專利名稱：一種天花粉蛋白突變體及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及一種天花粉蛋白突變體(Mutant of Trichosanthin，MTCS)及制備方法。
天花粉是我國傳統(tǒng)醫(yī)學的中藥，來源于葫蘆科植物栝樓(Trichosanthes Kirilowii M.)的根，有二千余年醫(yī)學臨床應用歷史。從中分離純化的一種分子量為27KD的蛋白質(zhì)稱為天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，它的化學本質(zhì)為一種單鏈的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，能特異切除真核細胞28SrRNA上第4324位腺嘌呤，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成。具有“清熱解毒”作用。六十年代人們進一步研究發(fā)掘了它的“終止妊娠”的能力。60年代后期中國臨床上已用于懷孕婦女的中期引產(chǎn)和治療葡萄胎。1989年美國科學家發(fā)現(xiàn)了它能抑制人免疫缺陷病毒(HIV)在急性感染的T淋巴細胞和慢性感染的巨噬細胞中復制(見文獻報道，Mcgrath MS，Hwang KM.，Caldwell SE，et al。GLQ223Aninhibitor of human immunodefienfiency virus replication in acutelyand chronically infected cells of lymphocyte and mononuclearphygocyte lineage。Proc Natl Acad Sci USA，1989，862844～2848)，并在臨床上試用于艾滋病人的治療。我們和其他學者還發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白還具有一定程度抗許多其它病毒、抗白血病和抗其它腫瘤的能力(見文獻報道，孔梅，柯一保，周美云等。天花粉蛋白誘發(fā)白血病細胞K562凋亡的研究。實驗生物學報，1998，31(3)233～243.Zheng YT，Zhang KL，Ben KL，etal。In vitro immunotoxicity and cytotoxicity oftrichosanthin against human nomal immunocytes andleukemia-lymphoma cells。Immunopharmacology andImmunotoxicology，1995，17(1)69～79。吳裕新，項丹妮，章水平等。天花粉蛋白對胃結(jié)腸癌細胞的殺傷作用及其機制的研究。中華消化雜志。1993。13(3)263-266。)。但是，在天花粉蛋白作為引產(chǎn)藥物應用時，中國科學家就發(fā)現(xiàn)了它偶爾會引起通過IgE介導的速發(fā)性過敏反應，因而每個引產(chǎn)婦女一生中只能注射一次，極大地限制了它的應用范圍。
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，研制一種過敏原性低、能反復使用的新的天花粉蛋白產(chǎn)品。
本發(fā)明提供了一種天花粉蛋白突變體產(chǎn)品(MTCS)，它是從天然天花粉蛋白的基因人工突變改造后，利用合適的表達系統(tǒng)得到的。
天然天花粉蛋白(TCS)是由247個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列的一級結(jié)構如下式表示ATG ATC AGAMet Ile ArgTTC TTA GTC CTC TCT TTG CTA ATT CTC ACC CTC TTC CTA ACA ACT CCT GCT GTG GAG GGC ↓Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly1GAT GTT AGC TTC CGT TTA TCA GGT GCA ACA AGC AGT TCC TAT GGA GTT TIC ATT TCA AATAsp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Va1 Phe Ile Ser Asn10 20CTG AGA AAA GCT CTT CCA AAT GAA AGG AAA CTG TAC GAT ATC CCT CTG TTA CGT TCC AGTLeu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser30 40CTT CCA GGT TCT CAA CGC TAC GCA TTG ATC CAT CTC ACA AAT TAC GCC GAT GAA ACC ATTLeu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile50 60TCA GTG GCC ATA GAC GTA ACG AAC GTC TAT ATT ATG GGA TAT CGC GCT GGC GAT ACA TCCSer Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser70 80TAT TTT TTC AAC GAG GCT TCT GCA ACA GAA GCT GCA AAA TAT GTA TIC AAA GAC CCT ATGTyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys TyrVal Phe Lys Asp Ala Met90100CGA AAA GTT ACG CTT CCA TAT TCT GGC AAT TAC GAA AGG CTT CAA ACT GCT GCA GGC AAAArg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys110120ATA AGG GAA AAT ATT CCG CTT GGA CTC CCT GCT TTG GAC AGT GCC ATT ACC ACT TTG TTTIle Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe130140TAC TAC AAC GCC AAT TCT GCT GCG TCG GCA CTT ATG GTA CTC ATT CAG TCG ACG TCT GAGTyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu150160GCT GCG AGG TAT AAA TTT ATT GAG CAA CAA ATI GGG AAG CGT GTT GAC AAA ACC TTC CTAAla Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu170180CCA AGT TTA GCA ATT ATA AGT TTG GAA AAT AGT TGG TCT GCT CTC TCC AAG CAA ATT CAGPro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln190200ATA GCG AGT ACT AAT AAT GCA CAG TTT GAA AGT CCT GTT GTG CTT ATA AAT GCT CAA AACIle Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn210220CAA CGA GTC ACG ATA ACC AAT GTT GAT GCT GGA GTT GTA ACC TCC AAC ATC GCG TTG CTGGln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu230240CTG AAT AGA AAC AAT ATG GCA↓GCC ATG GAT GAC GAT GTT CCT ATG ACA CAG AGC ITTLeu Asn Arg Asn Asa Met Ala Ala Met Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe247GGA TGT GGA AGT TAT GCT ATT TAGGly Cys Gly Ser Tyr Ala Ile End上式中的數(shù)字表示氨基酸序號MTCS的一級結(jié)構組成保留了天然TCS結(jié)構的絕大多數(shù)氨基酸序列。其特征之一在于天花粉蛋白質(zhì)的第174位到180位、203位到226位、230位到247位計49個氨基酸殘基中的任意1個或1個以上氨基酸殘基的被缺失或被改造，包括極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基的互變，酸性與堿性氨基酸殘基的互變，或被接上其它化學基團或在上述三段氨基酸順序中插入一個或一個以上其它氨基酸殘基等原因而引起的電荷的改變；特征之二在于羧基末端再加接兩個或兩個以上的非極性氨基酸或氨基酸殘基。上述MTCS結(jié)構特征的出現(xiàn)，成為與天然TCS結(jié)構有差異的、具有優(yōu)秀性能的新的天花粉蛋白突變體，它極大地降低了天花粉蛋白的過敏原性，但保留了TCS的一切生物學活性。
該產(chǎn)品一級結(jié)構的改變，涉及的極性氨基酸的概念是指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)等十一種氨基酸。其中，Asp、Asn、Glu、Gln為酸性氨基酸，Lys、Arg、His為堿性氨基酸；非極性氨基酸的概念是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)、甲硫氨酸(Met)等九種氨基酸。
本發(fā)明的天花粉蛋白突變體產(chǎn)品(MTCS)的免疫學活性及藥效測試結(jié)果如下一、TCS部分缺失蛋白和突變蛋白的性質(zhì)為了探索一級結(jié)構與生物學活性與免疫學活性的關系，從基因水平將TCS進行改造，獲得了多個氨基酸殘基被改造和C末端缺失的基因，經(jīng)大腸桿菌表達、純化后分別獲得了相應的多個氨基酸殘基被改造和C末端缺失的蛋白質(zhì)。由于TCS及其突變體是一種RNAN-醣苷酶，可使核糖體失活，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成，因而經(jīng)檢測這些突變體和C末端有明確缺失部位的突變體的系列蛋白的生物學與免疫學活性后，結(jié)合TCS的空間結(jié)構分析，作活性區(qū)域的結(jié)構基礎判斷資料。RIP活性依Pehem &Jackson的方法進行；抗生育活性按我們實驗室的常規(guī)方法進行，體外免疫反應用Elisa方法檢測。實驗結(jié)果可列表如下所示
注NTCS為天然TCS；LTCS為缺失體TCS；MTCS為突變體TCS。*RIP活性IC50(ng/ml)≤50++，＜50→≥500+，＜500→≥5000±，＞5001-；**抗生育活性％≥80++，＜80→≥30+，＜30→≥5±，＜5-；***體外免疫反應能力％≥++，＜80→≥30+，＜30→≥10±，＜10-。在M31TCS(M226-203，180-174)這個突變體中，有二個突變區(qū)域，序列174-180和序列203-226，其中可被突變或缺失的極性氨基酸殘基共18個，非極性氨基酸殘基共3個。這二個區(qū)域分別可有一個或一個以上(174-180)或二個或二個以上(203-226)的極性氨基酸殘基被突變改造或缺失，在174-180區(qū)域還可有3個非極性氨基酸殘基被缺失。
174-180區(qū)域可被突變的氨基酸的序列分布列表為原氨基酸殘基及其序號 優(yōu)選改造成的氨基酸殘基ARG174、 Glu、Asp、GlyAsp176Lys、GlyLys177Glu、Asp、GlyThr178Gly、AlaVal175缺失Phe179缺失leu180缺失203-226區(qū)域可被突變的氨基酸的序列分布列表為原氨基酸殘基及其序號 優(yōu)選改造成的氨基酸殘基Se203、Ser211Gly、AlaThr204、Thr224、Thr226Gly、AlaAsn205、Asn206、Asn217、Asn220Lys、GlyGln208、Gln219、Gln221Lys、GlyGlu210Lys、GlyArg222Glu、Asp、Gly230-247區(qū)域可被突變的氨基酸的序列分布列表為
優(yōu)選雙突變位點區(qū)域 優(yōu)選雙突變位點174-180 Arg174與Asp176或Lys177與Thr178203-226 Ser203與Thr204或Glu210與Thr226從上述基因缺失而獲得的缺失體蛋白質(zhì)(L-TCS)和基因突變獲得的突變體蛋白質(zhì)(M-TCS)的主要性質(zhì)檢測結(jié)果表明隨著C末端氨基酸殘基缺失程度的逐漸加大至缺失10個氨基酸殘基，它們的IgG與IgE體外檢測免疫活性也如同NTCS一樣呈現(xiàn)強陽性；缺失程度加大至14個氨基酸殘基后，免疫活性則有所下降，但使核糖體失活和致孕鼠中期引產(chǎn)的兩種生物學活性尚未受到影響。直至缺失29個氨基酸殘基，它的生物學活性才受到影響。按筆者以往所述，TCS的生物學活性部位在序列110至174區(qū)域，但末端氨基酸一定程度的缺失引起的空間結(jié)構的松弛變化對活性區(qū)域仍有影響，且這種氨基酸殘基缺失越接近活性中心區(qū)域，失活越大，直至失去全部活性。免疫活性區(qū)域較生物學活性區(qū)域結(jié)構排列在后，比較接近羧基末端，因而較早受到氨基酸缺失的結(jié)構影響。至缺失29個氨基酸殘基后，它的免疫活性已降至微弱陽性。與IgG和IgE相關的體外免疫反應降低為微弱陽性的產(chǎn)品、并且仍然保留著包括RIP和抗生育兩種活性的蛋白質(zhì)有L29TCS1-218、L46TCS1-201，并且仍然保留兩種強生物學活性的有M7TCS(M180-174)和M24TCS(M226-203)兩種，兩種體外免疫活性為陰性而仍然保留兩種強生物學活性的為M31TCS(M226-203，180-174)一種。這是一種性質(zhì)尤為優(yōu)秀，極大地降低了天然天花粉蛋白(NTCS)的免疫原性，也幾乎無損生物學活性的新的天花粉蛋白突變體。二、M-TCS的性質(zhì)檢測體外失活核糖體能力、懷孕小白鼠中期引產(chǎn)能力、體外與IgG和IgE反應能力和在體外培養(yǎng)下對不同細胞的殺滅情況均為我們實驗室的常規(guī)應用方法。
1.經(jīng)改造后的具有優(yōu)選性能的MTCS產(chǎn)品與天然TCS的免疫與生物學活性相比較.總結(jié)見下表NTCS MTCS失活核糖體能力(％) 100 100中期引產(chǎn)能力(％) 100 100腫瘤細胞毒性(K562細胞株) 100 100體外與IgE反應能力(％)100 ＜10體外與IgG反應能力(％)100 ＜10誘發(fā)大白鼠體內(nèi)IgE應答情況++ 一(見3d)誘發(fā)豚鼠急性過敏情況 ++ ±(見3c)2.MTCS對不同細胞的殺滅情況總結(jié)于下表CELL LINELC50CELL LINELC50CELL LINELC50(ug/ml) (ug/ml) (ug/ml)Jar 7.0B1669.2Wish ＞1000HL60 8.1A431 77.6*HMPLC ＞1000MLT 10.0B7-325 218.8K56211.0SPCA1 257.0U93717.07404 354.8*為人正常外周血淋巴細胞，從臨床采集。
從上表中可見，MTCS對K562、HL60、MLT、U937等白血病細胞和Jar人絨癌細胞的半殺滅劑量LC50＜30ug/ml，我們稱LC50≤30ug/ml的細胞為最敏感的細胞群；MTCS對B16、A431、B7-325、SPCA1、7404等癌細胞的LC50＞30ug/ml以上，稱它們?yōu)橐话忝舾行图毎海籑TCS對人外周血淋巴細胞和人羊膜細胞等正常體細胞的LC50＞1000ug/ml以上，稱為非敏感型細胞群。這就清楚地明確在一定的劑量條件下，MTCS對白血病等癌細胞有強烈的殺滅作用；而對正常體細胞不敏感。這與以往對TCS的研究相一致。
3、抗人體癌癥動物模型的性質(zhì)。
a)藥效學研究將人白血病紅白細胞癌的K562細胞接種至八周令裸小鼠(nodemice)皮下，接種細胞數(shù)量為1×107數(shù)量級。接種10天后，可見腫瘤在接種部位生成，接種成功率為50％。選擇腫瘤生成鼠隨機分為四組，給予不同劑量的MTCS注射治療。并以生理鹽水注射鼠作為對照。在每鼠治療劑量≤引產(chǎn)劑量(15nm/Kg、45nm/Kg、75nm/Kg)條件下，每四天注射一次，以四次治療為限，均可見不同程度的抑瘤效應。各治療組的抑瘤率分別為(40±3)％、(71±2)％和(92±4)％。選用另一種免疫雙缺陷動物Scid小鼠人體動物模型，繼續(xù)研究MTCS的對紅白細胞癌(K562)的殺滅效應。選用九周令Scid小鼠給予K562細胞接種，接種細胞數(shù)量同裸小鼠，接種成功率為100％。在接種后第五天，隨機將小鼠分為四組，其中三組為MTCS治療組，另一組為生理鹽水對照組。治療組按高、中、低不同劑量進行注射治療。分為150nm/kg一次注射組、75nm/kg二次治療注射組(每周注射一次)和37nm/kg注射組(每四天注射一次)，總劑量均為150nm/kg。高、中、低三組抑瘤率分別為(43±6)％、(64±8)％、和(94±3)％、二種人體動物模型的實驗結(jié)論是在引產(chǎn)劑量條件下，便可見明顯的抑瘤效應；一半引產(chǎn)劑量四次注射便可見90％以上的抑瘤效果，即小劑量多次注射效果尤佳。
上述為人紅白細胞白血病細胞癌的癌細胞接種至兩種動物機體形成實體瘤后，MTCS的治療效果均佳。在此兩種動物模型的基礎上，繼續(xù)用Scid小鼠建立了一種與臨床表現(xiàn)更為接近的人白血病的動物模型，即一種能從小白鼠血液生化指標、白血球數(shù)量的變化反映人源白血病的小鼠。實驗從小鼠尾靜脈注射3.75nm/kg、7.5nm/kg、和15nm/kg劑量的MTCS，用以治療患人紅白細胞癌的小鼠，經(jīng)三次注射后，上述三組白血球總數(shù)恢復至正常值的小鼠分別為(25±6)％、(75±8)％和(94±3)％。即MTCS治療液體瘤的劑量可小于實體瘤，而治療液體瘤的效果卻優(yōu)于實體瘤。
b)小白鼠急性毒性的研究。
選用八周齡ICR/JCL-F1小鼠按常規(guī)急性毒性研究法，一次注射MTCS和NTCS，比較MTCS和NTCS的LD50，結(jié)果表明在同一劑量條件下，動物死亡率天然組大于突變體組，且動物死亡時間天然組早于突變體組。以七天為觀察時間，它們的半致死劑量分別為LD50(NTCS)＝18.4mg/kg和LD50(MTCS)＝27.5mg/kg，因而MTCS的急性毒性明顯低于NTCS，約下降了50％。
c)豚鼠體內(nèi)急性過敏毒性試驗。
將NTCS和MTCS分別作豚鼠體內(nèi)急性過敏毒性試驗。致敏用量為一次皮內(nèi)注射致孕婦臨床劑量的4.5倍劑量，14天后進行攻擊，攻擊劑量為一次耳靜脈注射致孕婦流產(chǎn)劑量的10倍。觀查動物在30分鐘內(nèi)的反應和死亡情況。結(jié)果NTCS組死亡動物數(shù)與試驗動物總數(shù)之比為12/14；占86％，MTCS組為3/15，占20％，兩者相較差異顯著。即MTCS引起的豚鼠體內(nèi)急性過敏程度比NTCS顯著降低。
d)大鼠被動皮膚過敏試驗。
按0vary，Z.S.的方法，作大鼠被動皮膚過敏(PassiveCutaneous anaphylaxis，PCA)試驗。將N-TCS和M-TCS分別致敏小白鼠，14天后，分別得NTCS和MTCS的抗血清。再將兩種抗血清分別注入麻醉了的大白鼠剃去毛的背部皮內(nèi)，并分別用含NTCS和MTCS的伊文思藍注射入大白鼠的尾靜脈進行攻擊，半小時后，拉尾致死，觀查大白鼠背部皮膚藍斑形成情況，以藍斑直徑大于0.5cm者為陽性。結(jié)果顯示經(jīng)N-TCS抗血清注射的大鼠背部斑塊均顯陽性(+)，而M-TCS抗血清注射的大鼠背部斑塊均顯陰性(-)。表明MTCS誘發(fā)大白鼠體內(nèi)IgE應答銳減，原NTCS的陽性反應已全部消失。三、MTCS抗腫瘤機理的研究1.MTCS誘導了敏感的腫瘤細胞的凋亡。
如上面第二條第1和第2點所述，MTCS對體外培養(yǎng)中的白血病細胞有極強的殺滅作用，而對正常細胞影響極微。我們以MTCS對K562細胞的殺滅作用為例，經(jīng)多種研究手段通過電子顯微鏡觀察可見加藥后K562細胞發(fā)生了典型的凋亡形態(tài)學改變，細胞變小，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核仁消失，染色質(zhì)凝聚濃縮為一個或數(shù)個團塊，有時可形成新月狀，許多細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，最后形成有外膜包繞典型的凋亡小體。生化上抽提加藥組細胞DNA，用瓊脂醣凝膠電泳觀察到“階梯狀”條帶的出現(xiàn)，這是凋亡的生化指標。以及利用流式細胞儀(FACS)檢測到的凋亡細胞出現(xiàn)的二倍體峰(即凋亡峰)，所有結(jié)果均表明TCS誘導了K562細胞的凋亡。
2.敏感細胞的細胞膜上存在著能與MTCS專一結(jié)合的蛋白組分。
用生物分子相互作用分析系統(tǒng)(Biomolecular InteractionAnalysis，BIA)研究，當敏感細胞的細胞膜抽提液流經(jīng)生物傳感片，能與固相化的MTCS結(jié)合，導致感應片上的共振變化。該變化轉(zhuǎn)換為SPR信號并以RU(Resonance unite)來衡量。敏感細胞均有100至300不等的RU變化，表明MTCS與膜蛋白的大分子結(jié)合甚強。而同樣處理正常細胞如人子宮羊膜細胞，則無此變化。
3.通過激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)研究，觀察到MTCS可以通過受體介導形式被內(nèi)吞到K562細胞胞漿內(nèi)；4.通過[35S]GTPγS的結(jié)合實驗，說明MTCS能激活敏感細胞膜上的G蛋白，而不敏感細胞則無此激活現(xiàn)象。表明在敏感細胞中引起了信號的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導；5.通過激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)研究，進一步觀察到外源MTCS刺激敏感細胞后，能引起細胞內(nèi)鈣庫中游離鈣離子的釋放和濃度變化。
根據(jù)以上研究得出的結(jié)論為敏感細胞的細胞膜上存在著MTCS的受體，能介導MTCS進入細胞內(nèi)，發(fā)揮致核糖體失活(RIP)作用；同時，MTCS還干擾了細胞的信號轉(zhuǎn)導。上述雙重作用導致了細胞的凋亡。這些敏感細胞極大多數(shù)是腫瘤細胞，因而MTCS治療癌癥與通?？鼓[瘤藥物對腫瘤細胞和正常細胞兩敗俱傷的殺傷機理完全不同。為MTCS作為新要代抗腫瘤藥物的臨床應用提供了堅實的理論基礎。
本發(fā)明的另一目的是提供了上述天花粉蛋白突變體產(chǎn)品的制備方法，該方法包括下列步驟(1)對原TCS基因的改造天然天花粉蛋白的基因是從ATG(起始密碼子)到TAG(中止密碼子)共計870 bp(堿基對)，可從基因庫或cDNA庫篩取，或利用PCR方法吊取，也可以利用化學方法人工全合成，該基因編碼了一個由289個氨基酸殘基組成的前體蛋白，即它除了編碼成熟的TCS(247氨基酸殘基)外，在其5’端前還編碼了一個由23肽組成的前導肽或信號肽、和在其3’端后還編碼了一個延伸肽或尾肽(19肽)。
利用分子生物學領域工作者均已知的DNA的定點突變方法，包括單鏈模板法和雙鏈模板法(即PCR法)對原始的天然TCS基因進行突變改造a.在編碼成熟TCS的DNA序列的5’端前引進限制性內(nèi)切酶NcoI位點(CCATGG)，也便引進了起始密碼子ATG，由此同時將編碼的原成熟TCS的N端前加了一個甲硫氨酸；或引進限制性內(nèi)切酶NdeI位點(CATATG)，由此同時使編碼的原成熟TCS的第一個氨基酸殘基從天門冬氨酸改為甲硫氨酸。
在編碼成熟TCS的DNA序列的3’端后引進限制性內(nèi)切酶Bam HI位點(GGATCC)，由此同時引進了終止密碼子。
b.對編碼恰當部位氨基酸殘基(174-180、203-226、230-247)的DNA序列進行改造，以及對編碼247位氨基酸密碼子后的延伸，以獲得本發(fā)明的天花粉蛋白突變體的基因。(3)MTCS的表達將具有優(yōu)秀性能的天花粉蛋白突變體的基因用NcoI(或NdeI)和Bam HI雙酶切后克隆進質(zhì)粒載體pET-2d(或pET-3a)，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。轉(zhuǎn)化子在37℃用LB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)中培養(yǎng)過夜后，用M9ZB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)在同樣溫度放大發(fā)酵培養(yǎng)至570mu的光吸收為0.8左右，加誘導劑IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析分離純化，其主峰即為MTCS產(chǎn)品。
本發(fā)明的產(chǎn)品能用于醫(yī)學臨床。
除包括了原天然天花粉蛋白的一切適應癥外，還擴大至抗腫瘤領域，即可應用于1)抗白血病和廣譜性的抗其它實體腫瘤。它的優(yōu)點是能選擇性地進入靶細胞，因而用量微，使用次數(shù)少。在一定的劑量范圍內(nèi)，對腫瘤細胞有強烈殺傷作用，而幾乎不損傷正常細胞，故不良反應極微。
2)抗病毒、抗HIV，可用于艾滋病人的治療，較天然TCS副反應少，病人可多次使用。
3)妊娠婦女的中期引產(chǎn)、宮外孕，可多次使用。
實施例1TCS基因的定點突變和克隆。
為方便基因操作，設計的引物有1.5’GTGCAGGCC ATG GAT GTT AGG 3’2.5’AAC AAT ATG GCA TAG GAT CCC ATG GAT GAC 3’引物1的特點是含NcoI位點(CCATGG)，同時引進起始密碼子(ATG).結(jié)果在編碼原成熟TCS的N端前加了一個Met；引物2的特點是含BamHI位點(GGATCC)，結(jié)果在編碼成熟的TCS后引進終止密碼子(TAG)。
選用Bio-Rad公司提供的Muta-Gene Phagemid in vitromutagenesis藥盒，按藥盒中所附的詳細說明和步驟進行突變操作，最后通過DNA序列分析驗證所獲基因符合試驗設計。該方法要求先將待突變的原始基因前體克隆進phagemid(噬菌粒)系列。我們挑選了pTZ-19U。
將上述用引物1突變好的pTZ-19U-TCS經(jīng)NcoI和Bam HI在37℃水解2小時，通過低熔點瓊脂醣凝膠在TAE緩沖液中電泳分離和回收長度約750bp的TCS基因片段，利用T4DNA連接酶在4℃與事先同樣經(jīng)NcoI和BamHI雙酶解的表達型質(zhì)粒pET-2d連接過夜，得到pET-2d-TCS。
實施例2pET-2d-TCS轉(zhuǎn)化受體菌及其表達pET-2d-TCS用常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。轉(zhuǎn)化子在370℃用LB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)中培養(yǎng)過夜后，再用M9ZB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)在同樣溫度放大發(fā)酵培養(yǎng)至600mu的光吸收為0.8左右，加誘導劑IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析。利用含50mM Tris-Hcl緩沖液的(0.1-0.4)M濃度梯度的Nacl分離純化，其主峰即為表達的產(chǎn)品。
實施例3MTCS的基因克隆除根據(jù)需要，設計的引物不同外，其余操作均與上面實施例1相同。最后得到含MTCS基因的質(zhì)粒pET2d-MTCS。
以MTCS(M177、203、204)為例，設計的突變引物為3.5’AAG CGT GTT GAC GAA ACC TTC CTA CCA 3’4.5’ATT CAG ATA GCG GGA GGT AAT AAT GGA CAG 3’引物3的特點是將原177位的Lys的密碼子改變成Glu的密碼子。由于密碼子的兼并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Glu的堿基GAG替代。引物4的特點是將原203和204位的Ser和Thr的密碼子改變成Gly和Gly的密碼子。由于密碼子的兼并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基如GGG GGG、GGA GGA、GGC GGC、GGT GGT等共有16種替代方式。
實施例4MTCS基因的轉(zhuǎn)化和表達。
含MTCS基因的質(zhì)粒pET2d-MTCS用常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。MTCS基因的轉(zhuǎn)化、表達和純化所用的方法與上述實施例2相同。最后得到所需的突變體TCS，在本例的情況下，為MTCS(M177、203、204)。
實施例5MTCS(M177、203、204)生物學活性和免疫活性的檢測。
RIP活性按文獻[8]報道方法進行，兔網(wǎng)織紅細胞裂解液為Promega產(chǎn)品，[3H]亮氨酸為New England Nuclear產(chǎn)品?？股钚杂梦覀儗嶒炇页Ｒ?guī)方法進行[9]，以中期懷孕11天的ICR小鼠為模型，背部注射MTCS(M177、203、204)75n mole/kg藥物劑量，48小時后斷頸處死小鼠。解剖記錄總胎鼠數(shù)及死亡胎鼠數(shù)(包括胎兒吸收點)，計算肽鼠死亡率。體外免疫活性用Elisa方法檢測，IgG抗體和單克隆抗體IgE為我們實驗室自行制備和純化[10]。純化方法用親和層析柱，其中TCS-Sepharose 4B按溴化氰活化方法制備。SDS-聚丙烯胺凝膠電泳按Laemmli方法進行，電泳后用0.25％考馬氏亮蘭R250染色。以上各項實驗結(jié)果除陰性對照外，均用NTCS為陽性對照。實驗結(jié)果小結(jié)為產(chǎn)品 氨基酸改動點RIP活性 抗生育活性 體外免疫反體外免疫反(％) (％) 應能力IgG 應能力IgENTCS0 100 100 100 100MTCS 177，203，204100 100 ＜10 ＜10實施例6MTCS(M177、203、204)對K562細胞的殺滅效應用實驗室常規(guī)的MTT方法測定MTCS(M177、203、204)對K562細胞的殺滅效應。人紅白細胞型白血病K562與采自臨床分離的正常人淋巴細胞，分別在含有10％滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)、于37℃、5％CO2條件下，以2×105/ml接種細胞，并分別加入1、5、10、20、50、100ug/ml的MTCS。培養(yǎng)48小時后每孔加入25ulMTT(購自Sigma)(5mg/ml)，2小時后每孔加入Lysing Buffer終止反應，37℃放置過夜，用酶標儀測定各孔A570值。最后結(jié)果顯示MTCS對K562的LC50為11.0ug/ml，而對正常人外周血淋巴細胞不敏感，在上述實驗劑量MTCS的濃度高達1000ug/ml條件下，測不出LC50值。
權利要求
1.一種天花粉蛋白突變體產(chǎn)品，其特征在于該產(chǎn)品改變了天花粉蛋白質(zhì)序列的第174位到180位、203位到226位、230位到247位計49個氨基酸殘基中的任意一個或一個以上氨基酸殘基的被缺失或被改造，包括極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基的互變，酸性與堿性氨基酸殘基的互變，或被接上其它化學基團或在上述三段氨基酸順序中插入一個或一個以上其它氨基酸殘基等原因而引起的電荷的改變；改變之二是在羧基末端再加接兩個或兩個以上的非極性氨基酸或氨基酸殘基，成為與天然TCS結(jié)構有差異的、具有優(yōu)秀性能的新的天花粉蛋白突變體。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種天花粉蛋白突變體，其特征在于其中所述的一級結(jié)構的改變，涉及的極性氨基酸是指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)或組氨酸(His)。其中，Asp、Asn、Glu、Gln為酸性氨基酸，Lys、Arg、His為堿性氨基酸；非極性氨基酸是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(I1e)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)或甲硫氨酸(Met)。
3.一種如權利要求1所述的天花粉蛋白突變體產(chǎn)品的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)對原TCS基因的改造利用分子生物學領域工作者均已知的DNA的定點突變方法，包括單鏈模板法和雙鏈模板法(即PCR法)對原始的天然TCS基因進行突變改造a.在編碼成熟TCS的DNA序列的5’端前引進限制性內(nèi)切酶NcoI位點(CCATGG)，由此引進起始密碼子，同時將編碼的原成熟TCS的N端前加了一個甲硫氨酸；或引進限制性內(nèi)切酶NdeI位點(CATATG)，由此同時使編碼的原成熟TCS的第一個氨基酸殘基從天門冬氨酸改為甲硫氨酸；在編碼成熟TCS的DNA序列的3’端后引進限制性內(nèi)切酶Bam HI位點(GGATCC)，由此同時引進了終止密碼子；b.對編碼恰當部位氨基酸殘基(174-180、203-226、230-247)的DNA序列進行改造，以及對編碼247位氨基酸密碼子后的延伸，以獲得本發(fā)明的天花粉蛋白突變體的基因；(2)MTCS的表達將具有優(yōu)秀性能的天花粉蛋白突變體的基因用NcoI(或Nde I)和Bam HI雙酶切后克隆進質(zhì)粒載體pET-2d(或pET-3a)，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌BL 21(DE3，plysS)，轉(zhuǎn)化子在37℃用LB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)中培養(yǎng)過夜后，用M9ZB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)在同樣溫度放大發(fā)酵培養(yǎng)至570mu的光吸收為0.8左右，加誘導劑IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析分離純化，其主峰即為MTCS產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程,具體涉及一種天花粉蛋白突變體產(chǎn)品及制備方法。本發(fā)明的產(chǎn)品是從天然天花粉蛋白基因經(jīng)突變改造后,通過合適的表達系統(tǒng)制備得到的。本發(fā)明產(chǎn)品極大降低了天花粉蛋白的過敏原性,生物活性好,能選擇性進入靶細胞,對腫瘤細胞有強烈殺傷作用,并能抗病毒、抗HIV,也可用于妊娠婦女中期引產(chǎn)、宮外孕,能多次使用。
文檔編號A61P15/04GK1336381SQ0110310
公開日2002年2月20日 申請日期2001年1月18日 優(yōu)先權日2000年8月2日
發(fā)明者柯一保, 聶慧玲 申請人:中國科學院上海細胞生物學研究所