專利名稱：用復制缺陷腺病毒載體加強cd8+t細胞對抗原的免疫應答的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對抗抗原的CD8+T細胞免疫應答的產生。更具體地說，本發(fā)明涉及“激發(fā)和加強”免疫方案，其中通過給予激發(fā)組合物而誘導的免疫應答由給予加強組合物而加強。本發(fā)明是基于發(fā)明者的實驗證明，即在用任何各種不同類型的激發(fā)組合物激發(fā)后，通過使用復制缺陷腺病毒載體可以獲得有效的加強。
抗許多病原體的免疫應答的主要保護成分是由CD8+類型的T淋巴細胞，也稱作細胞毒T淋巴細胞(CTL)介導的。CD8+T細胞的一項重要功能是分泌γ干擾素(IFNγ)，這提供了CD8+T細胞免疫應答的測量方法。
CD8+T細胞應答在防御許多寄生蟲，包括原生動物寄生蟲如弓形蟲屬和錐體蟲屬、惡性瘧原蟲(在小鼠中為伯氏瘧原蟲)，病毒如HIV、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、HBV、HCV、流感病毒、EBV、麻疹病毒、登革熱病毒和HTLV-1，細菌如結核桿菌和利斯特菌，以及各種癌癥，如黑色素瘤和腎癌中是重要的。
用伯氏瘧原蟲感染小鼠為人體中的惡性瘧原蟲提供了良好的模型，發(fā)明者選擇將其用于舉例說明本發(fā)明提供對抗抗原的強CD8+T細胞免疫應答的能力。瘧疾是全球的一個主要健康問題，針對找到用于接種的有效免疫組合物已經付出了許多努力。
為防御惡性瘧的紅細胞前期，免疫原性組合物必需誘導強CD8+T細胞免疫?？偟恼f來，可以在健康個體中產生無害的短期感染的減毒活疫苗可以有效誘導T細胞應答。接受過輻射的瘧原蟲子孢子可以感染肝細胞但不進展為血液期感染，它們表現(xiàn)出通過誘導抗紅細胞前期抗原的T細胞應答而防御小鼠和人的瘧疾〔Nardin and Nussenzweig(1993)Annu.Rev.Immunol.11687-727〕。然而在人中，這要求長時間中的多種免疫，同時盡管這些實驗免疫提供了有價值的信息，這種方法對開發(fā)疫苗是無用的。
重組蛋白亞單位疫苗激發(fā)了體液應答，但只激發(fā)了微弱的CD8+T細胞免疫〔Schirmbeck et al.，(1995)Vaccine 13(9)857-865〕。DNA疫苗表現(xiàn)出激發(fā)抗約氏瘧原蟲CS蛋白的體液和細胞應答〔Sedegahet al.，(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 91(21)9866-70〕。然而，用表達伯氏瘧原蟲CS基因的DNA疫苗免疫的小鼠對保護性CD8+T細胞表位pb9只有微弱的CD8+T細胞應答〔Romero et al.，(1989)Nature 341(6240)323-6〕并且甚至在重復免疫后也不能防御感染性子孢子的侵襲〔Schneider et al.，(1998)Nat.Med.4(4)397-402〕。由聚集為30nm顆粒的重組蛋白組成的類Ty病毒顆粒誘導更強的CD8+T細胞應答，但不能防御感染〔Gilbert et al.，(1997)Nat.Biotechnol.15(12)1280-4〕。
重組病毒也可以用作疫苗。修飾的疫苗病毒Ankara(MVA)在人細胞中不復制，并且是用作疫苗的非常安全的病毒〔Mayr et al.，(1978)Zentralbl.Bakteriol.167(5-6)375-90；Sutter and Moss(1992)ProcNatl.Acad.Sci.89(22)10847-51；Sutter et al.，(1994)Vaccine 12(11)1032-40〕。在小鼠中也檢驗了表達伯氏瘧原蟲CS的重組MVA，細胞毒性測定中產生與用Ty VLPs免疫小鼠時相似水平的肽特異性裂解〔Gilbert et al.，(1999)Biol.Chem.380(3)299-303〕。同樣，這些小鼠不能防御感染侵襲。然而，盡管單獨使用DNA疫苗、Ty VLPs或MVA都不能防御瘧疾感染，使用DNA或Ty VLPs激發(fā)T細胞應答并用MVA加強導致了分泌IFN-γ的CD8+T細胞數(shù)目很大程度上的增加，當靜脈給予MVA時，產生了完全的感染防御〔Schneider et al.，(1998)Nat.Med.4(4)397-402，WO98/56919〕。
本發(fā)明使用了復制缺陷腺病毒，如下面描述的實驗所示，發(fā)現(xiàn)它是對用任何各種不同的激發(fā)組合物激發(fā)的對抗原的CD8+T細胞免疫應答提供加強的有效方法。
源于人血清型5的復制缺陷腺病毒由Graham和同事開發(fā)為活病毒載體〔Graham and Prevec(1995)Mol.Biotechnol.3(3)207-20；Bett et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(19)8802-6〕。腺病毒是含約3600bp的線性雙鏈DNA基因組的無被膜病毒。重組病毒可以通過腺病毒基因組質粒和含感興趣的基因與強真核啟動子的穿梭載體之間的體外重組，在允許病毒復制的允許細胞系中構建?？梢詮脑试S細胞系中獲得高病毒滴度，但產生的病毒盡管可以感染許多細胞類型，但并不在允許細胞系以外的細胞中復制，所以是安全的抗原運送系統(tǒng)。重組腺病毒表現(xiàn)出激發(fā)了抗許多抗原包括蜱傳播的腦炎病毒NS1蛋白〔Jacobs et al.，(1992)J.Virol.66(4)2086-95〕和麻疹病毒核蛋白〔Fooks et al.，(1995)Virology 210(2)456-65〕的保護性免疫應答。另外，單劑量的重組腺病毒導致小鼠中肝寄生蟲約氏瘧原蟲的rRNA水平減少93％，以及表現(xiàn)為CD8+T細胞介導的40％的保護作用〔Rodrigues et al.，(1997)J.Immunol.158(3)1268-74〕。
很顯然，下面描述的實驗工作證明了本發(fā)明實施方案的使用允許表達抗原的重組復制缺陷腺病毒(特別用伯氏瘧原蟲的CS基因舉例說明)增強由DNA疫苗、Ty-VLPs或重組的修飾疫苗病毒Ankara(MVA)激發(fā)的CD8+T細胞免疫應答。發(fā)現(xiàn)皮內或肌內免疫后復制缺陷腺病毒誘導CD8+T細胞應答。在初次/加強接種方案中，復制缺陷腺病毒也可以激發(fā)能被MVA加強的應答。
用復制缺陷腺病毒免疫并用MVA加強的小鼠完全抵抗伯氏瘧原蟲子孢子侵襲。重組復制缺陷腺病毒和重組MVA是用于人安全的疫苗。有利的是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)可以采用初次和加強免疫都使用皮內免疫的接種方案，制定適于誘導CD8+T細胞的通用免疫方案，如在人類中。
本發(fā)明在各種方面和實施方案中使用編碼抗原的復制缺陷腺病毒載體，從而增強由前面給予抗原或編碼抗原的核酸激發(fā)的對該抗原的CD8+T細胞免疫應答。
本發(fā)明總體方面提供復制缺陷腺病毒載體在加強對抗原的CD8+T細胞免疫應答中的用途。
本發(fā)明的一方面提供了一種增強對個體中抗原的CD8+T細胞免疫應答的方法，此方法包括在個體中提供復制缺陷腺病毒載體。此復制缺陷腺病毒載體包括與調節(jié)序列可操作性連接的編碼抗原的核酸序列，從而通過核酸表達而在個體中產生抗原，由此加強前面在個體中激發(fā)的對抗原的CD8+T細胞免疫應答。
對抗原的免疫應答可以通過免疫，通過用感染性媒介感染，或通過生成腫瘤或惡性腫瘤而激發(fā)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種在個體中誘導對抗原的CD8+T細胞免疫應答的方法，此方法包含給予個體包含抗原或編碼抗原的核酸的激發(fā)組合物然后給予包含復制缺陷腺病毒載體的加強組合物，復制缺陷腺病毒載體包括與調節(jié)序列可操作性連接的編碼抗原的核酸序列從而通過核酸表達而在個體中產生抗原。
如文中所公開的，本發(fā)明的另一方面提供了復制缺陷腺病毒在生產給予哺乳動物而加強對抗原的CD8+T細胞免疫應答的藥物中的用途。這種藥物一般在給予包含抗原的激發(fā)組合物之后給予。
激發(fā)組合物可以包含任何病毒載體，盡管一般不是腺病毒，如疫苗病毒載體，如復制缺陷株如修飾病毒ankara(MVA)(Mayr et al.，(1978)Zentralbl.Bakteriol.167(5-6)375-90；Sutter and Moss(1992)Proc.Natl.Acad.Sci 89(22)10847-51；Sutter et al.，(1994)Vaccine 12(11)1032-40)或NYVAC(Tartaglia et al.，Virology(1992)118(1)217-32)，禽痘病毒載體如禽痘或黃雀痘，如稱作ALVAC的株(Kanapox，Paoletti et al.，Dev Biol Stand(1994)8265-9)，或皰疹病毒載體。激發(fā)組合物可以包含重組細菌載體，如重組BCG或沙門氏菌。包含重組禽痘病毒的激發(fā)組合物是用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案之一。
激發(fā)組合物可以包含編碼抗原的DNA，這種DNA優(yōu)選以不能在哺乳動物細胞中復制的環(huán)形質粒的形式存在。任何可選擇的標記不應該對臨床上使用的抗生素耐藥，所以例如卡那霉素耐藥比氨芐青霉素耐藥優(yōu)選。抗原表達應由在哺乳動物細胞中有活性的啟動子，例如巨細胞病毒即刻早期(cytomegalovirus immediate early)(CMV IE)啟動子驅動。
激發(fā)組合物可以是重組Ty-VLP。這些是由從釀酒酵母的Ty1反轉座子得到的自發(fā)聚集為顆粒的單種蛋白組成的蛋白顆粒。重組Ty-VLPs的產生可以通過將要求的表位或抗原的編碼序列與TyA蛋白的編碼序列的3′端融合，并用包括編碼序列的載體轉化釀酒酵母而表達融合蛋白，融合蛋白然后在酵母細胞漿中聚集為顆粒，并可以在此被純化。Ty-VLP的特殊屬性允許它們被抗原呈遞細胞攝取并激發(fā)對包含在它們中的表位的CD8+T細胞應答。
其它適當?shù)募ぐl(fā)組合物包括帶有脂質尾的肽、融合蛋白、佐劑組合物等。
在本發(fā)明各方面的特定實施方案中，在給予激發(fā)組合物后用第一和第二加強組合物加強，第一和第二加強組合物互不相同，如下面的舉例說明?？梢允褂眠M一步的加強組合物而不離開本發(fā)明的范圍。在一種實施方案中，一種三次免疫方案使用DNA，然后將腺病毒作為第一加強組合物，然后將MVA作為第二加強組合物，其后可以選用進一步的(第三)加強組合物或后續(xù)加強給予一種或另一種或兩種相同或不同的載體。另一種選擇是DNA，然后是MVA，然后是Ad，然后可以選用后續(xù)加強給予一種或另一種或兩種相同或不同的載體。
分別包括于激發(fā)和加強組合物的抗原(不管使用多少加強組合物)不需要相同，但至少應該有一個相同的CD8+T細胞表位。抗原可以對應于靶病原體或細胞中的完整抗原或其片段?？梢允褂秒谋砦换蛉斯け砦淮?，切掉抗原中不必要的蛋白序列和載體中的編碼序列更有效?？梢园ㄒ环N或更多額外的表位，例如由T輔助細胞識別的表位，特別是在不同HLA類型個體中識別的表位(如破傷風表位)。
在復制缺陷腺病毒載體中，編碼抗原表達的調節(jié)序列包括啟動子?！皢幼印北硎疽环N核苷酸序列，它可以起始下游的(即雙鏈DNA有義鏈的3′方向)可操作性連接的DNA的轉錄。“可操作性連接”表示作為同一核酸分子的部分被連接，為轉錄從啟動子起始而適當定位和定向。與啟動子可操作性連接的DNA在啟動子的“轉錄起始調節(jié)下”。其它調節(jié)序列包括終止子片段，聚腺苷酸化序列，增強子序列，標記基因和其它可以包括的適當?shù)模媳绢I域普通技術人員知識和慣例的序列見，例如，Molecular Cloninga Laboratory Manual2nd edition，Sambrook et al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。許多操作核酸的已知技術和方案，例如制備核酸構建體、誘變、測序、將DNA引入細胞和基因表達，以及蛋白質分析都詳細描述于CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，John Wiley &Sons，1994。
用于本發(fā)明的一些方面和實施方案的適當啟動子包括有或無內含子A的巨細胞即刻早期(CMV IE)啟動子，以及在哺乳動物細胞中其它任何有活性的啟動子。
激發(fā)和加強組合物之一或全部可以包括佐劑，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或其編碼核酸。
給予加強組合物一般在給予激發(fā)組合物的約10天到4周之后，優(yōu)選約2-3周之后。
優(yōu)選地，激發(fā)組合物，加強組合物，或激發(fā)組合物和加強組合物的給予是皮內或肌內免疫。
可以通過使用針頭注射病毒懸浮液而完成腺病毒和MVA疫苗的皮內給予。另一種方法是使用無針頭注射設備而給予病毒懸浮液(如使用BiojectorTM)或含疫苗的凍干粉末(如依照Powerject的技術和產品)，提供生產不需要冷藏的個別制備的劑量。這對非洲農村所需要的疫苗將是很大的優(yōu)點。
腺病毒和MVA都是在人類免疫中有非常安全的記錄的病毒?？梢院芎唵蔚赝瓿芍亟M病毒的產生，并且可以大量重復生產。皮內給予重組復制缺陷病毒并隨后給予重組MVA因此高度適合人類的預防或治療性接種以對抗可以由CD8+T細胞應答控制的疾病。
個體可以有疾病或紊亂，這樣抗原運送和對抗原的CD8+T細胞免疫應答的產生是有益的或有治療上有益的作用。
更最多的情況下給予疫苗將有預防目的，是為了在感染或癥狀發(fā)展之前產生抗病原體或疾病的免疫應答。
可以依照本發(fā)明治療或預防的疾病和紊亂包括前面已經指出的和其它CD8+T細胞免疫應答可以起保護或治療作用的疾病和紊亂。
依照本發(fā)明給予的成分可以配方為藥物組合物。這些組合物可以包含可藥用賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領域技術人員公知的物質。這些物質應該是無毒的并不應該干擾活性成分的效果。載體或其它物質的精確特性取決于給藥途徑，如靜脈內，皮膚或皮下，鼻，肌肉，腹膜內途徑。
如提到的，優(yōu)選皮內，皮下或肌肉給藥。
液體藥物組合物一般可以包括液體載體如水，石油，動物或植物油，礦物油或合成油。也可以包括生理鹽水、葡萄糖或其它糖溶液或二元醇，如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。
對于靜脈內、皮膚或皮下注射，或在病痛部位的注射，活性成分將以腸外可接受的水溶液的形式存在，它不含致熱源并具有適當?shù)膒H，等滲性和穩(wěn)定性。本領域中的相關技術人員可以很容易用例如等滲載體如氯化鈉注射液，林格氏液，乳酸化林格氏液制備適當?shù)娜芤??？梢园匆蟀ǚ栏瘎?、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。
可以使用緩釋配方。
在產生復制缺陷腺病毒顆粒和選擇將這些顆粒配制成組合物后，可以將這些顆粒給予個體，特別是人或其它靈長類動物。也可以給予其它哺乳動物，如嚙齒類如小鼠、大鼠或倉鼠、豚鼠、兔、綿羊、山羊、豬、馬、牛、驢、狗或貓。
優(yōu)選以“有效預防量”或“有效治療量”給藥(視具體情況而定，盡管預防可以考慮為治療)，這足夠對個體表現(xiàn)益處。實際給藥劑量，給藥速度和時間段將取決于處理情況的性質和嚴重程度。治療的處方，如劑量的決定等都是在一般實施者和其它醫(yī)生，或在獸醫(yī)學領域中的獸醫(yī)的責任范圍內，一般考慮需要治療的疾病，個體病人的狀況，運送位點，給藥方式和實施者已知的其它因素。上面提到的技術和方案的例子可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.(ed)，1980中找到。
在一種優(yōu)選方案中，以0.5mg/注射的劑量給予DNA(優(yōu)選肌肉注射)，然后給予劑量為5×107-5×108個病毒顆粒/注射的腺病毒(優(yōu)選肌肉或皮內注射)。
可以單獨或與其它治療結合給予組合物，可以同時或序貫給藥，這取決于需要治療的狀況。
運送到非人哺乳動物不需要為了治療目的，而可以是用于實驗內容，例如，用于研究對感興趣的抗原，如防御癌癥、瘧疾、其它病原體等抗原的免疫應答機制。
根據(jù)前面的公開內容和下面的通過圖例說明但不限于此的實驗舉例，并參考附圖，本發(fā)明的其它方面和實施方案對于本領域中的普通技術人員將是很明顯的。在附圖中，

圖1表示證明由Ad-PbCS單次免疫激發(fā)的肽特異性IFN-γ分泌T細胞的實驗結果。通過所表示的途徑使用107pfu免疫三只一組的各組小鼠。兩周后對脾細胞進行兩次Elispot測定而檢測IFN-γ分泌pb9特異性T細胞。此圖表示每種給藥途徑中每100萬脾細胞中的斑點形成細胞(SFC)。
圖2表示激發(fā)/加強免疫的結果。在第0天用所表示的第一種疫苗免疫三只一組的各組小鼠(D＝pSG2.PbCS，A＝Ad-PdCS，M＝MVA-PbCS)，在第14天用第二種疫苗免疫。DNA用肌肉注射，腺病毒和MVA用皮內注射。在第28天進行分離脾細胞的Elispot。此圖表示每種激發(fā)/加強免疫方案中每100萬脾細胞中的SFC。
圖3表示三種疫苗結合免疫的結果，以及它與兩種疫苗結合免疫的比較。用圖示疫苗免疫三只一組的各組小鼠，間隔為10天(D＝pSG2.PbCS，A＝Ad-PdCS，M＝MVA-PbCS)，兩種疫苗結合的第一種疫苗與三種疫苗結合的第二種疫苗是在同一天給予。在最后一次免疫后10天進行兩次脾細胞Elispot測定。此圖表示每種免疫方案中每100萬脾細胞中的SFC。
實驗舉例本發(fā)明者構建了一種表達伯氏瘧原蟲CS基因的重組復制缺陷腺病毒，(Ad-PbCS)，并檢驗了病毒自身或與其它類型的疫苗結合在小鼠中誘導CD8+T細胞反應的能力。
當用作單次免疫時，產生了高水平的抗原特異性CD8+T細胞。用腺病毒激發(fā)并隨后用MVA加強產生完全保護。顯著的是，腺病毒可以充分加強由DNA，Ty-VLP或MVA激發(fā)的反應。
材料和方法DNA疫苗DNA疫苗pSG2.PbCS由有內含子A的驅動伯氏瘧原蟲CS蛋白表達的CMV啟動子及牛生長激素聚腺苷酸序列組成。此質粒為耐卡那霉素的并且不能在真核細胞中復制。用Qiagen柱和在無內毒素的磷酸緩沖液(PBS)中稀釋而制備質粒。
構建重組復制缺陷腺病毒將從pSG2.PbCS得到的有內含子A的CMA啟動子、伯氏瘧原蟲CS蛋白基因及牛生長激素聚腺苷酸序列連接到腺病毒穿梭載體pΔElsp1A的多克隆位點〔Bett et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(19)8802-6〕。此載體可以用于構建E1缺失的腺病毒5重組體。重組穿梭載體用于與腺病毒基因組質粒pJM17一起轉染允許細胞系293〔Graham and Prevec(1995)Mol.Biotechnol.3(3)207-20〕。將從轉染細胞得到的病毒通過在293細胞中的三次連續(xù)的有限稀釋進行克隆純化，并用免疫熒光證實伯氏瘧原蟲CS在感染了分離病毒的細胞中表達。在免疫前用感染的293細胞制備大量病毒并通過用Arklone提取而純化〔Graham and Prevec(1995)Mol.Biotechnol.3(3)207-20〕。
Ty VLPs按〔Gilbert et al.，(1997)Nat.Biotechnol.15(12)1280-4〕中所描述的制備表達伯氏瘧原蟲CS的Pb9表位SYIPSAEKI的重組TyVLPs并將其懸浮在PBS中。
重組MVA通過在初級雞胚胎成纖維細胞中由疫苗P7.5啟動子驅動的含CS基因的穿梭載體和MVA病毒之間的體外重組制備表達伯氏瘧原蟲CS的MVA〔Sutter et al，，(1994)Vaccine 12(11)1032-40〕。將也表達大腸桿菌β半乳糖苷酶的重組體進行重復噬斑純化并用免疫熒光證實重組基因的表達。通過蔗糖緩沖的超速離心純化用于免疫的病毒并將其懸浮在無內毒素的PBS中。
免疫對于單個實驗，按描述在麻醉下免疫4-6周齡的雌性BALB/c小鼠。每個脛骨肌用50μg DNA進行肌肉DNA免疫。將MVA和腺病毒(分別為每劑106和107pfu)皮內注射到耳廓。將Ty VLP(100μg每劑)皮內注射到爪墊或靜脈注射到尾外側靜脈。
ELISPOT測定按前面所描述的在新鮮脾細胞制劑中判斷分泌IFN-γ的pb9特異性T細胞數(shù)目〔Schneider et al.，(1998)Nat.Med.4(4)397-402〕。用抗鼠IFN-γ抗體(ETCC的R4克隆)包被96個加樣孔的硝化纖維滴定板，用PBS洗滌，然后用含10％FCS的完全培養(yǎng)基封閉。將從免疫小鼠得到的脾細胞以1-2×107細胞/毫升重新懸浮并放置兩份于包被的加樣孔中，并連續(xù)稀釋。將H2-Kd限制肽pb9(SYIPSAEKI)(Romero)加入試驗加樣孔并將無關肽加入對照加樣孔。在過夜孵育后洗滌加樣孔并將第二種生物素化的抗IFN-γ抗體(Pharmingen克隆)加入加樣孔。再次洗滌加樣孔并加入鏈霉親和素-堿性磷酸酶。在進一步洗滌后，通過加入堿性磷酸酶底物產生斑點。通過洗滌加樣孔終止反應并在立體顯微鏡下計數(shù)斑點。
伯氏瘧原蟲侵襲從實驗室飼養(yǎng)的雌性按蚊中獲得伯氏瘧原蟲(ANKA株克隆1)的子孢子，這些按蚊在用感染的小鼠喂養(yǎng)后在18℃下維持20-25天。通過解剖收集按蚊的唾液腺并將其與RPMI 1640(Sigma)放置于組織勻漿器中釋放子孢子，然后用血細胞計數(shù)器計數(shù)。通過注射2000個子孢子到尾靜脈而侵襲小鼠。通過感染后7天和9天后制作的吉姆薩染色的血涂片上環(huán)形體的出現(xiàn)判斷感染。如果在兩個時間點都觀察到了血液期的寄生物血癥，則處死小鼠。至少進一步觀察3周看存活動物是否出現(xiàn)瘧疾癥狀。
結果用不同給藥途徑的單次腺病毒免疫的免疫原性最先檢驗了給藥途徑對Ad-PbCS誘導pb9特異性IFN-γ分泌T細胞能力的作用。
Rodrigues等(Rodrigues et al.，(1997)J.Immunol.158(3)1268-74)發(fā)現(xiàn)在肌內和皮下免疫后誘導了高水平的瘧疾特異性CD8+T細胞，但靜脈內、腹膜內或鼻內免疫卻沒有。本發(fā)明者沒有檢驗靜脈內和腹膜內免疫，因為這些不是用于人的預防性疫苗的適當途徑，但包括了皮內和“基因涂抹(gene paint)組一即簡單地將重組腺病毒給藥到皮膚(稱作基因涂抹)，此方法在以前已經表明可以誘導對抗病毒表達的抗原的免疫應答〔Tang et al.，(1997)Nature 388(6644)729-30〕。
各組小鼠接受單次107pfu Ad-PbCS免疫，在14天后檢驗了脾細胞中肽特異性IFN-γ分泌T細胞。
肌內或皮內免疫后檢測到的肽特異性IFN-γ分泌T細胞數(shù)量(圖1)比單次用肌內DNA免疫后檢測到的肽特異性IFN-γ分泌T細胞略高，并比用肌內MVA免疫后檢測到的IFN-γ分泌T細胞略低〔Gilbertet al.，(1999)Biol.Chem.380(3)299-303〕。鼻內或皮下免疫產生數(shù)目非常低的肽特異性IFN-γ分泌T細胞，而“基因涂抹”組檢測不到任何肽特異性IFN-γ分泌T細胞。以下實驗均使用皮內免疫。
不同激發(fā)/加強免疫的免疫原性圖2表示在第0天接受激發(fā)免疫并在第14天接受加強免疫后在免疫小鼠脾中檢測到的肽特異性IFN-γ分泌T細胞數(shù)目。
使用同樣的疫苗進行激發(fā)和加強產生特異性CD8+T細胞的增加，但在異種加強后可以看到大得多的增加。DNA并不加強正存在的應答。然而腺病毒激發(fā)和MVA加強的結合產生極高數(shù)目的肽特異性CD8+T細胞。除了可以激發(fā)能被加強到這種高水平的應答，Ad-PbCS可以加強由DNA或MVA激發(fā)的應答。
三種疫苗結合免疫的免疫原性異種激發(fā)和加強很明確比重復用同種疫苗有效。序貫使用三種不同的疫苗。DNA疫苗不加強，所以有兩種可能的結合，使用DNA/Ad/MVA和DNA/MVA/Ad。以10天的間隔免疫各組小鼠并在最后一次免疫10天后檢測脾細胞。
如以前的實驗，在DNA/MVA，Ad/MVA，MVA/Ad和DNA/Ad免疫后檢測到了高數(shù)目的肽特異性IFN-γ分泌T細胞(圖3)。然而，當給予第三種異種加強免疫時，這些數(shù)目并不增加到同樣程度(3到10倍)。
防御感染性侵襲一些使用腺病毒作為激發(fā)或加強劑的激發(fā)/加強結合產生預計保護小鼠不受伯氏瘧原蟲子孢子侵襲的高數(shù)目的肽特異性IFN-γ分泌T細胞。所以用許多不同的異種激發(fā)/加強結合免疫8～11只小鼠一組的各組小鼠并在加強免疫2周后用2000個感染性伯氏瘧原蟲子孢子侵襲。結果見表1。
皮內給予腺病毒后皮內給予MVA完全保護被免疫小鼠。在以前的伯氏瘧原蟲侵襲實驗中發(fā)現(xiàn)肌內DNA免疫后皮內MVA免疫產生高水平保護，但只有在靜脈給予MVA時才獲得完全保護〔Schneider etal.，(1998)Nat.Med.4(4)397-402〕。然而使用腺病毒激發(fā)和MVA加強時，兩種疫苗都可以皮內給予而不失去保護。MVA激發(fā)和腺病毒加強也產生高水平保護，而兩次連續(xù)的腺病毒免疫則不產生。腺病毒也加強由DNA或Ty-VLPs激發(fā)的應答，產生與DNA激發(fā)和皮內MVA加強相當?shù)谋Ｗo水平。
表1用不同異種激發(fā)/加強結合免疫小鼠的保護。肌內給予DNA(劑量為50μg)。除特別指出外，MVA(劑量為106ffu)、腺病毒(劑量為107pfu)和Ty VLPs(劑量為100μg)均采用皮內給藥。在第0天給予激發(fā)免疫，在第14天加強免疫，在第28天進行侵襲。激發(fā)加強 感染數(shù) 侵襲數(shù)保護％DNA MVA 510 50Ad MVA 010 100MVA Ad210 80Ad Ad7813DNA Ad511 55MVA MVA 5838Ty(i.v.) Ad710 30Ty(i.v.) MVA(i，v.)111 91Ty Ad410 60未免疫的 810 20
權利要求
1.編碼抗原或該抗原的CD8+T細胞表位的復制缺陷腺病毒載體在生產藥物中的用途，此藥物用于治療體內對抗原的CD8+T細胞免疫應答具有治療或預防益處的個體，其中藥物用于在給予包含所述抗原或表位或編碼所述抗原或表位的核酸的激發(fā)組合物之后給予這種個體，從而加強在個體中對抗原的CD8+T細胞免疫應答。
2.權利要求1的用途，其中激發(fā)組合物包含編碼所述抗原或表位的DNA。
3.權利要求1的用途，其中激發(fā)組合物包含重組Ty-VLP。
4.權利要求1的用途，其中激發(fā)組合物包含修飾病毒Ankara(MVA)。
5.權利要求1至4的任何一項的用途，其中藥物為加強組合物，在給予另一種不同的含所述抗原或表位的加強組合物之前給藥。
6.權利要求1至4的任何一項的用途，其中藥物為加強組合物，在給予另一種不同的含所述抗原或表位的加強組合物之后給藥。
7.權利要求1至6的任意一項的用途，其中藥物用于皮內給藥。
8.權利要求1至6的任意一項的用途，其中藥物用于肌內給藥。
9.一種加強個體中對抗原的CD8+T細胞免疫應答的方法，此方法包括在個體中提供復制缺陷腺病毒載體，此載體包括與調節(jié)序列可操作性連接的編碼抗原或該抗原的CD8+T細胞表位的核酸，用于通過核酸的表達在個體中產生所述抗原或表位，從而加強對前面在個體中激發(fā)的抗原的CD8+T細胞免疫應答。
10.一種在個體中誘導對抗原的CD8+T細胞免疫應答的方法，此方法包括給予個體包含抗原或該抗原的CD8+T細胞表位或編碼該抗原或表位的核酸的激發(fā)組合物，然后給予包含復制缺陷腺病毒載體的加強組合物，此載體包括與調節(jié)序列可操作性連接的編碼所述抗原或表位的核酸，用于通過核酸的表達在個體中產生所述抗原或表位。
11.權利要求10的方法，其中激發(fā)組合物包含編碼所述抗原或表位的DNA。
12.權利要求10的方法，其中激發(fā)組合物包含重組Ty-VLP。
13.權利要求10的方法，其中激發(fā)組合物包含修飾病毒Ankara(MVA)。
14.權利要求9至13的任何一項的方法，進一步包含給予另一種不同的，含上述抗原或表位的加強組合物。
15.權利要求9至14的任何一項的方法，其中加強組合物是皮內給藥。
16.權利要求9至14的任何一項的方法，其中加強組合物是肌內給藥。
全文摘要
在給予激發(fā)組合物后用編碼抗原或抗原的CD8+T細胞表位的復制缺陷腺病毒載體加強個體中對抗原的CD8+T細胞免疫應答。激發(fā)組合物包含抗原或表位或編碼抗原或表位的核酸，并可以是DNA，Ty－LVP′s或修飾病毒Ankara(MVA)?？梢允瞧然蚣冉o藥。
文檔編號A61K35/76GK1391609SQ0081593
公開日2003年1月15日 申請日期2000年9月20日 優(yōu)先權日1999年9月21日
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