專利名稱：Afmk在制備具有自由基清除作用的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種褪黑激素衍生物在制備具有自由基清除作用的藥物中的應用。
自由基是指一類分子在最外圍軌道上含有未曾成對的電子，這類分子的化學反應性非?；顫?，有從其它的物質或分子獲取一個電子的趨勢。自由基是在生物氧化代謝過程中不可避免的附屬產物。生物所利用的氧，最終有2-4％最終轉變成自由基。如這些自由基逃逸出生物抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶及內外源性小分子抗氧化劑，這些自由基就會攻擊生物大分子物質，如蛋白質、細胞膜、DNA，造成這些大分子的變性和損傷，最終導致細胞或生物體結構的破壞與功能的喪失。根據(jù)目前為科學家廣泛接受的自由基理論，氧自由基與許多病理生理有直接或間接的聯(lián)系，其中包括衰老、老年性癡呆、帕金森病、心臟病、腫瘤、風濕性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、發(fā)熱性炎癥、痛風等臨床常見病多發(fā)病。
褪黑激素(melatonin)即N-乙?；?，是人體及哺乳動物體內的內源性物質，主要由位于大腦正中部位的松果體腺生成。近年來發(fā)現(xiàn)褪黑激素為目前強的內源性自由基清除劑，能延長實驗動物的壽命達30％，保護中樞神經系統(tǒng)對抗多種有毒物質的損傷，又發(fā)現(xiàn)對愛滋病有輔助治療效果。褪黑激素的半衰期短，僅為約40分鐘，需反復多次給藥才能維持的需要的治療濃度。褪黑激素的抗氧化作用為直接清除自由基，其通過受體介導的作用就成了副作用，例如導致嗜睡。因而，褪黑激素具有半衰期短，有一定的副作用的缺點。
本發(fā)明目的就在于克服褪黑激素半衰期短、存在一定毒副作用的缺點，提供一種化合物在制備具有強自由基清除作用的藥物中的應用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供如下化合物 N1-乙酰-N2-甲醛-5-甲氧基尿黑胺；N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine(AFMK)。
AFMK的理化性質為無味，淡黃色結晶，易溶于水和乙醇，在室溫下其化學結構穩(wěn)定，分子量264。
譚等于2000年將該物質的合成及結構鑒定的有關內容發(fā)表在美雜志上(Free Redical Biology & Medicine 2000,29:1177-1185),AFMK的合成方法為褪黑激素溶于高濃度的過氧化氫中(如(30％)，避光、靜置于室溫下24～48小時，褪黑激素大部分被氧化成AFMK。用氯仿提取，收集氯仿，真空干燥后再溶于甲醇，通過硅膠柱層析，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，真空干燥，可獲得較高純度的AFMK(90％以上)，合成效率(生成物比反應物)約為40％。終產物經電子轟擊質譜分析及H1核磁共振結構分析，證實其結構為AFMK,AFMK已被發(fā)現(xiàn)存在于動物體內，但是對其生物活性及功能的研究未見文獻報導。
我們發(fā)現(xiàn)，AFMK為一類高效的抗氧化自由基清除劑。對于由自由基誘導的脂質DNA損傷及海馬神經細胞的死亡具有強大的保護作用。其實驗依據(jù)如下一、AFMK抗氧化作用的機理，雙電子供給作用能直接還原氧自由基的小分子抗氧化劑，又稱為自由基清除劑，能夠直接提供電子給自由基來清除這些有害的分子。因此，測定自由基清除劑的氧化——還原電位可以評估這些物質的自由基清除能力。目前一種比較新穎的方法就是用循環(huán)電壓測定儀來達到這一目的。本實驗在測定AFMK的供電子能力時，將50毫摩爾濃度的AFMK(10％甲醇90％磷酸緩沖液100毫摩爾，PH7.4)溶液1毫升置于微循環(huán)電壓測定儀的測量室內。測定儀型號CV-50W(生物分析系統(tǒng)，westlafayette公司，美國)，在操作過程中，電壓-電流曲線記錄在循環(huán)電壓圖像儀上(圖一)。從圖一上可見，在電壓456和668毫伏處，有兩個正電極電流波。這顯示了AFMK可能存在著兩個供電子基團。AFMK在循環(huán)電壓場中能提供兩個電子的特征，提示此化合物為一高效抗氧化自由基清除劑，其作用應優(yōu)于經典的抗氧化劑維生素C，維生素E，谷胱甘肽等，這些傳統(tǒng)的抗氧化劑在循環(huán)電壓場中僅顯示一個正電極電流，也就是只能提供一個電子去中和自由基。
二、AFMK對生物膜脂質過氧化的保護作用脂質過氧化是細胞膜脂質受到氧自由基攻擊損傷的一個重要標志。為了檢測AFMK對細胞膜脂質過氧化的保護作用，用以下實驗方法。取大白鼠肝細胞進行勻漿(100毫克肝組織加入1毫升磷酸緩沖液PH7.5,50毫摩爾濃度)，漿液加入過氧化氫(H2O2)和兩價的鐵離子(Fe2+)一起溫育(37℃，一小時)，在實驗組標本中同時加入不同濃度的AFMK。實驗結果顯示，H2O2和Fe2+能使大白鼠肝細胞勻漿液的脂質過氧化物明顯增高，其機理為2價的鐵通過Fenton反應使H2O2還原成細胞毒性的羧基自由基，羧基自由基導致了細胞膜的損傷。AFMK能抑制大白鼠肝細胞勻漿液的脂質過氧化物生成，其抑制作用呈劑量依賴關系(圖二)，從而證明AFMK通過清除H2O2，還原成細胞毒性的羧基自由基，有效地保護了生物膜由H2O2和二價鐵離子(Fe2+)導致的脂質過氧化。
三、AFMK對由氧自由基引起DNA損傷的保護作用8-羧基脫氧鳥嘌呤核苷(8-OH-dG)是DNA受到氧化損傷的一個重要指標。8-OH-dG被認為是羧基自由基攻擊DNA所生成的具有特征性的產物，已被廣泛應用于檢測DNA損傷的一種有效的方法。本實驗中采用了小牛胸腺純DNA與H2O2和三價鉻離子(Cr3+)一起溫育(37℃,60分鐘)，三價的鉻離子能提供一個電子給H2O2，使其還原成細胞毒性的羧基自由基，羧基自由基攻擊DNA鏈上的鳥嘌呤堿基使其第8位上羧基化。然后加入核苷酸酶P1(Nuclease p1)消化DNA，使DNA水解成堿基核苷，再用高壓液相(HPLC)-電化學檢測儀來測定8-OH-dG結果顯示1、H2O2和Cr3+一起溫育的DNA,8-OH-dG的含量比正常對照組增加了大約20倍。2、AFMK能抑制由H2O2和Cr3+導致的8-OH-dG的升高，這種抑制呈明顯的劑量依賴關系(圖三)，當AFMK的濃度為5微摩爾時，8-OH-dG的生成被減少了80％，此實驗證明了AFMK有強大的DNA保護作用。
四、AFMK對培養(yǎng)神經細胞的保護作用海馬回神經元是與人類短期記憶關系最為密切的細胞。老年性癡呆發(fā)病原因之一就是海馬回神經元退行性病變。海馬回神經細胞株(HT22)被選擇作為本實驗的培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)方法為常規(guī)的細胞培養(yǎng)法，于DENEM培養(yǎng)液中加入10％小牛血清，被用作HT22海馬回神經細胞培養(yǎng)基質，然后，在溫度37℃,5％二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天換培養(yǎng)液一次。3-(4,5-dimethythiazol-zyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)被用于檢測神經細胞的存活率。具體方法為96孔培養(yǎng)板，每孔置于大約1500個細胞(100毫升培養(yǎng)液)，處理組細胞預先與AFMK一起培養(yǎng)24小時，讓細胞貼壁生長，再加入細胞毒性物質包括H2O2，谷氨酸和β-淀粉肽，共同培育16小時，然后加入MTT(最終濃度0.5毫克/毫升)一起培養(yǎng)(37℃,4小時)，藍色的沉淀物被溶于溶解液中(溶解液20％SDS,50％N,N-dimethylformamide,PH4.7)用培養(yǎng)板閱讀儀(UQuantBio-Tek Instruments In)在750納米處檢測細胞的存活率。所有的MTT分析至少重復3次，每次每組7個標本，所有資料都用于平均值加減標準誤表示(mean±SE)，統(tǒng)計學分析用ANOWA法，然后用StudentNewman-Reuls檢驗。當P值＜0.05時被認為有顯著性差異。
A、N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)對由H2O2誘導的海馬回神經細胞死亡的保護作用細胞培養(yǎng)條件如上所述，HT22細胞株單獨或與不同濃度(1/100微摩和1毫摩)的AFMK預先培育24小時，然后加入不同濃度的H2O2(25,50,100微摩)，H2O2為細胞代謝過程中的副產物，當達到一定濃度或在有過渡金屬如2價鐵離子和1價銅離子等存在時，能致細胞的氧化損傷。實驗結果顯示H2O2能誘導劑量依賴性的HT22細胞死亡，AFMK在100微摩濃度和1毫摩濃度都有能有效地保護H2O2誘導的培養(yǎng)的海馬回神經細胞死亡。在高濃度(1毫摩)保護率達100％(圖四)B、N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)對由谷氨酸誘導的海馬回神經細胞死亡的保護作用。
細胞培養(yǎng)條件如上所述，HT22細胞株單獨或不同濃度的AFMK預先培養(yǎng)24小時，然后再加入不同濃度的谷氨酸(5毫摩和10毫摩)，谷氨酸為興奮性氨基酸神經遞質，當濃度過高時可引起神經細胞內鈣過載，自由基產生，最終致細胞損傷。實驗結果顯示谷氨酸能誘導HT22細胞的死亡，AFMK對興奮性氨基酸-谷氨酸誘導海馬回神經細胞的死亡具有顯著的保護作用，這種保護作用呈劑量依賴關系，AFMK為100微摩爾濃度時保護率達15％,1毫摩爾達60％(圖五)。
C、N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)對由β-淀粉樣肽誘導的海馬回神經細胞死亡的保護作用細胞培養(yǎng)條件如上所述，HT22細胞株單獨或與不同濃度的AFMK預先培養(yǎng)24小時，然后再加入不同濃度(0.2,2和20微摩爾)的β-淀粉樣肽片斷(β-25-35)一起培育。β-淀粉樣肽被認為是老年性癡呆神經細胞病理改變、神經斑塊形成的主要物質，β-淀粉蛋白的沉積，導致自由基形成最終導致神經細胞死亡，實驗結果顯示β-淀粉樣肽片斷(β-25-35)能誘導HT22細胞的死亡。AFMK對由β-淀粉樣肽誘導的神經細胞死亡具有保護作用，這種保護作用具有顯著的統(tǒng)計學意義(圖六)。
通過上述的實驗結果，證明AFMK在分子和細胞水平具強大的抗氧化和自由基清除作用，具有潛在的臨床應用價值，可以加工成口服劑型，包括片劑、緩釋片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液，也可加工成注射液，包括粉針，注射液，還可加工成外用劑型，如透皮吸收膜劑、膏劑、霜劑，也可添加入化妝品中或作為防曬劑。
說明與結論N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)為一內源性生物胺，自然存在于人和動物體中。褪黑激素的氧化代謝可能為其主要來源。迄今為止，缺少對其生物活性及功能的研究。本發(fā)明通過對AFMK的深入研究，用可信賴的科學方法首次發(fā)現(xiàn)并證實了AFMK為一強大的內源性抗氧化自由基清除劑。采用新穎的循環(huán)電壓場技術，可以檢測到在456和668毫伏的電壓場內AFMK能形成2個正電極電流波，提示AFMK的化學結構可能存在著2個供電基團。提供電子用以中和氧自由基是經典的小分子抗氧化劑或自由基清除劑抗氧化作用必備的重要條件。經典的小分子抗氧化劑維生素C或維生素E在此電壓場中僅能形成一個正電極電流波。從理論意義上說AFMK的抗氧化自由基清除作用應當優(yōu)于傳統(tǒng)的抗氧化劑。
為了探討AFMK是否對生物大分子脂質DNA是否有保護作用，細胞膜脂質過氧化與DNA堿基氧化損傷的加成物8-羧基脫氧鳥苷被選好測定指標。脂質是組織細胞膜的主要成份，對于細胞膜的功能完整起關鍵作用。DNA為生物遺傳的基本物質，是所有生物信息的攜帶者。如果這些重要的生物大分子受到損傷，必將對細胞及生物的功能產生不利的影響。而氧自由基可以導致脂質的損傷產生脂質過氧化物，破壞細胞功能的完整性。氧自由基也可以攻擊DNA使堿基變性，導致疾病或腫瘤。實驗結果顯示，AFMK能有效地保護由于H2O2和兩價鐵所致的肝細胞均漿液的脂質過氧化及由H2O2和三價鉻所致的DNA損傷，這種保護作用呈明顯的量效關系。本實驗中的脂質過氧化和DNA堿基氧化被認為與羧基自由基形成有關。因為在H2O2與二價鐵及H2O2與三價鉻系統(tǒng)中都能通過Fenton反應生成羧基自由基。為了證實AFMK在細胞水平的抗氧化自由基清除作用，實驗中選用了HT22細胞株。HT22細胞株起源于大白鼠海馬回神經細胞，海馬回神經細胞被認為與記憶功能有密切的關系；老年性癡呆的記憶障礙也可能與患者海馬回神經細胞的退行性病變有關。在實驗中，我們采用了三種不同的細胞毒性物質，包括H2O2，谷氨酸和β-淀粉樣蛋白來誘導HT22細胞株死亡。這三種細胞毒性物質都認為與神經細胞的退行性病變有密切的關系，它們的共同點就是通過不同的途徑產生細胞毒性自由基。實驗結果顯示，這三種物質都可誘導培養(yǎng)的HT22海馬回神經細胞的死亡，而AFMK能夠有效的保護由各種不同的毒性物質引起的HT22海馬神經細胞損傷，其保護作用具有明顯的量效關系和顯著的統(tǒng)計學意義(圖四、五、六)。從以上的實驗結果可以證實，AFMK為一新型有效的內源性抗氧化自由基清除劑，其作用原理可能為提供電子以中和自由基。AFMK有能力提供2個電子，其抗氧化自由基清除能力可能優(yōu)于經典的抗氧化劑維生素C或維生素E。AFMK不僅能在分子水平保護脂質過氧化和DNA堿基氧化，而且也可在細胞水平保護由于不同的有害物質引起的神經細胞的死亡。
氧自由基與衰老，氧自由基與許多疾病的關系已得到越來越多實驗依據(jù)的支持。根據(jù)目前較為流行的衰老理論認為，自由基對細胞的累積損傷是衰老過程中的一個重要原因。氧自由基損傷也是許多疾病的病理病因之一。其中包括神經系統(tǒng)退行性疾病(老年性癡呆，帕金森病)，心臟病、腫瘤、風濕性關節(jié)病，類風濕性關節(jié)病，痛風以及失癥性疼痛。由于AFMK具有強大的抗氧化自由基清除作用，又為一內源性物質(提示可能無毒副作用)，對于臨床用于延緩衰老及預防和治療上述疾病有著潛在的應用價值。
通過實驗結果估計人體的有效劑量為2～10mg/天，每天1-4次。
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1AFMK的合成。
稱取褪黑激素5克，溶于30％的過氧化氫100毫升中，避光、靜置24～48小時，加入氯仿提取二次，每次400毫升，合并提取液，回收氯仿，殘渣用5毫升甲醇溶解，過硅酸柱層析，用乙酸乙酯洗脫，用分部收集儀收集已包含AFMK的部分，真空干燥，獲得純度90％以上的AFMK2克。
實施例2AFMK的顆粒劑的制備。
取AFMK適量，加淀粉、糖粉，制成顆粒劑。
實施例3AFMK的片劑的制備。
取AFMK適量，加淀粉、糖粉制粒，加硬脂酸鎂、滑石粉，通過壓片機壓片。
本發(fā)明不限于上述實施例。
權利要求
1.N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺在制備具有自由基清除作用的藥物中的應用，其結構式為，
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺加工成的劑型為口服劑型、包括片劑、緩釋片劑、膠囊劑、顆粒劑或口服液，或加工成注射液，包括粉針或注射液，加工成外用劑型，包括透皮吸收膜劑，膏劑或霜劑，或加工成化妝品。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備治療和預防神經系統(tǒng)退行性疾病的藥物。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備治療和預防心臟病的藥物。
5.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備治療和預防風濕性關節(jié)病、類風濕性關節(jié)病、痛風、失癥性疼痛的藥物。
6.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備延緩衰老的藥物。
全文摘要
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文檔編號A61P43/00GK1314151SQ0110760
公開日2001年9月26日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權日2001年2月28日
發(fā)明者譚敦憲, 顏美婷 申請人:譚敦憲, 顏美婷