專利名稱：抗白血病和腫瘤耐藥性的bc1－2基因反義核酸藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗白血病和腫瘤耐藥性的bcl-2基因的反義核酸藥物。
砷劑作為凋亡誘導(dǎo)劑用于白血病的治療已引起人們關(guān)注，我國學(xué)者在三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床和基礎(chǔ)研究方面取得的進(jìn)展令人矚目。但由于砷劑的毒副反應(yīng)大，進(jìn)入人體的砷約有80％停留在肝、腎、胃腸壁、脾、肺等全身組織，主要經(jīng)腎臟和胃腸道排泄，易對人體的肝、腎等產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。而且通過與含巰基結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合，易在頭發(fā)、指甲、骨骼中蓄積并且使得含巰基的酶失活，如丙酮酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、脫氧核糖核酸聚合酶等，嚴(yán)重干擾機(jī)體的代謝，細(xì)胞的氧化過程，易致癌、致突變。砷劑的毒副作用與劑量成正相關(guān)，若能找到協(xié)同作用的藥物，聯(lián)合使用，既能提高和加強(qiáng)其療效，同時又能控制砷劑的用量在一定范圍內(nèi)，將使砷劑的使用更加安全。
腫瘤耐藥是成功治療白血病的主要障礙之一。目前有大量研究表明大部分的抗腫瘤化療藥物引起細(xì)胞死亡的機(jī)理是通過引起細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡基因的過度表達(dá)引起腫瘤細(xì)胞對大多數(shù)抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性。
白血病癌基因(bcl-2)是迄今為止功能研究得最明確的細(xì)胞凋亡的拮抗基因。本發(fā)明人等在1998年第14(6)期《中國病理生理雜志》591～594頁《bcl-2基因反義核苷酸對HL-60和K562細(xì)胞的影響》一文中報道，應(yīng)用互補(bǔ)于bcl-2基因mRNA的翻譯起始部位設(shè)計的全硫代的反義寡核苷酸體外作用于K562和HL-60細(xì)胞可下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞對化療藥物阿糖胞苷的敏感性。反義技術(shù)的引入，給由于bcl-2基因過度表達(dá)引起的白血病細(xì)胞的耐藥的逆轉(zhuǎn)帶來希望。
本發(fā)明的目的就是提供一種抗白血病和腫瘤耐藥性的bcl-2基因反義核酸，根據(jù)反義技術(shù)原理，針對bcl-2基因的mRNA蛋白編碼區(qū)對反義核酸較敏感位點設(shè)計bcl-2基因反義寡核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種能增加白血病和腫瘤細(xì)胞對三氧化二砷敏感性，提高其治療效果，降低三氧化二砷用量和毒副作用的反義藥物，與三氧化二砷聯(lián)合作用，共同下調(diào)bcl-2基因的表達(dá)，提高細(xì)胞對砷劑的敏感性，相應(yīng)減少砷劑的用量，從而具有抗白血病和腫瘤耐藥性的藥，使之安全高效地應(yīng)用于臨床治療。
上述的發(fā)明目的是通過分別由如下技術(shù)方案實現(xiàn)的根據(jù)反義技術(shù)原理，設(shè)計出具有藥用價值的bcl-2基因反義寡脫氧核糖核苷酸(ASODN)，其序列為5’-ATCCTCCCCCAGTTCACC-3’。18個經(jīng)全硫代修飾，使其具有抗核酸酶作用。
能增加自血病和腫瘤細(xì)胞對三氧化二砷敏感性，提高其治療效果，降低三氧化二砷用量和毒副作用的反義藥物，由10～40μmol/L上述的bcl-2的基因反義寡核苷酸、0.25～2.0μmol/L三氧化二砷和鈉離子、氯離子、水組成。
發(fā)明人選用急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4和慢性髓系白血病急變細(xì)胞株K562作靶細(xì)胞，通過本發(fā)明設(shè)計的bcl-2基因反義寡核苷酸、三氧化二砷、及兩者聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實驗，實驗證明該bcl-2基因反義寡核苷酸有較強(qiáng)的下調(diào)bcl-2基因的表達(dá)，抑制白血病細(xì)胞的生長的作用，bcl-2基因反義寡核苷酸與三氧化二砷聯(lián)合作用可共同下調(diào)bcl-2基因的表達(dá)，提高細(xì)胞對砷劑的敏感性和砷劑的療效，相應(yīng)減少砷劑的用量，使之安全高效地應(yīng)用于臨床。
實驗用流式細(xì)胞儀碘化丙啶(PI)染色法測定細(xì)胞DNA含量，低于合成前期(G1期)DNA含量的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，從而可測定凋亡細(xì)胞數(shù)量。用免疫熒光測定bcl-2蛋白的表達(dá)。
實驗結(jié)果見表1～2和附

圖1～13
表一、As2O3與ASODN聯(lián)合誘導(dǎo)NB4和K562細(xì)胞凋亡百分率(％)。(取指數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于24孔板，置于5％CO2培養(yǎng)箱中，ASODN濃度10μmol/L，SODN(正義寡脫氧核糖核苷酸)濃度10μmol/L，空白對照組加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液，作用96小時，對K562細(xì)胞，As2O3濃度為2.0μmol/L，對NB4細(xì)胞，As2O3濃度為0.25μmol/L，)
表一所示，As2O3(2.0μmol/L)+ASODN(10μmol/L)聯(lián)合作用于K562細(xì)胞96小時流式細(xì)胞儀測定凋亡百分率為38.45％，與單用As2O3(2.0μmol/L)、ASODN(10μmol/L)凋亡百分率相比，單因素方差分析有顯著差異(p＜0.01)，而As2O3(2.0μmol/L)+SODN(10μmol/L)凋亡百分率為11.33％，與單用As2O3(2.0μmol/L)相比無顯著性差異(p＞0.05)。As2O3(0.25μmol/L)+ASODN(10μmol/L)聯(lián)合作用于NB4細(xì)胞96小時，凋亡百分率為34.67％，與單用As2O3、ASODN相比，單因素方差分析有顯著差異(p＜0.01)，而聯(lián)用SDON組與單用As2O3相比無差異。
表二、流式細(xì)胞儀檢測K562和NB4細(xì)胞bcl-2陽性率(％)，作用96小時。
表二所示為As2O3與bcl-2ASODN對K562及NB4細(xì)胞聯(lián)合作用96小時，流式細(xì)胞儀測定bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)百分率，單因素方差分析示As2O3+ASODN組與As2O3組及ASODN組相比有顯著性差異(p＜0.01)，As2O3+SODN與As2O3組相比無顯著性差異(p＞0.05)。
圖1是K562及NB4細(xì)胞的生長曲線。細(xì)胸生長的起始密度為2×104/mL，置37℃，飽和濕度，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。
圖2是不同濃度的As2O3對K562細(xì)胞生長的抑制作用曲線圖。取指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞起始密度為2×105/mL，置37℃，飽和濕度，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。
圖3是不同濃度的As2O3對NB4細(xì)胞生長的抑制作用曲線圖。
圖4是不同濃度As2O3誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的百分率圖。
圖5是不同濃度As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的百分率圖。
圖6是不同濃度bcl-2 ASODN對K562細(xì)胞的抑制作用曲線圖。
圖7是不同濃度bcl-2 ASODN對NB4細(xì)胞的抑制作用曲線圖。
圖8是不同濃度bcl-2 ASODN誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的百分率圖96小時。
圖9是不同濃度bcl-2 ASODN誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的百分率圖。
圖10是bcl-2 ASODN與1.0μmol/L As2O3聯(lián)合對K562細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)曲線圖。
圖11是bcl-2 ASODN與2.0μmol/L As2O3聯(lián)合對K562細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)曲線圖。
圖12是bcl-2 ASODN與0.25μmol/L As2O3聯(lián)合對NB4細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)曲線圖。
圖13是bcl-2 ASODN與0.5μmol/L As2O3聯(lián)合對NB4細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)曲線圖。
圖14是經(jīng)全硫代修飾的反義寡核苷酸化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
我們可得出結(jié)論根據(jù)bcl-2基因的特定部位設(shè)計出特定的反義核酸，它能特異性地抑制bcl-2基因的表達(dá)，促進(jìn)白血病和腫瘤細(xì)胞的凋亡，提高藥物敏感性，克服耐藥性，對正常組織幾乎無毒副作用，可作為藥物應(yīng)用于臨床。bcl-2反義核酸與三氧化二砷聯(lián)合作用，可協(xié)同下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相對提高對三氧化二砷的敏感性，從而減少砷劑的用量，減少毒副作用的發(fā)生，克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
實施例1合成bcl-2-ASODN的原料A.T.G.C.可從國外進(jìn)口，依序列5’-ATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，用核酸合成儀自動合成，18個經(jīng)全硫代修飾。使用前加生理鹽水配制所需濃度，可采用靜脈點滴的方式發(fā)藥。
實施例2稱取三氧化二砷干粉0.1978克，用1mmol/L的NaOH滴定至完全溶解，加入三蒸水，用1mmol/L的HCl調(diào)整pH為7.2，定容至1000mL，配制成1mmol/L三氧化二砷儲存液，使用前加生理鹽水配制成所需濃度。另bcl-2-ASODN加生理鹽水配制成所需濃度。兩者可分別采用靜脈點滴的方式給藥，協(xié)同發(fā)揮作用。
權(quán)利要求
1.一種抗白血病和腫瘤耐藥性的bcl-2基因反義核酸，其核苷酸序列為5’-ATCCTCCCCCAGTTCACC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的bcl-2基因反義核酸，其特征在于18個經(jīng)全硫代修飾。
3.一種抗白血病和腫瘤耐藥性的bcl-2基因的反義藥物，其特征在于由權(quán)利要求1或2所述的bcl-2基因反義核酸和三氧化二砷、鈉離子、氯離子、水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反義藥物，其特征在于所述bcl-2基因反義核酸濃度為10～40μmol/L，三氧化二砷濃度為0.25～2.0μmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗白血病和腫瘤耐藥性的bc1－2基因反義核酸,其核苷酸序列為:5’－ATCCTCCCCCAGTTCACC－3’,18個經(jīng)全硫代修飾,它能特異性地抑制bc1－2基因的表達(dá),促進(jìn)白血病和腫瘤細(xì)胞的凋亡,提高藥物敏感性,克服耐藥性,對正常組織幾乎無毒副作用,可作為藥物應(yīng)用于臨床。該反義核酸與三氧化二砷聯(lián)合作用,可協(xié)同下調(diào)bc1－2蛋白的表達(dá),促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提高對三氧化二砷的敏感性,減少砷劑的用量,減少毒副作用的發(fā)生,克服白血病和腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
文檔編號A61K31/7088GK1374088SQ0110762
公開日2002年10月16日 申請日期2001年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者張洹, 雷小勇, 沈偉利 申請人:暨南大學(xué)