專利名稱：Rna病毒的感染性克隆及其衍生的疫苗及診斷分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA病毒及得自RNA病毒的感染性克隆領(lǐng)域，本發(fā)明進一步涉及經(jīng)利用及修飾該RNA病毒感染性克隆所得的疫苗及診斷分析。
重組DNA技術(shù)包括非常多樣的并非常有效的分子生物學技術(shù)，其目的在于在DNA水平修飾核酸并使得能在分子水平分析及修飾基因組。在這一方面，由于病毒的基因組小，所以特別適于如此操作。但由于非逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA病毒在其復制中不包括DNA中間步驟，因而重組DNA技術(shù)不能立即應(yīng)用于這些病毒，這些病毒的感染性克隆(如DNA拷貝或體外轉(zhuǎn)錄的RNA拷貝或其衍生物)需在重組DNA技術(shù)可被應(yīng)用于其基因組以產(chǎn)生修飾的病毒之前進行開發(fā)。感染性克隆的衍生可通過構(gòu)建所研究的病毒的全長(基因組長度)cDNA(在本文中這一術(shù)語是指廣義的RNA的DNA拷貝而不僅僅是狹義的mRNA的DNA拷貝)，然后在由全長cDNA轉(zhuǎn)染的細胞體內(nèi)合成感染性轉(zhuǎn)錄物而進行，但感染性轉(zhuǎn)錄物也可從組成完整病毒基因組的體外連接的部分長度cDNA片段的體外轉(zhuǎn)錄而獲得。在所有情況下，轉(zhuǎn)錄的RNA攜帶所有已引入cDNA的修飾，并可用于進一步傳代如此修飾的病毒。
許多含有12kb或稍大基因組的正鏈RNA病毒均已產(chǎn)生了感染性cDNA克隆及感染性體外轉(zhuǎn)錄物(綜述參見Boyer及Haenni，病毒學198，415-426)。瘟病毒屬的病毒基因組長度到目前為止似乎是最長的正鏈RNA病毒基因組，從中已制備出感染性克隆(Moormannet al.，病毒學雜志70763-770)。與基因組長度相關(guān)的問題不僅在于難以在細菌中得到和保持長的且穩(wěn)定的cDNA克隆，也在于初始RNA轉(zhuǎn)錄物的感染性，該初始RNA轉(zhuǎn)錄物在宿主細胞中的復制需在沒有與病毒復制相連的正常相關(guān)的病毒蛋白的幫助下進行。為獲得成功的感染，病毒轉(zhuǎn)錄物必須與病毒編碼的蛋白質(zhì)相互作用，特別是與病毒復制酶及宿主細胞組分如翻譯機制相互作用；因而病毒轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)應(yīng)盡可能地接近病毒顆粒RNA的結(jié)構(gòu)。另一些問題發(fā)生在那些經(jīng)轉(zhuǎn)錄自基因組3’側(cè)的次基因組信使RNA機制復制的正鏈RNA病毒及在復制期間產(chǎn)生包括一些結(jié)構(gòu)蛋白但僅是基因組的一部分的缺陷干擾顆粒如裸衣殼或空殼顆粒的正鏈RNA病毒。不完全RNA病毒片段或例如與待轉(zhuǎn)錄的病毒RNA或復制中間體RNA相互作用或干擾并或破壞其結(jié)構(gòu)的基質(zhì)或核衣殼蛋白的存在將破壞全長RNA鏈的合成，由此產(chǎn)生包含基因組長度RNA的感染性病毒。
萊利斯塔德(Lelystad)病毒(LV)也稱豬生殖呼吸綜合征病毒(PRRSV，基因組長15.2kb)，是動脈炎病毒科(Arteriviridae)家族的一個成員，該家族也包括馬動脈炎病毒(EAV，基因組長12.7kb)，乳酸脫氫酶升高病毒(LDV，基因組長至少14.2kb)，及猿出血熱病毒(SHFV，基因組長近15kb)，(Meulenberg et al.，1993a，Plagemann and Moenning，1993)。
近來病毒分類國際委員會已決定將這個家族與冠形病毒科(基因組長28-30kb)及Toroviridae(基因組長26-28kb)一起歸入一種新的病毒綱，即Nidovirales。Nidovirales綱代表含有正鏈RNA基因組并在復制期間合成3’嵌套的次基因組RNA的有包膜RNA病毒。冠形病毒及動脈炎病毒的次基因組RNAs含有一衍生自病毒基因組5’末端的引導序列(Spaan et al.，1988.Plagemann and Moening，1993)。Toroviruses的次基因組RNAs缺少引導序列(Snijder andHorzinek，1993)。盡管編碼RNA依賴性RNA聚合酶的ORF1a及1b從基因組RNA中表達，但編碼結(jié)構(gòu)蛋白的在Nidovirales基因組3’末端的較小ORFs表達自次基因組mRNA。
PRRSV(萊利斯塔德病毒)在1991年由Wensvoort等首次分離出，并示出是一種目前已知為豬生殖呼吸綜合征(PRRS)這種新疾病的病因。該疾病的主要癥狀是豬呼吸困難及母豬流產(chǎn)。盡管該病大規(guī)模爆發(fā)如1987首次在美國及1991年在歐洲所觀察到的爆發(fā)已減少，但該病毒仍可導致美國，歐洲，亞洲豬群的經(jīng)濟損失。PRRSV優(yōu)選地生長于肺泡巨噬細胞中(Wensvoort et al.，1991)，一些細胞系如CL2621及其它克隆自猴腎細胞系MA-104的細胞系(Benfield etal.，1992；Collins et al.，1992；Kim et al.，1993)也是該病毒易感性的。一些熟知的PRRSV毒株的登錄號為CNCM I-1102，I-1140，I-1387，I-1388，ECACC V93070108或ATCC VR 2332，VR2385，VR2386，VR2429，VR2474及VR2402。PRRSV基因組已完全或部分測序(Conzelmann et al.，1993；Meulenberg et al.，1993a，Murthaugh etal，1995)并且除了編碼RNA依賴性RNA聚合酶(ORFs 1a及1b)外，還編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中四種包膜糖蛋白命名為GP2(ORF2)，GP3，(ORF3)，GP4(ORF4)及GP5(ORF5)，一種非糖基化膜蛋白M(ORF6)及核衣殼蛋白N(ORF7)(Meulenberg et al.，1995，1996；van Nieuwstadt et al。1996)。PRRSV的EP及US毒株的免疫學鑒定及核酸序列測定已鑒別出PRRSV毒株間位于病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的微小抗原差異(Nelson et al.，1993；Wensvoort et al.，1992；Murtaugh et al.，1995)。
豬可經(jīng)口鼻途徑被PRRSV感染，肺內(nèi)的病毒可被肺泡巨噬細胞吞噬且在這些細胞中PRRSV的復制在9小時內(nèi)完成。PRRSV在12小時內(nèi)從肺行至肺淋巴管，并在3天內(nèi)到達周圍淋巴管、骨髓及脾。在這些部位只有少數(shù)細胞對病毒抗原染色陽性。該病毒在血液中存在至少21天，通常更長的時間。7天之后在血液中發(fā)現(xiàn)PRRSV的抗體。在PRRSV感染的豬體內(nèi)病毒與抗體同時出現(xiàn)顯示病毒感染不管抗體出現(xiàn)與否均可持續(xù)較長時間，盡管其在低水平持續(xù)。在至少7周期間，肺內(nèi)肺泡細胞群體不同于正常SPF肺。
PRRSV需要其包膜經(jīng)口鼻途徑去感染豬，由此豬的正常免疫應(yīng)答尤其需要產(chǎn)生針對一種或多種包膜蛋白的中和抗體。這種抗體能使病毒喪失感染力。但一旦在肺泡巨噬細胞內(nèi)，該病毒也產(chǎn)生由M和/或N蛋白衣殼化的RNA構(gòu)成的裸衣殼，有時多少含有糖蛋白的某一種。這些不完全病毒顆?；?部分)裸衣殼在細胞內(nèi)及細胞外的存在可經(jīng)電子顯微鏡檢術(shù)表明。有時可發(fā)現(xiàn)沒有核酸成分的裸衣殼。這些裸衣殼經(jīng)血流分布至全身并被脾，淋巴管及骨髓中的巨噬細胞從血液中吸收。這些裸露的但感染性的病毒衣殼不能被豬產(chǎn)生的抗體中和，這樣就解釋了在抗體存在下病毒感染的持續(xù)狀態(tài)。以這種方式，來自被感染骨髓細胞的巨噬細胞子代將病毒感染傳播至身體的新部位。由于不是所有的骨髓巨噬細胞譜系細胞都被感染，所以只是在外周部位的少量巨噬細胞被感染并產(chǎn)生病毒。只由ORF7蛋白組成的PRRSV衣殼在缺乏其它病毒蛋白的條件下，可通過例如用嵌合假狂犬-ORF7載體病毒感染巨噬細胞形成。PRV病毒可被操作成含有PRRSV的ORF7遺傳信息。在感染后18小時之后，感染細胞的胞質(zhì)含有大量小的，空球狀的具有PRRS病毒核衣殼大小的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明現(xiàn)提供一種衍生自基因組長度遠遠超過到目前為止已從中獲得感染性克隆的正鏈RNA病毒最長基因組的一種病毒的感染性克隆。本申請的實驗部分描述了基于并衍生自具有15.2kb基因組長度的PRRSV的感染性克隆的產(chǎn)生，但這種克隆現(xiàn)在也可得自也具有大約15kb基因組長度的LDV和SHFV，及得自基因組略短的EAV，和得自更長基因組長度的病毒如冠形病毒科或Toroviridae。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生感染性克隆的方法，該方法解決了病毒RNA鏈合成中所遇到的問題，從而產(chǎn)生感染病毒，所遇到的問題是不完全病毒RNA片段或例如基質(zhì)或核衣殼蛋白的存在，它們干擾或與轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄物或復制中間體RNA相互作用并破壞其結(jié)構(gòu)，從而破壞全長RNA鏈合成。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生感染性克隆的方法，該方法是用基于野生型病毒基因組的重組核酸轉(zhuǎn)染基本上不易被該病毒感染的宿主細胞，隨后經(jīng)傳代至易于感染該病毒的細胞或與易于感染該病毒的細胞共培養(yǎng)從所述宿主細胞中得到感染性子代病毒。本質(zhì)上不易感的細胞與通常用于病毒復制的細胞相比較只稍易感于或完全不易感于所研究的病毒，但也許地易感于其它病毒菌株。本發(fā)明提供了一種經(jīng)轉(zhuǎn)染不易感于野生型病毒的感染的宿主細胞而產(chǎn)生感染性克隆的方法，因而避免了含有干擾病毒RNA鏈合成的RNA片段和基質(zhì)或核衣殼蛋白的裸衣殼或不完全病毒顆粒的產(chǎn)生。經(jīng)傳代至對病毒易感的細胞從如此轉(zhuǎn)染的宿主細胞中獲得感染性病毒。在實驗部分描述了怎樣以如此方法得到PRRSV的感染性克隆，但該方法也適用于其它正鏈RNA病毒。
本發(fā)明現(xiàn)還提供經(jīng)重組DNA技術(shù)的進一步應(yīng)用而產(chǎn)生修飾的感染性克隆的可能性。該修飾可以是經(jīng)本領(lǐng)域已知的任何重組DNA技術(shù)方法所得到的單突變或多突變、取代、缺失或插入或其組合。因此本發(fā)明提供了修飾的RNA病毒以用于研究RNA病毒并制備疫苗。
本發(fā)明現(xiàn)還提供了感染性克隆，如衍生自動脈炎病毒科如PRRSV的感染性克隆，其可被用作抗由感染性克隆所基于的病毒所致疾病的單向疫苗。例如，基于PRRSV的感染性克隆現(xiàn)可用于研究PRRSV的毒力標志或血清學標志。已知的PRRSV的血清學標志是在由ORF2-7編碼的PRRSV的某些結(jié)構(gòu)蛋白上，但也發(fā)現(xiàn)位于由ORF1a和1b編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)。毒力標志在ORF1a和1b編碼的PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)，但也發(fā)現(xiàn)在某些ORF2-7編碼的蛋白質(zhì)上。針對這些標志，通過對感染性克隆基因組的修飾，可得到無毒或比其親代菌株減毒的PRRSV，和/或經(jīng)血清學標志的缺失或插入而被修飾的PRRSV以使免疫接種的豬和野生型病毒感染的豬之間有血清學差異。這種修飾的例子是這樣的PRRSV感染性克隆，其中編碼ORF7N蛋白的核酸序列由ATCC VR2332或LDV的ORF7蛋白所置換。
本發(fā)明還提供了可用作許多抗原的輸送系統(tǒng)或病毒載體疫苗的感染性克隆，如衍生自動脈炎病毒科如PRRSV的感染性克隆。在這種克隆中，插入了與所研究的病毒的序列不相應(yīng)的異源核酸序列。該異源核酸序列例如可衍生自編碼任何所選抗原的序列。這種抗原是一種可誘導抗病原體的免疫性的蛋白質(zhì)或肽。由于病毒感染骨髓中的巨噬細胞及巨噬細胞系細胞，并將含抗原的病毒通過其子代細胞分布，這種病毒載體疫苗感染免疫系統(tǒng)關(guān)鍵的細胞并可呈遞抗原以進一步加工。該載體疫苗病毒感染抗原呈遞細胞如樹突狀巨噬細胞或肝巨噬細胞或其它免疫系統(tǒng)細胞，并能以(不完全的)包膜病毒顆?；蚵阋職ゎw粒而感染。由于裸衣殼或不完全病毒顆粒可引起持續(xù)感染，免疫學加強效應(yīng)將引起抗抗原篩選自其中的病原體的終生免疫(由于在低水平持續(xù)刺激)。通過加入其它病原生物體或物質(zhì)的表位信息，我們可以用該病毒作為抗原攜帶者。一些攜帶外源表位信息的這種載體疫苗病毒可以混合在一起并在同一個時間內(nèi)給藥。這使主動免疫可以抗一種病原體的不同抗原或使主動免疫可以抗不同的病原體。
本發(fā)明現(xiàn)還提供了可被用作雙向疫苗的感染性克隆，如衍生自動脈炎病毒科如PRRSV的感染性克隆。例如基于PRRSV的感染性克隆可被用于構(gòu)建抗PRRSV及另一種病原體的保護性疫苗，通過將載體疫苗的研制與只抗PRRS的單向疫苗的研制組合起來而成。在PRRS疫苗中插入衍生自己知可感染豬的任何其它呼吸病原體的抗原可開發(fā)出一種特異的雙向疫苗，以抗豬的呼吸疾病。
本發(fā)明還提供了疫苗，無論其是單向，雙向或載體疫苗均不會釋放到環(huán)境中，因此是安全的。疫苗的安全性(非釋放)可通過將產(chǎn)生有包膜的感染性病毒所需的那些病毒蛋白的信息缺失來保證。該病毒需在組成型表達蛋白質(zhì)的細胞系中增殖，在該互補細胞系中復制的病毒有完整的包膜并能感染豬巨噬細胞。在一個復制周期之后，丟失了包膜蛋白質(zhì)信息的子代病毒，不能作為有包膜病毒感染其它細胞。作為裸衣殼或不完全病毒顆粒感染體內(nèi)巨噬細胞始終是可能的。
本發(fā)明也提供了可從根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA病毒感染的細胞培養(yǎng)物中獲得的病毒抗原及蛋白質(zhì)。如此的抗原可用于如ELISA診斷分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它類型的診斷分析。這種分析可用作初步診斷的唯一標準，或作為已用基于本發(fā)明修飾的RNA病毒的判別或標志疫苗接種過的動物群體的對比標準。
實驗部分從中可體外轉(zhuǎn)錄感染性RNA的cDNA克隆的產(chǎn)生已成為正鏈RNA病毒的分子遺傳學分析的基本工具。該技術(shù)可用于正鏈RNA病毒，在導入合適宿主細胞時其RNA基因組可作為mRNA并引發(fā)一輪完整的感染。已描述了許多病毒感染性克隆，從而促進了對遺傳表達、復制，病毒蛋白的功能及RNA病毒重組的研究(綜述參見Boyer及Haenni，1994)。另外這些克隆可以用于新病毒載體和疫苗的研制。目前動脈炎病毒的感染性cDNA克隆未被闡述過，我們在此報告PRRSV的感染性克隆的產(chǎn)生及其首次在嵌合PRRSV病毒產(chǎn)生中的應(yīng)用。
材料及方法細胞和病毒PRRSV(或LV)的Ter Huume株(保藏在CNCM，巴黎，保藏號I-1102)在1991年被分離出(Wensvoort et al.，1991)并培養(yǎng)于原始肺泡巨噬細胞或CL2621細胞中。本研究應(yīng)用的是Ter Huure株(TH)的第6代及其衍生物，LV4.2.1，其通過連續(xù)傳代在CL2621細胞上生長適應(yīng)。肺泡巨噬細胞保持在RPMI1640培養(yǎng)基(Flow)中，而CL2621細胞保持在Hank’s最小基本培養(yǎng)基(Gibco-BRL/LifeTechnologies)中。BHK-21細胞保持在Dulbecao’s最小基本培養(yǎng)基中。為進行轉(zhuǎn)染試驗，如Liljestron及Garoff(1993)方法，BHK-21細胞培養(yǎng)于Glasgow最小基本培養(yǎng)基(GIBCO-BRL/LifeTechnologies Ltd)中。
病毒RNA的分離細胞內(nèi)RNA分離自如前所述用PRRSV以感染復數(shù)為1感染24小時后的肺泡巨噬細胞或CL2621細胞(Meulenberh et al.，1993a)。為分離病毒基因組RNA，如Nieuwstaolt et al.，(1996)所述將病毒顆粒在蔗糖梯度上純化，并重懸浮于TNE(0.01M Tris-HCl，pH7.2，0.1MNaCl，1mM EDTA)中。將1ml的蛋白酶K緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.2，25mM EDTA，300mM NaCl，2％(w/v)SDS)和0.4mg蛋白酶K(Boehringer Mannheim)加入到1ml純化的PRRSV病毒顆粒(108TCID50)中。將此反應(yīng)混合物在37℃保溫30分鐘，RNA用苯酚/氯仿(1∶1)抽提一次，并用乙醇沉淀。將RNA貯存在-20℃乙醇中。該RNA制備物的十分之一用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)。
PRRSV基因組的5’和3’末端的克隆用修改的單鏈連接單鏈cDNA方法(SLIC；Edwards et al.，1991)克隆PRRSV病毒基因組的5’末端。將如上制備的病毒RNA的十分之一與引物11U113(5’TACAGGTGCCTGATCCAAGA3’)用于RT反應(yīng)，該引物與基因組的1232-1251位核苷酸互補。此RT反應(yīng)如前所述在終體積為20μl中進行(Meulenberg et al.，1993b)。隨后將2μl 6M的NaOH加入RT反應(yīng)中并在37℃將RNA水解30分鐘。用Boehringer Mannheim的高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化單鏈cDNA。將純化的cDNA用乙醇沉淀，重懸浮于TE中，并與錨定引物ALG3(5’CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC3’)連接。該引物含有EcoRI，ClaI及BamHI位點，且其3’末端用防止自連接的氨基封閉基團修飾。將此單鏈cDNA產(chǎn)物與4pmol ALG3在50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，10μg/mlBSA，25％PEG，1.0mM己胺氯化鈷，40μM ATP及0.5μl(10U)T4 RNA連接酶(New England Biolabs)中在室溫下連接過夜。將該連接反應(yīng)物的三分之一用作引物為LV69(5’AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGATCGGGTACC3’)和ALG4 (5’GAAGGATCCAGAATCGATAG 3’)的PCR中的模板。引物LV69互補于LV基因組的594-615位核苷酸，而ALG4互補于錨定引物ALG3。PCR條件如Meulenberg et al.，(1993b)所述，將獲得的產(chǎn)物用EcoRI及SalI消化并克隆在pGEM-4Z中。用相似的策略克隆來自細胞內(nèi)LV RNA的LV基因組5’末端。為進行這些實驗，使用10μg分離自用LV感染的CL2621細胞的總細胞RNA。對5’cDNA克隆進行測序，并將含有比發(fā)表的PRRSV序列(Meulenbery et al.，1993a)長10個核苷酸的克隆pABV387用作進一步實驗。
用含EcoRI，XbaI及PvuI位點的引物LV76(5’TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)403’)進行LV RNA的逆轉(zhuǎn)錄，以構(gòu)建含長的聚(A)尾部的3’末端cDNA克隆。此逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后用引物LV75(5’TCTAGGAATTCTAGACGATCGT3’)(該引物與LV76除了聚(T)一段序列之外是相同的)及39U70R(5’GGAGTGGTTAACCTCGTCAA3’)(相應(yīng)于LV基因組14566-14585位核苷酸并含有一HpaI位點的有義引物)進行PCR。用HpaI及EcoRI消化所得PCR產(chǎn)物，克隆進用相同酶消化的cDNA克隆pAV39中(圖1)。將含有45個A和109個A的聚(A)序列及由寡核苷酸測序確定的正確基因組cDNA序列的兩個cDNA克隆(pABV382和pABV392)用于構(gòu)建全長基因組cDNA克隆。
序列分析用PRISMTMReady Reaction Dye DeoxyTMTerminator Cycle測序試劑盒及Applied Biosystems的自動測序儀確定寡核苷酸序列。
PRRSV的全長基因組cDNA克隆的構(gòu)建將用于確定LV基因組核苷酸序列的以前產(chǎn)生的cDNA克隆(Meulenberg et al.，1993a)在如圖1所示方便的限制位點連接在一起。從pABV克隆25，11，12及100中構(gòu)建質(zhì)粒pABV254，并用于先前的實驗(den Boon et al.，1996)。根據(jù)Sambrook et al.，(1989)所述進行標準克隆步驟。這產(chǎn)生在高拷貝數(shù)質(zhì)粒pGEM-42中含LV的重疊cDNA序列的三個質(zhì)粒。質(zhì)粒pABV331及pABV369由LV基因組的5-6015位核苷酸組成。在對第3462位測序時發(fā)現(xiàn)在6個獨立cDNA克隆中以1∶1的比率出現(xiàn)核苷酸差異，該核苷酸差異導致ORF1A中第1084位氨基酸的取代(Leu代替Pro)。由于我們不能預(yù)言該氨基酸對感染性的影響，因而我們也通過在EcoRV(核苷酸3403)和SacII(核苷酸3605)位點的交換克隆了pABV331中編碼Leu的cDNA片段，得到pABV369。質(zhì)粒pABV384由LV基因組的5168-9825位核苷酸組成。由于沒有適當?shù)腸DNA克隆可與質(zhì)粒pABV20及pABV5重疊并最終與pABV331和pABV369質(zhì)粒的cDNA序列融合，因此通過RT-PCR產(chǎn)生了兩個新cDNA片段。相應(yīng)于5169-5186位核苷酸的有義引物LV59(5’TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG3’)和互補于6076-6097位核苷酸的反義引物61U303(5’CATCAACACCTGTGCAGACC3’)應(yīng)用于一個PCR中。位于5936-5955位核苷酸的有義引物61U526R(5’TTCCTTCTCTGGCGCATGAT 3’)及互補于6727-6745位核苷酸的LV60(5’GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC3’)用于另一PCR中。將這兩個PCR片段用摻入LV59中的XbaI位點，內(nèi)ApoI位點(6006位核苷酸)及也被摻入到引物LV60中的在6740位核苷酸的BamHI位點一起連接到pABV20中。將該新cDNA片段完全測序，其不含任何導致與發(fā)表序列(Meulenberg et al.，1993a)有氨基酸差異的突變。質(zhì)粒pABV368包含PRRSV基因組的8247-13720位核苷酸。由于cDNA片段在pGEM-4Z中的進一步連接導致不穩(wěn)定克隆，因而pABV331/369，pABV384及pABV368的插入物連接到pOK12的5’和3’cDNA片段(Viera and Messing，1991)上。預(yù)期質(zhì)粒載體pOK12更適于大的外源cDNA序列的克隆，因為其比pGEM-4Z具有較低拷貝數(shù)。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a，在32℃有15μg/ml卡那霉素存在下生長以盡可能低地保持其拷貝數(shù)。首先，將pABV382((A)45)和pABV392((A)109)的cDNA片段用EcoRI消化并用Klenow聚合酶(Pharmacia)將該位點修飾成平端，隨后用BamHI消化。這些片段克隆進用BamHI和FspI消化的pOK12中(FspI位點也被修飾成平端)，產(chǎn)生pPBV394和pABV395。以這種方式pOK12中的T7 RNA聚合酶啟動子被除去。接著將pABV368和pABV384的cDNA片段用BclI位點(13394位核苷酸)，ScaI位點(8657位核苷酸)和在側(cè)翼或載體序列中的BamHI及BgiII位點連接到3’末端cDNA克隆，這導致產(chǎn)生質(zhì)粒pABV401和pABV402(圖1)。
含有直接融合到LV基團組5’末端的T7 RNA聚合酶啟動子的-5’cDNA克隆用引物LV83(5’GAATTCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC3’)和LV69經(jīng)PCR從pABV387中擴增。LV83從5’至3’次序由-EcoRI和SpeI位點，-T7 RNA聚合酶啟動子序列，起始轉(zhuǎn)錄的單G及LV基因組的1-19位核苷酸組成。PCR片段克隆進在pOK12的EcoRI和SaII位點導致產(chǎn)生pABV396。pABV396的正確序列用寡核苷酸測序來評價。接著用ApaI和BamHI切下pABV331和pABV369的LV cDNA片段，并連接至用ApaI和BamHI消化的pABV396中。最后將所得5’cDNA片段用T7 RNA聚合酶啟動子上游的SpeI位點和在病毒基因組5168位的單一PmlI位點克隆入pABV401及pABV402中。以此方式中得到相應(yīng)于類似親代株的病毒及含外源開放讀框的嵌合病毒的基因組長度cDNA克隆。
含PacI和/或SwaI位點的突變病毒的產(chǎn)生為將單一PacI位點導入基因組長度cDNA克隆ORF7基因的下游，在14987和14988位核苷酸的T和A用有義引物LV108(5’GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC3’)與反義引物LV112(5’CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA3’)及有義引物LV111(5’TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG3’)與LV75經(jīng)PCR用A加以置換。相似地可通過將14980位的G置換為T及在14985位的T用A置換來產(chǎn)生單一SwaI位點，該置換是用引物LV108和LV110(5’CCTGACTGTCAATTTAAATTGCACCCTGAC3’) 及引物LV109(5’GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG3’)和LV111進行PCR而成。將PCR片段用所產(chǎn)生的PacI和SwaI位點及側(cè)翼HpaI和XbaI位點連接入pABV395中，分別導致pABV427和pABV426的產(chǎn)生。然后將此片段用相同的HpaI和XbaI位點插入pABV414中，導致pABV437和pABV442的產(chǎn)生(見圖4)。為檢測回收自pABV437和pABV422轉(zhuǎn)錄物的病毒中的標志突變，將RNA從感染的豬肺泡巨噬細胞的上清液中分離出。將該RNA用于逆轉(zhuǎn)錄-PCR中以用引物LV76，LV75及39U70R擴增一個約0.6kb的片段(跨越核苷酸14576-不同長度的聚A尾部)?；蚪M標志的存在可用PacI或SwaI消化PCR片段加以檢測。
RNA的體外轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)染將含LV全長基因組cDNA片段的質(zhì)粒pABV414，pABV416用位于聚(A)序列下游的PvuI線性化。由Semliki Forest病毒(SFV)表達載體pSFV1(Meulenberg et al.，1997)的ORF4組成的質(zhì)粒pABV296用SpeI線性化，并作為體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染試驗的對照。線性化質(zhì)粒用乙醇沉淀，根據(jù)Liljestrom和Garoff(1991和1993)所述應(yīng)用于SFV的方法將1.5μg這些質(zhì)粒用T7 RNA聚合酶(質(zhì)粒pABV414，pABV416)或Sp6 RNA聚合酶(pABV296)進行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄的RNA用異丙醇沉淀，用70％乙醇洗滌并在-20℃貯存直至使用。將BHK-21細胞播種于M6孔中(大約106細胞/孔)并用2.5μg與10μl最適宜的脂染劑混合的RNA轉(zhuǎn)染，如Liljestrom及Garoff(1993)所述?；蛘邔NA經(jīng)電穿孔導入BHK-21細胞中，在此情況下，利用Liljestrom和Garoff(16)的電穿孔條件，將10μg體外轉(zhuǎn)錄的RNA或10μg細胞內(nèi)LV RNA轉(zhuǎn)染至大約107BHK-21細胞中。轉(zhuǎn)染24小時后收集培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至CL2621細胞以拯救感染性病毒。基本上根據(jù)Wensvoort et al.，(1986)所述的免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)測試轉(zhuǎn)染的及感染的細胞對LV特異性蛋白的表達。用抗GP3，GP4，M及N蛋白的單克隆抗體(MAbs)122.13，122.59，122.9及122.17(Van Nieuwstadt et al.，1996)在IPMA中染色。
結(jié)果LV基因組RNA的5’末端序列的再構(gòu)建盡管已報導了具有截短的5’末端的體外轉(zhuǎn)錄的RNA的感染性(Davis et al.，1989，Klump et al.，1990)，通常認為獲得感染性克隆需要包括5’和3’最末端的全部病毒序列。為克隆LV基因組的5’末端，使用修改的單鏈連接單鏈cDNA(SLIC；Edwards et al.，1991)方法。分離自用LV感染的CL2621細胞的細胞內(nèi)RNA及來自純化病毒顆粒的LV RNA，利用互補于ORF1A 5’末端的引物LV69進行逆轉(zhuǎn)錄。將第一鏈cDNA產(chǎn)物連接至錨定引物ALG3，該引物3’末端的自連接反應(yīng)被封閉。經(jīng)PCR擴增該連接產(chǎn)物并克隆。將衍生自LV細胞內(nèi)RNA及得自兩個獨立PCR的12個克隆，和衍生自病毒顆粒RNA及得自兩種獨立PCR的14個克隆測序。在這26個cDNA克隆中，22個克隆包括比以前公布的cDNA序列(Meulenberg etal，1993a)多10個核苷酸(5’ATGATGTGTA3’)的序列，而其它4個克隆在此附加序列的5’末端缺失1～3個核苷酸(表1)。這使我們認為這10個核苷酸代表LV基因組的5’最末端，并因而包括在基因組長度cDNA克隆中。
LV的基因組長度cDNA克隆的構(gòu)建為構(gòu)建LV的基因組長度cDNA克隆，將預(yù)先分離及測序的cDNA(Meulenberg et al，1993a)根據(jù)圖1所述的策略在共享的限制酶位點連接。另外產(chǎn)生新cDNA片段裝配基因組長度cDNA克隆。經(jīng)RT-PCR產(chǎn)生一個跨越5168～6740位核苷酸的cDNA片段以使來自克隆pABV5和pABV20的cDNA序列連接。用于體外轉(zhuǎn)錄的T7 RNA聚合酶啟動子經(jīng)PCR被直接連接至LV基因組的5’末端，且克隆在pABV396內(nèi)的此新cDNA片段被插入基因組長度cDNA克隆。對在6種新的且獨立的cDNA克隆中的3420-3725位核苷酸的再測序表明在ORFla中的第1084位氨基酸Leu與Pro以1∶1的比率出現(xiàn)。由于我們無法預(yù)測該氨基酸對轉(zhuǎn)錄自最終的基因組長度cDNA克隆的RNA的感染性的影響，而將這兩種氨基酸用于構(gòu)建克隆。使用的是兩種在3’末端有差異的cDNA克隆，我們已先分離了含有最多20個A的聚(A)尾部的3’末端cDNA克隆(Meulenberg et al.，1993a)，但根據(jù)對相關(guān)病毒如LDV的聚(A)尾部的長度的研究(Chenet al，1994)，完整的聚(A)尾部預(yù)計更長一些。因而使用含40個T殘基序列的引物LV76產(chǎn)生新的3’末端cDNA克隆。對這些cDNA克隆進行測序，其含有40-109個A殘基的序列。將含有最長聚(A)序列的cDNA克隆(109個A殘基；pABV392)用于基因組長DNA克隆，由于長的同聚序列會干擾質(zhì)粒在E.coli中的復制(Deng andWu，1981)，我們選擇了含45個A殘基的第二種克隆pABV382用于隨后的克隆步驟。首先，觀察到在高拷貝數(shù)質(zhì)粒中保持基因組長度cDNA克隆導致引起合成自這些克隆的轉(zhuǎn)錄物感染性喪失的突變或缺失的積累(Lai et al.，1991；Rice et al.，1987；Sumiyoshi et al.，1992)。當我們試圖將pABV克隆331/369，384和368的較長cDNA片段連接至pGEM-4Z中的5’和3’末端時，還觀察到質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，從而最終將這些克隆在低拷貝數(shù)載體pOK12中互相融合(Viera andMessing，1991)。這導致產(chǎn)生基因組長度cDNA克隆pABV414/415和416，其在所用的生長條件之下在Ecoli中可穩(wěn)定繁殖。同時觀察到含45個或109個A殘基的基因組長度cDNA克隆的穩(wěn)定性沒有差異。
LVRNA的感染性LV優(yōu)選在豬肺泡巨噬細胞中生長。到目前為止，CL2621細胞系或其它衍生自猴腎細胞系MA104的克隆均顯示為可繁殖LV的細胞系(Benfield et al.，1992；Collins et al.，1992；Kim et al.，1993)。因而CL2621細胞被用于確定LV RNA轉(zhuǎn)染的最佳條件。分離自經(jīng)LV感染的CL2621細胞的RNA使用不同的方法如脂轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染胺、DEAE-葡聚糖及電穿孔法以不同用量轉(zhuǎn)染至CL2621細胞，直至轉(zhuǎn)染后7天，篩選有細胞病變效應(yīng)及噬斑的細胞，但這些感染性病毒的信號未檢測到。另外在IPMA中使用LV特異性MAbs未檢測到非LV特異性抗原。將體外轉(zhuǎn)錄自pABV296的RNA在這些試驗中用做對照。質(zhì)粒pABV296由插入表達載體pSFV1中的編碼GP4的ORF4基因組成(Meulenberg et al.，1997)。通過在IPMA中用GP4特異性MAbs染色轉(zhuǎn)染的細胞來測試pABV296 RNA的轉(zhuǎn)染效率。導致0.01％陽性CL2621細胞的最高轉(zhuǎn)染效率經(jīng)電穿孔而得，而用BHK-21細胞使用相似條件可得80-90％陽性細胞。這些結(jié)果表明，CL2621細胞不適于轉(zhuǎn)染試驗而BHK-21細胞(不易感于野生型病毒的感染)明顯示出非常適于轉(zhuǎn)染。因而將BHK-21細胞用于測試LVRNA的感染性。分離自經(jīng)LV感染的CL2621細胞的2μgRNA，根據(jù)所述的用于SFV條件(Liljestrom and Garoff，1993)用脂轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)至大約106BHK-21細胞中，轉(zhuǎn)染24小時后，用抗LV-N蛋白的LV特異性Mab 122.17將細胞染色。大約3-10個細胞染色陽性，但沒有觀察到提示細胞與細胞之間擴散的感染性中心或噬斑。使用這些條件，轉(zhuǎn)錄自pABV296的對照RNA的轉(zhuǎn)染導致60-70％陽性BHK-21細胞。將用細胞內(nèi)LV RNA和pABV296 RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液轉(zhuǎn)移至CL2621細胞。3-4天后，，在與來自經(jīng)細胞內(nèi)LV RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液溫育的細胞內(nèi)可觀察到噬斑，而與來自經(jīng)pABV 296 RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液溫育的細胞內(nèi)未觀察到噬斑。在IPMA中該噬斑被LV特異性MAbs陽性染色。當使用分離自LV純化病毒顆粒的RNA時得到相似結(jié)果。進一步地，當細胞經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染時染色陽性的細胞數(shù)提高2-4倍。這些數(shù)據(jù)表明可能由于BHK-21細胞缺乏LV受體而使LV不能感染BHK-21細胞。但一旦基因組RNA導入BHK-21細胞，新的感染性病毒顆粒產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)基中。用這些顆粒，無論是裸衣殼還是完整包膜的或部分包膜的顆粒對已轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞再感染同樣是不可能的。
感染RNA的體外合成由于實際上不易感于野生型PRRSV感染的BHK-21細胞特別適于從細胞內(nèi)LV RNA中拯救病毒，而易感的CL2621細胞則不能，因而將BHK-21細胞用作測試轉(zhuǎn)錄自基因組長度cDNA克隆的RNA是否是感染性的。將質(zhì)粒pABV414/416經(jīng)PuvI線性化并使用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄。PvuI位點位于聚(A)序列下游，因而轉(zhuǎn)錄的RNA在3’末端含有2個非病毒核苷酸(圖2)。另外，轉(zhuǎn)錄物在5’末端應(yīng)含有一非病毒G，其是T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點。將大約2.5μg體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，同時將2μg細胞內(nèi)LV RNA作為隨后在CL2621細胞中拯救病毒的陽性對照，將pABV296 RNA作為RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞的陽性對照和隨后在CL2621細胞拯救病毒的陰性對照。轉(zhuǎn)染24小時后，收集細胞的上清液并將細胞固定及在IPMA中用N-特異性MAb 122.17染色。在用細胞內(nèi)LV RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的孔中只觀察到少量陽性細胞，而在用轉(zhuǎn)錄自pABV414/416的RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的孔中觀察到800-2700個陽性細胞。為檢測感染性病毒是否從細胞中釋出，將上清液用于感染CL2621細胞。在經(jīng)用細胞內(nèi)LV RNA及pABV414/415的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液感染的CL2621培養(yǎng)物中產(chǎn)生噬斑。該噬斑在IPMA中用抗N，M，GP4，及GP3蛋白的MAbs染色陽性，提示這些蛋白質(zhì)都能被合適地表達。在與用轉(zhuǎn)錄自pABV296的RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液溫育的CL2621培養(yǎng)物中未觀察到噬斑和在IPMA中的染色。因而這些結(jié)果清晰地示出將轉(zhuǎn)錄自基因組長度cDNA克隆pABV414和pABV416的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞可導致感染性LV的產(chǎn)生和釋放。此外當將pABV414和pABV416的轉(zhuǎn)錄物經(jīng)電穿孔而非脂轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞時，可觀察到用LV特異性MAbs染色陽性的細胞增加2-4倍。在這些電穿孔的BHK-21細胞上清液中重組病毒的滴度大約為105TCID50/ml。
感染性拷貝病毒與Ter Huurne和LV 4.2.1的生長曲線的對比拯救的病毒的生長特性初始的轉(zhuǎn)染及感染試驗提示，與拯救自經(jīng)細胞內(nèi)LV RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的病毒相比，標為vABV414和vABV416的拯救重組病毒在豬肺泡巨噬細胞中感染和生長同樣良好，但在CL2621細胞中生長稍慢。分離從用LV4.2.1感染的CL2621細胞分離此細胞內(nèi)LV RNA，該LV4.2.1已經(jīng)適于在CL2621上生長。為更深入地研究vABV414和vABV416的生長性能，測定在CL2621細胞中及豬肺泡巨噬細胞中的生長曲線，并與只在豬肺泡巨噬細胞上傳代的野生型LV(TH)的生長曲線及在CL2621細胞上生長的LV4.2.1的生長曲線相比較。此兩種重組病毒的生長速率沒有差別，不論直接衍生自BHK-21或在豬肺泡巨噬細胞上進一步傳代，其生長同樣良好(圖3)。在感染32小時后在豬肺泡巨噬細胞中的滴度出現(xiàn)峰值(7.1-7.9 TCID50/ml)，而在CL2621中滴度稍慢，甚至在感染96小時后還未出現(xiàn)峰值。TH病毒的生長特性與重組病毒相似。相反在CL2621中適應(yīng)的病毒LV4.2.1在CL2621細胞上的生長比vABV414，vABV416及TH病毒的生長要快(圖3)。概括地講，這些結(jié)果表明重組病毒的生長性能與TH病毒相似。由于用于構(gòu)建感染性克隆的cDNA序列是衍生親代“未適應(yīng)性”TH病毒，因而這一點是可預(yù)期的。
在LV感染性克隆中導入遺傳標志為論證基因組長度cDNA克隆能用于產(chǎn)生LV病毒突變體，將一單一PacI和SwaI位點經(jīng)PCR介導的誘變導入ORF7基因的下游(圖4)。當轉(zhuǎn)錄自含PacI位點的基因組長cDNA克隆pABV437和含SwaI位點的pABV442的RNA被轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，并將上清液在轉(zhuǎn)染24小時后移至豬肺泡巨噬細胞及CL2621細胞中時，產(chǎn)生感染性病毒。拯救的病毒vABV437和vABV442與親代病毒vABV414在豬肺泡巨噬細胞及CL2621細胞中生長性能相似(數(shù)據(jù)未示出)。對分離自用vABV414和vABV416感染的豬肺泡巨噬細胞上清液的病毒RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增了一大約0.6kb的特異性區(qū)域(14576位核苷酸-聚(A)尾部)。經(jīng)PacI的消化示出此限制位點在衍生自vABV437的片段中確實存在，但在衍生自vABV414的片段中不存在。相似地也確定了SwaI位點在vABV442中的存在(數(shù)據(jù)未示出)。這樣我們可排除野生型病毒污染的可能性，從而確認vABV437和vABV442的同一性。
討論現(xiàn)代重組DNA技術(shù)使我們可以在分子水平分析和修飾基因組，這樣可更深地洞察其組織和表達。在RNA病毒的情況下，這要求產(chǎn)生基因組長度cDNA克隆，由此合成感染性轉(zhuǎn)錄物。在多數(shù)情況下，感染性克隆構(gòu)建的前提是對可能是病毒RNA復制關(guān)鍵性的各個病毒基因組的末端序列的鑒定。在先前的研究中示出LV在3’末端含有一聚(A)尾部(Meulenberg et al.，1993a)。在本研究工作中，LV基因組的精確5’末端被確定。盡管已描述了檢測病毒基因組RNAs或mRNAs的5’末端的一些方法，但其中多數(shù)有嚴重限制。已用于黃病毒和瘟病毒的方法是基于基因組RNA的環(huán)化，但此方法需附帶分析以明確基因組5’和3’末端之間的界限。cDNA末端的5’快速擴增(5’RACE)方法是基于用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)在第一鏈cDNA鏈加入一同聚物尾部。但加尾反應(yīng)效率較低且該方法由于不能確定尾部的第一個核苷酸是代表病毒序列，還是酶促增加的尾部的一部分而需附加分析。在本研究中我們通過將具有特異性的一寡核苷酸與第一鏈引物延伸產(chǎn)物的連接及經(jīng)PCR擴增確定了病毒基因組的5’最末端。在一些獨立克隆中發(fā)現(xiàn)與公布列相比延伸的10個核苷酸(ATGATGTGTA)，從而被假定為代表病毒基因組的5’最末端核苷酸?？傊@導致了一221個核苷酸的前導序列，其與EAV的前導序列長度(20個核苷酸；den Boon et al.，1991)，及SHFV的前導序列長度相似(208個核苷酸；Zeng et al.，1995)，但比LDV的前導序列(155個核苷酸；Chen et al.，1994)要長。但在這些動脈炎病毒的前導序列之間沒有明顯的同源性存在。
將5’最末端摻入基因組長度cDNA以產(chǎn)生感染性克隆。產(chǎn)生感染性病毒的主要問題是當在細菌中克隆時病毒序列的穩(wěn)定性及正確的5’和3’末端的產(chǎn)生。盡管開始試圖在pGEM-4Z中裝配基因組長度cDNA克隆失敗了，但LV的15207個核苷酸長基因組cDNA片段在低拷貝數(shù)質(zhì)粒pOK12中保持穩(wěn)定，且是目前現(xiàn)已產(chǎn)生的陽性RNA鏈病毒的最長感染性克隆。基因組長度cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物含5’帽結(jié)構(gòu)，在5’末端含一額外非病毒G，在3’末端含一非病毒CG，但這些延伸未影響其感染性。一些研究人員已報導轉(zhuǎn)錄自全長cDNA克隆的RNA的初始感染降低，這是由于在5’或3’末端的無關(guān)的非真實序列或不完全加帽所致。缺失帽結(jié)構(gòu)的LV全長cDNA的轉(zhuǎn)錄物是非感染性的。而感染性cDNA克隆轉(zhuǎn)錄物的感染性已在易感于病毒的細胞系中測試，我們不能確定來自基因組長度cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物或分離自用這些LV RNA轉(zhuǎn)染的CL2621細胞的LVRNA的感染性。這是由于在CL2621細胞中較差的轉(zhuǎn)染效率所致，從而病毒RNA鏈合成可能被不完全RNA片段或用有缺陷的干擾顆粒如只含有病毒基因組片段的裸衣殼對CL2621細胞的再感染產(chǎn)生的衣殼蛋白干擾或與其相互作用而被阻止。但全長cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物及細胞內(nèi)LV RNA對BHK-21的轉(zhuǎn)染導致感染性病毒的產(chǎn)生和釋放，該病毒可在CL2621細胞中被拯救。用裸衣殼對BHK-21細胞的再感染不會發(fā)生，因此不能妨礙全長病毒RNA的合成。特異感染性大約為每μg體外轉(zhuǎn)錄的RNA400-1500個陽性細胞，而每μg LV細胞內(nèi)RNA得到2-5個陽性細胞。但這些特異性感染性不能相比較，這是因為分離自LV感染的CL2621細胞的細胞內(nèi)RNA只有非常少的一部分代表基因組LV RNA。另外用于轉(zhuǎn)染的分離自病毒顆粒的基因組RNA量太少而不能準確地定量。
另外，在IDMA中用LV特異性MAbs記錄了BHK-21細胞產(chǎn)生的抗原，其與感染性病毒的產(chǎn)生不是必然相關(guān)，這一點清楚地在如下實驗中表明，在CL2621細胞上分析，用2μg細胞內(nèi)LV RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液比用2.5μg全長cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的上清液含較高滴度的噬斑形成單位。盡管以前表明許多病毒的聚(A)尾部的長度影響病毒轉(zhuǎn)錄物的感染性(Holy and Abouhaidar，1993；Sarow，1989)，我們未觀察到在含45個或109個A殘基尾部的基因組cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物之間感染性有何不同。這也許是45個A殘基的尾部在閾長度之上，低于此相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性將發(fā)生變化。我們已發(fā)現(xiàn)ORFla中第1084位氨基酸的克隆差異，在此位PRO與LEU的比率是1∶1。此氨基酸對感染性沒有影響，這是由于含這一LEU或PRO密碼子的全長cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物在對BHK-21細胞的感染性方面未示出有任何不同。
基因組長度感染性克隆用于產(chǎn)生表達PRRSV株ATCC VR2332的核衣殼蛋白的嵌合病毒。另外基因組長度感染性克隆用于產(chǎn)生表達鼠病毒LDV的核衣殼蛋白的嵌合病毒。這些嵌合病毒可用株特異性MAbs與親代病毒中區(qū)別開來，它們對與PRRSV的Ter Huurne株的N(ORF7)蛋白特異反應(yīng)的單克隆抗體不染色。另外其中PRRSVN蛋白被LDV N蛋白取代的嵌合病毒與與PRRSV N蛋白反應(yīng)的豬恢復期抗體不起反應(yīng)。由于所有為PRRSV感染的豬均產(chǎn)生抗PRRSVN蛋白的抗體，此嵌合病毒可在未來的計劃中應(yīng)用，使用抗PRRSV的新的活疫苗且將該病毒用作載體系統(tǒng)，特異性地瞄定宿主細胞肺泡巨噬細胞。在此方面需提及的是初始試圖用滅活病毒或重組亞單位去進行保護是失敗的。到目前為止可利用的唯一的抗PRRS的有效疫苗是基于US株的修飾的活疫苗(Gorcyca，et al.，1995)。但經(jīng)此修飾的活性產(chǎn)物接種的豬不能與被野生型病毒感染的豬區(qū)別開來。PRRSV的感染性克隆由此經(jīng)基因組的定位誘變提供了一種的所謂的標志疫苗，如此接種的豬與野生病毒感染的豬基于血清抗體的不同可以區(qū)分開來。
本文所述的LV感染性克隆，是到目前為止所開發(fā)的正鏈RNA病毒的最長的感染性克隆，并是動脈炎病毒家族的第一例。該PRRSV感染性克隆的產(chǎn)生開創(chuàng)了對該病毒的病理、宿主嗜性及復制和轉(zhuǎn)錄的研究方面的新機會。動脈炎病毒和冠形病毒共享一種特異的轉(zhuǎn)錄機制，其也指作前導序列引導的轉(zhuǎn)錄，其涉及含共有的5’前導序列的所謂嵌套式的一組次基因組RNAs的產(chǎn)生(Spaan et al.，1998；Plagemann and Moennig，1991)。前導序列引導的轉(zhuǎn)錄是一復雜過程，現(xiàn)在還不十分清楚。病毒學家對冠形病毒病毒的闡明前導序列引導的轉(zhuǎn)錄的未明了機制的研究受限于檢測干擾RNAs的cDNAs的分析及定位誘變，這是由于大基因組(28-30kb)妨礙了感染性克隆的構(gòu)建。PRRSV感染性克隆被用模型系統(tǒng)去研究及闡明動脈炎病毒及冠形病毒的轉(zhuǎn)錄和復制的機制。
衍生自PRRSV的感染性克隆也可用作插入PRRSV基因組的外源抗原的輸送系統(tǒng)或載體疫苗病毒，因為該病毒可感染骨髓中的巨噬細胞和巨噬細胞系細胞及免疫系統(tǒng)的其它細胞，并通過其子代細胞分布含抗原的病毒。在含動脈炎病毒或PRRSV的ORF7或N蛋白的片段的抗原的特例中，這些抗原將在感染的細胞的細胞膜外側(cè)被表達，從而進一步增強免疫應(yīng)答。該免疫加強效力將導致抗該病原體的終生免疫(由于在低水平持續(xù)刺激)。通過加入其它病原生物體或物質(zhì)的表位信息，我們可以用該病毒作為抗原攜帶者。一些攜帶外源表位信息的修飾的PRRS病毒可以混合在一起并在同一個時間內(nèi)給藥。這使主動免疫可以抗一種病原體的不同抗原或使主動免疫可以抗不同的病原體。修飾的PRRSV疫苗的安全性(如非釋放的)可以經(jīng)缺失那些產(chǎn)生有包膜感染性病毒所需的病毒蛋白的信息而確保。該病毒需在組成型表達包膜蛋白的細胞系中增殖。在此互補細胞系中復制的病毒具有完整的包膜，且能感染豬巨噬細胞。在復制一輪之后，喪失包膜蛋白信息的子代病毒不能作為有完整包膜的病毒感染其它細胞。裸衣殼仍能感染體內(nèi)巨噬細胞。以這種方式疫苗保持在接種動物的體內(nèi)而不會傳播給其它動物。


圖1LV基因組長度cDNA克隆的構(gòu)建。上部(A)示出在pGEM-4Z中的已測序(Meulenberg et al.，1993a)的cDNA克隆的融合。所用的這些克隆的pABV號及限制位點已標明。黑條代表在下一克隆步驟中融合的cDNA克隆部分。用R.T.標明的淺灰色條是經(jīng)RT-PCR新產(chǎn)生的cDNA克隆，黑灰色條代表經(jīng)PCR產(chǎn)生的新cDNA克隆。下部(B)示出較長cDNA克隆pABV331/369，pABV384，及pABV368與含T7 RNA聚合酶啟動子的5’末端克隆pABV396，及含聚(A)尾部的3’末端克隆pABV395，在低拷貝數(shù)載體pOK12中的裝配。在pOK12的多克隆位點內(nèi)和外的限制性位點已標明。這些限制性內(nèi)切酶位點是A，ApaI；Ap，ApoI；B，BamHI；Bg，BglII；Bs，BspEl；Bc，BclI；E，EcoRI；Ec，EcoRV；H，HindIII；K，KpnI；N，NarI；Nc，NcoI；S，SacII；Sp，SpeI；Sa，SalI；Sc，ScaI；P，PstI；Pm，PmlI；X，XbaI；Xh，XhoI。
圖2克隆的全長LV cDNA及轉(zhuǎn)錄自該cDNA克隆的感染性RNA的末端序列。基因組長度cDNA克隆用PvuI線性化，并用T7 RNA聚合酶在合成的帽狀類似物m7G(5’)ppp(5’)G存在下轉(zhuǎn)錄。所得RNA在5’末端應(yīng)包含一個額外核苷酸(G)，在3’末端含兩個額外核苷酸(GC)。RNA中的箭頭相應(yīng)于真正的LV RNA序列的5’至3’末端核苷酸。
圖3LV野生型病毒TH，LV4.2.1及重組病毒vABV414和vABV416在豬肺泡巨噬細胞(A)和CL2621細胞(B)中的生長曲線。BHK-21細胞中產(chǎn)生的重組病毒vABV414和vABV416可直接使用(BHK)，或在豬肺泡巨噬細胞(PAM)中繁殖后使用。TH病毒在豬肺泡巨噬細胞(PAM)中制備，而LV4.2.1在CL2621細胞(CL)中制備。將細胞培養(yǎng)物用所標明的病毒以0.05MOI感染，并在標明時間收集。經(jīng)終點稀釋試驗檢測在豬肺泡巨噬細胞或CL2621細胞上的病毒滴度(TCID50/ml)。
圖4將單一PacI和SwaI位點導入LV感染性cDNA克隆中。PacI和SwaI位點可經(jīng)如在材料和方法中所述的PCR介導的誘變法產(chǎn)生。將含PacI和SwaI位點的cDNA片段在pABV414中用其已標明的單一HpaI和XbaI位點交換，分別產(chǎn)生pABV437和pABV442。
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1)下劃線的核苷酸代表在以前分離和測序的cDNA克隆(Meulenberg et al.，1993a)中未發(fā)現(xiàn)的額外的序列。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生基于正鏈RNA病毒基因組的感染性克隆的方法，所述方法包括產(chǎn)生一種重組核酸，其包含至少一個全長DNA拷貝或體外轉(zhuǎn)錄的RNA拷貝或兩者中任一個的衍生物，其中該RNA病毒具有至少約15kb的基因組。
2.一種產(chǎn)生基于RNA病毒基因組的感染性克隆的方法，所述方法包括產(chǎn)生一種重組核酸，其包含至少一個全長DNA拷貝或體外轉(zhuǎn)錄的RNA拷貝或兩者中任一個的衍生物，所述方法進一步包括用所述重組核酸轉(zhuǎn)染宿主細胞以篩選感染性克隆，其中所述宿主細胞基本上不易感于所述病毒的感染。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病毒是一種具有至少約15kb基因組的正鏈RNA病毒。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述宿主細胞是BHK-21細胞。
5.一種重組核酸，包括根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述方法獲得的感染性克隆。
6.如權(quán)利要求5所述的重組核酸，包括基于選自Nidovirales的任一種病毒的基因組的感染性克隆。
7.如權(quán)利要求6所述的重組核酸，包括基于選自動脈炎病毒科的任一種病毒的基因組的感染性克隆
8.如權(quán)利要求7所述的重組核酸，其中所述病毒是PRRSV。
9.如權(quán)利要求5-8任一項所述的重組核酸分子，其中編碼毒力標志和/或血清學標志的核酸序列被修飾。
10.如權(quán)利要求9所述的重組核酸分子，其中編碼所述標志的核酸序列位于編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的任一種開放讀框中。
11.如權(quán)利要求10所述的重組核酸分子，其中一個開放讀框是動脈炎病毒科的任一種病毒的ORF7。
12. 權(quán)利要求5-8任一項所述的重組核酸分子，其中一開放讀框由動脈炎病毒科的ORF7取代。
13. 如權(quán)利要求5-12任一項所述的重組核酸分子，其中插入了至少一個附加的異源核酸序列。
14. 如權(quán)利要求13所述的重組核酸分子，其中所述異源核酸序列編碼一種抗原。
15. 如權(quán)利要求5-14任一項所述的重組核酸分子，其中開放讀框已被修飾。
16. 一種修飾的RNA病毒，包括如權(quán)利要求5-15任一項所述的重組核酸。
17. 一種疫苗，包括如權(quán)利要求16所述的修飾的RNA病毒。
18. 一種用權(quán)利要求16的修飾的RNA病毒感染的細胞。
19. 一種從權(quán)利要求18的細胞培養(yǎng)物獲得的蛋白質(zhì)和/或抗原。
20. 一種使用權(quán)利要求19的蛋白質(zhì)和/或抗原的診斷分析。
全文摘要
本發(fā)明包括一種產(chǎn)生基于具有至少15kb基因組的正鏈RNA病毒基因組的感染性克隆的方法。本發(fā)明進一步包括一種產(chǎn)生基于RNA病毒基因組的感染性克隆的方法,所述方法包括用所述重組核酸轉(zhuǎn)染宿主細胞以篩選感染性克隆,其中所述宿主細胞基本上不易被所述病毒感染。本發(fā)明還提供了修飾的RNA病毒及其衍生的疫苗及診斷分析。
文檔編號C12N5/10GK1240481SQ97180706
公開日2000年1月5日 申請日期1997年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月30日
發(fā)明者約翰娜·雅各芭·瑪麗亞·莫伊倫貝格, 約翰尼斯·瑪麗亞·安東尼厄斯·波爾, 朱迪·諾爾瑪·阿萊塔·博斯－德勒伊特 申請人:農(nóng)業(yè)技術(shù)研究基金會