專利名稱：一種積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法
一種積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法絲領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種從積雪草甙提取物中分離獲得純度大于98%的積雪草 甙化學(xué)對(duì)照品的制備方法。積雪草甙(Asiaticoside)是積雪草中一種重要的化學(xué)成分，屬于五環(huán)三 萜類化合物，我國(guó)2005版國(guó)家藥典中把積雪草甙作為鑒定成分。積雪草甙 的結(jié)構(gòu)式如下OH OHOH積雪草甙能明顯促進(jìn)傷口愈合，刺激肉芽生長(zhǎng)，促進(jìn)表皮角質(zhì)化，并有助于發(fā)生新的結(jié)締組織，可用治療燒傷，下肢潰爛，創(chuàng)傷，肌腱粘連等。 蔣毅等(中國(guó)專利CN 1520824A， 2004年公開)報(bào)道了積雪草甙對(duì)二甲基 亞硝胺引發(fā)的大鼠肝纖維化的防治作用，證實(shí)了積雪草甙具有抑制成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的功能，進(jìn)而確定積雪草甙的預(yù)防治療肝纖維化藥物作用。秦路平等(中國(guó)專利CN1211098C， 2005年公開)報(bào)道了積雪草總甙的 提取方法，該方法采用皂甙型大孔吸附樹脂吸附積雪草提取物，經(jīng)蒸餾水 洗脫，去除雜質(zhì)后，以水醇洗脫，得到積雪草總甙溶液，以乙酸乙酯結(jié)晶， 減壓濃縮至干，經(jīng)核磁共振分析，所得總皂甙主要由積雪草甙和羥基積雪 草甙組成，兩種成分占總該提取物的60%以上。何明芳等(中國(guó)藥科大學(xué) 學(xué)報(bào)，2000,31 (2): 91 93)報(bào)道的釆用大孔吸附樹脂結(jié)合硅膠柱層析的 方法獲得積雪草甙的分離方法，王寶奎等(海峽藥學(xué)，1996， 8 (4): 3) 報(bào)道的采用正丁醇萃取結(jié)合硅膠柱層析獲得積雪草甙的分離方法，獲得積 雪草式結(jié)晶。目前積雪草甙單體化合物的制備存在如下缺點(diǎn)1.純度大于98%的積 雪草甙單體的獲得還停留在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模水平，無(wú)法提供克級(jí)化學(xué)對(duì)照品； 2.目前可大規(guī)模提供的積雪草甙純度最高僅能達(dá)到卯％，無(wú)法滿足積雪草
藥材或相關(guān)制劑的質(zhì)量分析及控制要求。以上兩點(diǎn)原因制約了積雪草及積 雪草甙的科學(xué)研究及應(yīng)用。開發(fā)一種可以獲得克級(jí)純度在訴％以上積雪草 甙化學(xué)對(duì)照品的方法是當(dāng)前積雪草研究的難點(diǎn)。 發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，優(yōu)化分離條件，本發(fā)明的目的在于提供一種分離時(shí)間短、分離效果好、產(chǎn)品純度高(純度在98。Z以上)的積雪草甙化學(xué) 對(duì)照品的分離制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案對(duì)照品的分離制備方法，以 重量含量30 97% (優(yōu)選60 97%)的積雪草甙提取物為原料，以制備型 高效液相色譜為分離手段，以甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得克級(jí)純度98% 以上積雪草式化學(xué)對(duì)照品；具體步驟為，(1) 樣品預(yù)處理將重量含量30 97%的積雪草甙提取物用甲醇或乙 醇溶液溶解，配置成重量濃度為30 60mg/ml的積雪草甙提取物溶液，經(jīng) 0.22 0.45拜微孔濾膜過(guò)濾；(2) 色譜柱處理高效液相色譜柱選擇制備型高效液相色譜柱，以5 一20倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱；洗脫體系溶液為甲醇水溶液， 其體積濃度為50—80%;(3) 進(jìn)樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為l 100ml;(4) 洗脫采用洗脫體系溶液洗脫色譜柱，流速控制在10 600ml/min， 在線紫外監(jiān)測(cè)，收集含有積雪草甙的洗脫液；(5) 積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲得減壓濃縮所收集到的積雪草甙洗脫 液至干，獲得純度高于98%的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。所述制備型高效液相柱選用商品化或自己裝填的制備型高效液相柱;其 填料可為C8或C18鍵合相填料；自己裝填的制備型高效液相柱裝填方式為 濕法裝柱，填料粒徑為5-20拜，柱效在2000以上；在線紫外檢測(cè)，其檢 測(cè)波長(zhǎng)為190nm 220nm，具體檢測(cè)波長(zhǎng)根據(jù)樣品中干擾成分與積雪草甙的 靈敏度確定，在所選擇波長(zhǎng)下，可以靈敏檢測(cè)到干擾成分與積雪草甙的信 號(hào)；積雪草甙洗脫液收集后，減壓濃縮，濃縮溫度控制在60—70'C。以本方法從積雪草提取物中分離積雪草甙化學(xué)對(duì)照品具有如下優(yōu)點(diǎn)和 進(jìn)步1. 本發(fā)明以制備型高效液相為分離手段，在保證積雪草甙得到高效分 離的前提下，提高了積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的產(chǎn)量，可以獲得克級(jí)純度在98 %以上的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。2. 本發(fā)明所述的甲醇-水洗脫體系能有效的保證積雪草甙與其他成分得 到有效分離，從而保證分離的效果。3. 本發(fā)明采用紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為l卯至210nm間任一 波長(zhǎng)，使積雪草甙的分離情況可以直接檢測(cè)，并可以選擇性收集，顯著提高收集效果o4. 本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，能有效的保證積雪草甙的穩(wěn) 定性。5. 可產(chǎn)業(yè)推廣。色譜柱規(guī)格為50X250mm時(shí)，其規(guī)模可達(dá)到10克/ 月以上。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例一制備的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的純度分析色譜圖。具體實(shí)n^r式下面通過(guò)實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 實(shí)施例i本實(shí)施例中，以30%的積雪草甙提取物為原料，以5MmC18鍵合相填 料為吸附劑，以甲醇-水(50: 50，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步 驟如下1. 樣品預(yù)處理積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為60mg/ml的積雪草甙溶液， 經(jīng)0.22拜微孔濾膜過(guò)濾。2. 色譜柱處理制備型高效液相柱選擇為日本Sheshido公司生產(chǎn)的固定相為C18的制 備柱(5Mm， 20X250mm)，以約5倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3. 上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為lml。4. 洗脫流速控制在10ml/min,在線l卯nm紫外檢測(cè)，收集含有積雪草甙的洗 脫液，5'.積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮積雪草甙洗脫液，濃縮溫度控制在70'C。得到純度為99.54% 的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品；如圖1所示，其分析結(jié)果如表l所示表l峰名稱保留時(shí)間A峰面積面積百分比110.06674760.462積雪草甙10.648162393299.54實(shí)施例2本實(shí)施例中，以60%積雪草甙提取物為原料，以lOnm的C8鍵合相填 料為吸附劑，以甲醇-水(70: 30，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝歩 驟如下1.樣品預(yù)處理60%積雪草甙提取物用乙醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的積雪草甙溶
液，經(jīng)0.45Mm微孔濾膜過(guò)濾。2. 色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為10拜的C18 鍵合相填料，濕法裝柱，色譜柱規(guī)格為50X250mm，以約10倍柱體積的洗 脫體系溶液平衡色譜柱。3. 上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為3ml。4. 洗脫流速控制在卯ml/min，在線207nm紫外檢測(cè)，收集含有積雪草甙的洗 脫液，5. 積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮積雪草甙洗脫液，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為98.51% 的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例3本實(shí)施例中，以60%的積雪草甙提取物為原料，以10nm的C18鍵合 相填料為吸附劑，以甲醇-水(60: 40，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工 藝步驟如下1. 樣品預(yù)處理積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的積雪草甙溶液， 經(jīng)0.45阿微孔濾膜過(guò)濾。2. 色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為10拜的C18 鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為75X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液 平衡色譜柱。3. 上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為10ml。 4 洗脫流速控制在150ml/min，在線200nm紫外檢測(cè)，收集含有積雪草甙的洗 脫液，5'.積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮積雪草甙洗脫液，濃縮溫度控制在651C。得到純度為98.74% 的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例4本實(shí)施例中，以卯％的積雪草甙提取物為原料，以20jimC18鍵合相填 料為吸附劑，以甲醇-水(80: 20，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步 驟如下1.樣品預(yù)處理積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為50mg/ml的積雪草甙溶液，
經(jīng)0.45nm微孔濾膜過(guò)濾。2. 色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為20拜的C18 鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為100X270mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶 液平衡色譜柱。3. 上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20ml。4. 洗脫流速控制在300ml/min，在線207nm紫外檢測(cè)，收集含有積雪草式的洗 脫液，5'.積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮積雪草甙洗脫液，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為98.15% 的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例5本實(shí)施例中，以90%的積雪草甙提取物為原料，以10(jmC8鍵合相填 料為吸附劑，以甲醇-水(75: 25，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步 驟如下1. 樣品預(yù)處理積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為50mg/ml的積雪草甙溶液， 經(jīng)0.45拜微孔濾膜過(guò)濾。2. 色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為lOpm的C8鍵 合相填料，色譜柱規(guī)格為100X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液 平衡色譜柱。3. 上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20ml。4. 洗脫流速控制在300ml/min，在線200nm紫外檢測(cè)，收集含有積雪草甙的洗 脫液,5'.積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮積雪草甙洗脫液，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為99.19% 的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例6本實(shí)施例中，以97%的積雪草甙提取物為原料，以20MmC18鍵合相填 料為吸附劑，以甲醇-水(65: 35，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步 驟如下1.樣品預(yù)處理積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為30mg/ml的積雪草甙溶液，
經(jīng)0.45阿微孔濾膜過(guò)濾。2. 色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為10阿的C18 鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為150X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶 液平衡色譜柱。3. 上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為100ml。4 洗脫流速控制在600ml/min，在線220nm紫外檢測(cè)，收集含有積雪草甙的洗 脫液。5.積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮積雪草甙洗脫液，濃縮溫度控制在65'C。得到純度為99.54。/0 的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。
權(quán)利要求
1. 一種積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于以重量含量30～97％的積雪草甙提取物為原料，以制備型高效液相色譜為分離手段，以甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得克級(jí)純度98％以上積雪草甙化學(xué)對(duì)照品；具體步驟為，(1)樣品預(yù)處理將重量含量30～97％的積雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量濃度為30～60mg/ml的積雪草甙提取物溶液，經(jīng)0.22～0.45μm微孔濾膜過(guò)濾；(2)色譜柱處理高效液相色譜柱選擇制備型高效液相色譜柱，以5～10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱；洗脫體系溶液為甲醇水溶液，其體積濃度為50-80％；(3)進(jìn)樣將過(guò)濾后的樣品溶液進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1～100ml；(4)洗脫采用洗脫體系溶液洗脫色譜柱，流速控制在10～600ml/min，在線紫外監(jiān)測(cè)，收集含有積雪草甙的洗脫液；(5)積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲得減壓濃縮所收集到的積雪草甙洗脫液至干，獲得純度高于98％的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征 在于所述原料為重量含量60 97%的積雪草甙提取物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征 在于所述制備型高效液相柱選用商品化或自己裝填的制備型高效液相柱； 其填料可為C8或C18鍵合相填料。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征 在于所述自己裝填的制備型高效液相柱裝填方式為濕法裝柱。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征 在于所述制備型高效液相柱的柱效在2000以上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征 在于所述制備型高效液相柱的填料粒徑為5-20pm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征 在于所述在線紫外檢測(cè)，其檢測(cè)波長(zhǎng)為190nm 220nm。8根據(jù)權(quán)利要求1所述積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在 于所述積雪草甙洗脫液收集后，減壓濃縮，濃縮溫度控制在60 7(TC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的制備方法。以重量含量30～97％的積雪草甙提取物為原料，以制備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度大于98％的積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。工藝步驟有樣品預(yù)處理，色譜柱處理，進(jìn)樣，洗脫，在線檢測(cè)，收集含有積雪草甙的洗脫液，減壓濃縮積雪草甙洗脫液至干，即得積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，積雪草甙的含量可達(dá)到98％以上。
文檔編號(hào)C07J63/00GK101210040SQ20061013509
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日
發(fā)明者肖紅斌, 高明哲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所