專利名稱：一種抑制腫瘤生長(zhǎng)、清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種保健軟骨膠囊，特別涉及一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)，清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊及其制備方法。
目前市場(chǎng)出售幾種抑制腫瘤生長(zhǎng)的保健品，特別是鯊魚軟骨膠囊，如一種品牌為“海之寶”的鯊魚軟骨膠囊，由清華大學(xué)生命與工程研究院，清華大學(xué)天地科技發(fā)展有限公司聯(lián)合研制。該產(chǎn)品由鯊魚軟骨和地龍經(jīng)加工成粉末制備而成。另一種品牌為鯊魚軟骨和硬脂酸鎂經(jīng)加工成粉末配制而成。關(guān)于鯊魚軟骨膠囊抑制腫瘤的專利也有報(bào)導(dǎo)，如文獻(xiàn)1中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?61008613，名稱為“一種鯊魚軟骨膠囊及其制造工藝”的發(fā)明專利，該專利申請(qǐng)公開“一種鯊魚軟骨膠囊及其制造工藝，其特征是膠囊中鯊魚軟骨含量為80％至100％，膠囊的制造工藝為(1)將軟骨從鯊魚體內(nèi)取出；(2)將鯊魚軟骨進(jìn)行粉碎；(3)將鯊魚軟骨殺菌后封在膠囊中，二次殺菌后包裝。
雖然鯊魚軟骨具有防癌抗癌作用，但是鯊魚軟骨資源短缺，相應(yīng)價(jià)格也昂貴，不是公眾普遍可以承受的。另外鯊魚軟骨抑制腫瘤生長(zhǎng)的途徑較單一，因此保健功能不夠高。
本發(fā)明的目的在于尋找一種原料來源豐富，且價(jià)格便宜，具有防癌和抗癌功能的動(dòng)物軟骨；本發(fā)明的目的之二為了提高動(dòng)物軟骨抗癌和防癌的效率和擴(kuò)大抑制腫瘤的途徑；本發(fā)明的目的之三是為了提供一種制備方法簡(jiǎn)單，原料價(jià)格便宜，工藝簡(jiǎn)單，可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的方法，所制備的膠囊無化學(xué)甜味劑，無毒無害，從而提供一種動(dòng)物軟骨粉、維生素或天然抗氧化劑制作的具有抑制腫瘤，清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨膠囊及其制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種抑制腫瘤生長(zhǎng)，清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，主要填充物包括作為活性成分的動(dòng)物軟骨粉，還包括藥用維生素，其中維生素添加量為填充物總重量0-30％，余量為動(dòng)物軟骨粉。還包括加入按填充物總重量計(jì)5-12％的天然藥物粉(均以重量百分比計(jì)算)；動(dòng)物軟骨粉可以是豬、牛、羊、雞、鴨、陸生動(dòng)物和禽類、鯊魚等軟骨制做的；維生素可以是維生素C、A、E；天然藥物粉可以是茶多酚、銀杏葉提取物、丹參粉。
本發(fā)明的一種抑制腫瘤生長(zhǎng)，清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊及其制備方法，包括下列步驟將洗干凈的動(dòng)物軟骨在低于20℃下干燥，經(jīng)干燥后粉碎、研磨至小于60目的粉末，采用食品工業(yè)通用的紫外線殺菌消毒之后，與藥用維生素按總重量計(jì)含維生素0-30％，余量為動(dòng)物軟骨粉的比例稱料混合均勻，裝入醫(yī)用膠囊中再重復(fù)紫外殺菌消毒工藝，進(jìn)行包裝。
本發(fā)明提供的配方之一是按每粒膠囊內(nèi)的總填充物600mg計(jì)，添加總填充物重量0-30％的藥用維生素C，余量為動(dòng)物軟骨粉組成。
腫瘤的一個(gè)主要特征是無限生長(zhǎng)和到處轉(zhuǎn)移，這就需要大量營(yíng)養(yǎng)，因此腫瘤的形成必須在其周圍首先形成大量血管，以供應(yīng)其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)。已有技術(shù)所述的鯊魚軟骨的一個(gè)重要功能是可以抑制血管的形成，但是抑制率低且價(jià)格貴。如果腫瘤周圍不能形成血管，就得不到其生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，腫瘤生長(zhǎng)就被抑制。體內(nèi)需要氧自由基代謝平衡，只有氧自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡時(shí)，身體才能保持健康。如果體內(nèi)產(chǎn)生氧自由基過多或清除能力降低，體內(nèi)就有多余有害氧自由基，會(huì)引起細(xì)胞成分的損傷，細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，酶的失活，蛋白質(zhì)變性，DNA突變，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，最明顯的是癌，心血管疾病和衰老的發(fā)生。這時(shí)就需要引入外加的抗氧化劑和自由基清除劑，幫助體內(nèi)維持自由基代謝的平衡，防止這幾種嚴(yán)重疾病的發(fā)生。本發(fā)明利用在動(dòng)物軟骨粉中再加入水溶性抗氧化劑維生素C制成復(fù)合膠囊，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明既具有清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化，又能抑制腫瘤生長(zhǎng)具有保健功能。
經(jīng)過用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，喂食該膠囊可以抑制接種H22腫瘤生長(zhǎng)，而且該膠囊能夠清除有害氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化等作用，還具有抗衰老，抗心血管病功能。經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在Fenton反應(yīng)體系中，可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.045％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.0050％；在卵磷脂和細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.40％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該膠囊130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)26％。
本發(fā)明提供的配方2是按每粒膠囊內(nèi)的總填充物600mg計(jì)，添加總填充物重量3-7％的藥用維生素E，余量為動(dòng)物軟骨粉組成。其中維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，它與動(dòng)物軟骨粉有抑制腫瘤生長(zhǎng)的協(xié)同作用。
用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，喂食該膠囊可以抑制接種H22腫瘤生長(zhǎng)，而且該膠囊能夠清除有害氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化等作用，還具有抗衰老，抗心血管病功能。經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.30-0.35％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該配方的膠囊130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)20-35％。
本發(fā)明提供配方3是按每粒膠囊內(nèi)的總填充物600mg計(jì)，添加總填充物重量3-7％的藥用維生素E和15％-30％維生素C，余量為動(dòng)物軟骨粉組成。其中維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，可以和維生素C協(xié)同抗氧化和清除自由基，進(jìn)而與動(dòng)物軟骨協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的配方4在上述配方1中，再加入填充物總重量5-12％的茶多酚，余量為動(dòng)軟骨粉組成。
本發(fā)明提供的配方5是在上述配方3中，再加入填充物總重量5-12％的茶多酚，組成。以上兩個(gè)配方中使用了茶多酚，因?yàn)椴瓒喾邮羌瓤扇苡谒挚扇苡谟袡C(jī)溶劑的物質(zhì)，可以和水溶性維生素C和脂溶性維生素E協(xié)同提高本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊的保健功能，本發(fā)明提供的配方6在上述配方5中，再添加以填充物總重量0.5-1.5％的銀杏葉提取物組成。
本發(fā)明提供的配方7在上述配方3中，再添加以填充物總重量0.5-1.5％的銀杏葉提取物組成。
本發(fā)明提供的配方8是按每粒膠囊內(nèi)的填充物總重量600mg計(jì)，添加總填充物重量5-12％的丹參粉和余量為動(dòng)軟骨粉組成。
用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)方法同上，在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.05-0.06％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.02-0.25％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.2-0.25％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)15-25％。另外，用阿霉素誘導(dǎo)小鼠引起心臟病，每天喂食該膠囊130-270mg/kg，可減少阿霉素對(duì)小鼠的毒性。可以看出增加了丹參粉后，不僅是含有活性成份動(dòng)物軟骨粉具有抑制腫瘤作用，而增加丹參粉對(duì)心臟也有保護(hù)作用。
本發(fā)明提供的配方9在上述配方中，再添加總重量5-12％的丹參粉。配方6、7、8、9中增加天然藥物粉是為了進(jìn)一步提高本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊的保健功能，特別是對(duì)心臟的保健功能。
用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法如上所述，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，喂食該膠囊可以抑制接種H22腫瘤生長(zhǎng)，而且該膠囊能夠清除有害氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化等作用，還具有抗衰老，抗心血管病功能。經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.018-0.019％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.0012-15％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.115-0.120％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)30-46％。另外，用阿霉素誘導(dǎo)小鼠引起心臟病，每天喂食該膠囊130-270mg/kg，可減少阿霉素對(duì)小鼠的毒性?？梢钥闯鲈黾恿说⒎酆螅粌H協(xié)同增效作用進(jìn)一步增大，而且對(duì)心臟也有保護(hù)作用。
本發(fā)明的效果1.本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊中主要添加動(dòng)物軟骨粉，維生素和天然植物提取物，可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，其抑制率26-46％；2.本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊能夠有效清除有害氧自由基，其消除羥基自由基的Ic50＝0.045-0.050％；其清除超氧陽離子自由基的Ic50＝0.0050-0.012％；3.本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用Ic50＝0.115-0.120％；4.本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊可能還具有抗衰老抗心血管病功能；5.本發(fā)明的動(dòng)物軟骨膠囊選用藥膳同源的天然食用動(dòng)物軟骨粉，維生素和天然植物提取物為原料，各組分符合藥政法規(guī)定，利用各組分之間的協(xié)同作用，達(dá)到有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，清除有害自由基，防止脂質(zhì)過氧化的作用；6.本發(fā)明無須煎煮，無苦澀感，服用方便，符合國(guó)家食品衛(wèi)生法規(guī)定；7.本發(fā)明的膠囊，原料易得，價(jià)格便宜；8.本發(fā)明不含任何其它添加劑，對(duì)人體無害無毒；9.制備方法簡(jiǎn)單，采用通常干燥，粉碎，殺菌消毒工藝，易于工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明的用途1.本發(fā)明用于抑制腫瘤生長(zhǎng)，適用劑量8-12粒/次，每日3次；2.本發(fā)明能夠有效清除人體內(nèi)有害氧自由基；3.本發(fā)明可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用；4.本發(fā)明還具有預(yù)防心血管病的功能；圖1 AAA對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用；圖2 AAA對(duì)黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除作用。
圖3 AAA對(duì)羥基自由基引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用。


說明書、圖和表中AAA代表本發(fā)明的動(dòng)物軟骨粉保健膠囊。
實(shí)施例1配制按每粒膠囊100mg計(jì)，取豬軟骨粉+維生素C+維生素E+茶多酚+丹參粉+銀杏葉提取物＝67.5mg+13.5mg+6mg+6mg+6,3mg+0.7mg組成。其制備方法是將豬軟骨經(jīng)清洗干凈，放在烘箱內(nèi)20℃烘干，再用食品加工器粉碎，經(jīng)研磨通過60目孔篩，把按上述比例稱好的料經(jīng)通常食品工業(yè)用的紫外線消毒裝置照射消毒后，與醫(yī)用維生素、天然藥物粉混合均勻裝入醫(yī)用膠囊內(nèi)，再重復(fù)紫外消毒一次包裝即可。
上述制備的復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生羥基自由基的清除作用羥基自由基是所有氧自由基中氧化性質(zhì)最強(qiáng)的自由基，壽命極短(10-6)，反應(yīng)性極強(qiáng)，它可以和細(xì)胞所有成分發(fā)生反應(yīng)，引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，酶的失活和蛋白質(zhì)的變性，造成DAN突變。
本實(shí)驗(yàn)采用Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生羥基自由基，用自旋捕集ESR技術(shù)或化學(xué)發(fā)光法，檢測(cè)產(chǎn)生的羥基自由基，本發(fā)明動(dòng)物軟骨膠囊可以有效清除在這一體系中產(chǎn)生的羥基自由基，其清除羥基自由基的Ic＝0.018％。
一、配制復(fù)合豬軟骨提取溶液1.本實(shí)施例配制的100mg/粒復(fù)合豬軟骨膠囊(67.5％豬軟骨粉，13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉，0.7％銀杏葉提取物)溶于1ml磷酸緩沖液，振蕩，離心，取上清液，作為實(shí)驗(yàn)用。
2.H2O20.5％，自旋捕集劑DMPO(5，5’dimethyl-pyrroline-oxyl，SigmaChemCo.)0.4mol/L。
3.Fe(NH4)2SO4溶于pH5.0弱酸中。
二、復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基的清除作用用Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生羥基自由基，用自旋捕集劑DMPO捕集產(chǎn)生的羥基自由基，用ESR或用化學(xué)發(fā)光技術(shù)測(cè)量產(chǎn)生的羥基自由基。在此體系中加入步驟一制做的復(fù)合豬軟骨提取液，測(cè)量復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)羥基自由基的清除作用。具體反應(yīng)體系為1.10μlPBS+10μlH2O2+10μlFe2++10μlDMPO2.10μl(0.0035％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlH2O2+10μlFe2++10μlDMPO3.10μl(0.035％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlH2O2+10μlFe2++10μlDMPO4.10μl(0.35％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlH2O2+10μlFe2++10μlDMPO5.10μl(3.5％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlH2O2+10μlFe2++10μlDMPO利用下式計(jì)算清除率E=Ho-HxHo×100%]]>這里Ho和Hx分別為對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣品自由基的濃度。
三、結(jié)果表1和圖1給出了復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用。
表1復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用濃度(％) OH(相對(duì)濃度) 清除率(％)0 840，860，720，800 00.017 553，600，500 31.6±5.070.17 258，300，350 62.4±4.71.7 100，96，9887.8±6.213.4 22，20，21 97.4±0.28由表1的數(shù)據(jù)和圖1的清除曲線可以看出復(fù)合豬軟骨膠囊可以有效清除Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基，其清除羥基自由基的IC50＝0.018％。實(shí)施例2制備方法及配方同實(shí)施的1相同，復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/XO)體系產(chǎn)生O2的清除作用復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/XO)體系產(chǎn)生O2-有清除作用，O2-是體內(nèi)產(chǎn)生的第一個(gè)氧自由基，它可以直接和細(xì)胞成分反應(yīng)，O2-也可以插入DNA引起細(xì)胞突變，產(chǎn)生細(xì)胞毒性和損傷。另外它還可以歧化生成H2O2，再經(jīng)Fenton反應(yīng)生成羥基自由基，引起細(xì)胞成分的損傷。本實(shí)驗(yàn)采用X/XO體系產(chǎn)生O2-，用ESR技術(shù)或Luminol的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)產(chǎn)生O2-。復(fù)合豬軟骨膠囊可以有效清除這一體系產(chǎn)生的O2-，其清除O2-的Ic50＝0.0012％一、溶液配制1.100mg復(fù)合豬軟骨膠囊(67.5％豬軟骨粉，13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉，0.7％銀杏葉提取物)溶于1ml磷酸緩沖液，振蕩，離心，取上清液，作為實(shí)驗(yàn)用。2.黃嘌呤50mg/l，黃嘌呤氧化酶35U/ml，自旋捕集劑DMPO0.4mol/L。
二、復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基的清除作用用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，用DMPO捕集產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，用ESR或化學(xué)發(fā)光技術(shù)測(cè)量產(chǎn)生的超氧陰離子自由基。在體系中加入復(fù)合豬軟骨膠囊提取液，測(cè)量復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。
具體反應(yīng)體系為1.10μlPBS+10μlX+10μlXO++10μlDMPO2.10μl(0.0035％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlX+10μlXO+10μlDMPO3.10μl(0.035％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlX+10μlXO+10μlDMPO4.10μl(0.35％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlX+10μlXO+10μlDMPO5.10μl(3.5％)復(fù)合豬軟骨膠囊+10μlX+10μlXO+10μlDMPO利用下式計(jì)算清除率E=Ho-HxHo×100%]]>這里Ho和Hx分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)樣品自由基的濃度。
三、結(jié)果表2和圖2給出了復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除作用。表2復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除作用。濃度 O2-(相對(duì)濃度)清除率(％)0590，650，489，459 00.0018 355，400，415 28.7±4.70.01879，78，76 85.8±0.220.18 7.0，10，1198.3±0.311.8 1.8，2.1，2.0 99.6±0.05由表2的數(shù)據(jù)和圖2的清除曲線可以看出復(fù)合豬軟骨膠囊可以有效清除黃嘌呤/呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，其清除超氧陰離子自由基的IC50＝0.0012％。實(shí)施例3配制每粒復(fù)合豬軟骨膠囊100mg計(jì)，其中添充物為13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉，0.7％銀杏葉提取物，余量為豬軟骨粉組成，該復(fù)合豬軟骨膠囊有抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用；制備方法與實(shí)施1相同。
紅細(xì)胞在血液中具有攜帶和運(yùn)輸O2的作用，很容易引起氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化。細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)生細(xì)胞膜脂質(zhì)斷裂形成醛類，典型的是丙二醛。利用TBA與MDA反應(yīng)生成TBA反應(yīng)物TBARS可以定量測(cè)定紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度。本實(shí)驗(yàn)采用Fenton反應(yīng)引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，復(fù)合豬軟骨膠囊可以有效抑制該體系產(chǎn)生的TBARS。其抑制脂質(zhì)過氧化的IC50＝0.115％，實(shí)驗(yàn)如下一、溶液配制1.取上述配制的100mg復(fù)合豬軟骨膠囊(67.5％軟骨粉，13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉，0.7％銀杏葉提取物)溶于1ml磷酸緩沖液，振蕩，離心，取上清液，作為實(shí)驗(yàn)用；2.紅細(xì)胞膜的提取，健康志愿者獻(xiàn)血，肝素抗凝，離心沉淀收集紅細(xì)胞，用冷凍低滲溶液漲破紅細(xì)胞，高速離心沉淀紅細(xì)胞膜，用磷酸緩沖液洗滌后待用。
3.Fe(NH4)2SO4溶于pH5.0弱酸中；4.TBA0.65mg/ml；5.甲醇∶丁醇85∶15二、復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用1.對(duì)照140μlPBS+20μlPBS+300μl紅細(xì)胞膜+50μlTBA+500μlHCl2.對(duì)照240μlPBS+20μlFe2++300μl紅細(xì)胞膜+50μlTBA+500μlHCl3.AAA40μl復(fù)合豬軟骨膠囊(0.0029％)+20μlFe2++300μl紅細(xì)胞膜+50μlTBA+500μlHCl4.AAA40μl復(fù)合豬軟骨膠囊(0.029％)+20μlFe2++300μl紅細(xì)胞膜+50μlTBA+500μlHCl5.AAA40μl復(fù)合豬軟骨膠囊(0.29％)+20μlFe2++300μl紅細(xì)胞膜+50μlTBA+500μlHCl6.AAA40μl復(fù)合豬軟骨膠囊(2.9％)+20μlFe2++300μl紅細(xì)胞膜+50μlTBA+500μlHCl以上樣品在95oC溫育40分鐘，冷卻到室溫后用甲醇丁醇抽提，有機(jī)相在532nm處測(cè)定光吸收，利用下式計(jì)算復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的抑制率。E=Ho-HxHo×100%]]>這里Ho和Hx分別為對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣品自由基的濃度。
三、結(jié)果表3和圖3給出了復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)羥基自由基引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用。
表3復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)羥基自由基引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用樣品 光吸收(532nm)抑制率(％)平均抑制率(％)對(duì)照21.0954
0.98461.00140 0復(fù)合豬軟骨膠囊(0.0029％)0.9533 8.40.918211.8 8.5±2.650.98565.3復(fù)合豬軟骨膠囊(0.029％)0.7793 25.10.785126.00.770225.0 25.4(0.45)復(fù)合豬軟骨膠囊(0.29％)0.500051.90.483853.50.463757.4 54.3(2.31)復(fù)合豬軟骨膠囊(2.9％)0.2605 75.00.527275.80.265674.5 75.1(0.54)由表3的數(shù)據(jù)和圖3的抑制曲線可以看出，本發(fā)明的復(fù)合豬軟骨膠囊可以有效抑制羥基自由基引起紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，其IC50＝0.115％。實(shí)施例4復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用癌的發(fā)生和發(fā)展都有自由基的產(chǎn)生和參與，致癌和促癌作用都與自由基有密切關(guān)系。因此，自由基清除劑應(yīng)對(duì)腫瘤有抑制作用。用軟骨和天然抗氧化劑科學(xué)配制而成的復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用H22腹水癌細(xì)胞接種于小鼠腋下形成實(shí)體瘤。分成兩組，每組20只小鼠，一組正常飲食，一組除正常飲食外，每天喂食復(fù)合豬軟骨膠囊270mg/kg，7天后將小鼠處死，分離瘤體，稱重，列于表8.由表中數(shù)據(jù)可以看出，復(fù)合豬軟骨膠囊可以抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)37.45％左右。
一、溶液的配制675g復(fù)合豬軟骨膠囊(67.5％軟骨粉，13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉0.7％銀杏葉提取物)溶在20ml蒸餾水中，形成懸浮液。
二、H22腫瘤的接種0.2mlH22腹水癌細(xì)胞注射在小鼠腹腔，培養(yǎng)三天，將腹水取出，用生理鹽水稀釋。將稀釋的H22細(xì)胞0.2ml接種到40只雄性小鼠(25g左右)腋下。隨機(jī)將小鼠分為兩組，每組20只，一組每天灌注0.2ml步驟1配制的復(fù)合豬軟骨膠囊懸浮液，另一組灌注0.2ml蒸餾水。
三、H22實(shí)體瘤的檢測(cè)將喂食7天的小鼠處死，從腋下分離H22實(shí)體瘤，稱重。
四、結(jié)果1.對(duì)照小鼠組和喂食本實(shí)施例配制的復(fù)合豬軟骨膠囊小鼠腋下實(shí)體瘤的重量如表5所示，其對(duì)小鼠接種H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用由下式計(jì)算

表4本實(shí)施例的復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)H22實(shí)體瘤的抑制作用N 對(duì)照(g) 復(fù)合豬軟骨(g)1 2.22.02 2.21.83 2.01.54 2.01.45 2.01.46 1.81.37 1.81.38 1.71.291.6 1.210 1.5 1.011 1.4 0.912 1.4 0.813 1.3 0.714 1.2 0.615 1.2 0.516 1.2 0.417 1.1 0.418 1.1 0.419 1.0 0.320 1.0 0.31.55±0.40 0.97+0.501.55-0.971.55×100%=37.5%]]>由以上結(jié)果可以看出，復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)接種H22腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑制率為37.5％左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p＜0.05，有顯著差異。實(shí)施例5本發(fā)明的復(fù)合豬軟骨膠囊與鯊魚軟骨對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用的比較為了進(jìn)一步比較豬復(fù)合軟骨膠囊和鯊魚軟骨對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用H22腹水癌細(xì)胞接種于小鼠腋下形成實(shí)體瘤。隨機(jī)分成四組，每組15只小鼠，一組正常飲食，一組除正常飲食外，每天喂食復(fù)合豬軟骨膠囊270mg/kg，另外兩組分別喂食270mg/kg鯊魚軟骨，7天后將小鼠處死，分離瘤體，稱重，列于表5.由表中數(shù)據(jù)可以看出，復(fù)合豬軟骨膠囊可以抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)46.5％左右，鯊魚軟骨抑制13.9％左右。
一、溶液的配制675g復(fù)合豬軟骨膠囊(67.5％軟骨粉，13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉0.7銀杏葉提取物％)和鯊魚軟骨(美國(guó)超健康產(chǎn)品有限公司制備)分別溶在20ml蒸餾水中，形成懸浮液。再提供20ml蒸餾水。
二、H22腫瘤的接種0.2mlH22腹水癌細(xì)胞注射在小鼠腹腔，培養(yǎng)三天，將腹水取出，用生理鹽水稀釋。將稀釋的H22細(xì)胞0.2ml接種到45只雄性小鼠(25g左右)腋下。隨機(jī)將小鼠分為四組，一組每天灌注0.2ml復(fù)合豬軟骨膠囊懸浮液，一組每天灌注0.2ml鯊魚軟骨懸浮液，另一組灌注0.2ml蒸餾水。
三、H22實(shí)體瘤的檢測(cè)將喂食7天的小鼠處死，從腋下分離H22實(shí)體瘤，稱重。
四、結(jié)果1.對(duì)照小鼠和喂食復(fù)合豬軟骨膠囊和鯊魚軟骨小鼠腋下實(shí)體瘤的重量如表5所示。復(fù)合豬軟骨膠囊和鯊魚軟骨對(duì)小鼠接種H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用由下式計(jì)算

表5本發(fā)明的復(fù)合豬軟骨膠囊和鯊魚軟骨對(duì)H22實(shí)體瘤抑制作用的比較N 對(duì)照(g) 復(fù)合豬軟骨膠囊(g) 美國(guó)鯊魚軟骨(g)l 0.88 0.18 0.302 1.04 0.18 0.553 0.62 0.60 0.554 0.89 0.45 1.575 0.68 0.56 0.696 0.78 0.25 0.417 1.56 0.28 0.328 0.64 0.49 0.869 0.48 0.60 1.2410 1.27 1.34 0.7111 1.02 0.35 0.9712 0.76 0.49 0.9313 0.96 0.35 0.6814 0.68 0.24 0.6615 0.69 0.560.86±0.070.460±080.740±.120.86-0.460.86×100%=46%]]>0.86-0.740.86×100%=13.9%]]>由以上結(jié)果可以看出，復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)接種H22腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑制率為46％左右。鯊魚軟骨對(duì)H22腫瘤也有明顯抑制作用，抑制率分別為14％左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p＜0.05，有顯著差異。復(fù)合豬軟骨膠囊抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力大大超過鯊魚軟骨膠囊。實(shí)施例6本發(fā)明的復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)阿霉素引起小鼠心臟病的保護(hù)作用很多治療腫瘤的藥物都有副作用，阿霉素的副作用就是對(duì)心臟的損傷。本發(fā)明利用阿霉素建立心臟損傷模型，檢驗(yàn)復(fù)合豬軟骨膠囊對(duì)心臟病的保護(hù)作用，但是，阿霉素?fù)p傷心肌的電鏡照片不明顯，實(shí)驗(yàn)無法判斷對(duì)心臟病的保護(hù)作用。但本發(fā)明的復(fù)合豬軟骨膠囊除含有動(dòng)物軟骨外，還含有多種天然抗氧化劑和治療心臟病的中藥成分，如銀杏葉提取物和丹參粉。本發(fā)明的復(fù)合豬軟骨膠囊應(yīng)當(dāng)對(duì)心臟病具有保護(hù)作用。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，阿霉素組，小鼠死亡率為46％，復(fù)合豬軟骨膠囊組為零。
一、溶液的配制1.分別將阿霉素和675g復(fù)合豬軟骨膠囊(67.5％軟骨粉，13.5％維生素C，6.0％維生素E，6％茶多酚，6.3％丹參粉，0.7％銀杏葉提取物)溶在20ml蒸餾水中，形成懸浮液。
2.20ml蒸餾水。
二、阿霉素和豬軟骨膠囊的注射隨機(jī)將30只小鼠分為二組，一組15只每天腹腔注射0.2ml阿霉素，另一組15只除每天注射注射0.2ml阿霉素外，每天灌注0.2ml復(fù)合豬軟骨膠囊懸浮液。10天以后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿霉素組，小鼠死亡率為46％，復(fù)合豬軟骨膠囊組為零。實(shí)施例7按600mg/粒計(jì)，其配方為占總填充物15％的維生素C和7％的維生素E，余量為主要填充物豬軟骨粉，制備方法同實(shí)施例1用每組20小鼠作實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，喂食該膠囊可以抑制接種H22腫瘤生長(zhǎng)，而且該膠囊能夠清除有害氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化等作用，還具有抗衰老，抗心血管病功能。經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.020-25％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.0040-0.0045％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.30-0.35％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該膠囊130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)20-35％。因?yàn)榫S生素E是脂溶性的，可以和維生素C協(xié)同抗氧化，進(jìn)一步和軟骨協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)?？梢钥闯鲈黾恿司S生素E后，具有協(xié)同增效作用。實(shí)施例8按實(shí)施例7的配方中再添加占總填充物重量12％的茶多酚，25％維生素C、5％維生素E和余量為動(dòng)物軟骨粉(豬、牛、羊、鯊魚、雞、鴨均可)，做成600mg/粒保健膠囊，制備方法同實(shí)施例1用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)表明在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.025-0.030％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.0022-0.0030％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.20％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)35-40％。因?yàn)椴瓒喾泳哂兄p溶性，可以和維生素E及維生素C協(xié)同抗氧化，可以看出增加了茶多酚后，協(xié)同增效作用更大。實(shí)施例9按實(shí)施例1的方法制做600mg/粒的本發(fā)明膠囊，其配比為占總填充物重量30％維生素C，12％茶多酚，余量為豬軟骨粉；用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)方法同前，實(shí)驗(yàn)表明在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.02-0.025％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.002-0.0025％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.15-20％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)25-30％。因?yàn)椴瓒喾泳哂兄p溶性，可以和維生素E及維生素C協(xié)同抗氧化，可以看出增加了茶多酚后，協(xié)同增效作用更大。實(shí)施例10
按實(shí)施例1的方法制做600mg/粒的本發(fā)明膠囊，其配比為占總填充物重量5％維生素C，12％維生素E，3％維生素A，0.5％茶多酚，1.5％銀杏葉提取物1.5％，和余量為豬軟骨粉。
用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)方法同前，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，喂食該膠囊可以抑制接種H22腫瘤生長(zhǎng)，而且該膠囊能夠清除有害氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化等作用，還具有抗衰老，抗心血管病功能。經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.020-0.025％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.0015-0.020％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.12-0.15％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該膠囊130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)20-25％。因?yàn)殂y杏葉提取物活性成分也具有抗氧化和抗癌作用，可以看出增加了銀杏葉提取物后，與軟骨有協(xié)同增效作用。實(shí)施例11按實(shí)施例1的方法制做600mg/粒的本發(fā)明膠囊，其配比為；占總填充物重量15％維生素C，3％維生素E，6％茶多酚，0.5％銀杏葉提取物1.5％，和余量為豬軟骨粉。
用每組20只小鼠作實(shí)驗(yàn)方法同前，實(shí)驗(yàn)表明，在Fenton反應(yīng)體系中，該膠囊可有效清除反應(yīng)活性最大的羥基自由基，清除該體系產(chǎn)生的羥基自由基的Ic50＝0.018-0.020％；該膠囊可有效清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，在該體系其清除超氧陰離子自由基的Ic50＝0.0012-0.015％；在卵磷脂和紅細(xì)胞膜體系中，該膠囊可以有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物MDA的形成，其抑制MDA的Ic50＝0.115-0.12％；在小鼠接種H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，除正常飲食外，每天喂食該膠囊130-270mg/kg，連續(xù)7天，與對(duì)照組相比可以抑制腫瘤生長(zhǎng)30-44％。因?yàn)殂y杏葉提取物活性成分也具有抗氧化和抗癌作用，可以看出增加了銀杏葉提取物后，協(xié)同增效作用進(jìn)一步增大。
權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于主要填充物包括作為活性成分的動(dòng)物軟骨粉，還包括藥用維生素；其中藥用維生素占填充物總重量的0-30％，余量為動(dòng)物軟骨粉。
2.按權(quán)利要求1所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于還包括添加占填充物總重量的5-12％的天然藥物粉。
3.按權(quán)利要求1、2所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述的動(dòng)物軟骨，包括豬、牛、羊、雞、鴨、兔陸生和禽類的動(dòng)物軟骨以及鯊魚軟骨。
4.按權(quán)利要求1所述的具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述添加的藥用維生素占填充物總重量的0-30％的維生素C。
5.按權(quán)利要求1、2所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述的添加藥用維生素占填充物總重量的3-7％的維生素E。
6.按權(quán)利要求1、2所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述的添加藥用維生素占填充物總重量的3-7％的維生素A。
7.按權(quán)利要求2所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述的添加天然藥物粉包括占填充物總重量的的5-12％茶多酚。
8.按權(quán)利要求2所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述的添加天然藥物粉包括占填充物總重量的0.5-1.5％的銀杏葉提取物。
9.按權(quán)利要求2所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊，其特征在于所述的添加天然藥物粉包括占填充物總重量的5-12％的丹參粉。
10.一種制備權(quán)利要求1-9所述的抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊方法，包括依下列步驟進(jìn)行(1)取清洗干凈動(dòng)物軟骨，在低于20℃下干燥；(2)干燥后的動(dòng)物軟骨經(jīng)通常粉碎方法粉碎成60目以下的粉末，經(jīng)用食品加工業(yè)通用的紫外線殺菌消毒裝置進(jìn)行消毒，之后，按裝入每粒膠囊中的填充物總重量的0-30％藥用維生素，余量為動(dòng)物軟骨粉的比例配料，經(jīng)混合均勻裝入醫(yī)用膠囊；(3)把已裝好的醫(yī)用膠囊再重復(fù)紫外殺菌消毒包裝。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的動(dòng)物軟骨保健膠囊及制法,本發(fā)明的保健膠囊主要填充物為動(dòng)物軟骨粉,還包括添加藥用維生素,其中藥用維生素按總填充物重量0—30%添加,余量為動(dòng)物軟骨粉,還可以加入天然藥物粉,制備方法是將動(dòng)物軟骨干燥、粉碎、消毒、混合之后再消毒殺菌包裝,本發(fā)明的保健膠囊可抑制腫瘤生長(zhǎng),抗衰老,對(duì)心血管有保健功能。制備方法簡(jiǎn)單,易于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P3/02GK1259353SQ9910007
公開日2000年7月12日 申請(qǐng)日期1999年1月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月7日
發(fā)明者張春愛, 趙保路, 忻文娟, 侯京武 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所