專利名稱：ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)ELISA篩藥系統(tǒng)篩選抗心血管病藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)篩選藥物方法，具體涉及ApoAI的ELISA測定方法及ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)ELISA篩藥系統(tǒng)篩選第三代升HDL抗動脈粥樣硬化心血管病藥的方法。
ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)ELISA篩藥系統(tǒng)是篩選新一代抗動脈粥樣硬化心腦血管病升高密度脂蛋白(HDL)藥中的核心技術(shù)工具，包括篩藥用細(xì)胞株的選擇，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，ApoAI ELISA測定方法和高通量篩藥方法等部分。我們已建立的篩選抗動脈粥樣硬化升HDL藥系統(tǒng)是根據(jù)動脈粥樣硬化心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)理，找出并以控制該疾病發(fā)生，發(fā)展和治療的關(guān)鍵蛋白ApoAI為靶標(biāo)，選擇以與ApoAI產(chǎn)生和代謝密切有關(guān)的細(xì)胞株HepG2為篩選細(xì)胞株，建立測定靈敏度高，測定濃度范圍大，操作簡單，便宜的ApoAI ELISA間接測定法。再以ApoAI ELISA測定法為主體，建立高通量升HDL藥篩藥方法。通過測定被篩選化合物激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生ApoAI蛋白的程度來篩選新一代抗動脈粥樣硬化升HDL藥。
動脈粥樣硬化心腦血管疾病(如冠心病，中風(fēng))是中國和西方國家致死疾病中的主要?dú)⑹?。其主要病因是高血清總膽固?Gordon et al.1981；Stamleret al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病學(xué)調(diào)查揭示，血清總膽固醇每增加1％，冠心病危險(xiǎn)因素增加2％(NCEPR1991)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，降低血清膽固醇水平可以減少冠心病的發(fā)病率，阻滯動脈粥樣硬化的發(fā)展(LPCP 1984；Frick 1987)。膽固醇不溶于水，不能在血液里轉(zhuǎn)運(yùn)。它們必需與脂蛋白結(jié)合才能在血液里運(yùn)轉(zhuǎn)。人血液里有四種脂蛋白負(fù)責(zé)膽固醇的運(yùn)載。它們是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，極低密度脂蛋白(VLDL)和中間密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的總膽固醇由LDL運(yùn)載。LDL攜帶內(nèi)源或外源膽固醇，穿過血管壁，進(jìn)入內(nèi)皮下(subendothelium)。在內(nèi)皮下，LDL膽固醇被氧化成氧化型LDL膽固醇，并通過清道夫受體被巨噬細(xì)胞以膽固醇酯的形式在細(xì)胞內(nèi)積聚。大量膽固醇酯積聚在巨噬細(xì)胞內(nèi)形成了泡沫細(xì)胞。積聚了大量膽固醇酯的泡沫細(xì)胞沉積在血管內(nèi)皮下，形成了動脈粥樣硬化斑塊核心。資料表明，由LDL運(yùn)載的膽固醇是導(dǎo)致動脈粥樣硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL膽固醇被稱為壞膽固醇。膽固醇引起的動脈粥樣硬化不但是冠心病的主要根源，同時也是腦血管疾病，如腦血栓形成，中風(fēng)的重要病因。此外人腦細(xì)胞內(nèi)積聚的高膽固醇酯還可能和老年性癡呆癥的形成有關(guān)。體內(nèi)膽固醇來源有內(nèi)源和外源。外源膽固醇來自于飲食，內(nèi)源膽固醇是自體合成的結(jié)果。內(nèi)源膽固醇合成亢進(jìn)和家族性高膽固醇血癥在西方國家較為普遍。這種疾病必須通過藥物控制。在美國，40％以上的成年人的LDL膽固醇(壞膽固醇)含量超過正常水平。由于膽固醇在形成心腦血管疾病中的重要作用，近十多年來，美國及歐洲藥廠都把其抗動脈粥樣硬化藥的研究和開發(fā)放到降低血清總膽固醇及LDL膽固醇上。這些藥中療效最顯著的有Merck藥廠的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。這些藥的作用機(jī)理都是抑制人體膽固醇合成的關(guān)鍵酶HMG-CoA-還原酶。雖然HMG-CoA-還原酶抑制藥能顯著的降低血清總膽固醇，防止、阻止及降低動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)病，發(fā)展和死亡，但它只能減少內(nèi)源性膽固醇合成及降低家族性高膽固醇血癥引起的冠心病的發(fā)展或惡化。對于治療外源性膽固醇增多引起的動脈粥樣硬化，對于消除已進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和抑制由此導(dǎo)致的動脈粥樣硬化形成，對于去除動脈粥樣硬化斑塊中積聚的膽固醇，使動脈粥樣硬化血管回復(fù)正常，則作用不大或無能為力。換句話說，目前歐美市場流行的抑制內(nèi)源性膽固醇生成藥物不能從根本上治療廣義的動脈粥樣硬化心腦血管疾病。
醫(yī)學(xué)研究證明，巨噬細(xì)胞吞噬和積聚膽固醇，轉(zhuǎn)換成泡沫細(xì)胞，沉積在血管壁內(nèi)皮下是動脈粥樣硬化斑塊形成的基礎(chǔ)。清除積聚在血管壁巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞內(nèi)的膽固醇，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟分解，是治療單純降血清膽固醇所不能達(dá)到的，根治動脈粥樣硬化心腦血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞及動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膽固醇的唯一的有效武器是HDL。近年來，西方心血管疾病研究人員及制藥公司開始把研究方向放到新一類抗動脈粥樣硬化藥，升高密度脂蛋白(HDL)藥上來。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的膽固醇載體，它在運(yùn)載膽固醇方面的功能與LDL截然相反。HDL可以刺激血管內(nèi)皮下巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水解，并將水解的非酯化膽固醇從巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟分解。更為重要的是，HDL能刺激沉積于血管壁和血管壁動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水解。非酯化膽固醇被HDL從泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟分解(Alan et al.1996)。從而去除了動脈粥樣硬化賴以形成的基礎(chǔ)。所以HDL的重要功能被稱為膽固醇逆相轉(zhuǎn)運(yùn)(Reverse Cholesterol Transportation)。膽固醇逆相轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)果是①抑制膽固醇酯在巨噬細(xì)胞內(nèi)累積，阻止其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，從而防止了動脈粥樣硬化的形成；②因?yàn)镠DL具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)運(yùn)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞里膽固醇至肝臟分解的作用，從而使動脈粥樣硬化血管壁逐步回復(fù)正常。HDL的此二項(xiàng)功能一直是西方醫(yī)學(xué)界在治療動脈粥樣硬化病中夢寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬細(xì)胞吞噬，產(chǎn)生泡沫細(xì)胞。HDL還可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放前列環(huán)素(PI)增加膽固醇酯水解和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。HDL的作用對象不分內(nèi)源或外源膽固醇?；A(chǔ)及臨床研究證實(shí)，每增加1mg/dl HDL膽固醇，冠心病死亡危險(xiǎn)即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血漿HDL是比高血漿膽固醇更重要的致動脈粥樣硬化及冠心病的危險(xiǎn)因子(Alan et al.1996)。
提高血漿HDL含量的機(jī)理是什么呢？簡單地說是激活合成HDL活性成份的有關(guān)基因及HDL合成過程中有關(guān)酶的基因，使其表達(dá)和合成HDL，同時抑制不利HDL合成的因素的活性。與HDL合成及其轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇功能密切有關(guān)的活性成份和酶有載脂蛋白A-I(ApoAI)，卵磷脂乙酰膽固醇轉(zhuǎn)移酶(LCAT)，脂蛋白脂酶(LPL)，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)，載脂蛋白C-III(apoC-III)。ApoAI的主要功能是①組成HDL最重要的結(jié)構(gòu)成份(Chapman etal.1980；Sastry et al.1988)；②激活HDL合成關(guān)鍵酶，LCAT(Fielding et al.1972；Soutar et al.1975)；③促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流(Glomset et al.1968；Scampfer et al.1991)。從人ApoAI流動率和靈長類HDL水平的研究認(rèn)為，ApoAI的合成速率決定了血漿HDL水平(Schaefer et al.1978，1982；Sorci-Thomas et al.1988)。LPL的功能是催化血漿VLDL和乳糜微粒脂解，產(chǎn)生膽固醇和磷脂供合成HDL的關(guān)鍵酶LCAT合成HDL的中心成份，膽固醇酯所用。apo C-III會抑制LPL活力，導(dǎo)致HDL合成原料饋乏。而CETP則催化膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)移到VLDL，并將三酸甘油酯從VLDL轉(zhuǎn)至HDL，使HDL分解，同時導(dǎo)致ApoAI在轉(zhuǎn)移中流失。apo C-III和CETP是HDL合成中的二個負(fù)性因子，所以要提高血漿HDL含量，必需升高①ApoAI，②激活LPL和③LCAT，④減少apo C-III和⑤抑制CETP活力。以上五項(xiàng)因素中，最重要一項(xiàng)是ApoAI水平。
流行病和轉(zhuǎn)基因動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，血漿ApoAI可以抑制動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展(Castelli et al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，動脈粥樣硬化發(fā)病率升高(Castelli et al.1986；Rutin et al.1991)。升高ApoAI本身對消除動脈粥樣硬化斑塊，治療動脈粥樣硬化作用顯著。所以ApoAI成為一個重要的篩藥靶標(biāo)。
本發(fā)明目的是提供了建立一種全新的ApoAI ELISA測定方法。
本發(fā)明的另一目的是提供ApoAI ELISA細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)篩選第三代升HDL抗動脈粥樣硬化心血管病藥的方法。
待測抗原(ApoAI)與過量抗體混合孵育，反應(yīng)平衡時抗體以兩種形式存在抗原-抗體復(fù)合物及游離抗體；將此平衡混合物加入預(yù)先經(jīng)抗原包被的酶標(biāo)板中，混合物中的游離抗體被板上的抗原捕獲，抗原-抗體復(fù)合物則經(jīng)洗板除去；最后加入辣根過氧化物酶底物，經(jīng)顯色反應(yīng)檢測板上抗體的濃度，由此可推知待測抗原濃度。
HrpAb2+Ab+Ag→HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab↓進(jìn)板HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓洗板HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓底物(OPD)酶標(biāo)儀492nm檢測HrpAb2—辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗Ab —一抗Ag —抗原Plate —酶標(biāo)板步驟1)抗原包板ApoAI稀釋至200ng/ml，加入Nunc酶標(biāo)板中，每孔50μl，置濕盒中，包板條件為37℃ 2小時或4℃ 16小時，蒸餾水洗板3次，每孔加入封閉液100μl，室溫放置1小時以上，用前再洗板3次。
2)孵育在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待測培液或標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)濃度配制ApoAI等比梯度稀釋，最終濃度為400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.12ng/ml；抗體稀釋一抗1∶50000，二抗1∶20000；空白孔100μl緩沖液；最大結(jié)合孔50μl抗體混合液，50μl緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)/樣品孔每孔加入抗體混合液50μl，ApoAI標(biāo)準(zhǔn)或待測培液50μl；振蕩混勻，37℃ 2小時或4℃ 16小時孵育以上。
3)抗體捕獲將96孔板中的孵育液轉(zhuǎn)移至包被好的Nunc酶標(biāo)板中，室溫反應(yīng)30分鐘，其間緩緩搖動。
4)檢測以蒸餾水洗板3次，每孔加入100μl新配制的底物顯色液，避光放應(yīng)30分鐘，加入25μl終止液終止反應(yīng)，與酶標(biāo)儀波長492nm處測定吸光值。
數(shù)據(jù)處理1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(見

圖1)標(biāo)準(zhǔn)濃度讀數(shù)減去空白值后，按以下公式計(jì)算x=lnB/Bmax1-B/Bmax]]>B-標(biāo)準(zhǔn)濃度吸光值Bmax-最大結(jié)合吸光值y＝lg CONCCONC標(biāo)準(zhǔn)濃度(ng/ml)Y對X作線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。
回歸方程y＝-0.478x+1.628(R2＝0.9964)(注實(shí)驗(yàn)條件變化時，斜率和截距會有變化)2)樣品濃度計(jì)算樣品讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)作同樣處理，根據(jù)以上回歸方程計(jì)算樣品中ApoAI抗原濃度。
以下羅列了本發(fā)明與目前正在使用的ELISA法測定ApoAI的方法比較及其優(yōu)勢分析。
1.雙抗夾心法雙抗夾心法以其靈敏度高(可達(dá)10-12g)(Anderson N，Chalatow KM，Castelli WP，Levy DL.(1987)Zentralbl Allg Pathol Pathol Anat 241-9.及Chiba H，Mitamura T，Matsuno K，and Kobayashi K，A sensitive sandwichenzyme-linked immunosorgent assay of rat apoliprotein A-1.Biochem MedMetabol Biol，1991；46380-390)而被廣泛使用，主要過程為抗體包板→加入待測液，待測抗原與包被抗體結(jié)合→加入第二種酶標(biāo)抗體，形成夾心復(fù)合物→加入酶底物檢測此法要求使用兩種不同的抗體，成本較高。在測定如ApoAI這樣的小分子量蛋白時(28kD)，雙抗夾心法對兩種抗體抗原識別簇(epitope)的空間位置有較嚴(yán)格的要求，二者之間必須有足夠的空間距離，否則由于位阻效應(yīng)無法得到結(jié)果。另外，雙抗夾心法線性范圍較小，一般不超過一個數(shù)量級。
2.直接競爭法直接競爭法簡單快速，應(yīng)用也較廣泛，主要過程為抗原包板→待測液與標(biāo)記抗體同時加入→板上包被抗原與待測液中游離抗原競爭標(biāo)記抗體→平衡后，洗板除去未結(jié)合抗原→加入酶底物檢測此法使用的酶標(biāo)抗體需根據(jù)不同抗原分別標(biāo)記，制備成本高。此外，直接競爭法靈敏度不高，線性范圍一般也只有一個數(shù)量級(10-100ng)(Gaver A，Weedy NK，Maldonado BR et al，Procedure for developmet of an enzyme-linkedimmunosorbent assay.Development of an assay for human apolipoprotein AI.Clinica Chimica Acta，1992；20823-27及Galban B，Macri J and Adeli K，Anamplified enzyme-linked immunosorbent assay for rapid and sensitivedetermination of apolipoprotein AI in plasma and tissue culture media.Ann ClinBiochem，1993；30404-406)。
3.相比之下，本方法有如下優(yōu)點(diǎn)(1)成本低。只使用一種一抗，且一抗不需標(biāo)記；酶標(biāo)二抗相對價(jià)格低廉，容易制備。大規(guī)模、高通量篩選時成本降低顯著。
(2)靈敏度高。本方法引入放射免疫法中的數(shù)學(xué)模型，改善了標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度區(qū)域的先行，靈敏度達(dá)3ng，最低可至1.5ng，比常規(guī)直接競爭法高3倍以上。
(3)線性范圍大。標(biāo)準(zhǔn)曲線從3ng到400ng都有很好的線性(R2＝0.996)，適于進(jìn)行高通量藥物篩選等樣品濃度變化較大的工作。
ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)用于藥物篩選方法(1)取5×104HepG2細(xì)胞(ATCC公司)接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5ml成分為10％胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml的MEM培液，于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時。
(2)加被篩選物質(zhì)(不同來源的化合物或混合物溶于DMSO中)于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)和細(xì)胞共同培養(yǎng)60小時。
(3)取50μl培養(yǎng)液測定ApoAI含量。測定方法見上述間接競爭ELISA法測定細(xì)胞培液中ApoAI濃度。
(4)中選化合物的選擇通過與40μg/ml Gemfibrozil培養(yǎng)后產(chǎn)生ApoAI量進(jìn)行比較來達(dá)到。被篩化合物所激發(fā)ApoAI蛋白產(chǎn)生超過Gemfibrozil激發(fā)產(chǎn)生量的50％以上者則為中選化合物。
應(yīng)用ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)ELISA篩藥系統(tǒng)篩選抗動脈粥樣硬化升HDL的藥物。
本發(fā)明的ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)ELISA篩藥系統(tǒng)可用于篩選單個或復(fù)合的合成化合物，可用于篩選植物提取的單個化合物或混合物及可用于篩選各種微生物代謝產(chǎn)物中的升高ApoAI的物質(zhì)，最終用于篩選升HDL藥之目的。
下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
圖1是ApoAI標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖2是已知ApoAI激發(fā)劑Gemfibrozil激發(fā)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ApoAI蛋白圖。
圖3是已知ApoAI激發(fā)劑Finofibrate激發(fā)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ApoAI蛋白圖。
實(shí)施例1材料與試劑(1)Ultra Pure Human Apolipoprotein AI蛋白，(Cat #11P-UP108，AcademyBio-Medical Company，Inc.)(2)Goat anti-human ApoAI，(Cat.#11A-G2-2b，Academy Bio-MedicalCompany，Inc.)(3)Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)，(Cat.#305-035-003，Jackson ImmunoResearch)
(4)96-well Nunc-ImmunoTMPlates，MaxiSorpTM，(Cat.#439454，NalgeNunc International)(5)普通96孔板(6)鄰苯二胺(O-Phenylenedimine，OPD)(7)牛血清白蛋白(BSA)(8)抗體稀釋和封閉緩沖液10mM磷酸鹽緩沖液，含1％(w/v)BSA，pH7.4；(9)底物緩沖液0.1mol/L檸檬酸，0.2mol/LNa2HPO4，用前每100ml加入30％ H2O20.15ml，OPD 60mg。
(10)顯色終止液2mol/L H2SO4。
(11)自動洗板機(jī)Wellwash Ascent，Labsystem，F(xiàn)inland(12)酶標(biāo)儀318-Microplate Reader，SANCO，Shanghai，China1)5×104HepG2細(xì)胞(ATCC公司)接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5ml成分為10％胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml的MEM培液，于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時。
2)不同濃度的已知ApoAI激發(fā)劑Gemfibrozil和Fenofibrate溶于DMSO中，于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)和細(xì)胞共同培養(yǎng)60小時。
3)取50μl培養(yǎng)液測定ApoAI含量。測定方法見上述間接競爭ELISA法測定細(xì)胞培液中ApoAI濃度。
4)測定結(jié)果見圖2和3。表1、ApoAI回收率表1
組1細(xì)胞培液組2樣品組1加入5μl 200ng/ml ApoAI純品
權(quán)利要求
1.一種酶聯(lián)免疫法(ELISA)，是間接競爭酶聯(lián)免疫法測定ApoAI待測抗原ApoAI與過量抗體混合孵育，反應(yīng)平衡時抗體以抗原-抗體復(fù)合物及游離抗體兩種形式存在；將此平衡混合物加入預(yù)先經(jīng)抗原包被的酶標(biāo)板中，混合物中的游離抗體被板上的抗原捕獲，抗原-抗體復(fù)合物則經(jīng)洗板除去；最后加入辣根過氧化物酶底物，經(jīng)顯色反應(yīng)檢測板上抗體的濃度，由此可推知待測抗原濃度，HrpAb2+Ab+Ag→HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab↓進(jìn)板HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓洗板HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓底物(OPD)酶標(biāo)儀492nm檢測HrpAb2—辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗Ab —一抗Ag —抗原Plate —酶標(biāo)板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶聯(lián)免疫法，具體方法如下1)抗原包板ApoAI稀釋至200ng/ml，加入酶標(biāo)板中，每孔50μl，置濕盒中，包板條件為37℃ 2小時或4℃ 16小時，蒸餾水洗板，每孔加入封閉液100μl，室溫放置1小時以上，用前再洗板；2)孵育在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待測培液或標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)濃度配制ApoAI等比梯度稀釋；抗體稀釋一抗1∶50000，二抗1∶20000；空白孔100μl緩沖液；最大結(jié)合孔50μl抗體混合液，50μl緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)/樣品孔每孔加入抗體混合液50μl，ApoAI標(biāo)準(zhǔn)或待測培液50μl；振蕩混勻，37℃ 2小時或4℃ 16小時孵育以上；3)抗體捕獲將96孔板中的孵育液轉(zhuǎn)移至包被好的酶標(biāo)板中，室溫反應(yīng)30分鐘，其間緩緩搖動；5)檢測以蒸餾水洗板，每孔加入100μl新配制的底物顯色液，避光放應(yīng)30分鐘，加入25μl終止液終止反應(yīng)，與酶標(biāo)儀波長492nm處測定吸光值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的酶聯(lián)免疫法，其中檢測后按以下公式分析計(jì)算(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)濃度讀數(shù)減去空白值后，按以下公式計(jì)算x=lnB/Bmax1-B/Bmax]]>B-標(biāo)準(zhǔn)濃度吸光值 Bmax-最大結(jié)合吸光值y＝lg CONCCONC 標(biāo)準(zhǔn)濃度(ng/ml)Y對X作線性回歸，回歸方程y＝-0.478x+1.628(R2＝0.9964)2)樣品濃度計(jì)算樣品讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)作同樣處理，根據(jù)以上回歸方程計(jì)算樣品中ApoAI抗原濃度。
4.ApoAI細(xì)胞靶標(biāo)ELISA篩藥系統(tǒng)篩選藥物的方法，(1)HepG2細(xì)胞接種培養(yǎng)，選擇以與ApoAI產(chǎn)生和代謝密切有關(guān)的細(xì)胞株HepG2為供篩選細(xì)胞株；(2)溶于DMSO中的被篩選物質(zhì)加于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)和細(xì)胞共同培養(yǎng)60小時；(3)取50μl培養(yǎng)液測定ApoAI含量。按權(quán)利要求1至3之一的方法測定細(xì)胞培液中ApoAI濃度；(4)被篩化合物所激發(fā)ApoAI蛋白產(chǎn)生超過Gemfibrozil激發(fā)產(chǎn)生量的50％以上者則為中選化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中被篩物質(zhì)為單個或復(fù)合的合成化合物，植物提取的單個化合物或混合物及各種微生物代謝產(chǎn)物中的升高ApoAI的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法篩選升HDL藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ApoAI ELISA間接測定法,該方法靈敏度高,測定濃度范圍大,操作簡單,便宜的ApoAI ELISA間接測定法。以該ApoAI ELISA測定法為主體,建立高通量升HDL藥篩藥系統(tǒng)。通過測定被篩選化合物激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生ApoAI蛋白的程度來篩選新一代升HDL抗動脈粥樣硬化藥。
文檔編號A61P9/10GK1366182SQ0110523
公開日2002年8月28日 申請日期2001年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月17日
發(fā)明者龔邦強(qiáng) 申請人:龔邦強(qiáng)