包含蛋白水解切割位點以便于去除融合蛋白序列。優(yōu)選的所述融合蛋白組件并不抑制所需蛋白序列的生物活性。用于本發(fā)明的多肽可以是一種基本分離的形式?？芍龅亩嚯目膳c不影響預(yù)期目的載體或稀釋劑相混合。所述的多肽可以是一種基本純的形式，這種情況下，一般在制劑中90％以上，如95％，98％或99％的蛋白包含用于本發(fā)明的多肽。2.含核定位序列的多肽在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物進一步包括含核定位序列(NLS)的多肽。一般而言，NLSs是本領(lǐng)域所公知的(參見例如DingwallandLaskey，1991，生物化學(xué)導(dǎo)向16478-481)。但特別優(yōu)選使用腺病毒核心蛋白的NLS。所述pV的NLS包含序列RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRR(SEQI.D.No.2)相應(yīng)于氨基酸315-337(D.Matthews，提交)。另一個NLS存在于N端(KPRKLKRVKKKKK-SEQI.D.No.3)，但優(yōu)選C-端的NLS。所述的NLS可存在于與所述包裝多肽不同的多肽上也可以是同一多肽鏈的一部分，如在融合蛋白中。B.所需的核酸序列可用本發(fā)明的遞送載體或復(fù)合物遞送的所需核酸序列(NOIs)包括DNA或RNA。它們可以是單鏈的也可以是雙鏈的。它們也可以是多核苷酸并在其中包含合成的或經(jīng)修飾的核苷酸。本領(lǐng)域中公知有許多不同的核苷酸修飾類型。這包括甲基膦酸酯或硫代磷酸酯(phosphorothioate)主鏈，在所述分子的3′和/或5′端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。為達到本發(fā)明的目的，可知這里所述的多核苷酸可由本領(lǐng)域所知的任何方法所修飾。此種修飾可以是為了加強所述NOIs在體內(nèi)的活性或有效期。所述的NOI典型地包含異源基因。術(shù)語＂異源基因＂包括任何基因，該異源基因可以是任何野生型基因的等位基因變異體，或者其可以是突變基因。術(shù)語＂基因＂是指包括至少能被轉(zhuǎn)錄的核酸序列。因此編碼mRNA，tRNA和rRNA，的序列及反義構(gòu)建體均包含在這一定義的范圍內(nèi)。核酸可以是例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其類似物。編碼mRNA的序列可選擇地包括一些或全部天然可轉(zhuǎn)錄但非翻譯側(cè)翼序列，或與所翻譯的編碼序列相關(guān)的序列。其可選擇地進一步包括通常與所轉(zhuǎn)錄的序列相關(guān)的轉(zhuǎn)錄控制序列，例如，轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄終止信號，多聚腺苷酸位點和下游的增強元件。所述的由異源基因轉(zhuǎn)錄的序列優(yōu)選可操作地與允許所述異源基因在哺乳動物細胞，優(yōu)選神經(jīng)細胞細胞，如中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細胞，癌癥細胞或上皮細胞中表達的控制序列相連接。術(shù)語“可操作地連接”是并列著且其中所述的組分處于允許其以預(yù)期的方式形式功能的關(guān)系?？刂菩蛄信c編碼序列“可選擇地連接”是通過下述方式連接，即在與控制序列相適合的條件下使編碼序列得以表達。所述的控制序列包含使異源基因得以表達的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號。所述的啟動子選自可在哺乳動物優(yōu)選人細胞中行使功能的啟動子。所述的啟動子可以是從真核基因序列啟動子衍生的。例如它可以是異源基因在其中表達的細胞的基因組所衍生的，上述細胞優(yōu)選哺乳動物中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細胞。關(guān)于真核啟動子，它們可以是以普遍存在的方式行使功能(如β-肌動蛋白，微管蛋白)，或者可任選地以組織特異性的方式(如丙酮酸鹽激酶基因的啟動子)。它們也可以是對特定的刺激作出反應(yīng)的啟動子，例如與類固醇激素受體相結(jié)合的啟動子。也可以用病毒的啟動子，例如Moloney鼠白血病病毒長末端重復(fù)(MMLVLTR)啟動子或皰疹病毒基因啟動子。所述的啟動子是誘導(dǎo)型的有助于在所述細胞存活期限內(nèi)調(diào)節(jié)異源基因表達?？烧T導(dǎo)的是指所獲得的表達水平用啟動子可以進行調(diào)節(jié)。另外這些啟動子中的任何一個均可通過添加進一步的調(diào)節(jié)序列，例如增強子序列進行修飾。也可以使用包含上述的兩種或多種不同的啟動子的序列元件的嵌合啟動子。而且使用位點控制區(qū)域(LCRs)也是可取的。所述的異源基因典型的是編碼治療用途的多肽。依照本發(fā)明合適的NOI序列包括那些應(yīng)用于治療和/或診斷的序列，例如但并不限于編碼細胞因子，趨化因子，激素，抗體，工程化的免疫球蛋白樣分子，單鏈抗體，融合蛋白，酶，免疫輔刺激分子，免疫調(diào)節(jié)分子反義RNA，靶蛋白的反式控制負突變，毒素，條件毒素，抗原，腫瘤抑制蛋白和生長因子，膜蛋白，血管作用蛋白和肽，抗病毒蛋白和核酶的序列及其衍生物(如與報告基團相連接)。治療用途多肽的例子包括神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子(NGF)，纖毛狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BNTF)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(如NT-3，NT-4/5)，其是潛在的治療性試劑以治療神經(jīng)性疾病如怕金森氏癥。用于本發(fā)明以治療或預(yù)防癌癥的包括編碼下述蛋白的適合的NOIs破壞靶細胞(例如核糖體毒素)，作為腫瘤抑制劑(例如野生型p53)；抗腫瘤免疫機制的激活劑(例如細胞因子，輔助刺激分子和免疫球蛋白)；血管生成抑制劑；或加強藥物敏感性(例如前-藥物激活酶)；通過天然效應(yīng)細胞間接刺激靶細胞的破壞(例如刺激免疫系統(tǒng)的強抗原或轉(zhuǎn)化前體物質(zhì)破壞靶細胞的毒素(如前藥物激活酶)的蛋白。所編碼的蛋白還可以破壞旁觀腫瘤細胞(例如由分泌的抗腫瘤抗體-核糖體毒素融合蛋白)，間接刺激旁觀腫瘤細胞的破壞(如細胞因子刺激免疫系統(tǒng)或引起局部血管閉和的促凝血蛋白)或轉(zhuǎn)化前體物質(zhì)為毒素以破壞旁觀腫瘤細胞(如將前藥物活化為可擴散藥物的酶)。也可以使用編碼反義轉(zhuǎn)錄物或核酶的NOI(s)，其干擾細胞或病原體基因表達，如有關(guān)腫瘤持續(xù)性的細胞基因的表達(例如抗Burkittslymphom中異常的myc轉(zhuǎn)錄物或抗慢性髓細胞樣白血病中的bcr-abl轉(zhuǎn)錄物)。也可以結(jié)合使用上述NOIs。替代或等同于在靶細胞中選擇性的表達，NOI或NOIs可以編碼前體藥物活化酶或某種酶，其在該個體沒有經(jīng)一種或多種該酶所針對的前藥治療之前沒有顯著的效果或有害的效果。在活化的NOI存在下，用合適的前體藥物對個體進行治療導(dǎo)致對腫瘤的生長和存活形成增強的還原作用。前體藥物活化的酶可遞送到腫瘤位點以治療癌癥。每次，合適的用于治療病人的前體藥物總是與適當?shù)那绑w藥物激活酶結(jié)合使用。合適的前體藥物與所述的載體結(jié)合施用。前藥的例子包括依托泊苷磷酸酯(與堿性磷酸酶)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨基酶)；阿霉素-N-p-羥苯氧基乙酰胺(與青霉素-V-酰胺酶)；對-N-雙(2氯乙基)氨基苯甲?；劝彼猁}(與羧肽酶G2)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸酯(與丙氨酸酯酶)；SR4233(與P450還原酶)；更昔洛韋(與HSV胸腺激酶)；芥菜前藥與硝基還原酶和環(huán)磷酰胺(與P450)。用于本發(fā)明的合適的前藥激活酶的例子包括胸腺嘧啶磷酸化酶其活化5-氟-尿嘧啶前藥capcetabine和去氧氟尿苷；來單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核甙激酶其活化更昔洛韋；細胞色素P450其活化前體藥物例如環(huán)磷酰胺成為DNA破壞試劑環(huán)磷酰胺；和胞嘧啶脫氨基酶其活化5-氟胞嘧啶。優(yōu)選使用人源的酶。NOIs也可以編碼抗原性多肽以用作疫苗。優(yōu)選的，這種抗原性多肽是由病原生物，如細菌或病毒衍生的。這種病原性多肽的例子包括丙型肝炎病毒抗原，乙型肝炎表面或核心抗原，HIV抗原，百日咳毒素，霍亂毒素或白喉毒素。NOIs還可以包括標記基因(例如編碼β-半乳糖苷酶或綠熒光蛋白的基因)或其產(chǎn)物可調(diào)節(jié)其他基因表達的基因(如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)。當疾病是由受損基因所引起，則可以施用編碼上述基因全部功能性等位基因的NOIs，如對于膽囊纖維化。已鑒定了多種遺傳性疾病的分子基礎(chǔ)并克隆了野生型的功能性序列?？梢灶A(yù)期將NOI側(cè)翼序列包括在與基因組中相應(yīng)側(cè)翼序列同源的治療性基因中，即可通過同源重組替換缺損的基因?；蛑委熀推渌委熜詰?yīng)用可能需要施用多種基因。多種基因的表達可能有利于治療不同的疾病。由于對整合到遞送載體或本發(fā)明的復(fù)合物中的NOI的大小沒有限制，在可以對靶細胞同時施用多種基因。C.陽離子脂質(zhì)本領(lǐng)域中已知有多種陽離子脂質(zhì)-參見例如W095/02698，其所公開的內(nèi)容引入此處作為參考，其中一些復(fù)制如下。用于本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)的實例的結(jié)構(gòu)列于W095/02698的表1中。一般來說，任何陽離子脂質(zhì)，單價的或多價的均可用于本發(fā)明的組合物和方法中。一般優(yōu)選多價陽離子脂質(zhì)。陽離子脂質(zhì)包括飽和的和不飽和的烷基和脂環(huán)烴醚和胺酯，酰胺或其衍生物。陽離子脂質(zhì)的直鏈和支鏈烷基和烯烴基可以包括1到約25個碳原子。優(yōu)選的直鏈或支鏈烷基或烯烴基包括6個或更多的碳原子脂環(huán)烴基可以包括約6到30個碳原子。優(yōu)選的脂環(huán)烴基包括膽固醇和其他類固醇基團。陽離子脂質(zhì)可由多種抗衡離子(陽離子)包括但不限于氯化物，溴化物，碘化物，氟化物，醋酸鹽，三氟乙酸鹽，硫酸鹽，亞硝酸鹽，和硝酸鹽一起制備。已知的陽離子脂質(zhì)是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)。DOTMA和其類似物二酯DOTAP(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基銨)丙烷)是可商購的。結(jié)構(gòu)上與DOTMA相關(guān)的其它陽離子脂質(zhì)如美國專利4,897,355中所述，該文獻在此引入作為參考。另一組與DOTMA和DOTAP相關(guān)的陽離子脂質(zhì)基團一般稱為DORI-醚或DORI-酯。DORI脂質(zhì)與DOTMA和DOTAP的不同之處在于其三甲基銨中的一個甲基被羥乙基取代。DORI脂質(zhì)的油酰基可由其他的烷基或烯烴基，例如棕櫚?；仓；?。DORI-型脂質(zhì)的羥基可用作進一步功能化的位點，例如胺的酯化作用，如羧基精胺。其他可用于本發(fā)明的遞送載體或復(fù)合物的陽離子脂質(zhì)包括如W091/15501所述的用于轉(zhuǎn)染細胞的脂質(zhì)。陽離子固醇衍生物，象3β-[N-(N′，N′-二甲基乙胺)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)，其中膽固醇與三烷基銨基相連，也可用于本發(fā)明。據(jù)報道對于有些細胞系，DC-Chol比含DOTMA的脂質(zhì)體具有更有效的轉(zhuǎn)染效率和更低的毒性。DC-Chol多元胺變異體，例如那些在W097/45442中所描述的也可以使用。含羧基精胺的多聚陽離子脂質(zhì)也可應(yīng)用于本發(fā)明的遞送載體或復(fù)合物。EP-A-304111描述的含羧基精胺的陽離子脂質(zhì)包括5-羧基鯨蠟基甘氨酸雙十八烷基酰胺(DOGS)和二棕櫚?；字Ｒ掖及?-羧基鯨蠟基甘氨酸(DPPES)。用其他的烷基或烯烴基分別替換DOGS和DPPES的十八烷基和棕櫚酰基可以獲得其他的陽離子脂質(zhì)。在本發(fā)明的遞送載體或復(fù)合物中，陽離子脂質(zhì)可任選地與非-陽離子輔助-脂質(zhì)，優(yōu)選中性脂質(zhì)相結(jié)合形成聚合物?？捎糜诒景l(fā)明的中性脂質(zhì)包括但不限于卵磷脂；磷脂酰乙醇胺，例如DOPE(二油?；字Ｒ掖及?，POPE(棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺)和DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)；磷脂酰膽堿；磷脂酰膽堿，例如DOPC(二油酰基磷脂酰膽堿)，DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)POPC(棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿)和DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)；磷脂酰甘油；磷脂酰甘油，例如DOPG(二油酰基磷脂酰甘油)，DPPG(二棕櫚酰磷脂酰甘油)，和DSPG(二硬脂酰磷脂酰甘油)；磷脂酰絲氨酸，例如二油?；?或二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸；二磷脂酰甘油；脂肪酸酯；甘油酯；鞘質(zhì)；卡多耳脂(cardolipin)；腦苷脂；和酰基鞘氨醇；和其混合物。中性的脂質(zhì)還包括膽固醇和其他3DOH-固醇。而且，在本發(fā)明的遞送載體和復(fù)合物中可任選地整合入一個或多個兩親性的化合物以修飾其表面特性。可用于本發(fā)明的兩親性的化合物包括但不限于，新生糖脂例如GLU4和GLU7，如圖22所示，聚乙二醇脂質(zhì)例如N-(共甲氧基(聚氧乙烯基)氧羰基)-磷脂酰乙醇胺，N-單甲氧基(聚氧乙烯基)琥珀酰基磷脂?；掖及泛途垩跻蚁┗戠薮蓟?；非離子去污劑例如烷基苷，烷基甲基葡糖酰胺，蔗糖酯，烷基聚甘油醚，烷基聚氧乙烯基醚和烷基脫水山梨醇氧乙烯基醚和甾族氧乙烯基醚；嵌段共聚物例如聚氧乙烯基聚氧丙烯基嵌段共聚物。一方面，本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)經(jīng)糖或聚乙二醇(PEG)修飾。另一方面本發(fā)明的復(fù)合物進一步包括能作為陽離子脂質(zhì)的化合物，所述化合物包含通過氨基與糖部分或聚乙二醇部分相連的膽固醇。如實施例中所述，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種經(jīng)糖/PEG修飾的陽離子脂質(zhì)特別有效。因此在本發(fā)明的再一方面提供能夠作為陽離子脂質(zhì)的化合物，所述化合物包含膽固醇其通過氨基與糖元件或聚乙二醇元件相連。上述化合物優(yōu)選包含1到7個糖元件或聚乙二醇元件。所述化合物可以包含糖元件和聚乙二醇元件的混合物。優(yōu)選的糖元件是葡萄糖或由葡萄糖演變而來。D.陽離子脂質(zhì)/NOI/包裝多肽復(fù)合物本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物典型地是通過下述方法產(chǎn)生的，首先將包裝多肽和NOI在無菌的試管中于室溫下相互作用10分鐘，產(chǎn)生縮合的多肽/NOI復(fù)合物。通常的技術(shù)是將所述核酸和其旁邊的蛋白進行準確定位，然后添加幾百微升的液體載體，例如制藥上可接受的載體，賦形劑或稀釋劑開始混合。此外且優(yōu)選的制備本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物的方法是通過在連續(xù)渦流過程中使包裝多肽和NOI相互作用。典型地，NOI與多肽的比率至少1∶1，優(yōu)選從1∶1到2∶1，更優(yōu)選從1.4∶1到1.9∶1，更優(yōu)選從1.5∶1到1.8∶1。我們發(fā)現(xiàn)NOI與多肽的比率近似于1∶0.6(～1.7∶1)時特別有效。在一些方面，典型的使用多肽與NOI的比率為從0.2到1.5，優(yōu)選從0.3到1.2(w/w)，更優(yōu)選從0.5到0.7。在其他的實施方式中典型的多肽與NOI的比率至少10∶1，或至少20∶1(w/w)。但是，理想的比率有賴于所述包裝多肽的電荷氨基酸比率。一般來說所用的電荷氨基酸比率約低所用的多肽NOI比率越高。接下來將陽離子脂質(zhì)添加到復(fù)合物中。在一個實施方式中陽離子脂質(zhì)是預(yù)形成的包含兩個或更多個脂質(zhì)成分例如DC-Chol和DOPE的脂質(zhì)體的一部分。所述的陽離子脂質(zhì)典型地與多肽/NOI復(fù)合物于室溫下溫育20分鐘。添加所述的陽離子脂質(zhì)的進一步且優(yōu)選的方法是以陽離子脂質(zhì)體懸浮液的形式添加。最終的復(fù)合物添加10％蔗糖(w/v)儲存在-80℃?zhèn)溆谩Ｖ|(zhì)體比NOI的量典型地是大約從3∶1到20∶1，優(yōu)選從6∶1到15∶1，更優(yōu)選從8∶1到14∶1。我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體與NOI的比率為12∶1時特別有效。在其他實施方式中脂質(zhì)體比NOI的量典型地是大約從2∶1到10∶1，或從3∶1到6∶1。當陽離子脂質(zhì)與中性的脂質(zhì)一起使用時，所述的比率約為1∶1。在特別優(yōu)選的實施方式中所述的比率脂質(zhì)體∶NOI∶多肽是3-20∶1∶0.5-1優(yōu)選8-14∶1∶0.5-0.7更優(yōu)選～12∶1∶～0.6所述的遞送載體/復(fù)合物現(xiàn)在可以使用了。盡管按上述方式將各種組分混合起來是優(yōu)選的，但以任意的順序混合各組分均是可行的。當進一步添加多肽組分時可以在任意階段添加，但優(yōu)選的是與包裝多肽一起添加。可以在所述的載體/復(fù)合物內(nèi)添加其他的組分，例如與細胞表面受體相結(jié)合的配體，使載體/復(fù)合物對細胞類型具有一定程度的選擇性。配體包括肽，糖蛋白，寡糖，凝集素和抗體及其片段。E.施用本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物優(yōu)選與制藥上可接受的載體或稀釋劑相結(jié)合以制備藥物組合物(用于人或動物)。合適的載體和稀釋劑包括等滲的鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的組合物可以直接注射的方式施用。本發(fā)明的組合物可制成以非腸道的，肌內(nèi)的，靜脈內(nèi)的，皮下的，眼內(nèi)的或經(jīng)皮施用或吸入的形式施用。典型地，每次施用劑量中NOI的的量為從10ng到10μg/kg體重，優(yōu)選從0.1到10μg/kg，更優(yōu)選從0.1到1μg/kg體重。另外，進行轉(zhuǎn)染的病人細胞可以來自體內(nèi)，通過去除病人的組織，用本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物轉(zhuǎn)染，然后再把轉(zhuǎn)染后的組織再植入。上述施用程序和劑量只是作為一種指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以依照特定的病人和特定的情況確定優(yōu)化的施用劑量和途徑。F.應(yīng)用本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物可與NOIs一起用于有效地轉(zhuǎn)染真核生物細胞，特別是哺乳動物細胞。對于轉(zhuǎn)染神經(jīng)細胞，與現(xiàn)有技術(shù)中的組合物相比本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物表現(xiàn)出特別的效果。這意味著其對于(i)使用神經(jīng)細胞進行的研究和(ii)需要將NOIs引入人或哺乳動物的中樞或外周神經(jīng)細胞的臨床應(yīng)用具有特別的價值。更一般地說，本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物可以在多種NOI遞送中應(yīng)用，例如，基因治療，DNA疫苗的遞送和體外轉(zhuǎn)染研究。用本發(fā)明的復(fù)合物/載體進行治療所針對的疾病的例子包括外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病例如神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)組織損傷導(dǎo)致的損傷/外傷(包括中風(fēng))。具體說來，神經(jīng)變性疾病包括運動神經(jīng)元疾病，幾種遺傳性疾病，例如家族性自主神經(jīng)機能異常，嬰兒脊髓肌肉萎縮和后期發(fā)病的神經(jīng)變性疾病，如怕金森氏癥。本發(fā)明的遞送載體/復(fù)合物還可以用于向患有惡性腫瘤的病人施用治療性基因?？勺鳛橹委煱械膼盒阅[瘤包括乳腺，子宮，結(jié)腸，直腸，子宮內(nèi)膜，腎，肺，卵巢，胰腺，前列腺，皮膚，胃，膀胱，CNS，食道，頭或頸，肝臟，睪丸，胸腺或甲狀腺處的癌。血細胞，骨髓細胞，B-淋巴細胞，T-淋巴細胞，淋巴祖細胞或骨髓祖細胞均可作為治療的靶。所述的腫瘤可以是實體瘤也可以是非實體瘤，可以是初級腫瘤或已傳播的轉(zhuǎn)移(次級)瘤。非實體瘤包括骨髓瘤；白血病(急性或慢性，淋巴細胞或髓細胞的)例如急性成髓細胞的，急性早幼粒細胞性，急性的，髓單細胞的，急性單核細胞的，紅白血??；和淋巴瘤例如Hodgkin′s，非Hodgkin′s和Burkitt′s。實體瘤包括癌，結(jié)腸癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，腺癌，黑素瘤，基底或鱗狀細胞癌，間皮瘤，腺癌，成神經(jīng)細胞瘤，膠質(zhì)瘤，星形細胞瘤，成神經(jīng)管細胞瘤，成視網(wǎng)膜細胞瘤，肉瘤，骨肉瘤，橫紋肌肉瘤，纖維肉瘤，成骨肉瘤，肝癌和精原細胞瘤。其他感興趣的疾病包括由突變，遺傳或體細胞或正常的細胞基因所引起的疾病，例如膽囊纖維化，地中海貧血等等。其他相關(guān)領(lǐng)域包括治療免疫相關(guān)的疾病如器官移植注射和自身免疫疾病。自身免疫疾病的范圍從器官特異性疾病(如甲狀腺炎，胰島炎，多發(fā)性硬化，虹膜睫狀體炎，眼色素層炎，睪丸炎，肝炎，Addison′s病，重癥肌無力)到系統(tǒng)性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他風(fēng)濕性疾病或紅斑狼瘡。其他疾病包括免疫高反應(yīng)性，例如過敏反應(yīng)，特別是與組胺的產(chǎn)生相關(guān)的反應(yīng)，和哮喘。本發(fā)明通過下述實施例進行說明，這些實施例僅作為對本發(fā)明的介紹而不是對其進行限制。圖1是平板；圖2是圖表；圖3是平板；圖4是圖表；圖5是圖表；圖6是圖表；圖7是圖表；圖8是圖表；圖9是結(jié)構(gòu)圖；圖10是圖表；圖11是圖表；圖12是圖表；圖13是圖表；圖14是圖表；圖15是圖表；圖16是平板；圖17是圖表；圖18是圖表；圖19是結(jié)構(gòu)圖；圖20是反應(yīng)路線；圖21是反應(yīng)路線；圖22是結(jié)構(gòu)圖；圖23是分子團(miscellarincorporation)整合原理；圖24是圖表；和圖25是圖表。圖1到6的詳細說明圖1-腺病毒核心蛋白Mul比多瘤病毒核心蛋白Vpl能更有效地與質(zhì)粒DNA相結(jié)合。A)BSA不影響pDNA的電泳遷移率。1mg的pCMVβ與0μg(泳道2)，5μg(泳道3)，10μg(泳道4)，15μg(泳道5)，20μg(泳道6)，25μg(泳道7)和30μg(泳道8)的BSA在室溫下于1XHBS中一起溫育10分鐘。然后在1％瓊脂糖凝膠上分析樣品的經(jīng)改變的遷移率。沒有觀察到任何由于BSA而使遷移率發(fā)生的改變。B)與BSA相反，Mul肽強烈地影響pDNA的電泳遷移率。pCMVβ(1，μg)與0.25μg(泳道2)，0.5μg(泳道3)，1μg(泳道4)，2μg(泳道4)，4μg(泳道6)，6μg(泳道7)和0μg(泳道8)如A中所示的重組的Mul肽一起溫育。當?shù)鞍着cpDNA的比率為0.25(w/w)(泳道2)時，不影響松弛型的pCMVβ(上部的帶)的遷移率，而超螺旋的pDNA(下部的帶)的遷移稍稍滯后。當所述比率為0.5(w/w)或更高時，兩種形式的pDNA的遷移均顯著延遲了。C).多瘤病毒蛋白Vpl不能十分有效地阻滯pDNA的遷移。pCMVβ(1μg)與2μg(泳道2)，4μg(泳道3)，6μg(泳道4)，8μg(泳道5)，16μg(泳道6)，32μg(泳道7)和0μg(泳道8)Vpl一起溫育。在比率為6或更高時(蛋白pDNA，w/w)能夠顯著阻滯超螺旋的pDNA(泳道6，下部的帶)的遷移。直到所用比率達32(w/w)時，才開始對松弛型pDNA(泳道7，上部的帶)產(chǎn)生影響。在所有的凝膠中是1KbDNA分子量對照(BRL)圖2-用pDNA-Mul-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染的ND7細胞中的β-半乳糖苷酶活性ND7細胞在轉(zhuǎn)染前24小時以5×104細胞/孔的密度接種到培養(yǎng)皿中。在將要轉(zhuǎn)染前用無血清的培養(yǎng)基洗細胞。在添加陽離子脂質(zhì)體DC-Chol/DOPE前通過將pCMVβ與Mul一起溫育形成復(fù)合物。每種情況下，1μgPCWP與0.6，6，12，和21μgMul肽絡(luò)合。每一結(jié)合體再與3，4和6μgDC-Chol/DOPE一起絡(luò)合。將ND7細胞暴露于轉(zhuǎn)染復(fù)合物2小時，然后在收獲前再在37℃，5％CO2的條件下再保溫24小時，然后進行分析β-半乳糖苷酶活性。數(shù)字代表平均±SD，n＝3。圖3在神經(jīng)細胞系ND7中3-Mul加強陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率。ND7細胞以4×104細胞/孔的密度置于孔培養(yǎng)板中，使其生長24小時。用單獨的pCMVb(A)，與DC-Chol/DOPE相絡(luò)合的pCMVb(1/3，w/w)(B)或與Mul和DC-Chol/DOPE相絡(luò)合的pCMVb(1/12/6)(C)轉(zhuǎn)染未分化的ND7細胞。48小時后將所述細胞固定并進行X-Gal組織化學(xué)檢測。由板C可見包含優(yōu)化比率Mul的復(fù)合物顯著增加了X-Gal陽性細胞(藍色)的數(shù)量。圖4-Mul比Vpl能更有效地加強在ND7細胞中陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。pCMVβ質(zhì)粒DNA與多種不同量的聚陽離子肽相絡(luò)合，再以1∶3的比率與陽離子脂質(zhì)體相混合(pCMVβ脂質(zhì)體；w/w)。用無血清的培養(yǎng)基沖洗后，將ND7細胞暴露于脂質(zhì)體-聚陽離子-脂質(zhì)體絡(luò)合2小時，然后轉(zhuǎn)到含血清的培養(yǎng)基中。24小時后收獲細胞并進行β-半乳糖苷酶分析。每種條件分三份進行每一實驗重復(fù)三次。數(shù)字代表平均±SD。圖5-Mul加強DC-Chol/DOPE在COS-7細胞中的轉(zhuǎn)染。COS細胞在轉(zhuǎn)染前24小時以60-80％的密度鋪滿24孔細胞培養(yǎng)板。在將要轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基洗細胞。在添加陽離子脂質(zhì)體DC-Chol/DOPE前通過將pCMVβ與Mul一起溫育形成具有細胞轉(zhuǎn)染能力的復(fù)合物。每種情況下，1μgpCWVβ與12μgMul肽絡(luò)合，這對于ND7細胞是理想的。所述的pCMVβMul復(fù)合物再與3，4和6μgDC-Chol/DOPE一起混合。將COS細胞暴露于轉(zhuǎn)染復(fù)合物2小時，然后在收獲前再在37℃，5％CO2的條件下再保溫24小時，然后進行分析β-半乳糖苷酶活性。數(shù)字代表平均±SD，n＝3。圖6-pCMVβ-Mul陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物在分化的ND7細胞中轉(zhuǎn)染效率。ND7細胞以4×104細胞每孔的密度置于24孔細胞培養(yǎng)板的正常生長培養(yǎng)基(+血清)中。24小時后換為分化培養(yǎng)基繼續(xù)生長24小時。使用三種不同的分化培養(yǎng)基；無血清(-血清)，正常生長培養(yǎng)基加1mMcAMP(cAMP)，或還原血清(0.5％)加1mMcAMP和50ng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)。所述細胞用與單獨的DC-Chol/DOP或Mul加DC-Chol/DOPE絡(luò)合的pCMVβ轉(zhuǎn)染。48小時后將細胞固定進行X-Gal組織化學(xué)分析確定陽性的細胞的數(shù)量。在所有的情況下Mul的存在均提高了陽性細胞的數(shù)量。有趣的是，對在cAMP中生長的細胞在Mul存在和不存在時，被轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)量都增加了。實施例材料和方法肽的合成肽Vpl和Mul在ShimadzuPSSM-8固相肽合成儀上用多于5倍的(9-芴基)甲酯基(Fmoc)-保護的L-氨基酸(Novabiochem)和FastMoc試劑2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四-甲基尿鎓六氟代磷酸鹽/羥苯并三唑(HBTU/HOBt)(AdvancedChemtechEurope)作為酰胺偶聯(lián)試劑。在樹脂裂解和脫保護之后，用0.1％TFA水溶液作為洗脫液以0.5-0.75ml/min的流速，用附著于FPLC系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotechUK)的P2Biogel(2×28cm；Biorad)柱進行凝膠過濾脫鹽。最終制備的反向純化是用附著于GilsonHPLC系統(tǒng)(Anachem)的Vydac柱(C18，5μm，2×25cm；Hichrom)進行的。肽以5ml/min的速度由0.1％TFA水溶液中的線性梯度乙腈進行洗脫，并在220-230nm下對洗脫進行監(jiān)控。所述的是用預(yù)上樣的L-Pro-2-氯代三苯甲基超級酸不穩(wěn)定樹脂(100mg，1.05mmol/g，0.1mmol)制備的。延長的偶聯(lián)時間是用于整合從第六個氨基酸殘基(Lsy)直到N末端的殘基。用在二甲基甲酰胺中的哌啶(20％，v/v)進行自動Fmoc脫保護之后，將所述的樹脂分離用二甲基甲酰胺和甲醇(15ml)洗，然后真空干燥。用冰冷卻的含苯酚(7％，w/v)，乙二硫醇(ethanedithiol)(2％，v/v)，苯硫基甲烷(4％，v/v)和水(4％，v/v)TFA(已知為MixtureA)(8ml)將粗肽從樹脂上切割下來，然后用冰冷卻的甲基叔丁基醚(MTBE)(30ml)沉淀。接下來將所得的小球脫鹽，再用反向HPLC純化上述多肽混合物。洗脫后將含有所需多肽(用68.5％的氰化甲烷洗脫)的部分合并，將所述肽冷凍干燥成為白色的粉末?？偣搏@得32mg(15μmol，15％)；MS(MALDITOF)C85H151N26O26S3[M+H]+calcd2049.5，發(fā)現(xiàn)2050.2。通過氨基酸和組分和序列分析確證所得的序列。通過HPLC分析同質(zhì)性＞95％。Mul肽用Gly-Wang樹脂(Novabiochem)(40mg，0.67mmol/g，0.03mmol)制備。始終用常規(guī)的偶聯(lián)時間。自動N末端Fmoc脫保護后將所述的樹脂分離用二氯甲烷(20ml)和甲醇(20ml)洗，然后真空干燥。然后如上所述用MixtureA(8ml)將粗肽從樹脂上切割下來，再用MTBE(30ml)沉淀。接下來將所得的粗肽混合物脫鹽，再用反向HPLC純化。洗脫后將含有所需多肽(用17.2％的氰化甲烷洗脫)的部分合并，將所述肽冷凍干燥成為白色的粉末?？偣搏@得65mg(26μmol，80％)；MS(MALDITOF)C95H170N52O21S2[M+H]+calcd2440.7，發(fā)現(xiàn)2440.6。通過HPLC分析同質(zhì)性＞95％。DNA結(jié)合分析所述的經(jīng)純化的肽在無菌雙蒸水中重建為3mg/mL。肽和pDNA在20μLHEPES鹽緩沖液中(137mMNaCl，5mMKCl，0.75mMNa2HPO4，19mMHEPES，pH7.4)于室溫下絡(luò)合20分鐘。接下來，對肽pDNA復(fù)合物進行凝膠電泳分析(1％)。普通大分子pDNA相互作用對照培養(yǎng)是用不同量的分子生物等級純化的小牛血清白蛋白(Sigma)進行的。細胞培養(yǎng)ND7s是成神經(jīng)細胞瘤(N18Tg2)和新生大鼠傳感細胞28的融合體衍生的已充分表征的細胞系。該細胞系在正常的生長培養(yǎng)基(NGM)(Leibovitz′sL-15培養(yǎng)基(BRL)用10％胎牛血清(BRL)，4g/L葡萄糖，4g/L重碳酸鈉(BRL)，100IU/mL青霉素/鏈霉素(BRL)加富)在37℃和5％CO2中保持。所述的細胞以能在24小時后鋪滿70％的密度置于24孔板(Costar)上。ND7細胞的分化通過前述的三種方法2829進行。ND7細胞以4×104細胞每孔的密度接種到24孔培養(yǎng)板(Nunc)。24小時后將所述培養(yǎng)基用下述培養(yǎng)基更換a)添加有1mM3′5′-環(huán)腺苷單磷酸(cAMP；Sigma)的NGM，或b)無血清的分化培養(yǎng)基(50％HamsF12，50％DMEM，5μg/mLTransrerrin，250ng/mL胰島素，0.3μM亞硒酸鈉)，或c)低血清神經(jīng)生長因子(NGF)培養(yǎng)基(L-15添加有2mM谷氨酰胺，4g/L葡萄糖，4g/L重碳酸鈉，10u/mL青霉素，10g/mL鏈霉素，0.5％FCS，1mMcAMP，50ng/mLNGF(AlomoneLabs))。分化的ND7細胞在轉(zhuǎn)染前于合適的培養(yǎng)基中于37℃5％CO2條件下生長24小時。COS-7細胞(源于綠猴腎)在添加有10％胎牛血清(BRL)和100IU/mL青霉素/鏈霉素(BRL)的RPMI1640培養(yǎng)基(BRL)中生長。質(zhì)粒構(gòu)建所有的轉(zhuǎn)染均使用含在人巨細胞病毒介導(dǎo)的早期啟動子/增強子(Clontech)下游的大腸桿菌β-半乳糖苷酶的全長報告質(zhì)粒pCMVβ(Clontech，PaloAlto，CA)進行。儲存的質(zhì)粒DNA用標準的分子克隆技術(shù)制備并用Qiagen內(nèi)毒素?zé)o質(zhì)粒純化系統(tǒng)(Qiagen，Dorking，UK)進行純化。脂質(zhì)體DC-Chol/DOPE脂質(zhì)體的制備30，31如上所述。簡要地說，6μmol的DC-Chol和4μmol的DOPE(以10mg/mL在CHCl3中添加)在氮氣中添加到新蒸餾的CH2Cl2(5mL)。5mL20mMHepes(pH7.8)添加到混合物中聲處理3分鐘。所述的有機溶劑在減小的壓力下去除所得的脂質(zhì)體懸液進一步進行聲處理3分鐘。脂質(zhì)體制劑在4℃下保存。轉(zhuǎn)染方法由于初步的實驗確定了胎牛血清抑制ND7細胞的轉(zhuǎn)染，因此在整個轉(zhuǎn)染過程中均利用無血清的分化培養(yǎng)基進行。不同量的DNA和脂質(zhì)體置于7mL無菌的Bijou容器底部(BibbySterilinLtd.，Staffordshire，U.K.)，但彼此不相互接觸。DNA和脂質(zhì)體通過添加400μL無血清的分化培養(yǎng)基并輕輕晃動而結(jié)合。所述的DNA脂質(zhì)體混合物在應(yīng)用于細胞前，于室溫下溫育20到30分鐘。所述的DNA/脂質(zhì)體混合物施用于細胞，在37℃下5％CO2中溫育2小時，然后用完全培養(yǎng)基替換這一培養(yǎng)基。24到48小時后將所述細胞固定如上所述31進行組織化學(xué)分析，或收獲細胞進行β-半乳糖苷酶分析(PromegaCorp.)。在×40放大條件下用NikonDiaphot倒置顯微鏡進行細胞記數(shù)。每次轉(zhuǎn)染至少重復(fù)三次，每孔至少進行三次獨立地記數(shù)。包括所試驗的肽的轉(zhuǎn)染復(fù)合物由下述方式產(chǎn)生。多種量的肽置于無菌的聚苯乙烯容器底部但不與1μgpCMVβ相接觸，通過添加400μl無血清NGM培養(yǎng)基相互混合。所述的復(fù)合物于室溫下溫育10分鐘，然后添加DC-Chol/DOPE。該pDNA/肽/脂質(zhì)體復(fù)合物進一步于室溫下溫育20分鐘然后如上所述施用于細胞。實施例1-DNA結(jié)合分析Mul是包含19個氨基酸且與腺病毒核心復(fù)合物相關(guān)的(表1)27，32聚陽離子肽。我們通過在凝膠阻滯分析中與質(zhì)粒DNA的相互作用比較了Mul與小鼠多瘤病毒主要的外殼蛋白Vpl的DNA結(jié)合能力。Vpl是具有19個氨基酸的肽其包含核定位信號26，但帶正電荷的氨基酸比Mul少。由此可以推測其具有較低的DNA結(jié)合能力。表1Mul和VPl蛋白序列多肽序列MW電荷比率/AAMulNH2-Met-Arg-Arg-Ala-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-24400.63Ser-His-Arg-Arg-Met-Arg-Gly-Gly-OHVPlNH2-Met-Ala-Pro-Lvs-Arg-Lvs-Ser-Glv-Val-Ser-Lys-20490.26Cys-Glu-Thr-Lys-Cys-Thr-Pro-Pro-OH在VPl中帶有下劃線的是NLS序列。不同量的經(jīng)純化的肽于室溫下在HBS中溫育約10分鐘然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。不添加肽，超螺旋的和松弛型環(huán)狀質(zhì)粒DNA(pDNA)以預(yù)期的方式進行遷移(圖1，泳道8)。從DNA∶Mul肽的比率為1∶0.25(w/w)開始，質(zhì)粒DNA的遷移受到阻滯(圖1)。質(zhì)粒DNA的遷移在1∶0.25的比率時稍稍受到影響，而在1∶0.5(w/w)比率時質(zhì)粒DNA的遷移嚴重減慢。在2∶1以上的比率下pDNA不能遷移到瓊脂糖凝膠中，溴化乙錠嵌入質(zhì)粒的能力減弱了。相比之下，對于Vpl，直到pDNA∶蛋白比率為1∶8(w/w)時都沒有檢測到質(zhì)粒DNA的電泳遷移率受到影響(圖1)。向1μg質(zhì)粒DNA中添加8μgVpl使超螺旋的pDNA帶加寬。但直到pDNA∶蛋白比率達到1∶32(w/w)前沒有觀察到其對松弛型的pDNA產(chǎn)生任何影響在這一比率下，超螺旋和松弛型的pDNA帶均顯著地受到阻滯，可以發(fā)現(xiàn)一些DNA留在孔中。當pDNA與BSA一起溫育時直到pDNA∶蛋白比率高達1∶30(w/w)也沒有檢測到其對電泳遷移率的影響(圖1)。實施例2-在未分化的ND7s中的轉(zhuǎn)染我們用β-半乳糖苷酶報告基因分析檢測了Mul和Vpl加強陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染神經(jīng)細胞系的能力。與多種不同量的肽和DC-Chol/DOPE絡(luò)合的pCMVβ感染ND7細胞。我們已經(jīng)在上述內(nèi)容中表明陽離子脂質(zhì)體DC-Chol/DOPE能夠有效地轉(zhuǎn)染神經(jīng)細胞衍生的ND7細胞系31。在這一研究中我們發(fā)現(xiàn)用1μg質(zhì)粒DNA與3μgDC-Chol/DOPE31絡(luò)合可在這一神經(jīng)細胞衍生的細胞系中獲得最佳的效率(＞40％)。暫時性的，在轉(zhuǎn)染后48-60小時轉(zhuǎn)基因的表達水平最高。因此為了盡可能檢測到轉(zhuǎn)染的改善，我們的分析都是在轉(zhuǎn)染的12-20小時內(nèi)當報告基因的表達量較低時進行的。預(yù)先我們發(fā)現(xiàn)pDNA∶脂質(zhì)體比率為1∶3(w/w)時最適于ND7細胞中的轉(zhuǎn)染31。由此，我們比較了在轉(zhuǎn)染比率為1∶3，1∶4和1∶6的pDNADC-Chol/DOPE中不同肽量對轉(zhuǎn)染的作用。凝膠阻滯分析實驗表明比率約為1∶0.5(w/w)的pDNA∶Mul已基本上足夠結(jié)合所有的質(zhì)粒DNA(圖1)。但最初應(yīng)用這一比率和脂質(zhì)體的實驗并不對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響(數(shù)據(jù)未顯示)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)染復(fù)合物的體積比用于凝膠阻滯分析的(400μLvs.20μL)大的多。因此，我們檢測的Mul的數(shù)量較大而其在用于凝膠阻滯分析的溶液中的濃度較低。我們比較了0.6，6，12和21μgMul肽對DC-Chol/DOPE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染所產(chǎn)生的作用。我們發(fā)現(xiàn)Mul可將陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率提高4倍以上。當使用pCMVβ/Mul/(DC-Chol/DOPE)的比率為1/12/6時轉(zhuǎn)染效率提高的最為顯著。與單獨施用DNA相比，這一組合使轉(zhuǎn)染效率提高了11倍(圖2)。所述的β-半乳糖苷酶報告基因分析提供了檢測所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的總體水平的方法，但沒有提供任何有關(guān)被轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量的信息。鑒于此我們對轉(zhuǎn)染的ND7細胞進行了記數(shù)。所述細胞以4×104的密度接種到24孔培養(yǎng)板上。24小時后用無血清培養(yǎng)基將細胞沖洗然后用與DCChol/DOPE和Mul肽絡(luò)合的pCMVβ轉(zhuǎn)染細胞。該比率是在所述的報告基因分析中所得的理想比率pCMVβ∶Mul∶DC-Chol/DOPE為1∶12∶6。使用這一比率我們發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量提高了6倍(圖3&6)。使用任何濃度的Mul復(fù)合物均未觀察到明顯的細胞損失。類似的在用于β-半乳糖苷酶報告基因分析的溶胞產(chǎn)物中的蛋白濃度也沒有隨非感染細胞產(chǎn)生明顯的變化(數(shù)據(jù)未給出)。相比之下，用Vpl沒有發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)染效率提高(圖4)。也沒有發(fā)現(xiàn)僅用Mul與pCMVβ絡(luò)合比裸DNA提高轉(zhuǎn)染效率。為了證明是否在其他細胞類型中轉(zhuǎn)染效率也可以提高我們對COS-7細胞進行了類似的分析。Mul也可以在COS-7細胞中提高脂質(zhì)體-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染效率(圖5)。與在ND7細胞中理想的pDNA∶Mul∶脂質(zhì)體比率類似的比率對COS-7細胞也是最佳的。與單獨的陽離子脂質(zhì)體相比也有類似的程度的提高。實施例3-在分化的ND7s細胞中的轉(zhuǎn)染我們還檢測了Mul在分化的ND7s細胞中提高陽離子脂質(zhì)體-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的能力.所述的ND7細胞系是由大鼠初級的后根神經(jīng)節(jié)細胞和小鼠成神經(jīng)細胞瘤N18Tg228融合衍生的。ND7細胞可以多種方式分化包括提取血清，施用cAMP或暴露于添加有cAMP和神經(jīng)生長因子的還原血清。ND7s的分化導(dǎo)致與其親本的傷害性感覺神經(jīng)原相關(guān)的細胞特性的表達包括細胞分裂的減少和軸突開始分枝。ND7細胞接種于24孔培養(yǎng)板，24小時后分化。分化開始后15到20小時進行如上所述的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后15到20小時將細胞固定進行X-gal組織化學(xué)分析。與上述的觀察結(jié)果一致，三個分化組間的轉(zhuǎn)染效率有很大的不同。由血清回收分化的ND7細胞轉(zhuǎn)染水平最低(1.3％)，cAMP組的轉(zhuǎn)染水平最高(8％)，血清/cAMP/NGF組居中(4.7％)(圖5)。在上述三種情況下包含Mul多肽的轉(zhuǎn)染復(fù)合物可提高分化的ND7細胞的轉(zhuǎn)染。單由cAMP或暴露于血清/cAMP/NGF進行分化的ND7s的轉(zhuǎn)染效率可提高6倍以上(圖5)。轉(zhuǎn)染效率提高最為顯著的是由回收血清進行分化的一組，可以觀察到其轉(zhuǎn)染效率提高了10以上。Mul肽和DNA的復(fù)合物如實施例1中(DNA結(jié)合分析)凝膠電泳所示所示在Mul∶DNA高于0.5∶1.0(w/w)時，質(zhì)粒DNA的遷移受到嚴重的阻滯，極少有DNA從孔中遷移出來這說明Mul肽與DNA發(fā)生強烈的相互作用并使核酸中和并縮合成為小顆粒以適合于基因遞送。在圖7所示的Mul∶DNA比率范圍基礎(chǔ)上測定Mul∶DNA(MD)顆粒大小。MD顆粒通過混合制備。簡要地說，在去離子水中的適當小份Mul肽加入到20mMHepes緩沖液中質(zhì)粒DNA(pCMVβ)中(終濃度為220μg/ml)，pH7.0。充分混合后，每份混合物在20℃下溫育10分鐘。溫育后立即用Hepes緩沖液稀釋每份混合物(最終的DNA濃度為24μg/ml)以易于用光子相關(guān)的光譜學(xué)(N4plus，Coulter)進行顆粒大小的分析。所有的測定均在20℃下進行并在呈90°時采集數(shù)據(jù)。Unimordal分析用于計算平均顆粒大小和標準分布(S.D.)。有趣的是，盡管在所檢測的全部范圍內(nèi)Mul結(jié)合DNA并形成復(fù)合物，顆粒大小相應(yīng)于Mul∶DNA比率變化很大。Mul∶DNA比率在0.3到1.2(范圍L)和5以上(范圍H)形成穩(wěn)定的小毫微顆粒。中間的比率形成大的聚集體且復(fù)合物顆粒的大小在溫育過程中不斷增長可達2μm以上(圖7)。實施例4-在范圍L內(nèi)LMD的制備我們確定了是否具有低MD∶DNA比率的脂質(zhì)體-Mul-DNA復(fù)合物能形成穩(wěn)定的毫微-顆粒和是否所得的復(fù)合物具有良好的轉(zhuǎn)染活性。脂質(zhì)體的制備；DC-Chol(301lmol)和DOPE(20slmol)在二氯甲烷中結(jié)合。所述的有機溶劑在不斷減小的壓力下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除，并將所得的殘渣真空干燥3小時。此后通過渦旋混合向脂質(zhì)膜中添加4mMHepes緩沖液，pH7.0(3ml)。稍進行聲處理后(23min)，所得的陽離子脂質(zhì)體懸液由擠壓裝置(LipexBiomembranes)擠壓，通過兩疊聚碳酸鹽濾器(0.2mMillipore)3次，再通過兩疊聚碳酸鹽濾器(0.1μmMillipore)10次，以形成小脂質(zhì)體(通過PCS測定平均直徑為109nm)(依制劑的不同約8-10mg/ml)。制備脂質(zhì)體∶Mul∶DNA(LMD)復(fù)合物；Mul肽(0.12mg于去離子水中，肽濃度3.5mg/ml)在連續(xù)的渦流下添加到于4mMHepes緩沖液中的質(zhì)粒DNA溶液中(pCFl-CAT)(0.2mg，質(zhì)粒濃度典型地為1.0mg/ml)。然后引入陽離子脂質(zhì)體懸液(總脂質(zhì)2.4mg，4μmol)形成小顆粒，通過PCS測定分布較窄(168nm±58nm)。這一LMD(最終DNA濃度0.14mg/ml)添加10％蔗糖(w/v)于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩＝?jīng)過一個月沒有觀察到顆粒大小偏差。以脂質(zhì)體∶DNA比率3∶1(w/w)即轉(zhuǎn)染ND7細胞的理想組合物制備脂質(zhì)體DNA(LD)復(fù)合物(脂叢(lipoplexes))作為對照實驗。在ND7細胞中的轉(zhuǎn)染；ND7細胞以約4×104細胞每孔的密度接種到24孔培養(yǎng)板的正常生長培養(yǎng)基(NGM)(添加有10％血清)中24小時后將細胞暴露于NGM(無血清)中沖洗，然后在所示的時間過程中用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理，用NGM(無血清)預(yù)先稀釋(所有的情況下最終DNA濃度3.2μg/ml)。再次洗細胞并在收獲前再溫育48小時。14C-CAM作為底物(Promega)通過氯霉素轉(zhuǎn)移酶(CAT)分析確定轉(zhuǎn)染水平。轉(zhuǎn)染活性是由酶轉(zhuǎn)化14C-CAM的百分數(shù)(％)表達的。我們發(fā)現(xiàn)與LD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染相比用LMD使報告基因表達量高出很多。實際上，與LD-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染相比CAT酶的活性在LMD轉(zhuǎn)染10分鐘后提高了16倍以上，在轉(zhuǎn)染60分鐘后提高了6倍(圖8)。用LMD即使轉(zhuǎn)染時間只有10分鐘也可以觀察到顯著的轉(zhuǎn)染。這一結(jié)果表明LMD顆粒可以相當迅速的進入細胞。實施例5-陽離子脂質(zhì)(cytofectin)變異體我們確定了是否可以通過整合聚陽離子膽固醇脂質(zhì)(WO97/45442)改善LMD復(fù)合物。用CDAN(B198)，ACHx(CJE52)和CTAP(B232)(圖9)替代DC-Chol制造陽離子脂質(zhì)體。所使用的每種陽離子脂質(zhì)體系統(tǒng)均包含60mol％的陽離子脂質(zhì)和40mol％的DOPE，依實施例4中所述進行制備。制備了下述不同的LMD復(fù)合物系統(tǒng)并進行了比較LMD(DC-Chol)，LMD(B198)，LMD(CJE52)，和LMD(B232)。所有的LMD系統(tǒng)均用陽離子脂質(zhì)體(總脂質(zhì)20μmol)和0.6mgMul肽每1.0mgDNA(pCMVβ)，如上所述進行制備。顆粒的直徑在200nm以下。以脂質(zhì)體∶DNA比率3∶1(w/w)即轉(zhuǎn)染ND7細胞的理想組合物制備脂質(zhì)體∶DNA(LD)復(fù)雜混合物(脂叢(lipoplexes))作為對照實驗。在ND7細胞中的轉(zhuǎn)染；ND7細胞以約4×104細胞每孔的密度接種到24孔培養(yǎng)板的正常生長培養(yǎng)基(NGM)(添加有10％血清)中24小時后將細胞暴露于NGM(無血清)中沖洗，然后在所示的時間過程中用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理1小時，用NGM(無血清)預(yù)先稀釋(所有的情況下最終DNA濃度2.51μg/ml)。再次洗細胞并在用X-gal染色進行組織化學(xué)分析前再溫育48小時。用倒置顯微鏡對染成藍色的細胞進行記數(shù)。在所有的情況下用LMD制劑均比相應(yīng)的用相同的聚陽離子膽固醇脂質(zhì)制備的LD系統(tǒng)效果更好(圖10)。轉(zhuǎn)染效率的等級順序為LMD(B98)＞LMD(DC-Chol)＞LMD(CJE52)LMD(B232)，用相應(yīng)的LD系統(tǒng)時有相同的等級順序B198＞DC-Chol＞B232。實施例6-在范圍L中Mul肽的量我們檢測了Mul∶DNA比率(在圖7范圍L中)對轉(zhuǎn)染活性的影響。按實施例4中所描述的方式制備包含陽離子脂質(zhì)B198和DOPE(3∶2m/m)的陽離子脂質(zhì)體。制備了一系列與陽離子脂質(zhì)體絡(luò)合的MD復(fù)雜混合物(Mul∶DNA比率在0.3到1.2之間變化)。所得的LMD系統(tǒng)包含脂質(zhì)體∶Mul∶DNA(pCMVβ)比率分別為12∶0.3∶1，12∶0.6∶0.6，12∶0.9∶1和12∶1.2∶1w/w/w。所測定的LMD顆粒體積約150nm。用Panc-1細胞(人胰腺癌細胞系)評估體外轉(zhuǎn)染活性。所述細胞以約5×104每孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的RPMI中在存在5％CO2的條件下于37℃生長24小時。所述細胞暴露于RPMI中沖洗然后在預(yù)先用RPMI(所有情況下最終DNA濃度為5.0μg/ml)稀釋后，用LMD復(fù)合物溶液處理30分鐘。再次洗細胞并在收獲前于添加有10％FCSRPMI中再溫育48小時，用標準試劑盒(Promega)分析β-半乳糖苷酶活性。如所圖11示轉(zhuǎn)染Panc-1細胞的最佳脂質(zhì)體∶Mul∶DNA比率為12∶0.6∶0.6。此外，用這些低比率的MulLMD復(fù)合物可獲得很好的轉(zhuǎn)染結(jié)果。實施例7-脂質(zhì)的量和組分為研究不同的陽離子脂質(zhì)與DOPE的比率及總脂質(zhì)與Mul和DNA的比率，我們用B198作為優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)制備了一系列的LMD系統(tǒng)。制備陽離子脂質(zhì)體包含60mol％的B198和40mol％的DOPE(3∶2m/m)；50mol％的B198和50mol％的DOPE(1∶1m/m)和33mol％的B198和67mol％的DOPE(1∶2m/m)按實施例4的方法依照圖12所示的比率與標準的復(fù)雜混合物(Mul∶DNA0.6∶1w/w)結(jié)合。以3∶1的脂質(zhì)體DNA比率(w/w)制備脂質(zhì)體∶DNA(LD)復(fù)雜混合物脂叢(lipoplexes)作為對照實驗。在所有的LMD系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)當當?shù)土康年栯x子脂質(zhì)體與MD復(fù)合物絡(luò)合后平均大小變大。但是包含多于12μmol脂/mgDNA的LMD顆粒的大小仍保持在200nm以下，含12到6μmol脂質(zhì)/mgDNA的大小在此之上。有時在制備包含6μmol脂質(zhì)s/mgDNA的LMD系統(tǒng)時可以觀察到可見的凝集。用Panc-1細胞確定了轉(zhuǎn)染活性(圖12)。所述細胞以約5×104每孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的DMEM中在存在5％CO2的條件下于37℃生長24小時。所述細胞暴露于DMEM中沖洗然后在預(yù)先用DMEM(所有情況下最終DNA濃度為5.0μg/ml)稀釋后，用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理2小時。再次洗細胞并在收獲前于添加有10％FCSDMEM中再溫育48小時，用標準試劑盒(Promega)分析β-半乳糖苷酶活性。所檢測的三種陽離子不同脂質(zhì)與DOPE形成的制劑的最大轉(zhuǎn)染效率沒有明顯的差異。由B198∶DOPE(1∶2m/m)制備的LMD系統(tǒng)在脂質(zhì)體∶DNA比率約為12.5μmol脂質(zhì)/mgDNA時可大最高程度的轉(zhuǎn)染。由B198∶DOPE(3∶2m/m)和B198∶DOPE(2∶2m/m)陽離子脂質(zhì)體制備的LMD系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染活性在脂質(zhì)體∶DNA比率高于12.5μmol脂質(zhì)/mgDNA時可以達到穩(wěn)定水平。所有分析的LMD系統(tǒng)在低脂質(zhì)體∶DNA比率是都趨于表現(xiàn)出低的轉(zhuǎn)染活性(圖12)?？芍c為各LMD系統(tǒng)用大量Mul肽制備的制劑相比，含有低量Mul肽LMD制劑需要大量的陽離子脂質(zhì)體以表現(xiàn)完全的轉(zhuǎn)染活性。實施例8-Mul肽與魚精蛋白的比較魚精蛋白是在魚精子中含量豐富的天然存在的陽離子肽，能有效地中和并縮合DNA。將魚精蛋白的轉(zhuǎn)染活性與Mul肽相比。Mul肽或魚精蛋白硫酸鹽(Sigma，來自鮭魚X級)與DNA(pCMVβ)絡(luò)合形成陽離子脂質(zhì)體(B198∶DOPE的比率為3∶2m/m)脂質(zhì)體∶肽∶DNA的比率為12∶0.6∶1(w/w/w)。在Swiss3T3細胞中檢測了轉(zhuǎn)染活性。所述細胞以約2×104每孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的DMEM中在存在5％CO2的條件下于37℃生長48小時至鋪滿。所述細胞暴露于DMEM中沖洗然后在預(yù)先用DMEM(所有情況下最終DNA濃度為5.0μg/ml)稀釋后，用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理1或2小時。再次洗細胞并在收獲前于添加有10％FCSDMEM中再溫育48小時，用標準試劑盒(Promega)分析β-半乳糖苷酶活性。如圖13所示含Mul肽的復(fù)合物比含魚精蛋白的復(fù)合物能更有效地轉(zhuǎn)染所鋪滿的細胞。實施例9-可任選的陽離子肽為檢測多種可任選的陽離子肽轉(zhuǎn)染活性制備了一系列的脂質(zhì)體∶陽離子肽∶DNA復(fù)合物并在體外分析了其轉(zhuǎn)染能力所用的肽是聚-賴氨酸鹽酸鹽(平均分子量為3970，Sigma)，聚精氨酸鹽酸鹽(平均分子量11800，Sigma)由蛋白V，pV衍生的肽(p5，序列如下所述)，一種肽，其為Mul類似物(V,序列如下所述)和Mul肽本身。所述的p5肽和V肽是用與制備Mul肽相同的固相肽合成法制備的。每種肽按實施例4中所述的脂質(zhì)體∶肽∶DNA比率12∶0.6∶1(w/w/w)與陽離子脂質(zhì)體(DC-Chol∶DOPE3∶2m/m)和DNA(pCMVβ)結(jié)合。所述的轉(zhuǎn)染活性用HeLa細胞(人上皮細胞)檢測。所述細胞以約5×104每孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的DMEM中在存在5％CO2的條件下于37℃生長24小時。所述細胞暴露于DMEM中沖洗然后在預(yù)先用OPTIMEM(Gibco)(所有情況下最終DNA濃度為1.0μg/ml)稀釋后，用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理30分鐘。再次洗細胞并在收獲前于添加有10％FCSDMEM中再溫育48小時，用標準試劑盒(化學(xué)發(fā)光，Roche)分析β-半乳糖苷酶活性。如圖14所示，由腺病毒衍生的陽離子肽(Mul和p5)和Mul類似物(V)顯示出比轉(zhuǎn)染由合成的陽離子多肽，聚賴氨酸和聚精氨酸制備的復(fù)合物更出色的轉(zhuǎn)染活性。p5，V和Mul肽的氨基酸序列p5RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRRVVRRVHHRRRRVSHRRVRGGMulMRRAHHRRRRASHRRMRGG實施例10-利用Panc-1與Transfst進行比較以實施例4中所描述的方法制備LMD和LD，但不用pCMVβ。Transfast(Promega)DNA復(fù)合物依制造商的說明進行制備。用Panc-1細胞在體外評估轉(zhuǎn)染活性。所述細胞以約5×104每孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的RPMI中在存在5％CO2的條件下于37℃生長24小時。所述細胞暴露于RPMI中沖洗然后在預(yù)先用RPMI(Gibco)(所有情況下最終DNA濃度為5.0μg/ml)稀釋后，用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理30分鐘。再次洗細胞并在收獲前于添加有10％FCSRPMI中再溫育48小時，用標準試劑盒(Promega)分析β-半乳糖苷酶活性。用TransfastDNA復(fù)合物在無血清培養(yǎng)基(最優(yōu)條件)中進行轉(zhuǎn)染1小時。如圖15所示LMD表現(xiàn)出比TransfastDNA復(fù)合物和LD更優(yōu)的轉(zhuǎn)染活性。這些結(jié)果與用ND-7細胞進行實驗的結(jié)果完全一致。實施例11-利用人支氣管細胞與Lipofectamine進行比較利用HBE細胞(人支氣管上皮細胞)比較LMD復(fù)合物和與DNA絡(luò)合的Lipofectamine(Gibco)的轉(zhuǎn)染活性。所述細胞接種于12孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的DEME中在存在5％CO2的條件下于37℃生長24小時。所述細胞暴露于DEME中沖洗然后在預(yù)先用OPTIMEM(Gibco)(所有情況下最終DNA濃度為5.0μg/ml)稀釋后，用含LMD(如實施例4中所述進行制備)或LD(由脂轉(zhuǎn)染胺∶DNA12∶1w/w制備)復(fù)合物的溶液以所示時間(參見圖16)進行處理。再次洗細胞并在用X-gal進行組織化學(xué)分析之前于添加有10％FCSDEME中再溫育48小時。LMD表現(xiàn)出比脂轉(zhuǎn)染胺更優(yōu)的轉(zhuǎn)染活性(圖16)，且能更快地被HBS細胞攝入。這些結(jié)果與用ND-7細胞進行實驗的結(jié)果完全一致。實施例12-用大鼠腦比較LT1；來自體內(nèi)的實驗我們用報告DNA(pCMVβ)以模仿體內(nèi)模型對來自大鼠腦的器官型培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染活性進行了評估。腦切片保持在透明的多孔膜上可觀察到其在很大程度上保持了內(nèi)在的連通性和細胞結(jié)構(gòu)。LMD和LD依實施例4所示進行制備。LTl是由PanVeraCo.制造的多元胺轉(zhuǎn)染試劑。含陽離子脂質(zhì)體(DC-Chol∶DOPE，3∶2m/m)，LT-1和pCMVβ質(zhì)粒的復(fù)合物以3∶3.2∶1(w/w/w)的比率進行制備。腦切片用含LMD，LD或脂質(zhì)體∶LTl∶DNA的溶液處理2小時(Murray等，基因治療1999，6，190-197)。所有的情況中的實驗過程中均未發(fā)現(xiàn)在切片中有形態(tài)的變化。在轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48小時的溫育，收獲細胞進行X-gal染色并對切片上的藍色細胞進行記數(shù)(圖17)。在DNA劑量為5.0μg(2ml培養(yǎng)物)時，LMD與LD或LTl復(fù)合物相比，在X-gal染色后給出顯然多的藍色染色細胞。在劑量低至129ng時，LMD表現(xiàn)出相當?shù)霓D(zhuǎn)染活性，比LD(與DNA絡(luò)合DC-Chol∶DOPE，3∶1w/w比率)(DNA劑量5.0μg)的活性更高。我們發(fā)現(xiàn)與由LD和脂質(zhì)體∶LTl∶DNA復(fù)合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染相比，與LMD一起報告DNA的表達量要高得多。實際上LMD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的效率比LD高出19倍以上，比脂質(zhì)體∶LTl∶DNA高出4倍以上。實施例13-與GL-67陽離子脂質(zhì)體s相比；在小鼠肺部的體內(nèi)實驗我們評估了LMD(依實施例4所述用DC-Chol∶DOPE陽離子脂質(zhì)體[3∶2，m/m]和pCF1-CAT質(zhì)粒制備)在小鼠肺部的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，將其與和pCF1-CAT質(zhì)粒絡(luò)合的陽離子脂質(zhì)體GL67∶DOPE∶DMPE-PEG5000(1∶2∶0.05m/m/m)(LD)(脂質(zhì)體∶DNA比率為5.4∶1w/w)，其在肺部臨床實驗中作用顯著，的轉(zhuǎn)染效率相比較。(Alton等，柳葉刀，1999，353，947-954)。LMD(最終DNA濃度0.14mg/ml；100μ1體積；DNA劑量14μg)滴注到Balb/c小鼠的肺部。GL-67∶DOPE∶DMPE-PEG5000(1∶2∶0.05m/m/m)與pCF1-CAT質(zhì)粒絡(luò)合(最終DNA濃度0.8mg/ml；100μl體積；DNA劑量80μg，這一LD復(fù)合物也類似地滴注到Balb/c小鼠的肺部。48小時后將上述肺臟勻化并分析CAT活性。誤差棒顯示s.e.m。結(jié)果(圖18)表明LMD和含LD系統(tǒng)的GL-67給出基本相同的體內(nèi)轉(zhuǎn)染水平，但LMD系統(tǒng)遞送的DNA劑量低了5倍。實施例14-糖修飾的LMD系統(tǒng)為在體內(nèi)應(yīng)用需模仿LMD與生物環(huán)境非特異的相互作用。例如在靜脈內(nèi)施用過程中與血液組分(鹽，蛋白...)和非靶細胞之間非所需的相互作用是重要的障礙。這一外源顆粒與血漿蛋白之間的通過先天的免疫系統(tǒng)去除外源顆粒的自然過程的最初步驟之一。為減少蛋白結(jié)合和鹽誘導(dǎo)的凝集，可將LMD與天然存在的聚糖相偶聯(lián)。這一對LMD的碳水化合物修飾也可應(yīng)用于LMD對碳水化合物受體的靶定。為獲得所需的效果，我們設(shè)計了如圖19所示的新生糖脂質(zhì)。那些化合物建立在三種不同結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上。ACHx(CJE52)這一脂質(zhì)(參見圖9)是作為所需的新生糖脂質(zhì)的遺傳脂質(zhì)平臺篩選出來的。所述的膽固醇脂肪環(huán)系統(tǒng)代表非常疏水的區(qū)域，其插入到LMD或LD顆粒的脂質(zhì)外殼內(nèi)作為新生糖脂質(zhì)錨。碳水化合物部分所述低聚糖的選擇受限包括碳水化合物修飾的任何化學(xué)過程的復(fù)雜性。我們確定用長鏈且可商購的麥芽四糖(maltotetraose)和麥芽七糖(maltohepataose)來檢驗上述原則。接頭經(jīng)證明化學(xué)選擇連接是有效且易行的，這使我們合成了大量的新生糖脂質(zhì)。這一化學(xué)選擇技術(shù)是基于CJE52轉(zhuǎn)變?yōu)榱u胺脂質(zhì)，其可直接與非保護的碳水化合物相偶聯(lián)。典型的羥胺-CJE52的合成如圖20路線1所示的碳水化合物部分偶聯(lián)到接頭上是基于O-取代羥胺的糖基化(與葡萄糖反應(yīng)的原理如圖21中路線2所示)，依據(jù)這些策略將麥芽四糖和麥芽七糖相偶聯(lián)以獲得GLU4和GLU7化合物(結(jié)構(gòu)如圖22所示)。所述的LMD糖修飾是基于新生糖脂質(zhì)微團天然存在的分離和游離脂質(zhì)整合到LMD膜中的能力。首先按照實施例4所述的由DC-CholDOPE陽離子脂質(zhì)體，Mul肽和pCMVβ質(zhì)粒形成LMD。此后，Hepes緩沖液pH7.0中的新生糖脂質(zhì)微團懸液，添加到LMD混合物中，在將上述混合物貯存于-80℃之前先在20℃下溫育30分鐘(圖23)。LMD新生糖脂質(zhì)的穩(wěn)定通過向LMD中摻入7.5mol％的GLU4或GLU7檢測經(jīng)新生糖脂質(zhì)修飾的LMD的穩(wěn)定性效果。已知所述的LD系統(tǒng)的脂質(zhì)層暴露于鹽會發(fā)生凝集。因此在于OPTIMEM中37℃處理30分鐘后可由PhotonCorrelationSpectroscopy(N4plus，Coulter)以估計LD(最終DNA濃度1μg/ml)顆粒的大小。單峰分析用于估計顆粒的平均大小。給出了LD顆粒大小的增長百分率(圖24)。針對系統(tǒng)LMD(GLU4)和LMD(GLU7)(最終DNA濃度5μg/ml)應(yīng)用相同的過程。結(jié)果表明在溶液中LMD比LD更為穩(wěn)定，而且表明GLU4和GLU7的存在對處于7.5mol％的LMD顆粒具有加強的抗凝集穩(wěn)定性效果。體外轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染效率是通過下述方式確定的，將Hela細胞以5×104每孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中添加有10％FCS的DMEM中在存在5％CO2的條件下于37℃生長到約70％鋪滿。所述細胞在PBS中洗一下，然后在預(yù)先用含所示百分比的FCS的DMEM(所有情況下最終DNA濃度為5.0μg/ml)稀釋后，用含LMD或LD復(fù)合物的溶液處理30分鐘。再次洗細胞并在正常培養(yǎng)基(NGM)中再溫育48小時，用標準試劑盒(化學(xué)發(fā)光，Roche)分析β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染效率的加強是由于在0％和50％血清條件下糖的修飾(圖25)。討論我們在前述已經(jīng)表明DC-Chol/DOPE脂質(zhì)體對于轉(zhuǎn)染神經(jīng)細胞衍生的ND7細胞系是有效的31。DC-Chol已成功地用于CNS外的多種組織并且對的基因治療進行了臨床實驗33，34。而且，已表明DC-Chol脂質(zhì)體并不表現(xiàn)細胞毒性副作用35，36。鑒于這些原因我們希望發(fā)展改進的這些脂質(zhì)體的試劑以應(yīng)用于神經(jīng)細胞。我們在本申請中所描述的將病毒編碼的蛋白用于細胞轉(zhuǎn)染。我們發(fā)現(xiàn)當Mul與陽離子脂質(zhì)體DC-Chol/DOPE結(jié)合能顯著地提高細胞轉(zhuǎn)染。這一效果很可能是由于Mul縮合pDNA的能力，而且可以通過改變多肽，pDNA和陽離子脂質(zhì)體的比率進行優(yōu)化。值得注意的是，轉(zhuǎn)染效率的加強更多的是針對分化的細胞。如上所述，ND7細胞是由原代DRGs衍生的。分化中的ND7細胞誘導(dǎo)與其親代外周神經(jīng)原類似的表型，包括軸突分枝的誘導(dǎo)，整體增殖能力的減弱和轉(zhuǎn)染能力的減弱。分化的ND7s轉(zhuǎn)染效率的提高可以反映出在原代神經(jīng)原或體內(nèi)促進轉(zhuǎn)染能力的增強。非病毒基因遞送載體作為病毒載體系統(tǒng)的活性替代物的成功依賴于具有高且長期轉(zhuǎn)染效率的復(fù)合物的發(fā)展。由于起先作為將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞中的載體，對發(fā)展更好的陽離子脂質(zhì)體制劑具有很大的推動作用5，7。對于改進陽離子脂質(zhì)體大部分的工作是基于對分子本身進行修飾。已研究出具有改進的轉(zhuǎn)染效率的新的制劑。但是對陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同的細胞類型的行為是不一樣的。例如我們發(fā)現(xiàn)對于加強陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染多肽Mul優(yōu)于Vpl。這可能是由于Mul′s電荷比率較高。兩種肽的分子量相似，而Mul的總體電荷比率是Vpl的兩倍多(表1)。與此一致，Mul在小于1/60th的濃度下仍能夠阻滯質(zhì)粒DNA的電泳遷移率，這表明Mul能夠多么緊密地與DNA相結(jié)合。但當0.25μgMul與1μgpCMVβ相絡(luò)合所檢測到的DNA遷移率改變很小，添加了0.5μgMul后所有的質(zhì)粒均停留在點樣孔附近(圖1)。Mul與pCMVβ的比率0.5/1.0(w/w)相當于1000/1的摩爾比。每一Mul分子包含12個具有潛在的承載正電荷的殘基。Mul與pCMVβ的理論電荷比為1.6(12000Mul陽離子比7500pCMVβ陰離子)，這一比率可以完全中和上的負電荷，并如所觀察到的完全阻滯其遷移率。由于制備方法不同不能對顯著阻滯DNA遷移的Mul的量與優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率的Mul的量進行直接比較。大量的制備肽-pDNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物(參見材料和方法)。盡管阻滯瓊脂糖凝膠中遷移率的Mul是達到優(yōu)化的加強轉(zhuǎn)染效率的Mul(12μg/1μgpCMVβ)24倍，溶液中的濃度是類似的(25ng/mL，pDNA阻滯；30ng/mL，優(yōu)化的轉(zhuǎn)染)。Mul的存在還改變了陽離子脂質(zhì)體pDNA相互作用。在Mul存在下DCChol/DOPE與PCMVβ間優(yōu)化的比率是6/1，兩倍于先前在神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)化比率31，38。理論上所使用的Mul的量應(yīng)該能完全中和pCMVβ上的正電荷，這可以阻止與DC-Chol/DOPE進一步絡(luò)合。顯然由于轉(zhuǎn)染效率獲得了大大提高說明情況并非如此?？赡苁遣⒎撬械膸щ姲被嵩谖覀兊木彌_條件下均質(zhì)子化。為什么需要更多的陽離子脂質(zhì)體以提高轉(zhuǎn)染效率并不清楚，我們現(xiàn)在的工作正著力解決這一問題。最后需要指出的一點是Vpl所包含的核酸定位信號。我們實驗室最近的研究(未發(fā)表的結(jié)果)和他人的研究結(jié)果10，11，39，40顯示所轉(zhuǎn)染的物質(zhì)的核轉(zhuǎn)運可能是無效的。因此，采用已知含具有核定位能力的肽序列的陽離子預(yù)縮合DNA的方式以提高核對轉(zhuǎn)染DNA的吸收17，20，22。然而我們發(fā)現(xiàn)對于提高轉(zhuǎn)染效率Mul對DNA更有效的縮合特性比Vpl的核定位能力要有價值的多。類似的Fritz等，22發(fā)現(xiàn)重組的人組蛋白(H1)和含經(jīng)修飾的SV40大T抗原核定位序列在轉(zhuǎn)染效率上沒有差異。其他的研究也表明，盡管是通過特定的細胞內(nèi)途徑，NLS的存在確實提高了轉(zhuǎn)染pDNA在核的累積41，42。本說明書中所引述的所有文獻均引入本文作為參考。在不背離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本發(fā)明的方法和系統(tǒng)所進行的各種修飾和變異對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管通過特定的實施例對本發(fā)明進行了描述，但可知本發(fā)明權(quán)利要求的范圍不應(yīng)當過分局限于這些特定的實施例。事實上對分子生物學(xué)和其相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，以多種修飾的方式實施本發(fā)明均屬于本發(fā)明權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。參考文獻1.WoodMJA等用缺陷的HSV-1載體將基因轉(zhuǎn)移到CNS中的炎癥效果?；蛑委熁蛑委?994；1283-291。2.ByrnesAP等腺病毒基因轉(zhuǎn)移在腦部引起的炎癥。神經(jīng)科學(xué)1995；661015-1024。3.NaldiniL等用慢病毒載體[參見注解]進行體內(nèi)基因遞送和未分裂細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)?？茖W(xué)1996；272263-267。4.MillerAD.用于基因遞送的陽離子脂質(zhì)體。AngewandteChemie國際版1998；371769-1785。*5.LeeRJ，HuangL.用于基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體載體系統(tǒng)。治療性藥物載體系統(tǒng)評論1997；14173-206。6.GaoX，HuangL.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。基因治療1995；2710-722。7.FelgnerPL等脂質(zhì)感染-一種高效脂質(zhì)介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染方法。美國國家科學(xué)院匯編1987；847413-7417。8.FarhoodH，SerbinaN，HuangL.二油酰磷脂酸乙醇胺在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中的作用。生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報1995；1235289-295。9.CaplenNJ等用陽離子脂質(zhì)體DC-Chol/DOPE在體內(nèi)進行脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染上皮細胞系?；蛑委?995；2603-613。10.Labat-MoleurF等電子顯微鏡研究用脂多元胺進行基因轉(zhuǎn)移的機制。基因治療1996；31010-1017。11.ZabnerJ等用陽離子脂質(zhì)進行基因轉(zhuǎn)移的細胞和分子屏障。生物化學(xué)雜志1995；27018997-19007。12.FelgnerJH等利用新系列的陽離子脂質(zhì)制劑加強基因遞送和機制研究。生物化學(xué)雜志1994；2692550-2561。13.SahenkZ等基因遞送到脊髓運動神經(jīng)原。腦研究1993；606126129。14.IwamotoY等脂質(zhì)體-介導(dǎo)BdnfcDNA轉(zhuǎn)移入完整的受損兔腦。神經(jīng)報道1996；7609-612。15.RoesslerBJ，DavidsonBL.用陽離子脂質(zhì)體直接質(zhì)粒介導(dǎo)在體內(nèi)轉(zhuǎn)染成年鼠腦細胞。神經(jīng)科學(xué)通訊1994；1675-10。16.ZhouX，HuangL.by含脂多聚賴氨酸的陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染特性和作用機制。生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報1994；1189195-203。17.SorgiFL，BhattacharyaS，HuangL.魚精蛋白硫酸鹽加強脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移?；蛑委?997；4961-968。18.LiS，HuangL.魚精蛋白硫酸鹽通過陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物提供加強和可再生的靜脈內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。脂質(zhì)體研究雜志1997；7207-219。19.VitielloL等質(zhì)粒DNA與聚賴氨酸縮合以增加脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到已確定的和主要的肌肉細胞?；蛑委?996；3396404。20.NamikiY，TakahashiT，OhnoT.用含非組蛋白染色質(zhì)蛋白的陽離子脂質(zhì)體對已散播腹膜內(nèi)腫瘤進行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對癌癥的陽離子脂質(zhì)體基因治療?；蛑委?998；5240-246。21.GaoX，HuangL.用聚陽離子強化陽離子脂質(zhì)體-介導(dǎo)的基因遞送。生物化學(xué)1996；359286-9286。22.FritzJD等用組蛋白縮合的質(zhì)粒DNA將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞。人類基因治療1996；71395-1404。23.HagstromJE等非-陽離子脂質(zhì)體和組蛋白H1的復(fù)合物介導(dǎo)的無需封閉的有效DNA轉(zhuǎn)染。生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報1996；128447-55。24.IsakaY等HVJ脂質(zhì)體方法。實驗?zāi)I病學(xué)(Exp-Nephrol)1998；6144-147。25.GillockET等多瘤病毒主要外殼蛋白VP1當在桿狀病毒系統(tǒng)中表達時能夠包裝細胞DNA。病毒學(xué)雜志1997；712857-2865issn0022-2538x。26.ChangD，CaiX，ConsigliRA.多瘤病毒外殼蛋白的結(jié)合特性的表征。病毒學(xué)雜志1993；676327-6331。27.AndersonCW，YoungME，F(xiàn)lintSJ.腺病毒2病毒顆粒蛋白，mu的表征。病毒學(xué)1989；172506-512。28.WoodJN等表現(xiàn)受傷害敏感神經(jīng)原特性的新細胞系。倫敦皇家協(xié)會匯編B集-生物科學(xué)1990；241187-194。29.BudhrammahadeoV，LillycropKA，LatchmanDS.神經(jīng)細胞中拮抗的Pou家族的轉(zhuǎn)錄因子Brn-3a和Brn-3b受血清生長因子的反向調(diào)節(jié)。神經(jīng)科學(xué)通訊1995；18548-51。30.Cooper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