專利名稱：馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)全長(zhǎng)前病毒基因組的克隆及其感染性分子的構(gòu)建。
含有該EIAV DLA感染性分子克隆質(zhì)粒的菌種已存入中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO.0501。菌種名稱為EIAV-p8.2，分類為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏日期為2000年11月7日。
馬傳染性貧血(Equine Infectious Anemia，EIA以下簡(jiǎn)稱馬傳貧)是由逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的馬傳染性貧血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)感染馬屬動(dòng)物引起的一種烈性傳染病。1843年Lignee在法國(guó)的一份獸醫(yī)學(xué)報(bào)告中描述了第一例馬傳貧?；捡R呈反復(fù)發(fā)熱，出血，貧血，黃疸，消瘦，浮腫等癥狀，并且以病毒持續(xù)感染為特征。1904年，Vallee和Carre證實(shí)該病是由一種濾過(guò)性病毒引起的。馬傳貧是最早被證明由病毒所致的傳染病之一。
EIAV是正鏈RNA病毒，病毒基因組由兩條線狀的RNA組成，兩條鏈通過(guò)氫鍵形成二聚體。EIAV基因組結(jié)構(gòu)與其它慢病毒相似。病毒RNA編碼三個(gè)主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env，此外還有幾個(gè)小開(kāi)放閱讀框架(S1、S2、S3)，其中g(shù)ag和pol基因部分重疊。病毒RNA基因組兩端是完全相同的重復(fù)區(qū)(R區(qū))，在5’R下游是5’獨(dú)特區(qū)(U5)；3’端R區(qū)上游是3’獨(dú)特區(qū)(U3)。R-U5和U3-R構(gòu)成了病毒基因組兩端的非編碼區(qū)。EIAV感染宿主細(xì)胞后，經(jīng)自身編碼反轉(zhuǎn)錄酶的作用，合成病毒cDNA。EIAV cDNA可以整合到宿主細(xì)胞基因組中形成前病毒。EIAV前病毒DNA具有長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Long Terminal Repeat，LTR)位于前病毒DNA的兩端，包括R、U3、U5三個(gè)區(qū)。其排列順序?yàn)?’-U3-R-U5-3’。EIAV前病毒基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)示意圖1。
慢病毒是嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康的一類病原體，這個(gè)家族還包括艾滋病的病原人免疫缺陷病毒(HIV-1&HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、綿羊梅迪-維斯納病毒(MVV)和山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CEAV)。這一類病毒在基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制的分子機(jī)制、病毒的生活周期、抗原漂移規(guī)律、免疫機(jī)理及病毒與宿主相互作用等方面都很相似。
以EIAV為致病因子的馬傳貧自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在世界范圍內(nèi)各養(yǎng)馬國(guó)家廣泛分布與流行。馬傳貧呈地方性流行，但有時(shí)也在小范圍內(nèi)爆發(fā)，本世紀(jì)50年代到80年代末，馬傳貧的流行使我國(guó)經(jīng)濟(jì)蒙受了巨大的損失。在美國(guó)，馬傳貧病毒的傳播是通過(guò)有計(jì)劃的檢疫及大規(guī)模的捕殺計(jì)劃得以控制的。盡管如此，在世界其他地方，由于缺乏有效的疫苗，馬傳貧仍然是一個(gè)令人頭疼的問(wèn)題。
近年來(lái)，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速蔓延。據(jù)聯(lián)合國(guó)近日公布的報(bào)告顯示，到今年12月，全球艾滋病患者和病毒攜帶者總?cè)藬?shù)達(dá)3610萬(wàn)，僅今年新增的艾滋病感染者和發(fā)病者就達(dá)530萬(wàn)，相當(dāng)于平均每天有近1.5萬(wàn)人感染艾滋病。隨著艾滋病在世界范圍的流行，人類面臨著十分嚴(yán)峻的威脅。但由于慢病毒的自身獨(dú)特性質(zhì)即病毒的持續(xù)感染和高度變異性，使得慢病毒特別是HIV疫苗研制存在嚴(yán)重的障礙。目前還沒(méi)有有效治療艾滋病的藥物和特異性預(yù)防疫苗。迄今為止，國(guó)外還沒(méi)有研制成功有效的慢病毒疫苗。
得益于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所科學(xué)家們的潛心研究，本世紀(jì)70年代，世界上第一個(gè)慢病毒減毒疫苗——馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗誕生了。該疫苗免疫動(dòng)物不但對(duì)同源毒株有效，而且可以抵抗異源強(qiáng)毒攻擊，強(qiáng)毒攻擊后免疫動(dòng)物不受感染并產(chǎn)生持久堅(jiān)強(qiáng)的免疫力。在中國(guó)及古巴的廣泛應(yīng)用使兩國(guó)馬傳貧已得到有效的控制，并在世界范圍內(nèi)開(kāi)創(chuàng)了慢病毒疾病免疫預(yù)防之先河。
馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株是將EIAV L株通過(guò)驢體傳代，使其毒力明顯增強(qiáng)，獲得EIAV驢強(qiáng)毒，然后在驢白細(xì)胞培養(yǎng)物上連續(xù)傳代致弱獲得的。馬傳貧弱毒疫苗的成功應(yīng)用，證明了慢病毒防制的現(xiàn)實(shí)可行性。
EIAV是遺傳結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的慢病毒，已構(gòu)建成功多株不同毒力的感染性分子克隆，EIAV感染的潛伏期只有幾天至幾周，而且在EIAV感染過(guò)程中新的抗原變異株的出現(xiàn)與疾病的復(fù)發(fā)相關(guān)，因此是研究人及其他動(dòng)物慢病毒理想的替代模型。我國(guó)具有自主研制開(kāi)發(fā)的馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒及其親本驢強(qiáng)毒和原始L系EIAV。因此在分子水平上揭示強(qiáng)弱毒株間的基因表達(dá)調(diào)控，抗原變異，免疫機(jī)理，無(wú)疑對(duì)包括艾滋病病毒在內(nèi)的人及其它動(dòng)物慢病毒的免疫預(yù)防及治療具有重要的理論意義和參考價(jià)值。
要揭示我國(guó)馬傳貧弱毒疫苗致弱的分子機(jī)制，為HIV-1及其他慢病毒疫苗的設(shè)計(jì)和研究提供極有價(jià)值的理論依據(jù)，急需構(gòu)建我國(guó)EIAV弱毒疫苗株的感染性分子克隆，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種反基因操作系統(tǒng)，克隆的DNA分子經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以形成完整的病毒粒子，并具有感染性。利用感染性分子克隆可以進(jìn)行反向遺傳操作，通過(guò)在病毒分子克隆的特定位置引入突變或缺失，對(duì)病毒進(jìn)行遺傳修飾，檢測(cè)其生物學(xué)特性的改變，可以驗(yàn)證病毒基因組序列變化與病毒蛋白功能的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步在分子水平上闡明我國(guó)EIAV疫苗株的復(fù)制機(jī)制、減毒機(jī)理和免疫保護(hù)機(jī)制具有極其重要的意義，這可為人愛(ài)滋病基因缺失減毒疫苗的研究提供借鑒，有助于解決愛(ài)滋病研究中所遇到的困惑。
另外，目前我國(guó)使用的馬傳貧弱毒疫苗尚未進(jìn)行克隆純化，為多克隆疫苗，如果用馬傳貧弱毒疫苗感染性分子克隆衍生的病毒作為疫苗代替現(xiàn)有疫苗，使用效果可能更好，而且更接近國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，更易于被國(guó)際接受，可以在世界范圍內(nèi)推廣，為國(guó)家創(chuàng)匯。因此，EIAV弱毒疫苗株感染性分子克隆的發(fā)明不僅具有理論價(jià)值，而且具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
本發(fā)明的目的是獲得EIAV弱毒疫苗株的感染性分子克隆，為進(jìn)一步研究該疫苗株的復(fù)制、致弱和免疫保護(hù)機(jī)制提供有價(jià)值的工具。
本發(fā)明構(gòu)建的是馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆，該克隆包含了EIAV弱毒疫苗株基因組從5’端長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env，小開(kāi)放閱讀框架(ORF)S1、S2、S3及3’端LTR的全長(zhǎng)前病毒基因組，該克隆具有感染性，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可形成完整的馬傳染性貧血病毒粒子。
馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆的構(gòu)建，首先在體外培養(yǎng)馬傳染性貧血病毒驢白細(xì)胞弱毒疫苗株(EIAV DLA)，提取前病毒，以EIAV DLA的前病毒DNA為模板，采用PCR方法分三個(gè)重疊片段擴(kuò)增出EIAV DLA的前病毒DNA，這三個(gè)片段覆蓋馬傳染性貧血病毒的全部基因組，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后順次連接，獲得一個(gè)含有EIAV全基因(8.0Kb)的重組質(zhì)粒，將其命名為p8.0。將此8.0Kb EIAV全基因再亞克隆到含有一完整EIAV DLA株長(zhǎng)末端重復(fù)序列的質(zhì)粒中，獲得一含有EIAV驢白細(xì)胞弱毒前病毒全基因的重組質(zhì)粒，將其命名為p8.2，經(jīng)核苷酸序列分析，證明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2轉(zhuǎn)染驢白細(xì)胞，將其作為種毒進(jìn)行傳代，于感染該克隆毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄酶，并將被感染的細(xì)胞經(jīng)透射電鏡觀察，構(gòu)建出具有感染性的EIAV DLA感染性分子克隆。
本發(fā)明具有如下積極效果EIAV DLA感染性分子克隆的構(gòu)建成功，為廣泛深入地研究該病毒提供了重要實(shí)驗(yàn)材料，利用EIAV DLA感染性分子克隆，可以從細(xì)胞水平到分子水平，從細(xì)胞模型到動(dòng)物模型，從局部到整體等多方位、多角度地展開(kāi)對(duì)EIAV DLA的致弱、免疫保護(hù)機(jī)制，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯機(jī)制等廣泛而深入的研究，并為愛(ài)滋病等其它慢病毒的研究提供借鑒。另外，用EIAV DLA感染性分子克隆衍生的病毒作為疫苗代替現(xiàn)有疫苗，使用效果可能更好，更接近國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，易于被國(guó)際接受，可在世界范圍內(nèi)推廣，為國(guó)家創(chuàng)匯。


圖1為馬傳染性貧血病毒前病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為EIAV DLA感染性分子克隆的重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為用于PCR擴(kuò)增的引物的位置圖。
圖4為pUC19及Bluescript SK載體質(zhì)粒圖譜。
圖5為EIAV DLA前病毒全基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
圖6為EIAV DLA株前病毒全基因組核苷酸序列。
EIAV DLA感染性分子克隆的具體構(gòu)建方法見(jiàn)如下實(shí)施例一、EIAV前病毒DNA的提取感染EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗株(由EIAV中國(guó)L系強(qiáng)毒在驢體內(nèi)傳70代，又在驢白細(xì)胞上傳124代而成，見(jiàn)文獻(xiàn)1)的驢白細(xì)胞出現(xiàn)病變后，將培養(yǎng)液倒掉，細(xì)胞于-20℃凍存，將凍存的細(xì)胞融化，用TNE(0.1mol/L Tris-HCl，PH8.0)將細(xì)胞懸浮，加10％SDS至終濃度0.4％，加蛋白酶K至終濃度100μg/μl，37℃消化2小時(shí)，用等體積酚和氯仿各抽提一次，加2倍體積冷無(wú)水乙醇，-20℃過(guò)夜，12000rpm離心20分鐘，沉淀用適量滅菌去離子水懸浮備用。二、合成和擴(kuò)增基因片段的引物(見(jiàn)表1及圖3)表1.PCR引物序列位置表引物名稱 序列位置P1 TTGCCAGGCAACTGCAGTGTGATAACCTTT 88P2 AGGGTGCCTCTTCCTGCAATTTATCCTCAG2879P3 GCCATCCATTAATCATCAGGAACCAG2625P4 ACTGCTCCATCACCTTTCCACAACAC5014P5 GCTAAGCAAGGGTTATTAATCAATGG4075P6 CAGCAGAGAAGGAGCTCAGACCGCAGAATC8123P7 ATTCCTTGCTGAAGCTTCCCACTATG7696P8 CTTCTCTAACTTCTTGAGCGCTTTGC 497三、PCR擴(kuò)增以EIAV DLA前病毒DNA為模板，以PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增3個(gè)基因片段。1、F1片段的擴(kuò)增PCR反應(yīng)組成(50μL反應(yīng)體系)TaKaRa LA Taq(5u/μl)0.5μl10×LA pCRTMBuffer II(Mg2+free) 5μl25mM MgCL25μldNTP Mixture(各2.5Mm) 8μl模板(0.8μg/μl) 1μl引物P1(10pmol/μl) 2.5μl引物P2(10pmol/μl) 2μl滅菌去離子水 26μlPCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10分鐘，94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃5分鐘，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘，51℃1分鐘，72℃5分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前72℃延伸10分鐘。2、F2片段的擴(kuò)增PCR反應(yīng)組成(50μL反應(yīng)體系)TaKaRa LA Taq(5u/μl)0.5μl10×LA pCRTMBuffer II(Mg2+free) 5μl25mM MgCL25μldNTP Mixture(各2.5Mm) 8μl模板(0.8μg/μl) 1μl引物P3(10pmol/μl) 2μl引物P4(10pmol/μl) 2μl滅菌去離子水26.5μlPCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10分鐘，94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃5分鐘，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃5分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前72℃延伸10分鐘。2、F3片段的擴(kuò)增PCR反應(yīng)組成(50μL反應(yīng)體系)
TaKaRa LA Taq(5u/μl)0.5μl10×LA pCRTMBuffer II(Mg2+free) 5μl25mM MgCL25μldNTP Mixture(各2.5Mm)8μl模板(0.8μg/μl) 1μl引物P5(10pmol/μl)1μl引物P6(10pmol/μl)1μl滅菌去離子水 28.5μlPCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10分鐘，94℃1分鐘，52.5℃1分鐘，72℃4.5分鐘，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘，52.5℃1分鐘，72℃5分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前72℃延伸10分鐘。四、PCR的三個(gè)擴(kuò)增片段的克隆及測(cè)序1.F1片段的克隆及測(cè)序1.1 PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒的酶切消化(1)在Eppendorf管中依次加入下列反應(yīng)物去離子水65μl，10×buffer10μl，pCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA(0.5μg/μl)20μl，限制性內(nèi)切酶HindIII5μl(10U)；(2)混勻，置于37℃水浴消化3小時(shí)；(3)60-70℃作用10分鐘以終止酶切反應(yīng)，取少量反應(yīng)物(約3-5μl)用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果；(4)若酶切完全，則加2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的NaAC(3MpH5.2)，于-20℃冰箱放置1小時(shí)；(5)取出，40℃離心12000rpm，15分鐘；(6)棄上清，沉淀加200μl70％乙醇，12000rpm，5分鐘；(7)棄上清，吹干沉淀，加85μl滅菌無(wú)離子水，按上述方法繼續(xù)用限制性內(nèi)切酶pst I酶切；(8)用DNA回收試劑盒(原平皓生物技術(shù)有限公司)回收酶切產(chǎn)物。
1.2外源DNA片段與載體連接及轉(zhuǎn)化將HindIII和Pst I雙酶切的PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pBluescript(見(jiàn)圖3及文獻(xiàn)2)以摩爾比3∶1混勻，置60℃水浴10分鐘，緩慢退火，再加入連接緩沖液及T4DNA連接酶(做10μl體系)，混勻，置17℃水浴過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ecoli JM109株感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自大連寶生物工程公司)中。涂布于含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的Amp LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑選培養(yǎng)基上的白色菌落進(jìn)行分析。
1.3陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定隨機(jī)挑取一些白色菌落，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，然后用HindIII及SalI進(jìn)行酶切及雙酶切，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，從中篩選出含有2.8kb大小外源片段的重組質(zhì)粒(命名為p2.8)。
1.4重組質(zhì)粒p2.8的序列測(cè)定將篩選鑒定的重組質(zhì)粒，送大連寶生物工程公司，用Thermol Cycling全自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列測(cè)定。
2.F2片段的克隆及測(cè)序PCR產(chǎn)物F2片段(2.4kb)用Apa I、HindIII雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選，鑒定，得到重組質(zhì)粒p2.4(方法同上)。
3.F3片段的克隆及測(cè)序PCR產(chǎn)物F3片段(4.0kb)用Sac I、Cla I雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選，鑒定，得到重組質(zhì)粒p4.0(方法同上)。五、含有EIAV DLA前病毒全基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、F1和F2片段的拼接將重組質(zhì)粒p2.8和p2.4分別用HindIII、Apa I雙酶切，回收p2.8酶切的5.7kb片段作為載體，p2.4酶切的2.0kb片段作為外源片段，連接、轉(zhuǎn)化，篩選出含EIAV4.7kb片段的重組質(zhì)粒，命名為p4.7。
2、PUC4.0載體的構(gòu)建由于F3片段在pBluescript+載體上是反向的，需要轉(zhuǎn)移到其它載體質(zhì)粒中，以便于與p4.7的連接。本實(shí)驗(yàn)選擇了pUC19載體質(zhì)粒(見(jiàn)圖4及文獻(xiàn)2)。將pUC19和p4.0分別用Sac I，Cla I雙酶切，回收2.7kb和4.0kb，連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切鑒定，篩選出含正向EIAV4.0kb片段的重組質(zhì)粒，命名為pUC4.0。
3、F1-F2和F3片段的拼接將p4.7用pst I全部酶切，Nco I部分酶切，回收4.7kb片段，做為外源片段。將pUC4.0用pst I，Nco I雙酶切回收約6.0kb片段，做為載體。將二者連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切鑒定篩選出含有EIAV全基因的重組質(zhì)粒，命名為p8.0。
4、含有EIAV DLA全基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建EIAV前病毒全基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖5。將重組質(zhì)粒p8.0經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mlu I(Mlu I酶切位點(diǎn)位于LTR內(nèi))完全酶切，獲得含有EIAV全基因的8kb線形分子，回收該8kb片段，將此8kb片段低濃度連接成含有單一LTR的環(huán)狀分子，根據(jù)測(cè)得的疫苗株的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(表1)，以該環(huán)狀分子為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增一0.76kb片段，該片段含有一個(gè)完整的LTR，將這一0.76kb片段克隆至質(zhì)粒載體pUC19內(nèi)，獲得含有一完整LTR的重組質(zhì)粒，將其命名為p0.76。將回收的8kb片段亞克隆到質(zhì)粒p0.76中，獲得一含有EIAV驢白細(xì)胞弱毒前病毒全基因的重組質(zhì)粒(圖2)，將這一重組質(zhì)粒命名為EIAV-p8.2，經(jīng)核苷酸序列分析(圖6)，證明EIAV-p8.2含有EIAV DLA前病毒的全基因，EIAV DLA前病毒基因組全長(zhǎng)為8266bp。六、轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒純化試劑盒(Promega，Genomic DNA Purification Kit)提取質(zhì)粒EIAV-P8.2，通過(guò)脂質(zhì)體法用6ul脂質(zhì)體將1ug質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到長(zhǎng)滿60-80％單層的驢白細(xì)胞中(35mm培養(yǎng)皿)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后4天收取2ml培養(yǎng)上清，用于測(cè)定反轉(zhuǎn)錄酶活性，剩余培養(yǎng)液及細(xì)胞凍融三次，作為種毒繼續(xù)傳代，結(jié)果傳數(shù)代，于接毒后第四天細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞變暗、圓縮或變成線狀，部分細(xì)胞脫落。七、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性的測(cè)定分別收取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p8.2的驢白細(xì)胞及用該轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為種毒接種的細(xì)胞的培養(yǎng)上清，于4℃2,000×g離心30分鐘，去掉細(xì)胞碎片，上清于4℃ 100,000×g離心30分鐘，棄凈上清，沉淀于-70℃凍存，用于反轉(zhuǎn)錄酶活性的測(cè)定。通過(guò)BOEHRINGER MAINNHEIM公司的反轉(zhuǎn)錄酶非放射性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中反轉(zhuǎn)錄酶的含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果傳至第4代，于接種的驢白細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢出反轉(zhuǎn)錄酶，說(shuō)明在驢白細(xì)胞中由EIAV-p8.2衍生出了EIA病毒。八、EIAV病毒的電子顯微鏡檢測(cè)以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒EIAV-p8.2的細(xì)胞作為種毒，在細(xì)胞上傳數(shù)代后，通過(guò)透射電鏡可觀察到典型的馬傳染性貧血病毒粒子，直徑約90nm，具有錐形的核心，進(jìn)一步說(shuō)明確實(shí)由EIAV-p8.2衍生出了EIA病毒粒子，證明EIAV-p8.2具有感染性。結(jié)果表明，我們已成功地構(gòu)建了EIAV DLA的感染性分子克隆。
EIAV DLA感染性分子克隆的構(gòu)建成功，為深入研究該病毒提供了重要實(shí)驗(yàn)材料，以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)可以進(jìn)行多方面的研究和應(yīng)用，例如1、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行有關(guān)EIAV DLA在體外細(xì)胞系統(tǒng)的復(fù)制及翻譯機(jī)制的研究。
2、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行減毒機(jī)理的研究。
3、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行免疫保護(hù)機(jī)制的研究。
4、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)，構(gòu)建強(qiáng)-弱毒嵌合病毒，對(duì)EIAV的致病性進(jìn)行研究。
5、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建。EIAV慢病毒載體與其它以鼠白血病病毒為基礎(chǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，EIAV載體的優(yōu)點(diǎn)是可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分化的細(xì)胞。
6、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行人類愛(ài)滋病及其它慢病毒動(dòng)物模型的研究。
7、以EIAV DLA感染性分子克隆為基礎(chǔ)衍生的病毒可用于生產(chǎn)馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗(克隆毒)。
參考文獻(xiàn)1.沈榮顯，徐振東，何云生，等。1979.馬傳染性貧血免疫的研究。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).(4)1-15。2.Sambrook J，E F Fritsch and T Maniatis.Molecular cloninga laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，N.Y 1989.
權(quán)利要求
1.馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)感染性分子克隆，其特征在于該克隆包含EIAV DLA的前病毒全長(zhǎng)基因組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其中含有該質(zhì)粒特征的菌種已存入中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO.0501。菌種名稱為EIAV-p8.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其特征在于該克隆中的核苷酸序列包括EIAVDLA前病毒從5’端長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env，小開(kāi)放閱讀框架(ORF)S1、S2、S3及3’端LTR的全長(zhǎng)基因組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其特征在于該克隆具有感染性，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可形成完整的馬傳染性貧血病毒粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其特征在于所用的載體為PUC19。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,是馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)的感染性分子克隆。該系統(tǒng)包含一個(gè)克隆,該克隆包含的核苷酸序列為EIAV DLA的全長(zhǎng)前病毒基因組,該克隆具有感染性,導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可形成完整的馬傳染性貧血病毒粒子。EIAV DLA感染性分子克隆構(gòu)建的成功,為研究EIAV DLA的復(fù)制、致弱和免疫保護(hù)機(jī)制及作為人類艾滋病的動(dòng)物模型提供了重要材料,并可用于生產(chǎn)馬傳染性貧血病毒弱毒克隆疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/21GK1366053SQ0110148
公開(kāi)日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2001年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月18日
發(fā)明者童光志, 王柳, 楊志彪, 劉紅全, 仇華吉, 孔憲剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所