專利名稱：特異殺傷原發(fā)肝癌細胞的腺病毒載體及使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因治療及病毒治療領域，具體的涉及到利用腫瘤特異性啟動子控制病毒載體特異性的在表達甲胎蛋白的肝癌細胞中特異復制與表達，從而殺死肝癌細胞的技術。發(fā)明背景惡性腫瘤的基因治療，要求病毒載體可以高效的特異性的進入腫瘤細胞，表達治療性基因，或特異性的在腫瘤細胞內(nèi)復制，進而殺死腫瘤細胞。
目前作為基因治療的常見載體有逆轉錄病毒載體，腺病毒載體和腺相關病毒載體，其中作為腫瘤基因治療較為常用的是腺病毒載體。
腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，其基因組長度約為36kb，分為早期轉錄區(qū)和晚期轉錄區(qū)。目前發(fā)現(xiàn)，人腺病毒有47個血清型，分屬A-F6個亞屬，其中C亞屬的5型腺病毒是目前人們研究最為詳細的一種。
將腺病毒刪除E1區(qū)及E3區(qū)所得到的腺病毒載體常被稱為第一代腺病毒載體，這種載體可插入并表達長度為8kb以內(nèi)的外源基因，這種腺病毒載體本身不能復制產(chǎn)生子代病毒，腺病毒載體DNA也不整合入宿主細胞的基因組中。
腺病毒載體可感染多種類型細胞，包括靜止期細胞。腺病毒載體可以較容易的大規(guī)模培養(yǎng)并獲得高滴度的病毒純品。這些特點使得腺病毒作為常用的腫瘤基因治療載體。
腺病毒作為腫瘤基因治療的載體，提高其對腫瘤細胞的特異性是十分重要的。
近年來，腫瘤的基因治療理論與實踐發(fā)展很快，在采用基因治療手段治療腫瘤的各種方案中，讓重組病毒特異性的在腫瘤細胞內(nèi)復制與表達，從而殺死腫瘤細胞的所謂溶瘤病毒(Oncolytic Virus)方案，目前進展最快，其中的代表是美國Onyx公司開發(fā)的重組腺病毒Onyx-15，目前正在進行III期臨床試驗。
為了提高病毒載體殺傷腫瘤細胞的特異性，尋找腫瘤細胞與正常細胞的差異十分重要。
在國內(nèi)外許多研究者均努力開發(fā)可在肝癌細胞中特異性復制表達的病毒載體，有人試圖通過改造腺病毒基因組本身達到此目的(Lieber，A.et.al.)，有人試圖通過修飾腺病毒的纖毛結構來達到此目的(Curiel，D.at.al.)，其中，以外源的腫瘤特異性啟動子控制重組病毒特異性復制，是一種重要的技術手段。(Yu，D.C.et.al.)原發(fā)肝癌細胞與正常肝細胞的一個重要區(qū)別是，超過70％的原發(fā)肝癌細胞表達甲胎蛋白，而正常肝細胞不表達，只有胎肝細胞才表達這一蛋白。這是癌細胞幼稚化的一種體現(xiàn)，在臨床診斷中，甲胎蛋白檢測是原發(fā)肝癌的重要普查方法。因此，是否表達甲胎蛋白是區(qū)別正常肝細胞和肝癌細胞的一個重要標記。如果將腺病毒中其自身啟動子刪除，置換成甲胎蛋白的啟動子，這樣，這種重組腺病毒將置于甲胎蛋白啟動子控制之下，只有在表達甲胎蛋白的細胞環(huán)境中，因為具有該啟動子的激活因子，所以啟動子被激活，病毒基因組開始復制及表達。而在正常的肝細胞中，不存在這樣的激活因子，病毒基因組將不能復制表達。這樣就造成了對肝癌細胞的選擇性殺傷。
目前，已有數(shù)個研究組采用甲胎蛋白啟動子控制腺病毒，以期達到特異抗肝癌的作用。由于甲胎蛋白啟動子的結構十分復雜，使用不同的部分，不同的結構會得出不同的結構，這就是為什麼很多研究組報道甲胎蛋白啟動子的特異性不理想。
我們在這方面進行了大量的研究，使用了一種特殊結構的甲胎蛋白啟動子，含有增強子(Enhancer)、靜默子(Silencer)及啟動子核心區(qū)(core promoter)等全部功能部件。
外源腫瘤特異性啟動子可能遇到的問題是啟動子的忠實性程度，即是否可以在異源基因組中保持同樣的特異性。為了增強甲胎蛋白啟動子的特異性，我們在重組腺病毒基因組中甲胎蛋白啟動子基因序列之前插入了特殊的基因調(diào)控組件-隔離子(ioslator)，使其達到了很高的特異性。
對于腫瘤基因治療載體，一方面要求其可以針對腫瘤細胞產(chǎn)生特異性；另一方面，也希望其具有抗腫瘤基因，置于腫瘤特異性啟動子控制之下，特異性的在腫瘤細胞內(nèi)表達，提高對腫瘤細胞的殺傷效果。同時，要求其在正常細胞中盡可能不復制，減低對正常細胞的殺傷。為達到這兩個目的，將A5型腺病毒E1a基因結合入病毒基因組中將會產(chǎn)生一個理想的結果。
5型腺病毒E1a基因位于病毒基因組左端，具有有84％的保守性。E1a編碼兩個主要的蛋白，一個有243個氨基酸(12S，243R)，一個有289個氨基酸(13S，289R)。E1a-12S和E1a-13S蛋白通過激活病毒基因的表達促使病毒復制。(Shenk，T。1996。Adenoviridea，P。2111-2148。)E1a-12S和E1a-13S蛋白是腺病毒最初表達的兩個蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特別是E2區(qū)和E4區(qū)基因的功能，而這兩個區(qū)的功能是有關腺病毒的復制。
E1a直接活化細胞基因，誘導細胞DNA復制，與細胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)pRb，pRb相關蛋白(P107/P130)或P300相互作用。
E1a與pRb家族蛋白分子的結合，釋放出E2F家族的轉錄因子，造成宿主細胞中一些有關DNA合成的基因被正向調(diào)控，使靜止期細胞進入S期。這些和一些其它在S期激活的細胞因子，產(chǎn)生了一個適合病毒DNA合成的環(huán)境。在正常細胞中，E1a誘導細胞周期負調(diào)控造成P53蛋白的累積，刺激P53介導G1期細胞停滯(e1-Deiry，W。S。et。al。，1993。Cell。75817-25；Xiong，Y。et。al。1993。Nature，366701-4)或進入細胞凋亡途徑。另外，E1a誘導的調(diào)亡也能通過不依據(jù)P53途徑發(fā)生。(Teodoro，J。G。et。al。1995。Oncogene。11467-74)E1a基因過去曾被認為是一個癌基因，可使動物胚胎細胞發(fā)生永生化，并可與其他病毒或細胞的癌基因相互作用。
在動物實驗中，E1a并不能單獨誘發(fā)癌變，而需與E1b等其它基因共同起作用。5型腺病毒本身沒有致癌性，其它型有致癌性的腺病毒與其單獨的E1a基因沒有必然的聯(lián)系。近十年來，很多實驗證實，5型腺病毒E1a基因不但對人體細胞沒有致癌性，而且實際上可以有抑制腫瘤生長的作用。E1a的腫瘤抑制作用可能與E1a對多種基因的調(diào)控有關。主要表現(xiàn)在以下幾個方面①neu基因過度表達與人體惡性腫瘤特別是頭頸口腔鱗癌密切相關，也與腫瘤的預后及耐藥性相關。而有證據(jù)顯示，E1a基因在轉錄水平可以特異性的抑制neu基因的表達，可以抑制如粘附、侵襲等與腫瘤轉移相關的特性，E1a基因也能抑制癌基因誘導的包括細胞多形性等在內(nèi)的癌變特性，也可提高高表達neu基因的乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性(YuDH，et.al.Molecular basis of oncology.1995131-162；UenoNT，et.al.Proc AACR，1998，39360(Abstract))②E1a通過提高細胞P53水平誘導細胞凋亡，產(chǎn)生抗腫瘤作用。③E1a可以提高細胞對5-氟尿嘧啶、順鉑等化療藥及輻射所誘導的細胞凋亡的敏感性。④E1a可在宿主細胞表面表達，提高機體對細胞表達E1a基因的細胞的殺傷、清除，達到抗腫瘤效果。
作為腫瘤基因治療，現(xiàn)有問題是提高其特異性地在腫瘤細胞中的表達，甲胎蛋白啟動子控制下的重組腺病毒載體具有這一特征，而E1a基因作為抗腫瘤基因近年來已運用于臨床試驗中。本發(fā)明人經(jīng)過研究試驗，將5型腺病毒E1區(qū)啟動子刪除，代之以甲胎蛋白啟動子，為研究甲胎蛋白啟動子及隔離子的腫瘤特異性，并在甲胎蛋白啟動子基因后面連接報告基因堿性磷酸酶基因，構建出一種新的腫瘤基因治療腺病毒載體M001，在M001重組腺病毒基因中甲胎蛋白啟動子基因之前插入隔離子，構建出另一種重組病毒M002。為進行實際應用，將以上兩個重組腺病毒載體中的堿性磷酸酶基因去處，代之以腺病毒E1a基因，形成兩個腫瘤特異性病毒載體A001及A002，目的是提供一種腺病毒載體可以特異性的在肝癌細胞中復制，表達E1a基因，從而特異高效的殺死肝癌細胞。
本發(fā)明中所構建的重組病毒M002已經(jīng)送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址為中國武漢，武漢大學內(nèi)。保藏日期是2001年10月28日，保藏編號是V200114，分類命名是腺病毒。
本發(fā)明還提供了含有此腫瘤特異性載體病毒及可藥用載體的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了此腫瘤特異性載體在制備用于治療腫瘤藥物組合物中的用途。


圖1.M001及M002重組腺病毒基因結構，其中AFP是甲胎蛋白啟動子，AP是堿性磷酸酶基因，pA是多聚腺苷，HS4是隔離子。圖2.A001及A002重組腺病毒基因結構，其中AFP是甲胎蛋白啟動子，AP是堿性磷酸酶基因，pA是多聚腺苷，HS4是隔離子。圖3.M001及M002重組腺病毒細胞特異性試驗，其中M1是M001病毒，M2是M002病毒，Hep3B為人肝癌細胞系HepG2為人肝癌細胞系，HuH7為人肝癌細胞系，BT549為人乳腺癌細胞系，F(xiàn)ibroblast為人成纖維細胞，Humhep為人肝細胞系，MCF-7為人乳腺癌細胞系，LS174T為人結腸癌細胞系，HeLa為人宮頸癌細胞系。發(fā)明詳述本發(fā)明中所構建的重組腺病毒載體是經(jīng)過改造的5型腺病毒。5型腺病毒的基因組含有35935個核苷酸。5型腺病毒是目前研究的最為清楚的一種病毒。流行病學上主要引起人的呼吸道感染，有明顯的自愈性。腺病毒作為疫苗應用于人體已有幾十年的歷史，從未發(fā)現(xiàn)有轉化人正常細胞及致癌現(xiàn)象發(fā)生。
本發(fā)明所構建的重組腺病毒載體如圖1中所使示的M001和M002。在M001中，腺病毒載體E1a的啟動子區(qū)被刪除，加入甲胎蛋白啟動子(AFP Promoter)控制整個腺病毒載體的復制。甲胎蛋白啟動子下游是一個報告基因堿性磷酸酶基因(AP)。將M001重組腺病毒基因組中甲胎蛋白啟動子序列前插入隔離子HS4，形成重組腺病毒M002，用以研究甲胎蛋白啟動子及隔離子的肝癌特異性。為進行實際藥效學研究及臨床應用，將以上兩個重組腺病毒載體中的堿性磷酸酶基因去處，代之以腺病毒E1a基因，形成兩個腫瘤特異性病毒載體A001及A002，目的是提供一種腺病毒載體可以特異性的在肝癌細胞中復制，表達E1a基因，從而特異高效的殺死肝癌細胞。
甲胎蛋白啟動子結構復雜，序列長達8kb。使用不同部分，其肝癌特異性有很大差別。本項目采用基因工程方法對人甲胎蛋白啟動子結構進行優(yōu)化，具體講，采用兩次重復的增強子(Enhancer)，六次重復的靜默子(Silencer)，及甲胎蛋白啟動子核心區(qū)，共同組成一個全新的，緊湊的，高效的甲胎蛋白啟動子，將5型腺病毒基因組置于這個啟動子控制之下，并結合隔離子(Isolator)等調(diào)控組件，組成一個可以特異性在肝癌細胞中復制表達的重組腺病毒。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明解決了肝癌基因治療領域中的兩個問題(1)如何在肝癌細胞內(nèi)特異性的表達基因，通過使用甲胎蛋白啟動子控制的重組腺病毒載體，可以在腫瘤細胞內(nèi)特異性表達外源基因，如果特異表達的是一些細胞毒性外源基因或與細胞凋亡有關的外源基因，將對肝癌的治療提供一種有效的手段。采用不同靶向的腫瘤特異性啟動子，就可以針對不同腫瘤進行特異性的治療。
(2)如何提高肝癌基因治療載體的腫瘤特異性。目前的腫瘤基因治療載體普通存在特異性差的問題。本發(fā)明中所使用的重組腺病毒載體，利用插入隔離子的設計，提高病毒載體在腫瘤細胞內(nèi)的復制及表達的特異性。
定義除非另有不同定義，在此使用的所有技術和科學術語的含義與本發(fā)明所屬領域中一般技術人員通常所理解的一樣。盡管任何與在此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實施或試驗。在此僅對優(yōu)選的方法和材料予以描述。為本發(fā)明現(xiàn)就以下術語予以定義在此使用的“外源基因”這一術語指插入本發(fā)明中所用腺病毒載體中的編碼任何感興趣的蛋白的DNA序列。插入外源基因長度的上限取決于腺病毒載體的包裝限度。插入的外源基因可編碼任何研究所需的蛋白，可以具有藥用或其它特征。外源基因可用常規(guī)方法制備得來，如合成，及由天然來源提取、克隆等得來。
在此使用的“肝癌特異性基因表達”和“肝癌特異性”這兩個術語是指腺病毒載體在肝癌細胞中的表達。雖然此載體在正常細胞中也會有表達，但表達水平很低，使得載體復制和包裝無法有效進行，以至于可以將這樣低的復制包裝水平忽略不計。
在此使用的“第一代腺病毒載體”或“第一代重組腺病毒載體”這一術語是指任何腺病毒載體，刪除了E1和/或E3區(qū)基因，致使腺病毒載體不能復制。
實施例I 重組腺病毒M001和M002的構建1.M001病毒的構建以下描述了M001、M002兩個重組腺病毒的構建。它們都是帶有甲胎蛋白啟動子的5型腺病毒載體，其中M002重組腺病毒還含有隔離子HS4基因，而M001不含有HS4基因。
除非另外說明，本發(fā)明所采用的技術，均是本領域常規(guī)技術，如分子克隆技術、微生物學技術、細胞生物學技術，這些技術在文獻中均有充分解釋。如Sambrook等的《分子克隆實驗室手冊》第二版(1989)等。
質(zhì)粒載體的構建用EcoRI和NsiI內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pLAPSN，回收含有AP基因的DNA片段。用SalI和AflII內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pXZAFP，回收大片段。
用AvrII和BlpI切割質(zhì)粒pAd.BG，回收大片段。分別將AP基因和AFP啟動子基因與該片段連接，構成質(zhì)粒pM001。采用磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒pM001與質(zhì)粒pBHG10共轉染293細胞，將細胞表面鋪0.5％瓊脂，內(nèi)含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約9天后，培養(yǎng)皿瓊脂層下細胞出現(xiàn)噬斑，挑取噬斑，進行擴增，提取重組腺病毒DNA，進行DNA酶切分析，確定正確的重組腺病毒毒株。2.M002病毒的構建M002重組腺病毒的構建方法是將HS4基因插入pM001質(zhì)粒中AFP啟動子序列5’端，形成質(zhì)粒pM002，然后與質(zhì)粒pBHG10共轉染293細胞，將細胞表面鋪0.5％瓊脂，內(nèi)含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約9天后，培養(yǎng)皿瓊脂層下細胞出現(xiàn)噬斑，挑取噬斑，進行擴增，提取重組腺病毒DNA，進行DNA酶切分析，確定正確的重組腺病毒毒株。
實施例2A001重組病毒和A002重組病毒的構建用點突變的方法在pXC1質(zhì)粒E1a基因前構建出一個AgeI酶切位點，用AgeI和HpaI限制性內(nèi)切酶將E1a基因切割下來，回收基因片段。
將pM001及pM002質(zhì)粒中的堿性磷酸酶基因切除，代之以E1a基因。分別構成質(zhì)粒pA001和pA002，將質(zhì)粒pA001和pA002分別與質(zhì)粒pBHG10共轉染293細胞，將細胞表面鋪0.5％瓊脂，內(nèi)含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約9天后，培養(yǎng)皿瓊脂層下細胞出現(xiàn)噬斑，挑取噬斑，進行擴增，提取重組腺病毒DNA，進行DNA酶切分析，確定正確的重組腺病毒毒株A001和A002。
實施例3M001和M002重組病毒在肝癌細胞中的特異性復制與表達M001及M002重組腺病毒培養(yǎng)于293細胞內(nèi)，培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清，37℃，5％CO2。用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，35000rpm兩次離心純化病毒，最后將病毒稀配于含有1mM MgCl2，10mM Tris，pH7.5，10％甘油的溶液中。
將M001病毒，M002病毒載體和野生型腺病毒以感染系數(shù)(MOI＝100)感染HepG2細胞(人肝癌細胞)，Hep3B細胞(人肝癌細胞)，LOVO細胞(人大腸癌細胞株)，HeLa細胞(人宮頸癌細胞株)，293細胞(5型腺病毒轉化的人胚胎腎細胞，支持非復制型腺病毒載體復制)，BT549(人乳腺癌細胞)，人成纖維細胞，人正常肝細胞系HumHep，MCF-7(人乳腺癌細胞)和LS174T(人結腸癌細胞)。以上細胞分別培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)條件是DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清，37℃，5％CO2。48小時后，將細胞裂解，進行堿性磷酸酶活性檢測，結果見圖3。從圖3中可見，對于表達甲胎蛋白的HepG2細胞，Hep3B細胞HuH7細胞，M001病毒和M002病毒顯示了極高的特異性，其中M002病毒的特異性更高。在不表達甲胎蛋白的其他腫瘤細胞及正常細胞中，兩個病毒基本沒有表達報告基因。
盡管本發(fā)明為了便于明確理解而通過舉例方式在某些方面做了詳細描述，但顯然在權利要求的范圍內(nèi)進行一定的變化和修飾是可行的。
權利要求
1.一種重組腺病毒載體，其刪除了E1和/或E3區(qū)基因，及E1區(qū)啟動子，并具有可在腫瘤細胞中特異性復制表達的外源插入基因。
2.一種由權利要求1中的病毒載體，其病毒基因組的復制與表達在外源啟動子控制之下。
3.權利要求2中所述腺病毒載體，其病毒基因組中外源啟動子序列左側具有隔離子(isolator)序列，以增強外源啟動子的特異性。
4.權利要求2中所述腺病毒載體，由以下幾種組件組成a.一段腺病毒左側倒置末端重復序列。b.一段腺病毒包裝序列，位于左側倒置末端重復序列的3’端。c.一段隔離子序列，位于左側腺病毒包裝序列的3’端。c.一段外源啟動子序列，位于左側隔離子序列的3’端。d.一段基因序列，其復制與表達置于外源啟動子控制之下，位于外源啟動子的3端’。e.一個或多個腺病毒基因，位于外源啟動子及其控制表達的基因的3’端。f.腺病毒右側倒置重復序列，位于腺病毒基因的3’端。
5.一種腺病毒載體，在外源啟動子控制表達的插入基因序列的3’端后具有一段雙向轉錄終止位點序列，可以阻斷轉錄進行。
6.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的啟動子是腫瘤特異性啟動子。
7.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的啟動子序列是甲胎蛋白(AFP)啟動子序列。
8.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的甲胎蛋白啟動子序列由增強子(Enhancer)，靜默子(Silencer)和啟動子核心區(qū)(core promoter)構成。
9.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的甲胎蛋白啟動子序列的增強子序列具有兩次重復，靜默子序列具有6至8次重復。
10.權利要求3中所述腺病毒載體，其中的隔離子序列是一段由雞基因中得來的序列，即隔離子HS4，或其它具有同樣功能的外源DNA序列。
11.權利要求4中所述腺病毒載體，其中的外源插入DNA序列表達一個或多個基因產(chǎn)物。
12.權利要求4中所述腺病毒載體，其終止位點是雙向的SV40多聚腺苷序列。
13.權利要求4中所述腺病毒載體，其終止位點是雙向的多聚腺苷序列。
14.權利要求4中所述腺病毒載體，其中的腫瘤特異性啟動子控制的插入基因產(chǎn)物是細胞凋亡基因或細胞裂解基因產(chǎn)物。
15.權利要求3中所述腺病毒載體，其中的腫瘤特異性啟動子控制的插入基因產(chǎn)物是堿性磷酸酶基因產(chǎn)物。
16.權利要求3中所述腺病毒載體，其中的外源插入基因是腺病毒E1a基因。
17.權利要求4中所述腺病毒載體，其中的腫瘤特異性啟動子控制的插入基因是自殺基因。
18.一種選擇性殺死腫瘤細胞的方法，該方法包括在感染條件下，將可殺死腫瘤細胞的權利要求2-17中的任意一種腺病毒載體與含有腫瘤細胞的細胞群體接觸，因此產(chǎn)生一種感染的細胞群體。
19.一種藥物組合物，含有可殺死腫瘤細胞的權利要求4-19中任意一項的重組腺病毒載體及可用藥用載體。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其還包括將該腫瘤細胞接觸一種免疫抑制或化學治療化合物。
21.一種組合物，其包括一種具有選自權利要求2-17中的任意一種腺病毒特性的重組腺病毒，以及一種化學治療化合物。
22.一種組合物，其包括一種具有選自權利要求2-17中的任意一種腺病毒特性的重組腺病毒，以及一種免疫抑制化合物。
23.權利要求2-17中任意一項所述病毒在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明“特異殺傷原發(fā)肝癌細胞的腺病毒載體及使用方法”,提供了基于病毒療法的治療表達甲胎蛋白的原發(fā)肝癌的方法和組合物。本發(fā)明構建了兩種基因工程重組腺病毒,其中含有甲胎蛋白啟動子和隔離子基因。研究表明,帶有甲胎蛋白的腺病毒可特異性的在腫瘤細胞內(nèi)復制,隔離子可以提高重組腺病毒在表達甲胎蛋白的原發(fā)肝癌細胞的復制的特異性。試驗結果表明,此兩個重組腺病毒可用于原發(fā)肝癌的病毒治療及基因治療。
文檔編號A61K48/00GK1379109SQ0113431
公開日2002年11月13日 申請日期2001年10月29日 優(yōu)先權日2001年10月29日
發(fā)明者梁旻, 葉迅, 胡放 申請人:上海三維生物技術有限公司