專利名稱：：積雪草總甙的制備新方法及其新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是制備積雪草總甙的一種新方法及其治療抑郁癥的新用途。抑郁癥是以顯著而持久的情緒低落、行為木僵和悲觀厭世為主要特征的一組疾病。實(shí)際上它很普通，以至被稱為精神疾病中的“普通感冒”，同時(shí)它還是嚴(yán)重的、威脅生命的疾病，折磨著世界上數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的人。目前用于治療抑郁癥的藥物主要有三環(huán)類抗抑郁劑、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺重吸收抑制劑，但是均有不同程度的副作用，如嗜睡、視物模糊、高血壓、驚厥和性欲低下等，從而限制了其廣泛使用。積雪草Centellaasiatica(L.)Urban為傘形科植物，我國(guó)長(zhǎng)江以南廣大地區(qū)均有分布，其提取物積雪草總甙具有促進(jìn)傷口愈合、減少疤痕疙瘩生成的作用，效果顯著?，F(xiàn)在已將積雪草總甙制備成外用藥(如積雪霜)和口服藥(如積雪片)，但是該藥僅限于治療外傷，迄今為止尚未見(jiàn)將積雪草總甙用于治療抑郁癥的報(bào)道，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)積雪草總甙具有較好的抗抑郁作用，是一種較有發(fā)展前途的天然抗抑郁劑。已報(bào)道的積雪草總甙的制備方法步驟復(fù)雜，使用有機(jī)溶劑種類和數(shù)量較多，易造成環(huán)境污染。本發(fā)明的目的之一在于提供一種工藝簡(jiǎn)單、得率高、不易造成環(huán)境污染的積雪草總甙制備新方法。本發(fā)明另一目的在于對(duì)積雪草總甙提供一種治療抑郁癥的新用途。積雪草總甙的制備方法包括提取、純化、結(jié)晶三步驟。本發(fā)明提取和結(jié)晶過(guò)程與原工藝相同，但純化過(guò)程不同。原純化工藝采用鹵化劑(氯仿、二氯甲烷等)萃取積雪草含水醇提取物，棄鹵化劑層，用高級(jí)醇(正丁醇、仲丁醇等)萃取水層中積雪草總甙，以氫氧化鈉水溶液和水溶液洗滌高級(jí)醇層提取物，并將其減壓濃縮，其缺點(diǎn)是方法復(fù)雜，過(guò)程繁瑣，使用較多的有機(jī)溶劑如鹵化劑、高級(jí)醇，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，也有害于實(shí)際操作者的身體健康(制備方法詳見(jiàn)專利CN1194154A號(hào))。本發(fā)明則將積雪草總甙提取液經(jīng)皂甙吸附型大孔樹(shù)脂吸附，用蒸餾水洗脫去除雜質(zhì)后，以含水醇洗脫積雪草總甙，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得到粘稠狀物，再用含水醇溶解后就可用乙酸乙酯加以結(jié)晶。此過(guò)程步驟簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑使用的種類及數(shù)量明顯減少，從而既縮短了工藝流程，又減少了對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)操作者身體的危害。本發(fā)明制備方法具體步驟如下一、積雪草總甙的提取1、以含水醇浸泡積雪草，得到積雪草總甙提取液；2、冷凍提取液，減壓過(guò)濾去除沉淀物，得濾液；二、積雪草總甙的純化1、按常規(guī)方法將上述提取液減壓濃縮，得到濃縮液；2、減壓過(guò)濾濃縮液，得到濾液；3、濾液經(jīng)皂甙吸附型大孔樹(shù)脂吸附，蒸餾水洗脫去除雜質(zhì)，再以含醇量5％～95％的甲醇或乙醇水溶液洗脫，得到洗脫液，詳見(jiàn)《中藥藥理研究方法學(xué)》(陳奇主編，人民衛(wèi)生出版社出版，199370)；4、按常規(guī)方法將洗脫液減壓濃縮至干，得到粘稠狀物；5、用含水醇溶解粘稠狀物，比例為粘稠狀物重量(公斤)∶含水醇的體積(毫升)＝1∶1～200，得到積雪草總甙溶液。三、積雪草總甙的結(jié)晶1、將上述積雪草總甙溶液以乙酸乙酯結(jié)晶，比例為積雪草總甙溶液的體積(毫升)∶乙酸乙酯的體積(毫升)＝1∶1～200，按常規(guī)方法減壓濃縮至干，得到粉末狀積雪草總甙。用于本發(fā)明的含水醇溶液含醇量為5％～95％的甲醇或乙醇。經(jīng)13C和1H核磁共振檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1和表2所示，說(shuō)明得到的積雪草三萜總皂甙類成分主要由積雪草甙和羥基積雪草甙組成，兩種成分占該提取物的60％以上。表1提取物樣品中積雪草甙和羥基積雪草甙的13C核磁共振化學(xué)位移值與標(biāo)準(zhǔn)品比較(溶解于吡啶)碳積雪草積雪草甙羥基積雪羥基積雪草碳積雪草積雪草甙羥基積雪羥基積雪草甙樣品標(biāo)準(zhǔn)品草甙樣品甙標(biāo)準(zhǔn)品甙樣品標(biāo)準(zhǔn)品草甙樣品甙標(biāo)準(zhǔn)品148.148.249.949.92723.423.723.723.8268.668.968.869.028176.0176.2176.0179.8378.478.778.378.52917.117.323.524.0443.443.142.943.13021.021.121.021.3547.948.748.248.6葡萄糖619.119.367.367.6195.395.595.595.5732.933.039.139.0275.073.675.173.6839.939.539.439.5377.678.377.678.3948.148.348.348.9470.070.170.070.41038.037.937.838.0576.276.676.276.71124.324.324.525.0669.171.070.771.012125.7126.0126.1126.3葡萄糖’13138.2137.7137.5138.61104.6104.4104.6104.01442.344.242.344.3273.575.073.775.01528.428.728.528.7378.477.678.377.61624.324.524.526.0477.778.378.078.31749.548.448.448.0576.976.376.876.31852.953.353.153.3661.061.461.061.61938.838.037.938.1鼠李糖2039.039.038.839.11102.4102.4102.4102.42130.531.030.531.0272.572.472.572.42236.537.536.637.5372.372.172.372.12366.266.563.766.6473.773.673.573.62414.115.515.815.5570.769.469.169.42517.917.517.117.2617.418.118.318.12618.318.519.018.6表2提取物樣品中積雪草甙和羥基積雪草甙的1H核磁共振化學(xué)位移值與標(biāo)準(zhǔn)品比較(溶解于吡啶)氫積雪草積雪草甙氫羥基積雪羥基積雪草甙樣品標(biāo)準(zhǔn)品草甙樣品甙標(biāo)準(zhǔn)品23.70ddd3.67ddd23.70ddd3.71ddd33.36d3.34d33.36d3.38d125.24t5.24t125.24t5.23t182.20d2.24d182.20d2.23d191.36m1.38m191.36m1.36m233.28d，3.51d3.46d，3.26d233.37d3.39d甲基-240.69s0.71s甲基-240.73s0.77s甲基-251.04s1.04s甲基-251.04s1.07s甲基-260.84s0.82s甲基-260.81s0.82s甲基-271.13s1.13s甲基-271.10s1.10s甲基-290.92s0.91d甲基-290.92s0.92s甲基-300.96s1.00s甲基-30095s0.95s葡萄糖葡萄糖15.29d5.29d15.29d5.29d23.33m3.31m23.31m3.31m33.37m3.39m33.39m3.39m43.42m3.42m43.40m3.42m53.48m3.49m53.47m3.49m6a4.06dd4.06dd6a4.06dd4.06dd6b3.76dd3.77dd6b3.76dd3.77dd葡萄糖’葡萄糖’14.37d4.37d14.36d4.37d23.23t3.23t23.23t3.23t33.43t3.45t33.44t3.45t43.51t3.53t43.51t3.53t53.29m3.29m53.29m3.29m6a3.81d3.80d6a3.80d3.80d6b3.65dd3.65dd6b3.65dd3.65dd鼠李糖鼠李糖14.83d4.84d14.84d4.84d23.83dd3.83dd23.81dd3.83dd33.60dd3.62dd33.62dd3.62dd43.39t3.40t43.41t3.40t53.96d3.96d53.97d3.96d甲基1.26d1.27d甲基1.27d1.27d四、積雪草總甙對(duì)實(shí)驗(yàn)性抑郁癥治療作用的驗(yàn)證強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forcedswimmingtest)和未預(yù)知的長(zhǎng)期應(yīng)激刺激實(shí)驗(yàn)(chronicunpredictablestresstest)是驗(yàn)證藥物具有抗抑郁作用常用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，故用其驗(yàn)證積雪草總甙對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物抑郁癥的防治作用。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，160～200克，每4只/籠群養(yǎng)，自由覓食和飲水，室溫23±2℃，自然光照。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)將大鼠放入水深15厘米，水溫25℃的量筒(高為40厘米，直徑為18厘米)中游泳，使其產(chǎn)生恐懼心理，15分鐘后取出，32℃下將毛烘干。24小時(shí)內(nèi)，分別給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射或灌胃給藥，再將大鼠放入上述環(huán)境中，測(cè)定大鼠在5分鐘內(nèi)保持游泳不動(dòng)的時(shí)間，以不動(dòng)時(shí)間的長(zhǎng)短作為判斷藥物抗抑郁作用的標(biāo)準(zhǔn)。方法詳見(jiàn)《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》(張均田主編，北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社出版，上冊(cè)19981064)。本實(shí)驗(yàn)將大鼠分為5組，每組8只。①空白對(duì)照組，給予與藥物實(shí)驗(yàn)組同劑量的生理鹽水；②陽(yáng)性對(duì)照組，給予藥物丙咪嗪，劑量為20mg/kg，這是一種應(yīng)用于臨床具有較好治療作用的抗抑郁藥；③實(shí)驗(yàn)組，給予藥物積雪草總甙，分為低、中、高三個(gè)劑量組，劑量分別為30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg，各組給藥時(shí)間均為大鼠毛烘干后24小時(shí)內(nèi)的相同時(shí)間。給藥途徑分為一次腹腔注射給藥和三次灌胃給藥。(2)未預(yù)知的長(zhǎng)期應(yīng)激刺激實(shí)驗(yàn)采用未預(yù)知的長(zhǎng)期應(yīng)激刺激能使動(dòng)物產(chǎn)生抑郁癥，亦即實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常接受21天各種不同的刺激，包括電擊足底、冷水游泳、熱刺激、搖晃、夾尾、禁水、禁食和晝夜顛倒等刺激，就可產(chǎn)生抑郁癥。方法詳見(jiàn)《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》(同上)。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組為，①空白對(duì)照組，正常大鼠不給予任何刺激，給予與藥物實(shí)驗(yàn)組同劑量蒸餾水；②抑郁癥模型組，正常大鼠給予21天刺激但不給予任何藥物，觀察其產(chǎn)生抑郁癥的情況；③陽(yáng)性對(duì)照組；④實(shí)驗(yàn)組，第③、④組均為大鼠給藥后再予刺激，藥物和劑量同強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，觀察藥物對(duì)抑郁癥的防治作用。給藥途徑為灌胃。1)實(shí)驗(yàn)前1天和實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第22天，測(cè)定大鼠體重和24小時(shí)內(nèi)1％蔗糖溶液的飲用量，比較其體重增加量和蔗糖溶液飲用量的變化。2)敞箱活動(dòng)性實(shí)驗(yàn)分別在實(shí)驗(yàn)前1天，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第7、14和21天，將大鼠置于高40厘米，直徑80厘米，周壁為黑色，底面由面積相等的25塊格組成的圓柱敞箱內(nèi)，光照為60瓦特，記錄大鼠的行為，以穿越底面格數(shù)為水平活動(dòng)得分，直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分，同時(shí)測(cè)定理毛時(shí)間、等待時(shí)間及排便次數(shù)，測(cè)定時(shí)間為3分鐘。方法詳見(jiàn)《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》(同上)。3)從病理組織切片觀察各組大鼠大腦頂葉皮層和海馬神經(jīng)元形態(tài)的變化，比較各組間的差異。方法詳見(jiàn)《病理組織切片技術(shù)》(高銘都、黃義祿著，南山堂出版社出版，1988124，Nissl染色法制備大鼠腦神經(jīng)組織病理切片)。4)實(shí)驗(yàn)第22天，采用放免法測(cè)定大鼠血清中的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和血漿中的促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、3，3，5-三碘甲狀腺原氨酸(rT3)的分泌，觀察積雪草總甙對(duì)大鼠下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸和下丘腦—垂體—甲狀腺軸的功能影響。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3表3各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間變化組別腹腔注射給藥游泳不動(dòng)時(shí)間灌胃給藥游泳不動(dòng)時(shí)間(秒)(秒)空白對(duì)照組175.25±9.50153.38±10.17陽(yáng)性對(duì)照組107.50±13.36**41.25±17.68**積雪草總甙低劑量組161.67±16.46124.88±11.64**積雪草總甙中劑量組153.38±21.17*92.63±13.26**積雪草總甙高劑量組152.50±24.64*45.88±9.35**與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01由表3中結(jié)果可以看出，一次腹腔注射給藥，積雪草總甙中、高劑量組較明顯地減少?gòu)?qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，低劑量組雖然也減少了強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，但不顯著。灌胃給藥，積雪草總甙不僅顯著減少?gòu)?qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，且高、中、低劑量組還顯示了一定的劑量依賴性關(guān)系。表明積雪草總甙具有防治動(dòng)物抑郁癥的作用。2)未預(yù)知的長(zhǎng)期應(yīng)激刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4表4各組大鼠體重增加量及1％蔗糖飲用量變化組別體重增加量1％蔗糖溶液飲用量變化(毫升)(克)實(shí)驗(yàn)前1天實(shí)驗(yàn)第22天空白對(duì)照組122.90±8.5738.63±4.5840.56±3.91**抑郁癥模型組46.35±5.7540.50±3.2513.81±3.86陽(yáng)性對(duì)照組99.98±12.31**39.38±2.9731.94±6.57**積雪草總甙低劑量組53.06±9.1339.75±3.2118.63±6.88積雪草總甙中劑量組74.48±10.73**36.38±4.1819.56±8.14積雪草總甙高劑量組86.11±8.71**40.25±4.3623.00±8.38**與抑郁癥模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01從表4中可以看出，抑郁癥模型組大鼠體重增加量和1％蔗糖溶液飲用量較空白對(duì)照組有極其明顯的下降，表明我們所采用的模型使大鼠處于抑郁狀態(tài)；陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)上述兩種改變具有較好的改善作用，說(shuō)明抗抑郁藥丙咪嗪在此模型中顯示了明顯的治療作用；積雪草總甙低劑量組對(duì)抑郁癥動(dòng)物體重的增加量和蔗糖溶液的飲用量無(wú)明顯改變，積雪草總甙中、高劑量組較明顯的增加了動(dòng)物的體重和1％蔗糖水溶液飲用量，表明高劑量積雪草總甙對(duì)動(dòng)物抑郁癥有防治作用。從敞箱實(shí)驗(yàn)可以觀察到，抑郁癥模型組運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性減少，包括大鼠水平活動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)和理毛時(shí)間的減少，等待時(shí)間和大便次數(shù)的增加，表明我們采用的模型使大鼠處于抑郁狀態(tài)；陽(yáng)性對(duì)照組顯著增加抑郁癥大鼠的活動(dòng)，不僅顯示丙咪嗪對(duì)抑郁癥較好的治療作用，而且表明其作為陽(yáng)性對(duì)照具有較好的參照性；積雪草總甙低劑量組對(duì)動(dòng)物的抑郁狀態(tài)沒(méi)有明顯的改善作用，積雪草總甙中、高劑量組則對(duì)抑郁大鼠以上5種行為的改變顯示了較顯著的作用，其中包括1周以后水平活動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)和理毛時(shí)間的逐漸增加，等待時(shí)間和大便次數(shù)的逐漸減少，表明積雪草總甙中、高劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抑郁癥具有較好的治療作用。3)各組大鼠大腦頂葉皮層和海馬神經(jīng)元形態(tài)的變化從大鼠腦病理組織切片Nissl染色結(jié)果觀察到空白對(duì)照組大鼠頂葉皮層神經(jīng)元尼氏體清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，分層清楚，由外至內(nèi)可見(jiàn)分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層和多層細(xì)胞層。海馬CA1、CA3及齒狀回神經(jīng)元尼氏體清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，層次較多，神經(jīng)元形態(tài)完整。抑郁癥模型組大鼠頂葉皮層神經(jīng)元尼氏體減少，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，分層不清楚，尤以外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層細(xì)胞變化明顯。海馬CA1、CA3及齒狀回神經(jīng)元尼氏體不清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列雜亂，層次較少，可見(jiàn)較多神經(jīng)細(xì)胞有空泡化和核固縮，部分細(xì)胞脫落，與空白組有明顯差異。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠頂葉皮層神經(jīng)元尼氏體較清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，分層較清楚，由外至內(nèi)可見(jiàn)分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層和多層細(xì)胞層。海馬CA1、CA3及齒狀回神經(jīng)元尼氏體較清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列比較整齊，層次較模型組多，神經(jīng)元形態(tài)較完整，有小部分細(xì)胞脫落。積雪草總甙各劑量組大鼠頂葉皮層神經(jīng)元尼氏體較清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，分層清楚，由外至內(nèi)可見(jiàn)分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層和多層細(xì)胞層。海馬CA1、CA3及齒狀回神經(jīng)元尼氏體較清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，神經(jīng)元形態(tài)較完整，神經(jīng)細(xì)胞有空泡化，有小部分細(xì)胞脫落，與抑郁癥模型組相比有較明顯的改善。從切片結(jié)果看出積雪草總甙各組改善了抑郁動(dòng)物大腦皮層、海馬和齒狀回神經(jīng)元排列紊亂、核固縮和空洞化等現(xiàn)象，表明積雪草總甙對(duì)抑郁大鼠腦組織形態(tài)方面的病理變化具有一定的預(yù)防作用。4)各組大鼠內(nèi)分泌變化結(jié)果見(jiàn)表5表5各組大鼠內(nèi)分泌變化組別ACTHTSHT3T4rT3(mg/L)(mU/L)(nmol/L)(nmol/L)(mmol/L)空白對(duì)照組0.726±0.094**0.288±0.069**0.96±0.17**84.27±16.58*0.243±0.025**抑郁癥模型組0.242±0.0490.078±0.0161.31±0.1852.40±11.550.145±0.019陽(yáng)性對(duì)照組0.594±0.2340.202±0.036**1.00±0.17*77.41±5.31**0.195±0.024*積雪草總甙低劑量組0.411±0.092**0.168±0.025**0.82±0.38*61.18±15.440.159±0.052積雪草總甙中劑量組0.476±0.2100.186±0.022**1.01±0.2373.38±7.08*0.179±0.047積雪草總甙高劑量組0.478±0.152*0.146±0.015**0.96±0.17**82.70±6.31**0.184±0.018**與抑郁癥模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01從表5可以看出，與空白對(duì)照組大鼠比較，抑郁癥模型組大鼠ACTH、TSH、T4和rT34項(xiàng)內(nèi)分泌指標(biāo)顯著降低，而T3則明顯增高，表明我們采用的模型使大鼠內(nèi)分泌功能紊亂；陽(yáng)性對(duì)照組較好的改善了抑郁癥大鼠內(nèi)分泌紊亂；積雪草總甙各劑量組不同程度的增加了ACTH、TSH、T4和rT3的分泌，減少T3的分泌，表明積雪草總甙較好的改善抑郁癥大鼠內(nèi)分泌的紊亂，具有抗抑郁作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明積雪草總甙制備工藝簡(jiǎn)單，不僅縮短了工藝流程，提高了得率，降低了成本，減少了環(huán)境污染，而且將積雪草總甙用于治療抑郁癥，有可能為抑郁癥患者提供一種有效的天然藥物。權(quán)利要求1.一種制備積雪草總甙的方法，包括積雪草總甙的提取、純化和結(jié)晶三個(gè)步驟，其特征在于積雪草總甙的純化采用皂甙吸附型大孔樹(shù)脂，亦即積雪草總甙提取液通過(guò)該樹(shù)脂吸附提取物，經(jīng)蒸餾水洗脫去除雜質(zhì)，以含水醇洗脫得積雪草總甙洗脫液，減壓濃縮洗脫液至干，再以含水醇溶解后，用乙酸乙酯結(jié)晶。2.積雪草總甙用以治療抑郁癥的用途。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
,是積雪草總甙的一種制備新方法及其治療抑郁癥的新用途。其制備工藝包括提取、純化、結(jié)晶三個(gè)步驟。本發(fā)明為改進(jìn)純化過(guò)程,以皂甙吸附型大孔樹(shù)脂吸附積雪草總甙提取液,經(jīng)蒸餾水洗脫去除雜質(zhì)后,以含水醇洗脫積雪草總甙即可,從而不僅簡(jiǎn)化了純化步驟,又避免了原純化工藝中所使用的大量有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的污染。積雪草總甙對(duì)抑郁癥的治療作用有望為抑郁癥患者提供一種新的天然藥物。文檔編號(hào)A61K31/70GK1387868SQ0111301公開(kāi)日2003年1月1日申請(qǐng)日期2001年5月29日優(yōu)先權(quán)日2001年5月29日發(fā)明者秦路平,陳瑤,鄭漢臣申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)