專利名稱：一種新的抗微生物組合物和其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及開發(fā)包含α-蒿甲醚、喹諾酮和類似藥物的重要的新的抗微生物組合物，所述組合物可作為新一代藥物組合物用于抗感染并同時通過內(nèi)在的作用機制清除抗藥性細胞以阻止細菌抗藥性的出現(xiàn)。
在本發(fā)明中，申請人使用具有不同和特異性的對抗作用模式的已知化合物的獨特組合來控制細菌的抗藥性的威脅。就如下概念而言本發(fā)明具有新穎性，即將兩種已知分子聯(lián)合起來，借助對抗作用----其中一種分子可殺死對另一種分子具有抗藥性的細菌且反之亦然----用于控制/殺死細菌和預防抗藥性菌株的出現(xiàn)，并最終導致自身即可防止抗藥性的出現(xiàn)。細胞在對一種分子產(chǎn)生抗藥性的同時會對另一種分子具有敏感性且反之亦然，這種現(xiàn)象是由遺傳控制的，因此一旦通過研究特異性突變鑒定出正確類型的抗微生物分子后這就成為一個自持過程(self sustaining process)，而本發(fā)明完成了這樣的鑒定。
化合物α和β蒿甲醚是從雙氫青蒿素通過用乙醇醚化而合成的。在印度，這些化合物早期由醫(yī)學和芳香植物研究中心(CIMAP)(Lucknow andCentral Drug Research Institute(CDRI)，Lucknow，印度)開發(fā)，在III期臨床試驗后用作抗瘧疾藥物。蒿甲醚在C-12位的絕對立體化學也已確定，并發(fā)現(xiàn)其效力比青蒿素的效力強2至3倍。在美國專利申請09/176,204中，申請人證實化合物α-蒿甲醚可以特異地殺死某些藥物的抗藥性細菌，因此能夠用作抗生素。
對于細菌的生長，DNA旋轉(zhuǎn)酶是DNA復制、因此也是細胞分裂所必需的。在依賴ATP的過程中該酶使DNA鏈瞬時斷裂并引入負超螺旋。大腸桿菌(E.coli)DNA旋轉(zhuǎn)酶是具有兩個亞基A和B的四聚體。亞基A對萘啶酮酸敏感，但該亞基中的某些突變可使細菌對萘啶酮酸有抗藥性。在所述美國專利申請中，申請人證實正常的野生型細菌不能被α-蒿甲醚殺死，但對萘啶酮酸和其它氟喹諾酮類化合物具有抗藥性的突變體(具有修飾的旋轉(zhuǎn)酶)對α-蒿甲醚高度敏感，而具有正常A亞基的細菌可被萘啶酮酸殺死。
同樣值得注意的是，全球每年有大約1千萬人感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，有約3百萬人因此死亡，這使該細菌成為全世界由單一感染物引起的死亡的最主要原因。喹諾酮和衍生的氟喹諾酮是對抗結(jié)核病的常用化療方法的一部分。已經(jīng)證明喹諾酮可抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，例如DNA復制過程中DNA超螺旋的松弛。幾位研究者指出，通過體外或體內(nèi)方法選出的幾種不同的喹諾酮抗藥性大腸桿菌菌株，其抗藥性是由位于gyrA基因0至400核苷酸之間的極小區(qū)域中的gyrA基因點突變導致的。分枝桿菌中由gyrA基因突變造成的抗藥性機制與大腸桿菌中的抗藥性機制是相關(guān)的。對于大腸桿菌、分枝桿菌、流感嗜血菌(H.influenzae)和許多其它細菌，喹諾酮抗藥性機制似乎相當類似。
在早先的發(fā)明中，申請人發(fā)現(xiàn)化合物α-蒿甲醚的新性質(zhì)，即，其對大腸桿菌的gyr突變(Nalr)菌株有效，但對野生型(Nals)菌株無效。因此，申請人想到將已不再使用的喹諾酮----萘啶酮酸和α-蒿甲醚聯(lián)合以制備自身可預防抗藥性出現(xiàn)的組合物。
而且，重要的是這些化合物和它們各自的活性均是已知的(喹諾酮自1960年以來而α-蒿甲醚自申請人的美國申請以來即是已知的)。但這兩種化合物的聯(lián)合活性卻至今未有過報道，而且申請人開發(fā)了一種廉價、安全的組合物，其中這些經(jīng)過測試的抗生素可以和經(jīng)過測試的安全化合物α-蒿甲醚共同施用。這些結(jié)果完全得到了此方面實驗的證實。這些聯(lián)合形式中的兩種分子可彼此殺死對對方具有抗藥性的細菌，從而使得任何抗藥性菌株/突變體都不能得以增殖而構(gòu)成微生物抗藥性出現(xiàn)的基礎。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是開發(fā)包含α-蒿甲醚、喹諾酮和類似藥物的新的抗微生物組合物。
另一目的是提供自身可用于阻止抗藥性出現(xiàn)的新的抗微生物組合物。
再一目的是開發(fā)能夠殺死對常規(guī)藥物具有抗藥性的細菌并防止抗藥性或突變菌株增殖的抗微生物組合物。
在一個實施方案中，所用喹諾酮化合物是但并不限于萘啶酮酸。
在再一實施方案中，α-蒿甲醚和喹諾酮在組合物中的比例是約8∶1至20∶1。
在再一實施方案中，喹諾酮衍生物選自氟喹諾酮類化合物，包括環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星、Oxfloxacin和洛美沙星。
在再一實施方案中，萘啶酮酸的濃度是至少50μg/ml。
在再一實施方案中，α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約2mg至500mg/ml。
在再一實施方案中，α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約400μg/ml。
在另一實施方案中，喹諾酮藥物在組合物中的濃度是大約0.5mg至500mg。
在另一實施方案中，使用至少1ml量的中和的無菌植物油或類似溶劑作為基質(zhì)。
在再一實施方案中，所述成分選自對彼此的抗藥性突變體具有對抗作用性質(zhì)的DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑，包括α-蒿甲醚和喹諾酮衍生物。
在另一實施方案中，所述成分選自對所述第一和第二成分，即α-蒿甲醚和喹諾酮、其衍生物或類似化合物的抗藥性突變體具有對抗作用性質(zhì)的DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑。
在再一實施方案中，組合物對原核生物的DNA復制具有抑制活性，因此可以用作潛在的第四代藥物組合物。
在再一實施方案中，所用第二成分可以是第一代喹諾酮藥物，選自但不限于萘啶酮酸和奧索利酸。
在另一實施方案中，所用第二成分可以是第二代喹諾酮藥物，選自但不限于環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星和Oxfloxacin。
在再一實施方案中，所用第二成分可以是第三代喹諾酮藥物，選自但不限于洛美沙星、托氟沙星、替馬沙星。
在另一實施方案中，所述組合物可以替代第一、第二和第三代藥物用于對抗抗藥性和敏感性感染。
在再一實施方案中，所述組合物可以用于預防針對第一、第二和第三代藥物的抗藥性的出現(xiàn)。
而且，本發(fā)明提供開發(fā)用于抑制抗藥性的第四代抗微生物組合物的方法，所述方法包括將α-蒿甲醚和選自以下的藥物混合的步驟喹諾酮、其衍生物、或細菌可對其產(chǎn)生抗藥性的任何其它類似化合物。
在該方法的一個實施方案中，α-蒿甲醚和喹諾酮在組合物中的比例是約8∶1至20∶1。
在該方法的另一實施方案中，所用的喹諾酮化合物是但并不限于萘啶酮酸。
在該方法的再一實施方案中，喹諾酮衍生物選自氟喹諾酮類化合物，包括環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星、Oxfloxacin和洛美沙星。
在該方法的再一實施方案中，萘啶酮酸的濃度是至少50μg/ml。
在該方法的再一實施方案中，α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約2μg至500μg/ml。
在該方法的另一實施方案中，α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約400μg/ml。
在該方法的再一實施方案中，喹諾酮藥物在組合物中的濃度是大約0.5mg至500mg。
在該方法的一個實施方案中，使用至少1ml量的中和的無菌植物油或類似溶劑作為基質(zhì)。
為了準確地定義本發(fā)明，申請人開發(fā)了一種新的組合物或藥物系統(tǒng)，以通過用該組合物治療細菌感染成功地阻止由應用萘啶酮酸引起的突變造成的抗藥性出現(xiàn)(或在單獨施用α-蒿甲醚時將會出現(xiàn)的任何對α-蒿甲醚的抗藥性)。由于已經(jīng)測試過這些化合物在用于人時的安全水平，因此可以開發(fā)并直接使用此聯(lián)合藥物來抵抗感染并同時遏制抗藥性威脅的出現(xiàn)。
在其它實驗中，申請人在圓片擴散和培養(yǎng)物實驗中使用萘啶酮酸和α-蒿甲醚的不同組合形式，對恥垢分枝桿菌和大腸桿菌突變體進行測試。在單個化合物給藥的所有情況下，在毒性圓片產(chǎn)生的暈圈內(nèi)觀察到抗藥性菌落的出現(xiàn)。但在圓片含有所述組合形式(包含各一半濃度的每種藥物)的情況下，甚至在延長的孵育期后，殺死/抑制暈圈內(nèi)也沒有顯示出任何菌落(

圖1)。在萘啶酮酸(2μg至500μg)和α-蒿甲醚(20μg至2000μg)的各種組合中，含有16∶1的萘啶酮酸和α-蒿甲醚的組合物對于兩種微生物最為有效。因此，16∶1比例的萘啶酮酸和α-蒿甲醚的組合可極為有效地預防細菌針對這兩種藥物分子之任一種產(chǎn)生抗藥性。然而，其它比例和組合也可以預防抗藥性的出現(xiàn)，但預防水平不同。
而且，值得注意的是，所述本發(fā)明化合物已用于人而且這些化合物的安全給藥數(shù)據(jù)是已知的。作為現(xiàn)有技術(shù)的一個已知例子(Asthana，O.P，Srivastava，J.S和Valecha，N.，1997，青蒿素衍生物，主要是蒿甲醚在瘧疾治療中的現(xiàn)狀，寄生蟲病雜志(Journal of Parasitic Disease)211-12)，α/β蒿甲醚混合物以150mg劑量(每天給藥一次，共3天)通過肌內(nèi)注射給藥以治療抗藥性和腦型瘧。所述制劑中的注射劑是在中和的植物油中制備的。在我們的實驗中，本發(fā)明的兩種化合物，即α-蒿甲醚和喹諾酮表現(xiàn)出在pH 7.0(中性)有最佳活性。因此，本發(fā)明組合物可以用于治療細菌感染，尤其是在已知抗藥性以高發(fā)生率出現(xiàn)的情況下。所述組合物/組合物可以用于預防細菌通過隨機突變產(chǎn)生對抗生素的抗藥性。因此，可以將多種類型的喹諾酮藥物懸浮在經(jīng)中和的植物油中以注射劑的形式和α-蒿甲醚一起給藥。組合物中的喹諾酮藥物可以以0.5mg至500mg范圍內(nèi)的不同劑量給藥。組合物1.α-蒿甲醚(2mg至500mg)2.喹諾酮藥物(0.5mg至500mg)3.至少1ml中和的無菌植物油喹諾酮藥物包括萘啶酮酸、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星、Oxfloxacin和洛美沙星等。
因此，本發(fā)明提供抗微生物化合物的新組合物，其可抑制由于細菌gyrA基因突變造成的抗藥性的出現(xiàn)，其中一種成分是α-蒿甲醚，而另一種成分可以是萘啶酮酸或氟喹諾酮類化合物(包括環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星、Oxfloxacin和洛美沙星等)或細菌可對其產(chǎn)生抗藥性的類似性質(zhì)化合物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，此新組合物的成分是但不限于α-蒿甲醚和萘啶酮酸。
本發(fā)明的再一實施方案提供其中的化合物對原核生物的DNA復制有抑制活性并因此可以用作潛在的新一代藥物組合物的組合物。
在本發(fā)明的其它實施方案中，組合物的成分可以是對聯(lián)用的兩種藥物中的任一種的抗藥性突變體具有對抗作用性質(zhì)的DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑，包括α-蒿甲醚和喹諾酮衍生物。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供新的組合物，其中組合物的成分可以是α-蒿甲醚(2mg至500mg)、喹諾酮藥物(0.5mg至500mg)和至少1ml中和的無菌植物油。
以下實驗用作本發(fā)明的例子以舉例說明本發(fā)明的某些實施方案，它們不應理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。這些實驗的關(guān)鍵性操作在于使用喹諾酮類如萘啶酮酸和α-蒿甲醚對彼此的抗藥性突變菌株的對抗作用性質(zhì)，并測定在控制細菌和預防抗藥性出現(xiàn)方面的效力。實施例1監(jiān)測Nalr突變體的出現(xiàn)在實驗中，申請人首先通過在這些藥物的存在下進行篩選在大腸桿菌(Escherchia coli)(Kumar，S.1976，Journal of Bacteriology，125545-555)和恥垢分枝桿菌(Snapper，S.B.，Melton，R.E.，Mustafa，S.，Kieser，T.和Jacobs，W.r.1990，Molecular Microbiology，41911-1919)中確定了隨后會導致抗藥性出現(xiàn)的自發(fā)突變頻率。將已知滴度的細菌培養(yǎng)液稀釋并接種在含有50μg/ml萘啶酮酸的毒性瓊脂培養(yǎng)基上，然后計數(shù)由此產(chǎn)生的抗藥性菌落以估計抗藥性(Nalr)出現(xiàn)的頻率(表1)。
表1萘啶酮酸抗藥性的自發(fā)出現(xiàn)頻率
實施例2監(jiān)測α-蒿甲醚r突變體的出現(xiàn)為了進一步確定大腸桿菌和恥垢分枝桿菌針對α-蒿甲醚的自發(fā)抗藥性突變頻率，申請人使用前面實施例的萘啶酮酸抗藥性突變體作為野生型菌株(因為這些菌株對α-蒿甲醚敏感)來分離α-蒿甲醚抗藥性菌落。將已知滴度的突變(Nalr)細菌培養(yǎng)液稀釋并接種在含有1000μg/mlα-蒿甲醚的培養(yǎng)皿中，然后計數(shù)由此產(chǎn)生的抗藥性菌落以確定頻率(表2)。
表2α-蒿甲醚抗藥性的自發(fā)出現(xiàn)頻率
實施例3萘啶酮酸和α-蒿甲醚聯(lián)合時對彼此的抗藥性突變體的對抗作用研究在聯(lián)合毒性瓊脂上接種肉湯培養(yǎng)物后，在存在50μg/ml萘啶酮酸和1000μg/mlα-蒿甲醚的條件下培養(yǎng)，未檢測到任一種抗藥性突變體，即分別或同時針對萘啶酮酸和α-蒿甲醚的抗藥性突變體的抗藥性菌落。
由于病原體總是試圖通過在藥物靶基因區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變進行自身遺傳修飾來抵抗藥物，因此必需殺死那些對有效的藥物處理產(chǎn)生抗藥性的突變細胞?；诖嘶驹瓌t，申請人評價了所篩選的針對萘啶酮酸的抗藥性菌株(M1)(野生型菌株對萘啶酮酸敏感)。從野生型發(fā)展產(chǎn)生的該突變菌株在GyrA亞基中存在缺陷，這通過轉(zhuǎn)移攜帶野生型gyrA基因的質(zhì)粒得以證實。有趣的是，來自野生型的此gyrA-突變體對化合物α-蒿甲醚敏感但能抵抗萘啶酮酸。類似地，從gyrA-突變菌株(Nalr)發(fā)展產(chǎn)生的第二突變體(M2)對萘啶酮酸敏感而對α-蒿甲醚具有抗藥性(表3)。值得注意的是，在所有測試的菌株中，對萘啶酮酸具有抗藥性的那些菌株總是對α-蒿甲醚敏感，而對萘啶酮酸敏感的那些菌株總是對α-蒿甲醚具有抗藥性。對于將這兩種成分組合在一起的這些藥物的聯(lián)合形式，沒有出現(xiàn)產(chǎn)生抗藥性的問題。之所以如此的原因是針對萘啶酮酸的抗藥性是通過gyrA突變產(chǎn)生的而這些突變體將被α-蒿甲醚殺死，同時，α-蒿甲醚抗藥性菌株會自動對萘啶酮酸敏感并因此被萘啶酮酸殺死，這樣所有的自發(fā)抗藥性細菌都被包含在內(nèi)。
表3大腸桿菌菌株對萘啶酮酸和α-蒿甲醚的敏感性
實施例4相反抗藥性和敏感性水平之間的相關(guān)性為了確定萘啶酮酸和α-蒿甲醚敏感性之間的相關(guān)性，申請人選擇對萘啶酮酸具有不同程度(濃度)抗藥性的大腸桿菌培養(yǎng)物?；谳拎ね岬淖钚∫种茲舛?，將大腸桿菌突變體分為高度敏感(MIC小于或等于10μg/ml)、抗藥性(MIC 10至200μg/ml)、高度抗藥性(MIC大于或等于200μg/ml)。然后通過估計這些菌株在存在遞增濃度的α-蒿甲醚情況下的生長(在620納米光波長的吸光度)，測試這些菌株對α-蒿甲醚的敏感性。以對照的吸光度作為100％，將所述吸光度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為生長百分數(shù)。然后按如下對生長進行量化1)大于80％生長突變體對α-蒿甲醚具有高度抗藥性；2)20至80％生長突變體對α-蒿甲醚具有中等抗藥性；3)少于20％生長突變體對α-蒿甲醚敏感。該實驗數(shù)據(jù)說明對萘啶酮酸具有高度抗藥性的大腸桿菌突變體在另一方面對α-蒿甲醚高度敏感。換言之，對萘啶酮酸具有最大抗藥性的大腸桿菌突變體可以最為有效地被α-蒿甲醚殺死(表4)且反之亦然。
表4相反抗藥性和敏感性水平之間的相關(guān)性
實施例5通過共培養(yǎng)具有相反抗藥性的菌株評價針對所述聯(lián)合形式的抗藥性菌株的出現(xiàn)進而，申請人使用本實驗分析在這些化合物單獨和聯(lián)合存在時與野生型比較單獨和共培養(yǎng)的突變菌株的生長情況。正如表5所顯示的，單獨培養(yǎng)時突變體對單獨的萘啶酮酸或α-蒿甲醚敏感，但在聯(lián)合使用這兩種化合物處理時無論在單獨的突變菌株中還是在突變體的混合物中均沒有觀察到生長，這說明在敏感的、單一抗藥性的或混合的菌株中均沒有出現(xiàn)雙重或單一抗藥性。表5在對混合的突變體培養(yǎng)物的聯(lián)合處理中進行抗藥性研究(620納米的光密度)
權(quán)利要求
1.用于抑制抗藥性的第四代抗微生物組合物，所述組合物包含兩種成分，其中一種成分是α-蒿甲醚而另一種成分是選自喹諾酮、其衍生物或細菌可對其產(chǎn)生抗藥性的任何其它類似化合物的藥物。
2.權(quán)利要求1的組合物，所用喹諾酮化合物是但不限于萘啶酮酸。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中α-蒿甲醚和喹諾酮在組合物中的比例是約8∶1至20∶1。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中喹諾酮衍生物選自氟喹諾酮類化合物，包括環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星、Oxfloxacin和洛美沙星。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中萘啶酮酸的濃度是至少50μg/ml。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約2μg至500μg/ml。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約400μg/ml。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中喹諾酮藥物在組合物中的濃度是大約0.5mg至500mg。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中使用至少1ml量的中和的無菌植物油或類似溶劑作為基質(zhì)。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述成分選自對彼此的抗藥性突變體具有對抗作用性質(zhì)的DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑，包括α-蒿甲醚和喹諾酮衍生物。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述成分選自對權(quán)利要求1中定義的第一和第二衍生物的抗藥性突變體具有對抗作用性質(zhì)的DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物對原核生物的DNA復制具有抑制活性，因此可以用作潛在的第四代藥物組合物。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所用第二成分可以是第一代喹諾酮藥物，選自但不限于萘啶酮酸和奧索利酸。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所用第二成分可以是第二代喹諾酮藥物，選自但不限于環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星和Oxfloxacin。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中所用第二成分可以是第三代喹諾酮藥物，選自但不限于洛美沙星、托氟沙星、替馬沙星。
16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物可以替代第一、第二和第三代藥物用于抵抗抗藥性及敏感性感染。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物可以用于預防針對第一、第二和第三代藥物的抗藥性的出現(xiàn)。
18.開發(fā)用于抑制抗藥性的第四代抗微生物組合物的方法，所述方法包括將α-蒿甲醚和選自以下的藥物混合的步驟喹諾酮、其衍生物、或細菌可對其產(chǎn)生抗藥性的任何其它類似化合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中α-蒿甲醚和喹諾酮在組合物中的比例是大約8∶1至20∶1。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所用喹諾酮化合物是但不限于萘啶酮酸。
21.權(quán)利要求18的方法，其中喹諾酮衍生物選自氟喹諾酮類化合物，包括環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、司氟沙星、Oxfloxacin和洛美沙星。
22.權(quán)利要求18的方法，其中萘啶酮酸的濃度是至少50μg/ml。
23.權(quán)利要求18的方法，其中α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約2μg至500μg/ml。
24.權(quán)利要求18的方法，其中α-蒿甲醚在組合物中的濃度是大約400μg/ml。
25.權(quán)利要求18的方法，其中喹諾酮藥物在組合物中的濃度是大約0.5mg至500mg。
26.權(quán)利要求18的方法，其中使用至少1ml量的中和的無菌植物油或類似溶劑作為基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含α－蒿甲醚和萘啶酮酸或喹諾酮藥物的重要的新型組合物的開發(fā)，所述組合物可以作為新一代藥物用于自身阻止抗藥性的出現(xiàn)，并可用于治療感染性疾病和抑制由細菌gyrA基因突變造成的抗藥性，尤其是在已知抗藥性菌株的出現(xiàn)極為頻繁的情況下。
文檔編號A61K31/4375GK1452487SQ00819463
公開日2003年10月29日 申請日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月28日
發(fā)明者S·P·S·哈努加, S·斯里瓦斯塔瓦, R·T·桑塔庫馬爾, A·K·沙薩尼, D·C·賈殷, M·P·達羅加, D·塞基亞, S·庫馬爾 申請人:科學與工業(yè)研究委員會