一種水稻微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種水稻微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素類(lèi)藥物廣泛應(yīng)用于防治水稻病害，目前水稻病害在防治過(guò)程中，濫用抗生 素類(lèi)藥物現(xiàn)象十分普遍，導(dǎo)致病原微生物進(jìn)化出耐藥性基因，產(chǎn)生耐藥性，使得抗生素類(lèi)藥 物在防治水稻病害時(shí)失效。因此，需要針對(duì)水稻中微生物耐藥性基因針對(duì)性地用藥，W避免 病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)，減少農(nóng)藥用量，降低成本。
[0003] 現(xiàn)有的檢測(cè)耐藥性基因的方法包括:預(yù)估待測(cè)樣品上攜帶的需要檢測(cè)的耐藥性基 因的病原菌，分離并純化該病原菌，通過(guò)PCR(Polymease化ain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)）引物擴(kuò)增該耐藥性基因，利用電泳或?qū)崟r(shí)定量PCR方法逐一判斷待測(cè)樣品中是否存在需 要檢測(cè)的耐藥性基因。
[0004] 在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在W下問(wèn)題中的一種：
[0005] 需要培養(yǎng)、分離和純化病原菌，使得檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)，延誤治療時(shí)機(jī);無(wú)法檢測(cè)不 可培養(yǎng)的耐藥菌中的耐藥性基因；一次只能針對(duì)一種或少數(shù)幾種病原菌進(jìn)行檢測(cè)；一次只 能檢測(cè)一種或少數(shù)幾種耐藥性基因，不能檢測(cè)到待測(cè)樣品中所有的耐藥性基因，不能給予 用藥所需的全面信息;不能實(shí)現(xiàn)耐藥性基因的定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)耐藥性基因的方法有待提高的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供 了一種水稻微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法。所述技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種水稻微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法，所述方法包括：
[000引確定待測(cè)樣品中需要檢測(cè)的微生物的耐藥性基因、所述待測(cè)樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基 因和所述待測(cè)樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，所述待測(cè)樣品為整株水稻植株或部分所述水稻植株；
[0009] 制備用于擴(kuò)增所述耐藥性基因、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)試區(qū) 域的多重?cái)U(kuò)增引物；
[0010] 提取所述待測(cè)樣品的基因組；
[0011] 向所述待測(cè)樣品的基因組中加入所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因，獲得混合核酸；
[0012] 利用所述多重?cái)U(kuò)增引物對(duì)所述混合核酸進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，利用所述擴(kuò)增 產(chǎn)物構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)；
[0013] 對(duì)所述高通量測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到測(cè)序片段組；
[0014] 分析所述測(cè)序片段組，獲得所述待測(cè)樣品中所述耐藥性基因的測(cè)序片段的數(shù)量、 所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量；
[0015] 根據(jù)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù) 量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功；
[0016] 若所述實(shí)驗(yàn)成功，則計(jì)算所述待測(cè)樣品中所述耐藥性基因的含量；
[0017] 根據(jù)所述耐藥性基因的含量判定所述待測(cè)樣品是否含有耐藥性基因。
[0018] 具體地，所述耐藥性基因至少為1個(gè)，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)，所述外源標(biāo)準(zhǔn) 基因至少為1個(gè)。
[0019] 具體地，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)樗龃郎y(cè)樣品的微生物中的基因。
[0020] 具體地，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于已知基因組的生物中。
[0021] 具體地，用于擴(kuò)增所述耐藥性基因的引物的設(shè)計(jì)區(qū)域或擴(kuò)增區(qū)域與所述待測(cè)樣品 中的生物的基因組的其它區(qū)域的所有生物的基因組上除耐藥性基因外的其它區(qū)域的同源 性低于98%。
[0022] 具體地，所述判斷實(shí)驗(yàn)是否成功的方法為：當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù) 量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量均含α1時(shí)，則實(shí)驗(yàn)成功；當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的 測(cè)序片段的數(shù)量或所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量<α1時(shí)，則實(shí)驗(yàn)失敗;其中，α1為判 定闊值。
[0023] 具體地，計(jì)算所述待測(cè)樣品中所述耐藥性基因的含量的方法為:第m種所述耐藥性 基因的含量的計(jì)算公式關(guān)
其中，i為第m種所述耐藥性基因的第i 個(gè)測(cè)試區(qū)域，nl為所述第m種所述耐藥性基因的測(cè)試區(qū)域的個(gè)數(shù)，bi為所述第m種耐藥性基 因的第i個(gè)測(cè)試區(qū)域的測(cè)序片段的數(shù)量，k為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因，n3為所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基 因的個(gè)數(shù)，j為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第j個(gè)測(cè)試區(qū)域，n2為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的 測(cè)試區(qū)域的個(gè)數(shù)，aj為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第巧巾測(cè)試區(qū)域的測(cè)序片段的數(shù)量;N為所 有所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)試區(qū)域的總數(shù)。
[0024] 具體地，判定所述待測(cè)樣品中是否含有所述耐藥性基因的方法為:所述耐藥性基 因的含量含α2時(shí)，判定所述待測(cè)樣品含有所述耐藥性基因；當(dāng)所有所述耐藥性基因的含量< 口 2時(shí)，判定所述待測(cè)樣品不含有所述耐藥性基因；其中，α2為判定闊值。
[0025] 具體地，所述方法還包括：向所述待測(cè)樣品中加入所述多重?cái)U(kuò)增引物不能擴(kuò)增的 外源核酸，將所述外源核酸與所述待測(cè)樣品的基因組一同提取。
[0026] 具體地，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的質(zhì)量與所述待測(cè)樣品的基因組的總質(zhì)量的比例大于 1/100000。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是:本發(fā)明實(shí)施例提供的方法可W 在不需要培養(yǎng)與純化的前提下，一次性的、定量的、快速的、準(zhǔn)確的檢測(cè)任意數(shù)量和類(lèi)型的 微生物中的任意多種希望檢測(cè)的耐藥性基因，可W給予用藥所需的全面信息。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一 步地詳細(xì)描述。
[0029] 實(shí)施例
[0030] 水稻微生物的耐藥性基因檢測(cè)
[0031] 待測(cè)樣品可W為整株水稻植株或部分水稻植株，本實(shí)施例中待測(cè)樣品為水稻葉 片，本實(shí)施例中使用的水稻葉片取自武漢濁口開(kāi)發(fā)區(qū)的水稻田，檢測(cè)其中的微生物的耐藥 性基因是為了針對(duì)性地對(duì)水稻病害用藥，避免耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)，減少不必要的用藥，節(jié) 約成本。本實(shí)施例包括如下步驟：
[0032] 步驟1、確定待測(cè)樣品中需要檢測(cè)的微生物的耐藥性基因、待測(cè)樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn) 基因和待測(cè)樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，具體方法如下：
[0033] 其中，耐藥性基因至少為1個(gè)，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)，外源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)。 內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)榇郎y(cè)樣品的微生物中的基因。外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于已知基因組的生物 中。
[0034] 本實(shí)施例中的耐藥性基因抗青霉素、β-內(nèi)酷胺酶、頭抱菌素酶、卡那霉素和新霉 素，其中，耐藥性基因 APH(3'）-Ia同時(shí)抗卡那霉素和新霉素。本實(shí)施例中內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)? 種，具體地，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)楹颂求wrRNA基因，該核糖體rRNA基因存在于絕大部分生物中且 具有保守區(qū)域。在本實(shí)施例中，外源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)榍山?，具體地，外源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)檑C-00004基 因，其在NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih.gov)上進(jìn)行同源比對(duì)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)其在已知生物參 考基因組中存在同源序列，即外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于已知的生物基因組中。表1為本實(shí)施例 中被檢測(cè)基因相關(guān)信息與檢測(cè)結(jié)果，在表1中耐藥性基因名稱(chēng)與序列編號(hào)與抗生素耐藥性 數(shù)據(jù)庫(kù)（CRAD:The Comprehensive Antibiotic Resistance Datab ase，網(wǎng)址為 a巧card.mcmaster. ca/)中的名稱(chēng)與序列編號(hào)一致。
[0035] 表1為本實(shí)施例中被檢測(cè)基因相關(guān)信息與檢測(cè)結(jié)果
[0036]
[0037]
[003引表1中'7'表示無(wú)。
[0039] 步驟2、制備用于擴(kuò)增耐藥性基因、內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)試區(qū)域的多 重?cái)U(kuò)增引物，具體方法如下：
[0040] 選擇耐藥性基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)多重?cái)U(kuò)增引物；用于擴(kuò)增耐藥性基因的引物的設(shè) 計(jì)區(qū)域或擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)樣品中的生物的基因組的其它區(qū)域的同源性低于98%，運(yùn)一要求 確保了耐藥性基因的檢測(cè)不受待測(cè)樣品中的生物的基因組的其它區(qū)域的干擾。具體地，耐 藥性基因的引物的設(shè)計(jì)區(qū)域在不同變體間是保守的，運(yùn)樣才能保證用相同的引物可W擴(kuò)增 出相同的耐藥性基因的不同變體，若耐藥性基因的引物的設(shè)計(jì)區(qū)域與待測(cè)樣品中的生物的 基因組的其它區(qū)域的同源性低于98%，則該引物不會(huì)擴(kuò)增其它區(qū)域，因此，不會(huì)干擾耐藥性 基因的檢測(cè)。否則，要求耐藥性基因的引物的擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)樣品中的生物的基因組的其 它區(qū)域的同源性低于98%，運(yùn)樣，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可W與耐藥性基因相區(qū)分，同樣不會(huì)干擾 耐藥性基因的檢測(cè)。同時(shí)，多重?cái)U(kuò)增引物中每對(duì)引物的擴(kuò)增效率均在95%~105%之間。
[0041] 具體地，在抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)中下載表