專利名稱：共聚物1和相關(guān)肽和多肽及其處理過的t細(xì)胞在神經(jīng)保護(hù)性治療中的用途的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，美國申請(qǐng)60/209,799，于2000年6月7日提交，和09/620,216，于2000年7月20日提交。由此，申請(qǐng)60/209,799和09/620,216中每個(gè)申請(qǐng)的內(nèi)容都在此引作參考。
神經(jīng)系統(tǒng)病變可由創(chuàng)傷性損傷引起，如穿透性創(chuàng)傷或鈍器傷，或由疾病或紊亂引起，其中包括但不限于阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、糖尿病神經(jīng)病、老年性癡呆和缺血。
保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)完整性是復(fù)雜的“平衡作用”，其中涉及免疫系統(tǒng)。大多數(shù)組織中，免疫系統(tǒng)在保護(hù)、修復(fù)和痊愈中起基本作用。由于其獨(dú)特的免疫特性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)相對(duì)有限(Streilein，1993，1995)。越來越多的證據(jù)表明，哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能恢復(fù)功能反映了損傷組織和免疫系統(tǒng)間的無效對(duì)話。例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液中巨噬細(xì)胞間有限的聯(lián)系影響軸索顯微術(shù)后軸突的再生能力；移植活化巨噬細(xì)胞可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生(Lazarov Spiegler et al，1996；Rapalino et al，1998)。
已經(jīng)證明活化T細(xì)胞可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)，這與其抗原特異性無關(guān)，但似乎只有能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原反應(yīng)的T細(xì)胞能夠持續(xù)(Hickey et al，1991；Werkele，1993；Kramer et al，1995)。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)中抗原，如髓鞘堿性蛋白(MBP)，反應(yīng)的T細(xì)胞在給予未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理的受試大鼠幾天內(nèi)可誘導(dǎo)癱瘓疾病即實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)(Ben-Nun，1981a)?？筂BP T細(xì)胞也與人疾病多發(fā)性硬化癥有關(guān)(Ota，K.et al，1990；Martin，1997)。然而，盡管它具有致病能力，但在健康個(gè)體免疫系統(tǒng)中存在抗MBP T細(xì)胞克隆(Burns，1983；Pette，M.et al，1990；Martin et al，1990；Schluesener et al，1985)?；罨疶細(xì)胞在完整中樞神經(jīng)系統(tǒng)中正常存在，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)病變部位瞬間積聚(Hirschberget al，1998)。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的災(zāi)難性后果是，原發(fā)性損傷經(jīng)常伴隨鄰近神經(jīng)元漸進(jìn)的繼發(fā)性損失，而這些神經(jīng)元表面上沒有損傷、或僅受初始損傷的邊際性破壞(Faden et al，1992；Faden et al，1993；McIntosh，1993)。原發(fā)性損傷引起細(xì)胞外離子濃度的改變、自由基的量增加、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、生長因子衰竭和局部炎癥。這些改變觸發(fā)鄰近神經(jīng)元的破壞性事件級(jí)聯(lián)，盡管這些神經(jīng)元避開了原發(fā)性損傷(Lynch et al，1994；Bazan et al，1995；Wu et al，1994)。通過活化電壓依賴的或激動(dòng)劑門控的通道、離子滲漏，活化鈣離子依賴的酶如蛋白酶、脂酶和核酸酶，線粒體功能障礙和能量衰竭、神經(jīng)元細(xì)胞死亡的極大化，由此可以介導(dǎo)這種繼發(fā)性破壞(Yoshina et al，1991；Hovda etal，1991；Zivin et al，1991；Yoles et al，1992)。由原發(fā)性損傷直接引起的損失以外的廣泛性神經(jīng)元損失被稱為“繼發(fā)性退化”。
引起疾病自我傳播的最常見載體之一是谷氨酸，甚至當(dāng)原發(fā)性危險(xiǎn)因素去除或減弱時(shí)也能如此，它是一種可表現(xiàn)雙重活性的興奮型氨基酸作為基本神經(jīng)遞質(zhì)在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中起關(guān)鍵作用，但當(dāng)超過其生理水平時(shí)則變得有毒。已有報(bào)道在許多CNS疾病中谷氨酸水平提高。作為興奮毒性化合物，谷氨酸是急性和慢性(包括青光眼中視神經(jīng)退化)退行性疾病中最常見毒性載體之一(Pitt et al.，2000和Schoepp et al.，1996)。內(nèi)源性谷氨酸歸因于在癲癇持續(xù)狀態(tài)、腦缺血或創(chuàng)傷性腦損傷后發(fā)生的急性腦損傷。這也有助于如肌萎縮性側(cè)索硬化癥和亨廷頓氏舞蹈病類疾病中的慢性神經(jīng)退化。
大量研究集中于通過使用局部作用藥物，如NMDA受體拮抗劑，來減弱谷氨酸細(xì)胞毒作用(Brauner-Osborne et al.，2000)。然而，該類型的常規(guī)治療經(jīng)常不能令人滿意，如在中和毒性作用上它可能干擾其生理作用。對(duì)于人，這種化合物有精神作用及其它副作用，這使之不適于用作治療劑。作為普遍存在的CNS神經(jīng)遞質(zhì)，它們也有干擾谷氨酸基本生理功能的缺點(diǎn)。因?yàn)楣劝彼峄钚詫?duì)于正常生理功能必需，而在急性損傷后或慢性CNS疾病中具有潛在破壞性，任何中和其有害作用的嘗試都必須不消除其在體內(nèi)其它位點(diǎn)處的基本活性。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的另一種有害后果是，哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)元在損傷后不能自發(fā)性再生。因而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起運(yùn)動(dòng)和感覺功能的永久性損傷。
無論損傷的嚴(yán)重程度，脊髓病變最初導(dǎo)致完全功能性麻痹，稱為脊髓休克?？梢杂^察到一些脊髓休克的自發(fā)性恢復(fù)，這在損傷后幾天開始并在三到四周內(nèi)逐漸停止。損傷程度越小，功能性恢復(fù)越好?；謴?fù)程度是未破壞組織減去繼發(fā)性退化引起損失量的函數(shù)。神經(jīng)保護(hù)處理可改進(jìn)損傷恢復(fù)，它可以降低繼發(fā)性退化。例如，減輕谷氨酸作用經(jīng)常是神經(jīng)保護(hù)性藥物開發(fā)的靶標(biāo)。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體或α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體拮抗劑就是為此目的正開發(fā)的藥物。當(dāng)它們干擾NMDA和AMPA受體功能時(shí)，這些藥物將不可避免地有嚴(yán)重副作用，因?yàn)檫@些受體對(duì)于CNS活性至關(guān)重要。在腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型中，NMDA和AMPA受體拮抗劑保護(hù)其免受急性腦損傷和遲發(fā)性行為缺陷。這類化合物正在進(jìn)行人體測試，但療效仍待確認(rèn)?？梢詫?duì)作用于谷氨酸能傳遞的藥物產(chǎn)生應(yīng)答的其它臨床狀況包括癲癇病、健忘癥、焦慮、痛覺過敏和精神病(Meldrum，2000)。
在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，識(shí)別患者神經(jīng)系統(tǒng)(NS)抗原的活化T細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生或賦予神經(jīng)保護(hù)作用。參考PCT公開WO 99/60021，其全部內(nèi)容在此引作參考。更具體地，在部分?jǐn)D壓破碎的視神經(jīng)大鼠模型中(Moalem et al，1999)以及脊髓損傷大鼠模型中(Hauben et al，2000)顯示MBP反應(yīng)性T細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。直至最近，一直認(rèn)為免疫系統(tǒng)排斥免疫細(xì)胞參與神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。非常令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是NS-特異的活化T細(xì)胞可用于促進(jìn)神經(jīng)再生或保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)組織避免繼發(fā)性退化，而這可在CNS或PNS損傷或疾病引起的破壞后發(fā)生。
如所述WO 99/60021公開描述，NS-特異的活化T細(xì)胞對(duì)患者NS抗原具有特異性。用來賦予T細(xì)胞特異性的抗原可以是患者自身NS抗原、由此衍生的肽、或另一個(gè)體甚或另一物種的NS抗原、或由此衍生的肽，只要活化T細(xì)胞識(shí)別患者NS中的抗原即可。
所述NS-特異的活化T細(xì)胞用于促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制疾病影響。如果待治療疾病是自身免疫病，其中自身免疫抗原是NS-抗原，則用于治療由這種疾病引起的神經(jīng)損傷或退化的T細(xì)胞不被活化用于對(duì)抗該疾病中相同的自身免疫抗原。
以上引用的PCT公開WO 99/60021中披露，含有給予NS-特異的活化T細(xì)胞用于改善損傷或疾病影響的治療可選擇與NS-特異的抗原或其衍生肽組合。如所述WO 99/60021定義，NS-特異的抗原是指這種抗原，它特異性活化T細(xì)胞，從而在活化后，活化T細(xì)胞積聚于患者NS中損傷或疾病位點(diǎn)。進(jìn)一步，口服NS-特異的抗原或其衍生肽可以結(jié)合主動(dòng)免疫以建立損傷后立即發(fā)生的臨界免疫應(yīng)答。
此在先發(fā)明中，用于體內(nèi)或體外活化T細(xì)胞或免疫患者的NS-特異的抗原，可以是由NS組織獲得的抗原，優(yōu)選來自CNS損傷或疾病位點(diǎn)的組織。公開的天然或合成NS-特異抗原或表位包括MBP、MOG、PLP、MAG、S-100、β-淀粉樣蛋白、Thy-1、P0、P2和神經(jīng)遞質(zhì)受體。公開于WO 99/60021中的這種有用的NS-特異的抗原的具體實(shí)例是人MBP、人蛋白脂蛋白(PLP)和人少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白。另外公開的還有NS-特異自體抗原的衍生肽或NS-特異抗原的衍生物，它們活化T細(xì)胞，但不誘導(dǎo)自身免疫病，如含髓鞘堿性蛋白(MBP)51-70位氨基酸的肽。
這種NS-特異的T細(xì)胞的作用機(jī)理仍有待闡明，但外源給予的T細(xì)胞大量積聚于CNS損傷位點(diǎn)提示，存在于損傷位點(diǎn)T細(xì)胞在神經(jīng)保護(hù)中起顯著作用。然而已顯示，盡管積聚是必要條件，但對(duì)此目的這并不充分，因?yàn)閷?duì)非自身抗原卵清蛋白特異的T細(xì)胞也在該位點(diǎn)積聚，但沒有神經(jīng)保護(hù)作用(Hirschberg et al，1998)。
一種高分子量合成堿性無規(guī)共聚物由L-Ala、L-Glu、L-Lys和L-Tyr殘基組成，其摩爾比約是6份Ala比2份Glu比4.5份Lys比1份Tyr，其分子量為15,000-25,000，它首先描述于美國專利3,849,550中，作為一種藥劑用于治療或預(yù)防實(shí)驗(yàn)過敏性腦脊髓炎(EAE)、一種類似多發(fā)性硬化癥(MS)的疾病，易感動(dòng)物可以誘導(dǎo)發(fā)生此病。平均分子量23,000的多批這種共聚物，稱為共聚物1或Cop1，顯示在幾種動(dòng)物中可以高效預(yù)防和抑制EAE(Teitelbaum et al，1971，1974a，1974b)。
后來發(fā)現(xiàn)，Cop 1可以顯著降低惡化-間歇型MS患者中的復(fù)發(fā)數(shù)(Bornstein et al，1990；Sela et al，1990；Johnson et al，1994)。共聚物1為醋酸鹽形式的合成多肽，包含L-Glu、L-Ala、L-Tyr和L-Lys，其平均摩爾分?jǐn)?shù)為0.141、0.427、0.095和0.338，它是COPAXONE，即一種治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的活性成分。
顯而易見，MS治療中共聚物1的作用是抑制或滅活多發(fā)性硬化癥患者對(duì)髓鞘抗原的自身免疫性T細(xì)胞反應(yīng)。就此目的，每日皮下注射給予無佐劑的共聚物1。
本來設(shè)計(jì)Cop 1是為了模仿MBP并誘導(dǎo)EAE，但發(fā)現(xiàn)它不能導(dǎo)致腦炎，甚至能抑制MBP(Teitelbaum et al，1971)、(PLP)(Teitelbaumet al，1996)、或(MOG)(Ben-Nun et al，1996)誘導(dǎo)的EAE。Cop 1預(yù)防EAE發(fā)生及改善多發(fā)性硬化癥(MS)的確切機(jī)理仍然未知，然而該共聚物的一些重要免疫學(xué)特性已經(jīng)顯現(xiàn)。研究證明了Cop 1和MBP在T細(xì)胞(Webb et al，1973)和抗體(Teitelbaum et al，1988)水平上的部分交叉反應(yīng)。Cop 1可起MBP免疫顯性表位的T細(xì)胞抗原受體的拮抗劑作用(Aharoni，1998)，它也可結(jié)合多種MHC II類分子并防止它們結(jié)合到具有特異性抗原識(shí)別特性的T細(xì)胞上(Fridkis-Hareli et al，1999a)。嚙齒動(dòng)物中，Cop 1可以誘導(dǎo)這種調(diào)節(jié)細(xì)胞，該細(xì)胞可以是致腦炎T細(xì)胞的旁觀抑制細(xì)胞(bystandersuppressors)(Ahroni，1998)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移這種T細(xì)胞可阻止MBP(Aharoni et al，1993)、PLP(Ahroni，1998)、或全脊髓勻漿(Ahroni et al，1997)誘導(dǎo)的EAE發(fā)生。
進(jìn)一步，也已有直接證據(jù)報(bào)道，Cop 1和相關(guān)共聚物和II型膠原(CII)肽與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)的HLA-DR分子間的競爭性相互作用，以及CII特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的抑制，這提示這些化合物可以有效對(duì)抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Fridkis-Hareli，1998，1999b)。
為獲得“口服耐受”而口服自身抗原已被公開用于治療多種自身免疫病。例如，EP 359783公開口服MBP治療多發(fā)性硬化癥。PCT國際公開WO 91/12816、WO 91/08760和WO 92/06 704都公開了用多種自身抗原的口服耐受方法治療其它自身免疫病。吞入或吸入共聚物1治療多發(fā)性硬化癥，以達(dá)到抑制對(duì)髓鞘抗原的自身免疫性T細(xì)胞應(yīng)答，這已經(jīng)公開于PCT公開WO 98/30227。
也已對(duì)共聚物1相關(guān)的化合物進(jìn)行研究并發(fā)現(xiàn)其具有共聚物1相似的特性。例如，由共聚物1中四種氨基酸的三種組成的共聚物結(jié)合到純化的MHC II類分子上組成的共聚物(Fridkis-Hareli et al，1999a，WO 005250)。另外，共聚物1與多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的HLA-DR分子的結(jié)合基序最近已經(jīng)闡明(Fridkis-Hareliet al，1999b)。根據(jù)這些結(jié)合基序，很容易推斷并測試序列確定的多肽結(jié)合到HLA-DR分子的肽結(jié)合溝。預(yù)計(jì)這些肽以與Cop 1自身相似的方式作用。這種合成肽的例子公開于WO 005249。
本部分或本申請(qǐng)的任意其它部分中任何參考文獻(xiàn)的引用或確定都不應(yīng)認(rèn)為是承認(rèn)該文獻(xiàn)是可用的本發(fā)明的先有技術(shù)。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制神經(jīng)元退化以改善和治療神經(jīng)系統(tǒng)(NS)疾病或損傷影響的方法和組合物。本發(fā)明部分基于申請(qǐng)人意外的發(fā)現(xiàn)抗Cop 1的活化T細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生或賦予神經(jīng)保護(hù)作用。它進(jìn)一步部分基于本發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)抗Cop 1的活化T細(xì)胞保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受谷氨酸毒性作用。如此處所用，“神經(jīng)保護(hù)”指防止或抑制神經(jīng)系統(tǒng)中損傷或疾病的退化作用，包括避免繼發(fā)性神經(jīng)退化作用，而即使當(dāng)原發(fā)性危險(xiǎn)因素已經(jīng)消除或減弱時(shí)這種作用仍持續(xù)存在。其中既包括保護(hù)白質(zhì)也包括保護(hù)灰質(zhì)。直至最近仍然認(rèn)為，免疫系統(tǒng)排斥免疫細(xì)胞參與神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。非常令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，Cop 1活化的T細(xì)胞可用于促進(jìn)神經(jīng)再生或保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)組織免受CNS或PNS損傷或疾病引起的破壞之后的繼發(fā)性退化作用。
此處所用的“活化T細(xì)胞”包括(i)通過暴露于Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽而活化的T細(xì)胞和(ii)這種活化T細(xì)胞的后代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有治療有效量的Cop 1特異的活化T細(xì)胞的藥物組合物以及用這種組合物促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制CNS或PNS中的神經(jīng)元退化，其量可以有效改善NS損傷或疾病的影響。此處所用的“Cop 1特異的活化T細(xì)胞”是指對(duì)Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽具有特異性的活化T細(xì)胞。
Cop 1特異的活化T細(xì)胞用于促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制繼發(fā)性退化作用，這種作用可能在原發(fā)性NS損傷或由疾病或狀況引起的神經(jīng)退化過程作用后出現(xiàn)，這種疾病或狀況描述于下面第(3)部分，但不包括多發(fā)性硬化癥。非限制性實(shí)例包括青光眼、中風(fēng)、缺血、槍傷以及危險(xiǎn)運(yùn)動(dòng)引起的腦損傷。Cop 1特異的活化T細(xì)胞不僅提供抗髓鞘(白質(zhì))相關(guān)的原發(fā)性和繼發(fā)性危險(xiǎn)因素的神經(jīng)保護(hù)作用，而且就所發(fā)現(xiàn)的抗谷氨酸毒性保護(hù)作用來說，還可以對(duì)抗與神經(jīng)細(xì)胞體自身(灰質(zhì))相關(guān)的原發(fā)性和繼發(fā)性危險(xiǎn)因素。因而，預(yù)期Cop 1特異的活化T細(xì)胞可用于本發(fā)明目的，并且沒有已知的免疫治療技術(shù)能提示這種用途。
進(jìn)一步，正如Cop 1防止谷氨酸毒性，其作用不單單通過與髓鞘的交叉活性。它也必須有調(diào)節(jié)活性，如通過創(chuàng)建調(diào)節(jié)細(xì)胞或調(diào)節(jié)物質(zhì)。就這種調(diào)節(jié)活性來看，Cop 1免疫接種及Cop 1特異的活化T細(xì)胞預(yù)期也可保護(hù)白質(zhì)和灰質(zhì)免受氧化應(yīng)激和其它來源的神經(jīng)細(xì)胞損傷引起的損傷。另外，由于這種調(diào)節(jié)活性，本發(fā)明也能用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞不僅免于多發(fā)性硬化癥，這正如先有技術(shù)提示，而且免于多發(fā)性硬化癥以外的其它自身免疫疾病。
本發(fā)明也提供含有治療有效量的Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽的藥物組合物以及用這種組合物促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制CNS或PNS中的神經(jīng)元退化的方法，其量可以在體內(nèi)外有效活化T細(xì)胞，其中活化T細(xì)胞抑制或改善NS損傷或疾病的影響。
本發(fā)明實(shí)踐中，含有給予Cop 1特異的活化T細(xì)胞以改善和治療損傷或疾病影響的治療可以與Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽組合。
另外，當(dāng)給予在佐劑中的Cop 1引發(fā)后，口服Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽抗原可有效進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)。因此，口服Cop 1可用于增強(qiáng)T細(xì)胞活性，繼而用這種Cop 1進(jìn)行初步活化，優(yōu)選輔以佐劑，以建立損傷后立即出現(xiàn)的臨界T細(xì)胞應(yīng)答。
另一實(shí)施方案中，可建立細(xì)胞庫保存Cop 1敏化的T細(xì)胞以便需要時(shí)在較晚時(shí)間進(jìn)行個(gè)體的神經(jīng)保護(hù)治療。在此情況下，可從個(gè)體獲取自體T細(xì)胞。另外可保存異體或半異體T細(xì)胞，從而每種最常見的II類MHC的T細(xì)胞庫都可獲得。一旦個(gè)體損傷有待治療，優(yōu)選使用保存的自體T細(xì)胞，但如果不能得到自體T細(xì)胞，則應(yīng)使用與患者具有相同MHC II類分子的細(xì)胞，并且預(yù)期這些細(xì)胞將在此個(gè)體中可以工作。細(xì)胞優(yōu)選保存狀態(tài)是暴露于Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽之后的活化狀態(tài)。然而細(xì)胞也可保存于靜止?fàn)顟B(tài)，一旦解凍則立即活化并制備供使用。庫中的細(xì)胞系優(yōu)選冷凍保存。細(xì)胞系用本領(lǐng)域公知的任一種方法制備。一旦細(xì)胞解凍，優(yōu)選在注射前進(jìn)行培養(yǎng)以消除死細(xì)胞。培養(yǎng)期間，可以按初始的活化方法用Cop 1抗原或肽活化或再活化細(xì)胞。另外，可在存在促有絲分裂原如植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(優(yōu)選前者)的條件下培養(yǎng)以使之活化，這甚至將使細(xì)胞進(jìn)入更高的活化狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)幾天對(duì)患者將無傷害，因?yàn)楸景l(fā)明的治療可以在損傷后一周或更長時(shí)間內(nèi)的任何時(shí)候進(jìn)行而仍然有效。另外如果時(shí)間是關(guān)鍵因素，保存細(xì)胞可以在解凍后立即使用。
圖2A和2B代表分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子的ELISA試驗(yàn)。大鼠抗MBP(圖2A中白條)或抗Cop 1(圖2A中黑條)的T細(xì)胞與其特異性抗原在刺激培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。收集T細(xì)胞上清并進(jìn)行夾心ELISA反應(yīng)。圖中表示每個(gè)樣品中分泌的NT3、BDNF、NGF和NT-4/5濃度?？笴op 1 T細(xì)胞分泌的BDNF或NT-3量與抗MBP T細(xì)胞分泌量的比例參見圖2B。圖中表示出神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均比例±SD。
圖3表示Cop 1免疫如何保護(hù)視神經(jīng)纖維免受繼發(fā)性退化。輕度視神經(jīng)損傷后，立即用含PBS的IFA或含Cop 1的IFA皮下免疫大鼠。為評(píng)價(jià)繼發(fā)性退化，擠壓損傷后兩周在視神經(jīng)損傷位點(diǎn)的遠(yuǎn)端使用神經(jīng)示蹤染料4-Di-10-Asp。5天后處死大鼠，切除視網(wǎng)膜并做成平展標(biāo)本。在熒光顯微鏡下計(jì)算位于距每個(gè)視網(wǎng)膜中視盤大致相同距離的四個(gè)視野中標(biāo)記(存活)的RGC數(shù)目，Cop 1免疫的神經(jīng)保護(hù)作用與PBS注射相比有顯著差異(P＜0.05，斯氏t檢驗(yàn))。結(jié)果是兩次試驗(yàn)的匯總，每組含8到10只大鼠。
圖4表示Cop 1免疫如何保護(hù)視神經(jīng)纖維免受谷氨酸毒性作用。用乳化于完全弗氏佐劑(CFA)中的Cop 1免疫小鼠，同時(shí)對(duì)照小鼠僅注射CFA。然后每只小鼠的一只眼僅注射鹽水，另一只眼注射含200nmol谷氨酸的鹽水。給予谷氨酸7天后切除視網(wǎng)膜并做成平展標(biāo)本。計(jì)算標(biāo)記(存活)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)數(shù)目。柱狀條表示分別接受鹽水或含谷氨酸鹽水的CFA處理小鼠剩余的RGC占對(duì)照的百分比，以及分別接受鹽水或含Cop 1鹽水的CFA-Cop 1處理小鼠剩余的RGC占對(duì)照的百分比。
圖5A和5B表示用pMOG免疫(圖5A)或被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗MBP T細(xì)胞(圖5B)不能保護(hù)小鼠RGC免受谷氨酸毒性作用。圖5A中，通過玻璃體內(nèi)注射L-谷氨酸(200nmol)將其RGC直接暴露于谷氨酸毒性之前14天，用pMOG免疫C57BL/6J小鼠。4天后用FluoroGold逆行標(biāo)記RGC，3天后切除視網(wǎng)膜并計(jì)數(shù)(見實(shí)施例3試驗(yàn)2的材料和方法部分)。RGC存活率表示為每mm2平均值±SEM。在含pMOG的CFA處理組(n＝8)和用含PBS的CFA處理的對(duì)照組(n＝7)間，沒有觀察到注射谷氨酸后RGC存活率的顯著差異。圖5B中，谷氨酸靜脈注射至路易氏大鼠。4天后給予染料4-Di-10-Asp以標(biāo)記RGC，隨之5天后切除視網(wǎng)膜并計(jì)數(shù)。注意T細(xì)胞處理組的視網(wǎng)膜存活率與對(duì)照組無顯著差異(每mm2RGC數(shù)，平均值±SEM(每組n＝6))。
圖6A和6B表示玻璃體內(nèi)注射谷氨酸后淋巴細(xì)胞的侵潤。谷氨酸注射入C57b1/6小鼠玻璃體內(nèi)。24小時(shí)后切除眼睛并經(jīng)組織學(xué)處理。圖中表示出注射谷氨酸小鼠(圖6A)和對(duì)照小鼠(圖6B)的經(jīng)H&E染色的視網(wǎng)膜切片(10μm厚)。橫條＝200μm。
圖7表示視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率。用乳化于CFA中的50μg Cop-1免疫后10天，用FluoroGold(見實(shí)施例3試驗(yàn)2的方法部分)逆行標(biāo)記成年Balb/c近交鼠的RGC。對(duì)照小鼠注射含PBS的CFA(每組n＝8-12)。RGC標(biāo)記3天后，對(duì)小鼠視神經(jīng)的眼內(nèi)部分進(jìn)行嚴(yán)重?cái)D壓損傷。損傷兩周后，切除視網(wǎng)膜并計(jì)數(shù)標(biāo)記RGC(見實(shí)施例3試驗(yàn)2的方法部分)。與非免疫對(duì)照相比，用含Cop-1的CFA免疫的小鼠存活率顯著提高(P＜0.001，斯氏t檢驗(yàn))。
圖8A-8D表示通過Cop-1主動(dòng)免疫而避免谷氨酸毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。圖8A中，注射谷氨酸之前10天，通過皮下注射含Cop-1的CFA(5mg/ml細(xì)菌)或注射含PBS的CFA免疫小鼠。圖中表示一次試驗(yàn)結(jié)果(每組中n＝5)。與注射含PBS的CFA的小鼠或僅接受谷氨酸的小鼠相比，Cop-1免疫小鼠的每mm2RGC存活數(shù)(平均值±SEM)有顯著提高(P＜0.02，雙尾t檢驗(yàn))。注射含PBS的CFA對(duì)RGC數(shù)目的作用檢測不出。重復(fù)試驗(yàn)3次，都有相同的結(jié)果。Cop-1處理組中13只動(dòng)物和PBS處理組中15只動(dòng)物都進(jìn)行了測試。圖8B中，玻璃體內(nèi)注射谷氨酸后，立即用乳化于CFA中的Cop-1(5mg/ml細(xì)菌)免疫小鼠。一周后檢測每mm2的RGC存活數(shù)(平均值±SEM)。圖中表示一次試驗(yàn)的結(jié)果，Cop-1免疫的作用顯著(P＜0.05；雙尾t檢驗(yàn)；Cop-1組n＝12，對(duì)照組n＝8)。該試驗(yàn)用11只小鼠作Cop-1免疫及8只小鼠注射含PBS的CFA(5mg/ml細(xì)菌)進(jìn)行重復(fù)。圖8C中表示谷氨酸刺激并立即用含Cop-1佐劑(其中含0.5mg/ml細(xì)菌)免疫后的RGC存活率。與注射谷氨酸小鼠(n＝5)相比，Cop-1免疫小鼠(n＝15)中每mm2存活的RGC數(shù)顯著提高(P＜0.04；雙尾t檢驗(yàn))。圖8D中表示谷氨酸刺激之前、之后立即或之后48小時(shí)進(jìn)行免疫的RGC存活。柱狀條表示由重復(fù)試驗(yàn)中收集的每處理組中所有檢測小鼠獲得的總體結(jié)果。刺激后48小時(shí)進(jìn)行免疫沒有發(fā)現(xiàn)其作用。
圖9表示Cop-1免疫不能保護(hù)小鼠免于NMDA毒性。注射NMDA之前10天，小鼠(n＝5-7)經(jīng)皮下注射含Cop-1的CFA或含PBS的CFA進(jìn)行免疫。如圖5A所示，標(biāo)記RGC并在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)RGC活細(xì)胞數(shù)。Cop-1免疫小鼠的RGC存活率表示為正常眼中存活的百分?jǐn)?shù)，它與注射PBS的小鼠相似(P＝0.55，斯氏t檢驗(yàn))，表明沒獲得神經(jīng)保護(hù)。


圖10表示Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞保護(hù)RGC免于谷氨酸毒性。注射谷氨酸(200nmol)后，立即向小鼠注射Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞或PBS。施加染料，制備并計(jì)數(shù)RGC，然后按圖5B計(jì)算RGC存活。與注射PBS的對(duì)照小鼠視網(wǎng)膜相比，注射Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞的小鼠視網(wǎng)膜中見到明顯更多的標(biāo)記RGC(P＜0.0007，斯氏t檢驗(yàn))。
圖11A-11D表示緩慢增加IOP和Cop-1免疫對(duì)路易氏大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的影響。圖11A中，激光燒灼引起鞏膜外層及邊緣靜脈阻塞，導(dǎo)致IOP增加以及隨后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。激光處理3周后，與未處理大鼠的15.8±0.2mm Hg(n＝7)相比，靜脈阻塞大鼠的平均IOP是30.4±0.42mm Hg(平均值±SEM，n＝5)。圖11B中，靜脈阻塞3周后，與未處理大鼠相比，激光處理大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)要小19.9％±0.51％(平均值±SEM)。圖11C中，靜脈阻塞后立即用Cop-1免疫減小視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失。激光處理后立即用含Cop-1(200μg)的CFA(n＝15)或注射含PBS的CFA(n＝13)免疫大鼠。3周后，切除視網(wǎng)膜并作整體標(biāo)本，計(jì)算用羅丹明聚葡糖胺預(yù)標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)。柱狀條代表每組大鼠中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失，計(jì)為未處理大鼠中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)(平均值±SEM)的百分?jǐn)?shù)。兩組中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)的差別顯著(P＜0.0001；雙尾t檢驗(yàn))。圖11D中，通過靜脈阻塞后10天免疫大鼠，檢驗(yàn)Cop-1延遲免疫對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失的影響。柱狀條代表Cop-1處理組(n＝5)或PBS處理組(n＝4)中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失，計(jì)為未處理動(dòng)物中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)(平均值±SEM)的百分?jǐn)?shù)。Cop-1延遲免疫后觀察到神經(jīng)保護(hù)作用的趨勢(shì)；僅在單尾t檢驗(yàn)中有顯著差異(p＝0.04)。
發(fā)明詳述僅為解釋方便，本發(fā)明詳述分為以下部分(1)Cop 1特異的活化T細(xì)胞；(2)Cop 1和Cop 1相關(guān)的肽和多肽；(3)治療用途；(4)制劑和給藥；(5)建立T淋巴細(xì)胞自體細(xì)胞庫；(6)實(shí)施例；和(7)結(jié)果討論；(1)Cop 1特異的活化T細(xì)胞如第二部分中所定義，Cop 1特異的活化T細(xì)胞(ATCs)是在存在Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽時(shí)被活化的T細(xì)胞。這種ATC可用于治療，也即改善或抑制CNS或PNS的損傷或疾病的影響，這些損傷或疾病導(dǎo)致NS退化，或用于促進(jìn)NS、特別是CNS中的再生。另外，因?yàn)楣劝彼嵩谒猩窠?jīng)退行性疾病中，無論是慢性或急性，是一種載體，這種ATCs有可能用于保護(hù)CNS細(xì)胞免于谷氨酸毒性并用于治療由谷氨酸毒性引起或加劇的疾病或狀況，如異常眼內(nèi)壓。
Cop 1特異的活化T細(xì)胞優(yōu)選來自自體，最優(yōu)選CD4和/或CD8表型，但也可是來自有親緣關(guān)系的供體的異體T細(xì)胞，例如兄弟姐妹，父母，孩子，或HLA匹配或部分匹配的、半異體或全異體的供體。
除了用分離自患者的自體T細(xì)胞外，本發(fā)明也含有使用半異體T細(xì)胞用于神經(jīng)保護(hù)。這些T細(xì)胞可制備成短期或長期細(xì)胞系并按常規(guī)凍存方法保存，供解凍及立即或培養(yǎng)1-3天后向經(jīng)受中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷并需要T細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)的患者給藥。
使用半異體T細(xì)胞基于以下事實(shí)，T細(xì)胞可以識(shí)別由外源抗原呈遞細(xì)胞(APC)呈遞的特異性抗原表位，前提是APC表達(dá)I類或II類MHC分子，以及T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位，而特異性應(yīng)答T細(xì)胞群體受限于這些MHC分子。因而，半異體的T細(xì)胞群體可識(shí)別至少一種該患者M(jìn)HC分子的等位基因產(chǎn)物，并且特異于Cop 1表位，這種細(xì)胞將能識(shí)別患者NS損傷區(qū)域與Cop 1交叉反應(yīng)的抗原并產(chǎn)生需要的神經(jīng)保護(hù)作用。在粘附分子、白細(xì)胞遷移分子和T細(xì)胞遷移到損傷區(qū)域、積聚并活化所需的輔助分子之間有很小或沒有多態(tài)性。因而，半異體T細(xì)胞將可遷移并積聚于需要神經(jīng)保護(hù)的CNS位點(diǎn)并將被活化以產(chǎn)生期望的作用。
已知半異體T細(xì)胞將被患者免疫系統(tǒng)排斥，但該排斥需要約兩周來產(chǎn)生。因此，半異體T細(xì)胞將有兩周時(shí)間發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。兩周后，半異體T細(xì)胞將被患者身體排斥，但該排斥對(duì)患者有益，因?yàn)檫@將從患者除去外源T細(xì)胞并防止活化T細(xì)胞任何不利的后果。因而半異體T細(xì)胞提供重要的安全作用并是優(yōu)選的實(shí)施方案。
已知相對(duì)少量的HLA II類分子被群體中大多數(shù)個(gè)體共有。例如，約50％猶太人群體表達(dá)HLA-DR5基因。因而，受限于HLA-DR5的對(duì)Cop1反應(yīng)的特異性T細(xì)胞庫對(duì)該群體的50％有用。用限于幾種其它優(yōu)勢(shì)HLA分子的少量其它T細(xì)胞系可基本覆蓋整個(gè)群體，這種分子如DR1、DR4、DR2等。因此，可制備并保存統(tǒng)一的功能性T細(xì)胞系的庫，供立即使用于給定群體的任何個(gè)體。這種T細(xì)胞庫將克服在開放的治療機(jī)會(huì)窗期間從需要神經(jīng)保護(hù)的患者獲得足量特異性T細(xì)胞的任何技術(shù)問題。半異體T細(xì)胞將在完成其神經(jīng)保護(hù)后被安全排斥。本發(fā)明的該方面不與此處所述的使用自體T細(xì)胞相矛盾，并且是其補(bǔ)充。
Cop 1特異的活化T細(xì)胞優(yōu)選不經(jīng)減毒，盡管可以使用減毒的Cop1特異的活化T細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的方法減毒，包括但不限于，通過γ輻射，例如1.5-10.0 Rad(Ben-Nun et al，1981b；Ben-Nunet al，1982)；和/或通過壓力處理，例如美國專利4,996,194所述(Cohen et al)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，Cop 1特異的活化T細(xì)胞按如下分離。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法分離并純化T細(xì)胞(Mor et al，1995)。對(duì)于例證性實(shí)例參見第6部分實(shí)施例1。
用已知程序分離并擴(kuò)增識(shí)別Cop 1的患者循環(huán)T細(xì)胞。為獲得Cop1特異的活化T細(xì)胞，分離T細(xì)胞然后用已知程序擴(kuò)增Cop 1特異的活化T細(xì)胞(Burns et al，1983；Pette et al，1990；Martin et al，1990；Schluesener et al，1985；Suruhan-Dires Keneli et al，1993，它們以其整體形式在此引作參考)。
T細(xì)胞體外活化期間，可將T細(xì)胞培養(yǎng)于添加至少一種適用的生長促進(jìn)因子的培養(yǎng)基中以使之活化。適用于此目的的生長促進(jìn)因子包括但不限于，細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白細(xì)胞介素2(IL-2)，和白細(xì)胞介素4(IL-4)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，活化T細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生一種改善NS中損傷或疾病影響的物質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，活化T細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生一種刺激其它細(xì)胞的物質(zhì)，包括但不限于，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，神經(jīng)生長因子(NGF)，神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5(NT-4/5)，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)；干擾素γ(IFN-γ)和白介素6(IL-6)，其中其它細(xì)胞直接或間接地改善損傷或疾病的影響。
體外擴(kuò)增以后，將T給予哺乳動(dòng)物治療對(duì)象。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該T細(xì)胞給予人類患者。優(yōu)選用Cop 1或Cop 1相關(guān)的肽或多肽進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增。
Cop 1活化的T細(xì)胞可立即使用或保存供以后使用，例如通過以下凍存方法。Cop 1特異的活化T細(xì)胞也可用之前的凍存T細(xì)胞獲得，也即細(xì)胞解凍后，T細(xì)胞與Cop 1或Cop 1相關(guān)的肽或多肽一起孵育，最優(yōu)與外周血淋巴細(xì)胞(PBL)一起孵育，以獲得Cop 1特異的ATC制備物。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，培養(yǎng)前后T細(xì)胞可以保存，例如通過凍存方法。
可用的凍存劑包括但不限于二甲亞砜(DMSO)(Lovelock et al，1959；Ashwood-Smith，1961)，甘油，聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，1960)，聚乙二醇(Sloviter et al，1962)，白蛋白，葡聚糖，蔗糖，乙二醇，i-赤蘚糖醇，D-核糖醇，D-甘露醇(Rowe et al，1962)，D-山梨醇，i-肌醇，D-半乳糖，氯化膽堿(Rowe et al，1962)，氨基酸(Phan The Tran et al，1960a)，甲醇，乙酰胺，甘油單乙酸酯(Lovelock，1954)，無機(jī)鹽(Phan The Tran et al，1960b；PhanThe Tran et al)，和組合羥乙基淀粉和人血清白蛋白的DMSO(Zarouliset al，1980)。
受控冷卻速率很關(guān)鍵。不同的凍存劑(Rapatz et al，1968)及不同的細(xì)胞類型具有不同的最佳冷卻速率。見例如，Rowe et al(1962b)；Rowe(1966)；Lewis et al(1967)；和Mazur(1970)關(guān)于冷卻速度對(duì)細(xì)胞存活及其移植能力的影響。水變成冰時(shí)的熔解熱應(yīng)最小。可用例如程序冷凍裝置或甲醇浴程序進(jìn)行冷卻程序。
程序冷凍裝置允許確定最佳冷卻程序并實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的可重復(fù)的冷卻。程控速率冷凍儀如Cryomed或Planar允許調(diào)節(jié)冷凍方案達(dá)至期望的冷卻速率曲線。
完全冷凍后，細(xì)胞可迅速轉(zhuǎn)移到長期冷凍容器中。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可低溫保存于機(jī)械冷凍機(jī)中，如維持約-80℃或約-20℃溫度的冷凍機(jī)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品可低溫保存于液氮(-196℃)或其蒸汽中。高效液氮冰箱的獲得大大方便這種保存方法，它類似一個(gè)具有極低真空和內(nèi)部超級(jí)絕緣的大型保溫容器，如此熱泄漏和氮損失保持在絕對(duì)最低的水平。
操作、凍存和T細(xì)胞長期保存的注意事項(xiàng)和程序可以發(fā)現(xiàn)，例如在以下文獻(xiàn)中，在此引作參考Gorin(1986)和國際原子能機(jī)構(gòu)(1969)。
可以獲得或考慮使用其它活細(xì)胞凍存方法或其改進(jìn)方法，例如冷金屬鏡技術(shù)，見Livesey et al(1987)；Linner et al(1986)；也見Senken et al的美國專利4,199,022，Schwartz的美國專利3,753,357和Fahy的美國專利4,559,298。
冷凍細(xì)胞優(yōu)選迅速解凍(例如在維持于37-47℃的水浴)并在融化后立即冷卻。為防止細(xì)胞在解凍中成團(tuán)可處理細(xì)胞。為防止成團(tuán)，可用多種方法，包括但不限于在凍存前后添加DNA酶(Spitzer et al，1980)、低分子量葡聚糖和檸檬酸鹽、檸檬酸鹽、羥乙基淀粉(Stiffet al，1983)、或酸性檸檬酸葡萄糖酯(Zaroulis et al，1980)等。
凍存劑如果對(duì)人有毒，應(yīng)在將解凍T細(xì)胞用于治療前除去。除去凍存劑的一種方法是稀釋到可忽略的濃度。
一旦冷凍T細(xì)胞解凍并恢復(fù)，按此處所述的關(guān)于非冷凍T細(xì)胞的方法將其用于促進(jìn)神經(jīng)元再生。如果在凍存前已經(jīng)活化，一旦解凍，T細(xì)胞可立即使用。然而，優(yōu)選在注射患者前培養(yǎng)解凍細(xì)胞以消除死細(xì)胞。進(jìn)一步，如果凍存細(xì)胞是靜止細(xì)胞，或在凍存前已活化但為幫助細(xì)胞達(dá)到更高的活化率，在此約1到3天的培養(yǎng)過程中，可加入適當(dāng)?shù)幕罨瘎┮曰罨?xì)胞。通常，有足夠時(shí)間允許給藥前的這種培養(yǎng)步驟，因?yàn)榭梢栽趽p傷后一周或可能更長的時(shí)間內(nèi)給予T細(xì)胞，而仍然保持其神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)作用。(2)Cop 1和Cop 1相關(guān)的肽和多肽含Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽抗原或其衍生物的藥物組合物可用于防止或抑制導(dǎo)致NS，特別是CNS退化的損傷或疾病的影響，用于保護(hù)CNS細(xì)胞免于谷氨酸毒性，或用于治療谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病。另外，Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽抗原或其衍生物可用于T細(xì)胞的體內(nèi)外活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制CNS或PNS損傷或疾病影響的方法包括將Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽抗原或其衍生物給予哺乳動(dòng)物，其中Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽抗原或其衍生物體內(nèi)活化T細(xì)胞，產(chǎn)生的T細(xì)胞群體積聚于CNS或PNS損傷或疾病位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，在用于保護(hù)CNS細(xì)胞免于谷氨酸毒性或用于治療谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病的方法中，給予Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽抗原或其衍生物。
用于本發(fā)明的組合物可以是Cop 1或Cop1相關(guān)肽或多肽。對(duì)本發(fā)明目的，“Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽”意味著包括任何肽或多肽，包括無規(guī)共聚物，它們與髓鞘堿性蛋白(MBP)有功能性交叉反應(yīng)并能在抗原呈遞中與MBP競爭II類MHC。
組合物可含有無規(guī)共聚物，其中含合適量的正電荷氨基酸，如賴氨酸或精氨酸，與帶負(fù)電荷的氨基酸(優(yōu)選較少量)，如谷氨酸或天冬氨酸組合，可選地與作為填充物的電中性氨基酸如丙氨酸或甘氨酸組合，并可選地與適于賦予共聚物免疫原性的氨基酸，如像酪氨酸或色氨酸之類的芳香氨基酸組合。這種組合物可包括公開于WO 005250中的任何一種，其全部內(nèi)容在此引作參考。
更具體地，用于本發(fā)明的組合物含有至少一種共聚物，它選自含有一種氨基酸的無規(guī)共聚物，該氨基酸選自以下各組中至少三組中的每一組(a)賴氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；(d)酪氨酸和色氨酸。
用于本發(fā)明的共聚物可由L-或D-氨基酸或其混合物組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，L-氨基酸存在于大多數(shù)天然蛋白中。然而，D-氨基酸有商業(yè)供應(yīng)并可取代用于制造本發(fā)明的三元共聚物及其它共聚物的一些或全部氨基酸。本發(fā)明包括同時(shí)含D-和L-氨基酸的共聚物，以及基本由L-或D-氨基酸組成的共聚物。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，共聚物含4種不同的氨基酸，每種來自(a)到(d)組中的不同組。根據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案優(yōu)選的共聚物含有丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸的組合，其帶有凈總正電荷且分子量為約2,000到40,000道爾頓，優(yōu)選約2,000到13,000道爾頓。最優(yōu)選的實(shí)例是平均分子量約4,700到13,000道爾頓的共聚物1(Cop1)。優(yōu)選的分子量范圍及制造優(yōu)選形式共聚物1的方法描述于美國專利5,800,808，其全部內(nèi)容以整體形式在此引作參考。顯而易見這只是以實(shí)例的方式給出，并且如果與以上一般標(biāo)準(zhǔn)一致，該組合物的成分及各成分的相對(duì)比例都可以變化。因而，共聚物可以是約15到約100個(gè)氨基酸長度的多肽，優(yōu)選約40到約80。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，共聚物含3種不同的氨基酸，每種來自(a)到(d)組的三組中的不同組，這些共聚物在此稱為三元共聚物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物包含酪氨酸、丙氨酸和賴氨酸，以下稱為YAK。這些三元共聚物中氨基酸的平均摩爾分?jǐn)?shù)可以變化。例如，酪氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.250；丙氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.3到約0.6；以及賴氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.1到約0.5。平均分子量在約2,000到約40,000道爾頓之間，并優(yōu)選約3,000到約35,000道爾頓。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，平均分子量為約5,000到約25,000道爾頓?？梢杂镁彼崛〈嚢彼?、甘氨酸取代丙氨酸、和/或色氨酸取代酪氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和賴氨酸，以下稱為YEK。這些三元共聚物中氨基酸的平均摩爾分?jǐn)?shù)可以變化谷氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.300，酪氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.250，以及賴氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.3到約0.7。平均分子量在約2,000到約40,000道爾頓之間，并優(yōu)選約3,000到約35,000道爾頓。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，平均分子量為約5,000到約25,000道爾頓。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、精氨酸取代賴氨酸、和/或色氨酸取代酪氨酸。
在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物包含賴氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下稱為KEA。這些三元共聚物中氨基酸的平均摩爾分?jǐn)?shù)也可以變化。例如，谷氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.300，丙氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.600，以及賴氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.2到約0.7。平均分子量在約2,000到約40,000道爾頓之間，并優(yōu)選約3,000到約35,000道爾頓。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，平均分子量為約5,000到約25,000道爾頓?？梢杂锰於彼崛〈劝彼?、甘氨酸取代丙氨酸、和/或精氨酸取代賴氨酸。
在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下稱為YEA。這些三元共聚物中氨基酸的平均摩爾分?jǐn)?shù)也可以變化。例如，酪氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.250，谷氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.300，以及丙氨酸的摩爾分?jǐn)?shù)可以是約0.005到約0.800。平均分子量在約2,000到約40,000道爾頓之間，并優(yōu)選約3,000到約35,000道爾頓。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，平均分子量為約5,000到約25,000道爾頓?？梢杂蒙彼崛〈野彼?、天冬氨酸取代谷氨酸、和/或甘氨酸取代丙氨酸。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些三元共聚物中氨基酸的摩爾分?jǐn)?shù)大約是共聚物1優(yōu)選的摩爾分?jǐn)?shù)。共聚物1中氨基酸的摩爾分?jǐn)?shù)是谷氨酸約0.14，丙氨酸約0.43，酪氨酸約0.10，以及賴氨酸約0.34。共聚物1最優(yōu)選的平均分子量為約5,000到約9,000道爾頓。如果進(jìn)行一或多個(gè)下面的取代，此處公開用途中共聚物1的活性預(yù)期仍保留天冬氨酸取代谷氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、精氨酸取代賴氨酸、和色氨酸取代酪氨酸。
更優(yōu)選的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的三元共聚物，或YEA，其單體摩爾比是約0.21比約0.65比約0.14。
更優(yōu)選的谷氨酸、丙氨酸和賴氨酸的三元共聚物，或KEA，其單體摩爾比是約0.15比約0.48比約0.36。
更優(yōu)選的谷氨酸、酪氨酸和賴氨酸的三元共聚物，或YEK，其單體摩爾比是約0.26比約0.16比約0.58。
更優(yōu)選的酪氨酸、丙氨酸和賴氨酸的三元共聚物，或YAK，其單體摩爾比是約0.10比約0.54比約0.35。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何方法制造三元共聚物。例如，可在縮合條件下用期望摩爾比的氨基酸溶液制造三元共聚物，或通過固相合成方法制造。縮合條件包括合適的溫度、pH和溶劑條件，供一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基縮合形成肽鍵。縮合劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺，可用于幫助形成肽鍵。封閉基團(tuán)可用于保護(hù)官能團(tuán)，如側(cè)鏈部分及一些氨基或羧基，避免不期望的副反應(yīng)。
例如，可使用美國專利3,849,650公開的方法，其中酪氨酸、丙氨酸、γ-芐基谷氨酸和N-ε-三氟乙?；嚢彼岬腘-羧酸酐(carboxyanhydride)在室溫下無水二氧六環(huán)中用二乙胺作引發(fā)劑進(jìn)行聚合。用含溴化氫的冰乙酸可去封閉谷氨酸的γ-羧基。用1M哌啶除去賴氨酸的三氟乙酰基。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，通過選擇性去除與谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或賴氨酸中任何一個(gè)有關(guān)的反應(yīng)，可對(duì)方法進(jìn)行調(diào)整以制造含期望氨基酸，也即，共聚物1中四個(gè)氨基酸中的三個(gè)，的肽或多肽。對(duì)此應(yīng)用目的，術(shù)語“環(huán)境溫度”和“室溫”意指約20到約26℃的溫度范圍。
多肽合成期間或制造出三元共聚物以后，可調(diào)節(jié)三元共聚物的分子量。在多肽合成期間調(diào)節(jié)分子量，要調(diào)節(jié)合成條件或氨基酸的量，使多肽達(dá)到期望的大致長度時(shí)停止合成。合成以后，期望分子量的多肽可通過任何可用的大小選擇方法，如在分子量選擇柱或凝膠上的多肽層析，然后在期望分子量范圍收集。本發(fā)明的多肽也可部分水解以除去高分子量的部分，例如酸或酶水解，然后純化以除去酸或酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可用以下方法制備期望分子量的三元共聚物，其中包括將保護(hù)多肽與氫溴酸反應(yīng)以形成具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽。通過一或多次試驗(yàn)反應(yīng)確定反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和反應(yīng)溫度。試驗(yàn)反應(yīng)期間，改變時(shí)間和溫度并檢測給定批次試驗(yàn)多肽的分子量范圍。提供最佳分子量范圍的多肽批次所使用的試驗(yàn)條件用于批量生產(chǎn)。因而，可通過以下方法制造具期望分子量分布的三氟乙酰多肽，其中包括按試驗(yàn)反應(yīng)已確定的反應(yīng)時(shí)間和溫度將保護(hù)多肽與氫溴酸反應(yīng)。然后用哌啶水溶液進(jìn)一步處理具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，以形成具期望分子量的低毒性多肽。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，給定批次的保護(hù)多肽測試樣品在溫度約20-28℃與氫溴酸持續(xù)反應(yīng)約10-50小時(shí)。通過幾次試驗(yàn)反應(yīng)確定最佳條件。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，保護(hù)多肽在溫度約26℃與氫溴酸持續(xù)反應(yīng)約17小時(shí)。
因?yàn)镃op 1結(jié)合MS-相關(guān)HLA-DR分子的結(jié)合基序已知(Fridkis-Hareli et al，1999b)，很容易制備確定順序的多肽并按Fridkis-Hareli et al(1999b)所述的方法測試其與HLA-DR分子肽結(jié)合溝的結(jié)合。這種肽的實(shí)例公開于WO 005249，其全部內(nèi)容在此引作參考。在所述申請(qǐng)中具體公開的肽中的32個(gè)在下表1中列出。預(yù)期這種肽及其它類似肽具有類似Cop 1的活性。然而，這很容易通過按與本發(fā)明一致的方法測試其活化T細(xì)胞的能力來確定。所有這些都無需過多的試驗(yàn)。這種肽及其它類似肽也被認(rèn)為在Cop 1相關(guān)肽或多肽的范圍內(nèi)，且其用途被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
表1序列編號(hào) 肽序列1AAAYAAAAAAKAAAA2AEKYAAAAAAKAAAA3AKEYAAAAAAKAAAA4AKKYAAAAAAKAAAA5AEAYAAAAAAKAAAA6KEAYAAAAAAKAAAA7AEEYAAAAAAKAAAA8AAEYAAAAAAKAAAA9EKAYAAAAAAKAAAA10 AAKYEAAAAAKAAAA11 AAKYAEAAAAKAAAA12 EAAYAAAAAAKAAAA13 EKKYAAAAAAKAAAA14 EAKYAAAAAAKAAAA15 AEKYAAAAAAAAAAA16 AKEYAAAAAAAAAAA17 AKKYEAAAAAAAAAA18 AKKYAEAAAAAAAAA19 AEAYKAAAAAAAAAA20 KEAYAAAAAAAAAAA21 AEEYKAAAAAAAAAA22 AAEYKAAAAAAAAAA23 EKAYAAAAAAAAAAA24 AAKYEAAAAAAAAAA25 AAKYAEAAAAAAAAA26 EKKYAAAAAAAAAAA27 EAKYAAAAAAAAAAA28 AEYAKAAAAAAAAAA29 AEKAYAAAAAAAAAA30 EKYAAAAAAAAAAAA31 AYKAEAAAAAAAAAA32 AKYAEAAAAAAAAAA本發(fā)明優(yōu)選的共聚物是共聚物1，此處也稱為Cop 1。共聚物1已在幾個(gè)國家批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)，商品名為COPAXONE，Glatiramer acetate。COPAXONE是Teva Pharmaceuticals Ltd.，Petah Tikva，Israel的商標(biāo)。幾個(gè)臨床試驗(yàn)表明共聚物1的耐受良好，只有很少副反應(yīng)且大多是注射位置的輕度反應(yīng)(Johnson et al，1995)。(3)治療用途第(1)到(2)部分中描述的組合物可用于促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制繼發(fā)性退化，否則它可能在原發(fā)性NS損傷后發(fā)生，例如閉合性頭部損傷和鈍器傷，比如參加危險(xiǎn)運(yùn)動(dòng)引起的創(chuàng)傷，穿透性創(chuàng)傷如槍傷，出血性中風(fēng)，缺血性中風(fēng)，青光眼，腦缺血，或手術(shù)如腫瘤切除引起的損傷。另外，這種組合物可用于改善導(dǎo)致退行性過程的疾病影響，例如灰質(zhì)或白質(zhì)(或同時(shí)都有)中的退化，這可由多種疾病或紊亂引起，包括但不限于糖尿病視網(wǎng)膜病，老年性癡呆，阿爾茨海默氏病，帕金森病，面神經(jīng)(Bell’s)麻痹，青光眼，亨廷頓舞蹈病，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)，持續(xù)癲癇，非動(dòng)脈炎性視神經(jīng)病變，椎間盤脫出，維生素缺乏，朊病毒疾病如克-雅氏病，腕管綜合征，與多種疾病相關(guān)的周圍神經(jīng)病變，這些疾病包括但不限于尿毒癥、卟啉癥、低血糖癥、干燥綜合癥、急性感覺神經(jīng)病變、慢性共濟(jì)失調(diào)性神經(jīng)病、膽汁性肝硬化、原發(fā)性淀粉樣變性、阻塞性肺病、肢端肥大癥、吸收不良綜合征、真性紅細(xì)胞增多癥、IgA和IgGγ球蛋白病、多種藥物(例如甲硝唑)和毒素(例如乙醇或有機(jī)磷酸)的并發(fā)癥、夏-馬-圖三氏病、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張、Friedreich共濟(jì)失調(diào)、淀粉樣多神經(jīng)病、腎上腺脊髓神經(jīng)病、巨軸索神經(jīng)病、植烷酸貯積癥、彌漫性體血管角質(zhì)瘤、脂蛋白血癥等。根據(jù)本發(fā)明谷氨酸保護(hù)作用方面的發(fā)現(xiàn)，可根據(jù)本發(fā)明的方法治療的其它臨床狀況包括癲癇，健忘癥，焦慮，痛覺過敏、精神病、癲癇發(fā)作，眼內(nèi)壓異常升高、氧化應(yīng)激，以及阿片耐受和依賴。另外，本發(fā)明谷氨酸保護(hù)作用方面，也即，治療由谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病，可包括術(shù)后治療如CNS腫瘤切除及其它形式CNS手術(shù)后的治療。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)Cop 1免疫可用于防止谷氨酸毒性，根據(jù)這一事實(shí)，預(yù)計(jì)與本發(fā)明一致的Cop 1治療或Cop 1相關(guān)的T細(xì)胞治療將在以上列舉的疾病治療中有效，其中不僅是髓鞘受影響的晚期階段，而且在神經(jīng)元受引起谷氨酸升高到毒性水平的因素攻擊的早期階段也有效。因而，本發(fā)明可用于任何適應(yīng)癥，即由谷氨酸水平升高引起或加劇的慢性或急性神經(jīng)退化，包括缺血性中風(fēng)、阿爾茨海默氏病等的早期階段。
進(jìn)一步，這種谷氨酸毒性保護(hù)作用確證，Cop 1的作用不限于其與髓鞘的交叉反應(yīng)。它也必須具有調(diào)節(jié)活性，如通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞或調(diào)節(jié)物質(zhì)。由于這種調(diào)節(jié)活性，預(yù)計(jì)Cop 1接種以及Cop 1特異的活化T細(xì)胞也可保護(hù)白質(zhì)和灰質(zhì)免受氧化應(yīng)激及其它來源的神經(jīng)細(xì)胞損傷。另外，因?yàn)檫@種調(diào)節(jié)活性，本發(fā)明也可用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞不僅免于多發(fā)性硬化癥，這正如現(xiàn)有技術(shù)所提示，而且免于多發(fā)性硬化癥以外的自身免疫病。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，活化T細(xì)胞或含本發(fā)明的Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽的免疫復(fù)合物用于治療疾病或紊亂，其中顯示必須進(jìn)行促進(jìn)神經(jīng)再生或防止或抑制繼發(fā)性退化作用的治療，但不包括多發(fā)性硬化癥和瘤形成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物給予人類患者。
如以上公開，Cop 1已被用作藥劑，用于多發(fā)性硬化癥患者中抑制或滅活自身免疫性T細(xì)胞對(duì)髓鞘抗原的反應(yīng)性。對(duì)此目的，不用佐劑，將Cop 1每日皮下注射給藥。先有技術(shù)中也有公開通過口服途徑向多發(fā)性硬化癥患者給予Cop 1，其目的也是誘導(dǎo)抑制自身免疫性T細(xì)胞對(duì)髓鞘抗原的應(yīng)答。需要注意在治療多發(fā)性硬化癥的先有技術(shù)中，Cop1的這些用途與本發(fā)明的主題，即Cop 1的神經(jīng)保護(hù)用途有根本性不同。首先，如來自本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的WO99/60021所示，神經(jīng)保護(hù)作用是通過活化特異性針對(duì)髓鞘抗原的自身免疫性T細(xì)胞來介導(dǎo)。因此，最令人驚奇的是，Cop 1，作為設(shè)計(jì)用于抑制T細(xì)胞自身免疫的藥劑，其作用應(yīng)該要求活化特異性抗髓鞘T細(xì)胞自身免疫。其次，根據(jù)本發(fā)明Cop 1的神經(jīng)保護(hù)用途是基于給予抗Cop 1的T細(xì)胞，這不同于Cop 1用于治療多發(fā)性硬化癥的方法。第三，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用佐劑進(jìn)行Cop 1給藥，如不完全弗氏佐劑或完全弗氏佐劑，這是一種Cop 1制劑類型，在多發(fā)性硬化癥治療或任何其它治療目的中不曾使用。同時(shí)本發(fā)明包括口服給予Cop 1用于神經(jīng)保護(hù)，這總是在用Cop 1，優(yōu)選使用佐劑，初步活化后進(jìn)行。因此，在Cop 1初步活化后，口服Cop 1可用于增強(qiáng)T細(xì)胞活性。
因此，組合物及其作用模式和神經(jīng)保護(hù)作用在理論和實(shí)踐上都是新穎的。以特異性設(shè)計(jì)的方式使用Cop 1活化特異性針對(duì)髓鞘抗原的T細(xì)胞，以用于神經(jīng)保護(hù)，包括改善自身免疫病引起的退化過程，這對(duì)本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員來說不是顯而易見的，他們熟悉使用Cop 1抑制或滅活T細(xì)胞對(duì)髓鞘抗原的反應(yīng)活性。
Cop 1活化的T細(xì)胞也可用于改善腫瘤引起的退化過程，而不需使用免疫治療方法。Cop 1活化的T細(xì)胞將在神經(jīng)退化位點(diǎn)積聚并有助于抑制這種退化。(4)制劑和給藥根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可按常規(guī)方式用一或多種生理可接受的載體或賦形劑配制。載體必須是“可接受的”，意思是與組合物中的其它成分相容并且對(duì)接受者無害。
下面列舉載體、給藥方式、劑量形式等的已知可用的具體實(shí)例，本發(fā)明可從中可選用載體、給藥方式、劑量形式等。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將明白，所選的任何給定的制劑和給藥方式應(yīng)首先測試并確定可獲得期望的結(jié)果。因而，例如，當(dāng)活性成分是Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽時(shí)，特定的制劑和給藥方式必須允許活性成分起疫苗作用，以增加由此體內(nèi)活化的T細(xì)胞。如果不能獲得這種免疫應(yīng)答，那么特定的制劑和給藥方式不能用于本發(fā)明。
與之相似，如果活性成分是活化T細(xì)胞，那么應(yīng)測試特定的制劑和給藥方式，確保待給藥的活化T細(xì)胞以活性狀態(tài)進(jìn)入血流，這樣根據(jù)本發(fā)明它們可以集中到CNS中的損傷位點(diǎn)。
術(shù)語“載體”指稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體，治療劑與之一起給藥。藥物組合物中的載體可含有粘合劑，如微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮(polyvidone或povidone)，黃蓍膠，明膠，淀粉，乳糖或一水合乳糖；崩解劑，如褐藻酸，玉米淀粉等；潤滑劑或表面活性劑，如硬脂酸鎂，或月桂基硫酸鈉；助流劑，如膠體二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；和/或增香劑，如薄荷，水楊酸甲酯，或橙味香精。
給藥方法包括但不限于，胃腸外給藥，例如，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，粘膜(例如口，鼻內(nèi)，頰，陰道，直腸，眼內(nèi))，鞘內(nèi)，局部，和皮內(nèi)途徑?？梢韵到y(tǒng)性或局部給藥。
對(duì)于口服給藥，藥物組合物可以是液體形式，例如，溶液，糖漿或混懸液，或可以作為藥物產(chǎn)品，使用前用水或其它合適的載體補(bǔ)充。這種液體制劑可按常規(guī)方法用藥物允許的添加劑制備，如助懸劑(例如，山梨醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用油脂)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(例如，杏仁油，油性酯，或分餾植物油)；和防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。藥物組合物的形式可以是，例如用藥物允許的賦形劑按常規(guī)方法制備的片劑或膠囊，賦形劑如粘合劑(例如，預(yù)糊化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉甘醇酸鈉)；或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法包被片劑。
口服制劑可適當(dāng)?shù)嘏渲瞥煽梢钥刂漆尫呕钚曰衔铩?br> 對(duì)于頰部給藥，組合物可采用常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式。
組合物可配制供注射用的胃腸外給藥，例如，快速濃注或連續(xù)輸注。注射制劑可以單位劑量形式提供，例如安瓿或多劑量容器包裝，并附加防腐劑。組合物可采用這種形式如油性或水性中的混懸液，溶液或乳液，并可包含配制助劑如助懸劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。替代性地，活性成分可以是粉末形式，可在使用前用合適的載體構(gòu)造，例如，無菌無熱源水。
組合物也可配成直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑，例如包含常規(guī)的栓基如可可油或其它甘油酯。
對(duì)于吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明的組合物常規(guī)以氣溶膠噴霧劑形式遞送，從壓縮包裝或噴霧器中提供，其中使用合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適氣體。就壓縮氣溶膠來說，劑量單位可以由計(jì)量閥門確定。用于吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒，例如由明膠制成，可以配制成包含粉末混合物，其中混有化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，含Cop 1活化的T細(xì)胞、Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽的組合物根據(jù)常規(guī)方法配制，如適用于人體靜脈給藥的藥物組合物的方法。典型地，靜脈給藥組合物是無菌等滲水緩沖溶液。必要時(shí)，組合物也可包括助溶劑和局部麻醉劑如利諾卡因以在注射位點(diǎn)止痛。一般來說，成分分別單獨(dú)供應(yīng)或混在一起供應(yīng)。當(dāng)組合物準(zhǔn)備以輸液方式給藥時(shí)，可以用含無菌藥物級(jí)水或鹽水的輸液瓶來配送。當(dāng)組合物以注射方式給藥時(shí)，可提供無菌水或鹽水安瓿，這樣成分可在給藥前混合。
含Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽的藥物組合物可選地可與佐劑一起給藥按常規(guī)方式免疫接種。這種佐劑的非限定性實(shí)例包括明礬和不完全弗氏佐劑。提高給藥肽或多肽免疫原性的其它方式包括與白蛋白或與其它載體以聚集體或復(fù)合體形式給藥。所有這些對(duì)于疫苗領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都熟知?？纱x脂乳液，如Intralipid或Lipofundin也可用作Cop 1治療的載體，其方式公開于WO 97/02016，其全部內(nèi)容在此引作參考。雖然已知這些物質(zhì)引起TH1向TH2的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)移，然而對(duì)于本發(fā)明目的，沒有理由不相信TH2細(xì)胞因子能起作用，并且可能甚至是優(yōu)選。
當(dāng)Cop 1口服攝入時(shí)，可與其它食品形式混合，并以固體、半固體、混懸液或乳液形式使用；另外它可與可藥用載體混合，包括水、助懸劑、乳化劑、增香劑等。在一個(gè)實(shí)施方案中，口服組合物有腸溶性包衣。使用腸溶性包衣在本領(lǐng)域公知。例如，Lehman(1971)給出腸溶性包衣如Eudragit S和Eudragit L。藥物賦形劑手冊(cè)(第二版)TheHandbook of Pharmaceutical Excipients，2ndEd.也給出了Eudragit S和Eudragit L的應(yīng)用?？捎糜诒景l(fā)明的一種Eudragit是L30D55。
通過吸入或滴鼻，Cop 1也可以上述某些形式經(jīng)鼻給藥。進(jìn)一步，可使用經(jīng)口吸入遞送Cop 1到氣管和支氣管通道的粘膜內(nèi)層。
本發(fā)明也提供藥物包裝或藥盒，其中含有一或多個(gè)容器，其中填充有本發(fā)明藥物組合物的一或多種成分。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在NS損傷或檢測到退行性病變后的短時(shí)間內(nèi)，將本發(fā)明的藥物組合物向哺乳動(dòng)物給藥，優(yōu)選給人。本發(fā)明的治療方法可以含有給予Cop 1活化的T細(xì)胞或Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽，或其任意組合。當(dāng)用組合治療時(shí)，可以在給予Cop 1活化的T細(xì)胞之前、同時(shí)或之后給予Cop 1。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與下面的一或多種組合在一起給藥(a)單核巨噬細(xì)胞，優(yōu)選培養(yǎng)的單核細(xì)胞(見PCT公開WO97/09985所述，它的全部內(nèi)容在此引作參考)，由此它已經(jīng)刺激使之增強(qiáng)其促進(jìn)神經(jīng)再生的能力；(b)神經(jīng)營養(yǎng)因子如酸性成纖維細(xì)胞生長因子；和(c)抗炎治療物質(zhì)(即，抗炎甾體，或非甾體抗炎肽如Thr-Lys-Pro(TKP))。
在另一實(shí)施方案中，根據(jù)PCT公開WO 97/09985和1998年3月11日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/041,280的單核巨噬細(xì)胞注射到CNS中損傷或病變位點(diǎn)，這是在胃腸外途徑給予Cop 1活化的T細(xì)胞、Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，給予Cop 1活化的T細(xì)胞、Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽，可以作為單劑量給藥或者可重復(fù)給藥，優(yōu)選間隔兩周及然后相繼更長間隔，每月一次、每季度一次、每六個(gè)月一次等。根據(jù)待治療疾病或狀況，療程可持續(xù)幾個(gè)月、幾年或偶爾也在個(gè)體的整個(gè)生命期。在CNS損傷情況下，治療跨度可以是幾天到幾個(gè)月或甚至幾年，直至狀況穩(wěn)定且沒有或僅有有限危險(xiǎn)會(huì)發(fā)生繼發(fā)性退化。對(duì)于人慢性病或帕金森病，根據(jù)本發(fā)明治療可持續(xù)一生。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯，治療效果有時(shí)依賴于待治療狀況或疾病，依賴于個(gè)體年齡和健康狀況，依賴于個(gè)體的其它體質(zhì)參數(shù)(例如，性別、體重等)，以及多種其它因素，例如個(gè)體是否在服用其它藥物等。
含有本發(fā)明Cop 1活化T細(xì)胞的治療組合物的最佳劑量與受待治療位點(diǎn)NS損傷或疾病影響的神經(jīng)纖維數(shù)目成比例。在優(yōu)選實(shí)施方案中，約5×106到約107個(gè)細(xì)胞的劑量范圍用于治療影響約105個(gè)神經(jīng)纖維的病變，如完全切斷大鼠視神經(jīng)，約107到約108個(gè)細(xì)胞的劑量范圍用于治療影響約106-107個(gè)神經(jīng)纖維的病變，如完全切斷人視神經(jīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯可根據(jù)待治療損傷位點(diǎn)或病變中認(rèn)為受影響的神經(jīng)纖維數(shù)目，按比例上下調(diào)整T細(xì)胞劑量。(5)建立T淋巴細(xì)胞自體細(xì)胞庫為使神經(jīng)損傷后的繼發(fā)性破壞最小，可給予用Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽敏化的自體或半異體T淋巴細(xì)胞來治療患者。因?yàn)橹委煷叭晕淳_限定，應(yīng)在原發(fā)性損傷之后盡可能早進(jìn)行治療，以使成功機(jī)會(huì)最大化，優(yōu)選在約一周內(nèi)。
為跳過活化所需時(shí)間和治療所需時(shí)間的間隔，可用個(gè)人的自體T淋巴細(xì)胞儲(chǔ)備建庫，以備用于將來NS損傷時(shí)經(jīng)神經(jīng)保護(hù)性治療繼發(fā)性退化。T淋巴細(xì)胞分離自血液，然后用Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽敏化。然后冷凍細(xì)胞并按個(gè)人名字、識(shí)別號(hào)和血型適當(dāng)保存于細(xì)胞庫中直至需要。
另外，可處理CNS中的自體干細(xì)胞并保存，在NS創(chuàng)傷性疾病情況下如缺血或機(jī)械損傷時(shí)供個(gè)體患者使用，或者用于治療神經(jīng)退行性狀況如阿爾茨海默氏病或帕金森病。替代性地，可在庫中冷凍保存半異體或異體T細(xì)胞，用于與T細(xì)胞來源具有共同MHC II類分子的任何個(gè)體。
以下實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的某些特征，但不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。(6)實(shí)施例實(shí)施例1和2的材料和方法動(dòng)物.雌性成年同系路易氏大鼠(8-12周齡)由魏茲曼科學(xué)研究所動(dòng)物繁育中心提供。大鼠飼養(yǎng)于光照和溫度可調(diào)的房間，并且每次試驗(yàn)中年齡匹配。根據(jù)IACUC(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì))制定的規(guī)則來使用動(dòng)物。
抗原.豚鼠脊髓來源的髓鞘堿性蛋白(MBP)和卵清蛋白(OVA)購自Sigma(St.Louis，MO)。本發(fā)明使用的Cop 1是TevaPharmaceuticals(以色列)的COPAXONE，該產(chǎn)品由市場購得。
抗體.小鼠抗大鼠T細(xì)胞受體(TCR)單克隆抗體由Boris Reizis博士友情提供。偶聯(lián)Cy-3的羊抗小鼠IgG(與大鼠、人、牛和馬血清蛋白具有最小交叉反應(yīng))購買Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)。
T細(xì)胞系.T細(xì)胞系從用上述抗原免疫的路易氏大鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞(draining lymph node cells)中產(chǎn)生(Ben-Nun et al，1981a)?？乖芙庥诹姿猁}緩沖液(PBS)(1mg/ml)并用補(bǔ)充4mg/ml結(jié)核桿菌(Difco)的等體積不完全弗氏佐劑(IFA)(Difco Laboratories，Detroit，MI)乳化。向大鼠后腳掌注射0.1ml乳液的抗原10天后，處死大鼠并手術(shù)摘除及分離其引流淋巴結(jié)細(xì)胞。清洗細(xì)胞，并在刺激培養(yǎng)基中用抗原(10μg/ml)活化，刺激培養(yǎng)基中含Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)并補(bǔ)充L-谷氨酰胺(2mM)、2-巰基乙醇(5×10-5M)、丙酮酸鈉(1mM)、青霉素(100IU/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、非必需氨基酸(1ml/100ml)和自體血清1％(v/v)。37℃、98％相對(duì)濕度和10％CO2孵育72小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中，它由上述同樣濃度的DMEM、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和抗生素組成，并添加10％胎牛血清(FCS)(v/v)和10％T細(xì)胞生長因子，它來源自伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的脾細(xì)胞上清(Gillis et al，1978)。細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中生長4-10天，然后在刺激培養(yǎng)基中存在輻照(2000rad)胸腺細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)的條件下再次用抗原(10μg/ml)刺激。通過重復(fù)刺激和增殖來擴(kuò)增T細(xì)胞系(Ben-Nun et al，1982)。
視神經(jīng)擠壓損傷.按前述方法對(duì)視神經(jīng)進(jìn)行擠壓損傷(Duvdevaniet al，1990)。簡單說，通過腹膜內(nèi)注射Rompun(甲苯噻嗪，10mg/kg；Vitamed，Israel)和Vetalar(氯胺酮，50mg/kg；Fort DodgeLaboratories，F(xiàn)ort Dodge，IA)對(duì)大鼠深度麻醉。用雙目手術(shù)顯微鏡對(duì)右眼行外眥切開術(shù)，并切斷側(cè)邊與角膜的連接。分離出眼球牽縮肌后，通過眶內(nèi)鈍器解剖暴露出視神經(jīng)。用校準(zhǔn)的交叉動(dòng)作鑷子，對(duì)視神經(jīng)在距眼1-2mm處行擠壓損傷。制造輕度和嚴(yán)重?cái)D壓損傷供短期試驗(yàn)(兩周)，因?yàn)橐呀?jīng)表明該時(shí)間段可最優(yōu)的展現(xiàn)繼發(fā)性退化及其對(duì)治療的反應(yīng)(Yoles，1998)。不干擾未損傷的平行對(duì)照。
通過逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞檢測繼發(fā)性退化.擠壓損傷兩周后將熒光親脂染料，4-(4-二癸基氨基)苯乙烯基)-N-甲基碘化吡啶(4-Di-10-Asp)(Molecular Probes Europe BV，Netherlands)施加到損傷位點(diǎn)的遠(yuǎn)端，由此檢測視神經(jīng)軸突及其相連的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的繼發(fā)性退化。因?yàn)橹挥型暾妮S突可運(yùn)輸染料到其胞體，損傷兩周后施加染料到損傷位點(diǎn)的遠(yuǎn)端，確保只有在原發(fā)性和繼發(fā)性退化中存活的軸突才被計(jì)數(shù)。這種方法可以區(qū)分功能仍然完整的神經(jīng)元和軸突受損但細(xì)胞體仍活著的神經(jīng)元，因?yàn)橹挥衅淅w維形態(tài)完整的神經(jīng)元可吸收施加到損傷位點(diǎn)遠(yuǎn)端的染料并將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞體。用這種方法，標(biāo)記RGC的數(shù)目可靠地反映了仍具有功能的神經(jīng)元數(shù)目。按下面的方法進(jìn)行標(biāo)記和檢測第二次暴露右側(cè)視神經(jīng)，但仍不破壞視網(wǎng)膜血液供應(yīng)。在距損傷遠(yuǎn)端邊界1-2mm處行完全軸索切開術(shù)，將4-Di-10-Asp的固體結(jié)晶(0.2-0.4mm直徑)沉積于新形成的軸索切開術(shù)位點(diǎn)。使用染料5天后處死大鼠。從眼中分離視網(wǎng)膜，在4％多聚甲醛溶液中制成平展的完整標(biāo)本，并用熒光顯微鏡檢查標(biāo)記RGC。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn).抗MBP T細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中生長一周，然后用PBS清洗并重懸于刺激培養(yǎng)基中。存在輻照的胸腺細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)的條件下，將T細(xì)胞(0.5×106細(xì)胞/ml)與ConA(1.25μg/ml)、或與MBP抗原(10μg/ml)、或與Cop 1抗原(10μg/ml)、或與OVA抗原(10μg/ml)、或不加抗原在37℃、98％相對(duì)濕度和10％CO2條件下一起孵育。另外，將輻照的胸腺細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)單獨(dú)在刺激培養(yǎng)基中孵育。48小時(shí)后離心細(xì)胞，收集上清并取樣。用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Promega，Madison，WI)并與標(biāo)準(zhǔn)NT(用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度)比較，從而確定樣品中神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)-3、神經(jīng)生長因子(NGF)、和NT-4/5的濃度。用靈敏的夾心ELISA檢測樣品中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的濃度。簡單地說，在96孔平底板上包被雞抗人BDNF抗體(Promega，Madison，WI)，它溶于0.025M NaHCO3和0.025M Na2CO3中(pH8.2)。用封閉溶液將重組人BDNF(用作標(biāo)準(zhǔn)；Research Diagnostics，F(xiàn)landers，NJ)系列稀釋，封閉溶液中含3％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％聚乙二醇-失水山梨醇月桂酸酯(Tween-20)和溶于PBS中的1％FCS(pH8.2)。將多孔板與小鼠抗人BDNF抗體(Research Diagnostics)一起孵育，然后與溶于封閉液中的偶聯(lián)過氧化物酶的羊抗鼠IgG一起孵育(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，從而檢測結(jié)合的BDNF。用3，3’5，5’-四甲基-聯(lián)苯胺液體基質(zhì)系統(tǒng)(Sigma，St.Louis，MO)對(duì)多孔板顯色。加入1M H3PO4終止反應(yīng)，并在450nm檢測光密度。每次試驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算成每毫升樣品中分泌的NT量，其中首先扣除與刺激培養(yǎng)基一起孵育的輻照胸腺細(xì)胞的背景水平。
免疫組織化學(xué).將神經(jīng)的徑向冷凍切片(10μm厚)放到包被明膠的載玻片上并冷凍至準(zhǔn)備熒光染色。切片在乙醇中室溫固定10分鐘，用雙蒸水清洗兩次，并在含0.05％Tween-20的PBS中孵育3分鐘。然后在室溫下將切片與小鼠抗大鼠TCR單克隆抗體(Hunig，1989)一起孵育1小時(shí)，抗體稀釋于含3％FCS和2％BSA的PBS中。然后用含0.05％Tween-20的PBS清洗切片3次，然后與偶聯(lián)Cy3的羊抗小鼠IgG(與大鼠、人、牛和馬血清蛋白具有最小交叉反應(yīng)；JacksonImmuno Research，West Grove，PA)室溫下一起孵育1小時(shí)。用含0.05％Tween-20的PBS清洗切片，并用含1，4-二氮雙環(huán)(2，2，2)辛烷的甘油處理以抑制熒光淬滅。切片用Zeiss通用型熒光顯微鏡觀察。實(shí)施例1抗Cop1 T細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用過繼轉(zhuǎn)移Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)損傷視神經(jīng)有保護(hù)作用在本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的前期研究中已經(jīng)表明，在大鼠急性CNS創(chuàng)傷后，被動(dòng)轉(zhuǎn)移對(duì)CNS自身抗原如MBP特異的致腦炎性T細(xì)胞可以避免損傷擴(kuò)展，并因而阻止繼發(fā)性退化(見WO 99/60021)。此處舉例說明Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，不同于MBP反應(yīng)性T細(xì)胞，這種T細(xì)胞不是致腦炎性的。輕度(圖1A)或嚴(yán)重(圖1B)視神經(jīng)損傷后，立即向大鼠注射含PBS的IFA或含Cop 1特異的T細(xì)胞的IFA。為評(píng)價(jià)繼發(fā)性退化，損傷后兩周在視神經(jīng)損傷位點(diǎn)的遠(yuǎn)端使用神經(jīng)示蹤染料4-Di-10-Asp。5天后處死大鼠，切除視網(wǎng)膜并做成平展標(biāo)本。在熒光顯微鏡下計(jì)算位于每個(gè)視網(wǎng)膜視神經(jīng)盤大致相同距離的四個(gè)視野中標(biāo)記(存活)的RGC數(shù)目，結(jié)果示于圖1A和圖1B。與PBS注射相比，Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用對(duì)輕度擠壓損傷(P＜0.005，斯氏t檢驗(yàn))和嚴(yán)重?cái)D壓(P＜0.05，斯氏t檢驗(yàn))損傷都有顯著性。結(jié)果是三次試驗(yàn)的匯總，每組含6到10只大鼠。Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞在損傷和非損傷神經(jīng)元組織中都積聚本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室之前已表明，向擠壓損傷大鼠被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗MBP的T細(xì)胞之后，注射T細(xì)胞大量積聚于損傷位點(diǎn)。相對(duì)于內(nèi)源性抗MBP T細(xì)胞在PBS處理的損傷大鼠中的積聚，本研究中被動(dòng)轉(zhuǎn)移Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞也引起注射T細(xì)胞在損傷位點(diǎn)的顯著積聚。Cop 1處理的大鼠中T細(xì)胞積聚在注射后7天最多。這些發(fā)現(xiàn)與不同特異性的注射T細(xì)胞系的早期結(jié)果吻合。在那些研究中，損傷神經(jīng)病變位點(diǎn)的T細(xì)胞積聚是非選擇性的，而未損傷神經(jīng)中只有對(duì)CNS自身抗原特異的T細(xì)胞才發(fā)現(xiàn)其積聚。因此，損傷神經(jīng)中Cop 1特異性T細(xì)胞積聚不提供任何跡象表明其與任何固有的CNS蛋白有交叉識(shí)別以及相應(yīng)的活性。然而，與MBP特異的T細(xì)胞相似，Cop 1特異的T細(xì)胞也在非損傷神經(jīng)中積聚，而不同于OVA特異的T細(xì)胞(結(jié)果未示出)。盡管與MBP特異的T細(xì)胞相比Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞積聚更少，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持Cop 1和MBP有體內(nèi)交叉活性的觀念。MBP特異的和Cop 1特異的注射T細(xì)胞系的細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子譜培養(yǎng)上清來自未刺激T細(xì)胞或分別用含以下物質(zhì)的刺激培養(yǎng)基刺激48小時(shí)的T細(xì)胞ConA絲裂源、或MBP抗原、或Cop 1抗原，將培養(yǎng)上清用于夾心ELISA。收集含這些細(xì)胞分泌產(chǎn)物的培養(yǎng)基并用ELISA定量其細(xì)胞因子濃度，結(jié)果見表2?；罨疶細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量大大超過未刺激T細(xì)胞。MBP刺激的T細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)Th1特異性細(xì)胞因子INF，而Cop 1刺激的T細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)Th2特異性的細(xì)胞因子IL-10。ConA刺激的T細(xì)胞上清中檢測到的細(xì)胞因子分泌量最大(表2)。
表2靜止?fàn)顟B(tài)MBP刺激 CopI刺激 ConA刺激TmbpTcopTmbp Tcop Tmbp TcopTmbp TcopIFN-γ 725 6645156929257242 11825 22758 22525(pg/ml)IL-10 41 382 1941 13 365 72443565 6503(pg/ml)本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中最近證明用其特異性抗原活化的T細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)性表達(dá)和分泌上調(diào)。在關(guān)于T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理的研究中，將本研究的T細(xì)胞上清用ELISA檢測有神經(jīng)保護(hù)作用的T細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子譜。Cop 1刺激的T細(xì)胞同時(shí)分泌NGF和NT-4/5，但分泌量小于抗MBP的T細(xì)胞。相對(duì)于抗MBP的T細(xì)胞，Cop 1刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生的NT-3可以忽略；而BDNF的產(chǎn)生量很高(圖2A)。不同刺激的T細(xì)胞分泌的NT-3和BDNF量在四次獨(dú)立檢測中產(chǎn)生相似的結(jié)果。每種情況下，Cop 1刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生的BDNF比抗MBP的T細(xì)胞多約2.5倍，而NT-3的量僅相當(dāng)于其10％(圖2B)。
免疫.每只C57B1/6J OLA小鼠(8-10周齡)注射總量75μg的Cop 1，其中Cop 1用等體積含5mg/ml分枝桿菌H37 RA(Difco)的完全弗氏佐劑(CFA)乳化。另一組小鼠注射用CFA乳化的磷酸鹽緩沖液(PBS)。在將谷氨酸引入視網(wǎng)膜前10天皮內(nèi)注射乳液，總體積為0.1ml。
谷氨酸毒性.免疫10天后，麻醉小鼠，并將含200nmol谷氨酸的1μl鹽水注射入右眼的玻璃體。左眼不注射作為對(duì)照。
標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞.評(píng)估RGC存活率前3天(72小時(shí))，麻醉每只小鼠并放置于立體定位裝置中。暴露顱骨并保持干燥和潔凈。確定前囟點(diǎn)并作標(biāo)記。指定注射點(diǎn)是腦表面2mm深度，前后軸向在前囟點(diǎn)后2.92mm，以及距中線的0.5mm側(cè)向。在左右半球的指定坐標(biāo)上的頭皮中鉆一窗口，然后用漢密爾頓注射器施加神經(jīng)示蹤染料FluroGold(4％鹽水溶液；Fluorochrome，Dever，CO)(1μl，速度0.5μl/min)。
評(píng)估RGC存活率.施加谷氨酸幾天后，摘除眼球并分離出視網(wǎng)膜，在4％多聚甲醛溶液中制備成平展的完整標(biāo)本。6到8個(gè)相同大小的視野(0.078mm2)中標(biāo)記細(xì)胞，位于視神經(jīng)盤約1mm處，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)并作平均，結(jié)果示于圖4。與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)Cop 1免疫的小鼠其谷氨酸毒性大約高出4倍。試驗(yàn)2接種保護(hù)神經(jīng)元免于谷氨酸毒性和眼壓過高用來自髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MMOG)的肽或用MBP主動(dòng)或被動(dòng)免疫，這對(duì)軸突損傷后提供有效的神經(jīng)保護(hù)(Moalem et al.，1999a；Moalem et al.，1999b and Fisher et al.，2000)，但在本研究中顯示不能保護(hù)神經(jīng)元免于谷氨酸引起的毒性。然而，接種Cop 1可以避免谷氨酸毒性。在維持高壓并且不受免疫接種影響的條件下，在大鼠青光眼模型中，Cop 1免疫進(jìn)一步顯示對(duì)眼壓過高引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡具有高效保護(hù)作用。材料和方法動(dòng)物.所有動(dòng)物根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)制定的規(guī)則來使用。C57BL/6J和Balb/c系小鼠，8-13周齡，和8-12周齡的成年同系路易氏大鼠由魏茲曼科學(xué)研究所動(dòng)物繁育中心提供，并飼養(yǎng)于光照和溫度可調(diào)的房間。每次試驗(yàn)前通過腹膜內(nèi)給予氯胺酮80mg/kg和甲苯噻嗪16mg/kg麻醉動(dòng)物。
抗原.Cop 1購自Teva Pharmaceuticals(Petah Tikva，Israel)。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)肽(pMOG)1-22(GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL)(序列編號(hào)33)在魏茲曼科學(xué)研究所化學(xué)系M.Fridkin教授實(shí)驗(yàn)室合成，其中使用Fmoc方法的自動(dòng)多肽合成儀(AMS422，Abimed，Langenfeld，Germany)。豚鼠脊髓來源的MBP購自Sigma(Israel)。
免疫.分別用75μg或100μg Cop 1免疫小鼠或大鼠，或用300μgpMOG免疫，pMOG首先用含0.5或5mg/ml結(jié)核桿菌的等體積完全弗氏佐劑(CFA)乳化。乳液(總體積0.15ml)皮下注射肋腹上一個(gè)位點(diǎn)。一周后向pMOG免疫小鼠另一側(cè)肋腹給予同樣的免疫作為加強(qiáng)。對(duì)照小鼠注射含磷酸鹽緩沖液(PBS)的CFA(Difco，Detroit，Michigan，USA)。
視神經(jīng)擠壓損傷.麻醉小鼠或大鼠并在距眼球1-2mm處視神經(jīng)的眶內(nèi)部分實(shí)施重度擠壓損傷。在雙目手術(shù)顯微鏡的輔助下，切斷連接并暴露出視神經(jīng)。用校準(zhǔn)的交叉動(dòng)作鑷子并采用不干擾血液供應(yīng)的特別處理，擠壓神經(jīng)2s(小鼠)或30s(大鼠)。
注射谷氨酸和NMDA.用27號(hào)針在鞏膜上部穿刺麻醉小鼠或大鼠的右眼。并用帶30號(hào)針頭的10-μl漢密爾頓注射器盡可能遠(yuǎn)地插入玻璃體。向小鼠注射溶解于鹽水中的總體積1μl(200nmol)L-谷氨酸或1μl N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA；75nmol；RBI，Boston，MA)。
損傷前向小鼠給予立體定位染料.暴露顱骨并用15％過氧化氫保持干燥和潔凈。確定并標(biāo)記前囟點(diǎn)。在兩半球的上丘部位上鉆孔(中線后0.292mm，以及側(cè)邊距0.05mm)(注意該數(shù)據(jù)與前面試驗(yàn)1相比，小了一個(gè)數(shù)量級(jí)，譯者認(rèn)為兩者本應(yīng)相同)。然后用立體定向測量裝置和漢密爾頓注射器，在兩半球上丘的一點(diǎn)上，腦骨下0.16mm或0.175mm深處(取決于小鼠株系)，向小鼠注射FluroGold(5％鹽水溶液；Fluorochrome，Dever，CO；1μl)。
評(píng)估小鼠中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率.給予小鼠致死量的戊巴比妥(170mg/kg)。摘除眼球，并分離視網(wǎng)膜，在多聚甲醛(4％，溶于PBS)中制成平展的完整標(biāo)本。在4-6個(gè)選定的相同大小的視野(0.078mm2)中計(jì)數(shù)標(biāo)記細(xì)胞，選定視野位于距視神經(jīng)盤(0.3mm)大致相同的距離處，以排除作為視神經(jīng)盤間距函數(shù)的RGC密度的變化。在熒光顯微鏡下(放大800倍)對(duì)視野計(jì)數(shù)，這由不了解小鼠所受處理的觀察者操作。計(jì)算每個(gè)視網(wǎng)膜中每個(gè)視野RGC的平均數(shù)。
評(píng)估大鼠中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率.損傷后將熒光親脂染料，4-(4-二癸基氨基)苯乙烯基)-N-甲基碘化吡啶(4-Di-10-Asp)(Molecular Probes Europe BV，Netherlands)施加到視神經(jīng)頭的遠(yuǎn)端，由此檢測大鼠RGC存活率。按以下方法實(shí)施標(biāo)記和檢測暴露視神經(jīng)但不破壞視網(wǎng)膜血液供應(yīng)。在距視神經(jīng)頭1-2mm處行完全軸索切開術(shù)，將4-Di-10-Asp的固體結(jié)晶(0.2-0.4mm直徑)沉積于所形成的軸索切開術(shù)位點(diǎn)。使用染料5天后處死大鼠。從眼中分離視網(wǎng)膜，在4％多聚甲醛溶液中制成平展的完整標(biāo)本，并用熒光顯微鏡檢查標(biāo)記RGC。在IOP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，通過逆運(yùn)輸葡聚糖四甲基羅丹明(DTMR)(Molecular Probes，OR)來標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。分子量3000的DTMR結(jié)晶施加到距眼球約2-3mm的視神經(jīng)切頭。24小時(shí)后制作視網(wǎng)膜完整標(biāo)本，并在400x放大下的8個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其中每象限2個(gè)(距視神經(jīng)盤邊緣0.66到1.103mm)。
小鼠Cop-1-T細(xì)胞系產(chǎn)生.小鼠T細(xì)胞系從用Cop-1抗原免疫的C57BL/6J小鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞中產(chǎn)生(Ben-Nun et al，1981a)。抗原溶解于PBS(1mg/ml)并用補(bǔ)充5mg/ml結(jié)核桿菌(Difco)的等體積CFA乳化。后腳掌免疫10天后，處死小鼠并手術(shù)摘除及分離引流淋巴結(jié)細(xì)胞。清洗細(xì)胞，并在刺激培養(yǎng)基中用抗原(10μg/ml)活化，刺激培養(yǎng)基中含RPMI并補(bǔ)充L-谷氨酰胺(2mM)、2-巰基乙醇(5×10-5M)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和自體血清1％(v/v)。37℃、98％相對(duì)濕度和10％CO2孵育72小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到RPMI增殖培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充非必需氨基酸(1ml/100ml)、丙酮酸鈉(1mM)、和上述同樣濃度的L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、青霉素和鏈霉素，并添加5％胎牛血清(v/v)和10％T細(xì)胞生長因子，它來源自伴刀豆球蛋白A刺激的脾細(xì)胞上清。細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中生長10-14天，然后在刺激培養(yǎng)基中存在輻照(2500rad)脾細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)的條件下再次用抗原(10μg/ml)刺激。通過重復(fù)刺激和增殖來擴(kuò)增T細(xì)胞系(Ben-Nun et al，1982)。該細(xì)胞系表型與前已描述的基本相似(Aharoni et al.，1997)。
大鼠Cop-1-T細(xì)胞系產(chǎn)生.T細(xì)胞系從用上述抗原免疫的路易氏大鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞中產(chǎn)生(Ben-Nun et al，1981a)?？乖芙庥诹姿猁}緩沖液(PBS)(1mg/ml)并用補(bǔ)充4mg/ml結(jié)核桿菌(Difco)的等體積不完全弗氏佐劑(IFA)(Difco Laboratories，Detroit，MI)乳化。向大鼠后腳掌注射0.1ml乳液的抗原10天后，處死大鼠并手術(shù)摘除及分離引流淋巴結(jié)細(xì)胞。清洗細(xì)胞，并在刺激培養(yǎng)基中用抗原(10μg/ml)活化，刺激培養(yǎng)基中含Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)并補(bǔ)充L-谷氨酰胺(2mM)、2-巰基乙醇(5×10-5M)、丙酮酸鈉(1mM)、青霉素(100IU/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、非必需氨基酸(1ml/100ml)和自體血清1％(v/v)。37℃、98％相對(duì)濕度和10％CO2孵育72小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中，它由上述同樣濃度的DMEM、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和抗生素組成，并添加10％胎牛血清(FCS)(v/v)和10％T細(xì)胞生長因子，它來源自伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的脾細(xì)胞上清(Gillis et al，1978)。細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中生長4-10天，然后在刺激培養(yǎng)基中存在輻照(2000rad)胸腺細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)的條件下再次用抗原(10μg/ml)刺激。通過重復(fù)刺激和增殖來擴(kuò)增T細(xì)胞系。
組織學(xué)分析.注射谷氨酸或鹽水7天后，通過注射致死量的戊巴比妥(170mg/kg)處死小鼠，摘除眼球，4℃下在甲醛(4％，溶于PBS溶液)中固定48小時(shí)。石蠟包埋切片(10μm厚)并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。
大鼠眼壓過高的產(chǎn)生/提高大鼠眼內(nèi)壓.雄性路易氏大鼠用氯胺酮(15mg/kg)、乙酰丙嗪(1.5mg/kg)和甲苯噻嗪(0.3mg/kg)的混合物麻醉。眼內(nèi)壓(IOP)升高由激光凝固邊緣和鞏膜外靜脈完成。間隔一周大鼠接受兩次藍(lán)綠氬氣激光(0.2秒1瓦，兩次處理在50μm內(nèi)共產(chǎn)生130-150個(gè)點(diǎn)；Coherent，Palo Alto，CA)處理。大鼠肌內(nèi)注射獸用鎮(zhèn)定劑乙酰丙嗪3.0mg/kg并在眼上局部涂覆丙美卡因0.5％以麻醉角膜后，用TONO-PEN(Mentor，Norwell，MA)每周一次測量IOP。結(jié)果髓鞘相關(guān)抗原不能防止谷氨酸毒性。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室之前已證明，被動(dòng)和主動(dòng)免疫髓鞘相關(guān)抗原可降低與小鼠和大鼠中視神經(jīng)擠壓損傷相關(guān)的創(chuàng)傷后退化(實(shí)施例1和2；Moalem et al.，1999和Fisheret al.，2000)和與成年大鼠脊髓結(jié)構(gòu)性損傷相關(guān)的創(chuàng)傷性退化(Hauben et al.，2000a and Hauben et al.，2000b)。為確定非機(jī)械損傷后是否發(fā)生這種免疫性神經(jīng)保護(hù)作用，首先檢查主動(dòng)免疫接種髓鞘相關(guān)抗原或被動(dòng)轉(zhuǎn)移對(duì)這些抗原反應(yīng)性的T細(xì)胞是否提供抗玻璃體內(nèi)注射谷氨酸誘導(dǎo)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。對(duì)大鼠和小鼠視神經(jīng)實(shí)施擠壓損傷。用本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室建立的免疫性神經(jīng)保護(hù)方法，對(duì)小鼠主動(dòng)免疫M(jìn)OG衍生肽(Fisher et al.，2000)以及向大鼠被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗MBP的T細(xì)胞(Moalem et al.，1999)。通過玻璃體內(nèi)注射谷氨酸實(shí)施谷氨酸刺激，所用濃度之前已顯示可導(dǎo)致小鼠和大鼠中一周后可測量的RGC死亡(Yoles et al.，2000)。
玻璃體內(nèi)注射谷氨酸(200nmol)之前用pMOG免疫小鼠。注射谷氨酸后一周評(píng)估RGC存活率，沒有發(fā)現(xiàn)pMOG免疫具有有益作用的證據(jù)(圖5A)。與之相似，大鼠注射谷氨酸后立即被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗MBP的T細(xì)胞也沒有檢測到有益作用(圖5B)。因此，盡管最近顯示視神經(jīng)擠壓損傷后接種pMOG(1-22)可誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)(Fisher et al.，2000)，在本研究中對(duì)接種pMOG小鼠實(shí)施谷氨酸刺激后沒發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)保護(hù)作用。
這些發(fā)現(xiàn)使本發(fā)明人考慮兩種可能性或者谷氨酸毒性后RGC損失與免疫性神經(jīng)保護(hù)無關(guān)，這意味著谷氨酸誘導(dǎo)的RGC死亡不涉及免疫系統(tǒng)，或者髓鞘相關(guān)的抗源如pMOG和MBP不是防止谷氨酸毒性的真正抗原。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室最近的結(jié)果(Kipnis et al.，2000)顯示，谷氨酸引起的細(xì)胞死亡率在缺乏成熟T細(xì)胞的大鼠或小鼠中比正常動(dòng)物更高，這強(qiáng)烈暗示對(duì)CNS刺激的有益生理反應(yīng)與T細(xì)胞有關(guān)。因此，加強(qiáng)這種內(nèi)源性谷氨酸誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答可能對(duì)損傷視網(wǎng)膜有益。
Cop-1免疫防止谷氨酸毒性。可能誘導(dǎo)對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)毒性的有益免疫應(yīng)答的生理性抗原研究仍然是此階段的主要目的，然而本發(fā)明人試圖發(fā)現(xiàn)一種抗原，它有可能用于對(duì)谷氨酸免疫應(yīng)答的外源性免疫系統(tǒng)操作。首先檢驗(yàn)注射谷氨酸是否引起RGC變得可以接近淋巴細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)注射谷氨酸24小時(shí)內(nèi)大量淋巴細(xì)胞侵入注射谷氨酸的眼睛(圖6A和6B)，這提示免疫操作可以影響局部暴露于谷氨酸的RGC存活。結(jié)合這兩種現(xiàn)象，本發(fā)明人認(rèn)為谷氨酸毒性活化T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)作用，并鼓勵(lì)本發(fā)明人研究加強(qiáng)這種有益免疫應(yīng)答的方法。在尋找合適抗原中，合成聚合物共聚物-1(Cop-1)被認(rèn)為是可能的候選者，它是多發(fā)性硬化癥患者使用的寡肽藥物，最近發(fā)現(xiàn)在成年大鼠視神經(jīng)擠壓損傷模型中可以加強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用(Kipnis et al.，2000a)。
首先，檢驗(yàn)小鼠、而不僅是大鼠，視神經(jīng)擠壓損傷后Cop-1免疫是否對(duì)RGC存活具有益作用。在此研究中使用Balb/c小鼠。用已發(fā)現(xiàn)的對(duì)大鼠視神經(jīng)擠壓損傷后有益的方法，接種Cop-1對(duì)小鼠視神經(jīng)損傷也有益(圖7)。
其次，觀察同樣的方法是否能導(dǎo)致防止谷氨酸誘導(dǎo)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。在此研究中使用C57b1/6小鼠，其中谷氨酸刺激后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)損失高于Balb/c小鼠(Kipnis et al.，2000b)。玻璃體內(nèi)注射谷氨酸10天前，C57b1/6小鼠免疫接種Cop-1，它乳化于含5mg/ml細(xì)菌的佐劑中。該株系的選擇是根據(jù)本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室最近的發(fā)現(xiàn)，由于遺傳連鎖神經(jīng)元損失和自身免疫病抗性，這類小鼠中注射谷氨酸引起的RGC損失大于Balb/c小鼠(Kipnis et al.，2000b)。Cop-1免疫導(dǎo)致谷氨酸毒性顯著降低(圖8A)。在試圖在該模型中建立Cop-1免疫治療窗的研究中，試驗(yàn)中Cop-1用含兩種不同濃度細(xì)菌(0.5或5mg/ml)的佐劑乳化，重復(fù)該試驗(yàn)，并在相對(duì)谷氨酸刺激不同的時(shí)間免疫小鼠。與注射相應(yīng)佐劑乳化PBS的小鼠相比，注射谷氨酸當(dāng)天免疫的小鼠仍表現(xiàn)出明顯更高的RGC存活率(圖8B和8C)。兩種佐劑都產(chǎn)生顯著作用。Cop-1的保護(hù)效力隨免疫接種和谷氨酸刺激之間的時(shí)間而消弱注射谷氨酸后立即或24小時(shí)后進(jìn)行Cop-1免疫時(shí)RGC平均百分存活率顯著高于注射PBS的視網(wǎng)膜，但注射谷氨酸后48小時(shí)給予Cop-1則不顯著(圖8D)。有趣的是，為在此體內(nèi)模型中引起不同于典型凋亡特性的RGC死亡，最近由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，Cop-1免疫不能保護(hù)小鼠免受NMDA引起的毒性(圖9)。
過繼轉(zhuǎn)移Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞防止谷氨酸毒性。為確定所觀察的Cop-1免疫是否導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的抗谷氨酸毒性神經(jīng)保護(hù)，注射谷氨酸(200nmol)后立即將5×106個(gè)Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞(250μl腹膜內(nèi)注射)被動(dòng)轉(zhuǎn)移入小鼠。一周后，與腹膜內(nèi)注射PBS的對(duì)照小鼠(1238±2，n＝3)相比，注射Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞的小鼠RGC存活率明顯更高(1978±86，n＝6)(圖10)。
Cop-1免疫防止大鼠眼壓過高引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡。間隔一周對(duì)路易氏大鼠作兩次激光處理以增加IOP。隨后在3周內(nèi)的指定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測量，其中顯示激光處理后2周，IOP增加到30±0.4mmHg(平均值±SEM)，并在此后保持在大致這個(gè)水平(圖11A)。初次激光處理后3周檢測這些大鼠，與未受激光的對(duì)照大鼠相比顯著降低(下降19.9％±0.51％，平均值±SEM)(圖11B)。為檢驗(yàn)Cop-1免疫對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率的影響，在第一次激光處理當(dāng)天用CFA乳化的Cop-1免疫大鼠。對(duì)照大鼠注射相同佐劑的PBS。3周后逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并在24小時(shí)后切除視網(wǎng)膜，做成整體標(biāo)本，并對(duì)標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。Cop-1免疫大鼠中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)目顯著高于注射PBS/CFA的對(duì)照(圖11C)。兩組大鼠的IOP保持與沒接受注射的激光處理組大鼠同樣高的水平(圖11A)。Cop-1免疫大鼠中具有盡管稍小但相似的作用，這時(shí)其IOP仍然很高(圖11D)。(7)結(jié)果討論對(duì)于脊髓損傷，工業(yè)社會(huì)最常見的但破壞性的創(chuàng)傷之一，仍沒有發(fā)現(xiàn)治愈方法。40多年來已知，不同于周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，CNS神經(jīng)元僅具有有限的損傷后再生能力。最近的二十年間，促進(jìn)再生的努力已經(jīng)產(chǎn)生導(dǎo)致部分恢復(fù)的方法。最近幾年已變得很明顯，盡管人脊髓所受的大多數(shù)創(chuàng)傷性損傷是局部的，然而其導(dǎo)致的功能損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過初次破壞造成的程度；繼發(fā)性退化的自我擴(kuò)展過程看起來起決定作用。
大量研究努力最近已定位于阻止損傷誘導(dǎo)的繼發(fā)性退化。至今所有努力已有藥理學(xué)基礎(chǔ)。并且其中一些已可以導(dǎo)致脊髓休克的進(jìn)一步恢復(fù)。相對(duì)而言本研究描述了一種細(xì)胞療法，它加強(qiáng)一種好像是天然機(jī)制的自我修復(fù)并導(dǎo)致在一次治療后可長期持續(xù)性恢復(fù)。其恢復(fù)程度看起來超過已報(bào)道的藥理學(xué)方法。
大多數(shù)組織中，損傷誘導(dǎo)的破壞啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而保護(hù)組織并維持其動(dòng)態(tài)平衡。該應(yīng)答可歸因于巨噬細(xì)胞和含免疫系統(tǒng)固有部分的其它細(xì)胞。淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)適應(yīng)性免疫，以前認(rèn)為其不參與組織維持。根據(jù)傳統(tǒng)觀念，適應(yīng)性免疫用于對(duì)抗外來危險(xiǎn)。然而，本研究現(xiàn)已表明，即使當(dāng)沒有外來病源時(shí)適應(yīng)性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答也可有保護(hù)作用。在組織維持的情況下，T細(xì)胞特異性針對(duì)組織自身抗原。
以上實(shí)施例的結(jié)果證明擠壓損傷的CNS神經(jīng)及暴露于谷氨酸毒性的視神經(jīng)中Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。在局部視神經(jīng)損傷大鼠模型中，在CNS損傷當(dāng)天過繼給予Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞或用Cop 1接種對(duì)神經(jīng)纖維繼發(fā)性退化有顯著預(yù)防作用。這是第一次表明，接種是防止視神經(jīng)創(chuàng)傷性損傷后繼續(xù)擴(kuò)散的可能方法。
大鼠視神經(jīng)擠壓損傷后，注射Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞導(dǎo)致顯著防止繼發(fā)性退化的破壞性作用。正如預(yù)期，T細(xì)胞積聚于損傷位點(diǎn)，但它們也在非損傷神經(jīng)中積聚。只有T細(xì)胞受體被呈遞的抗原識(shí)別時(shí)，T細(xì)胞才有可能積聚于非損傷CNS。無論其特異性，活化T細(xì)胞可穿過血腦屏障(BBB)，但只有對(duì)CNS抗原有反應(yīng)的活化T細(xì)胞可積聚于非損傷神經(jīng)(Hickey，1991)。因此本發(fā)現(xiàn)第一次證明Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞與CNS髓鞘成分間的體內(nèi)交叉識(shí)別。損傷位點(diǎn)的這種識(shí)別可能起觸發(fā)T細(xì)胞活化的作用，導(dǎo)致T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成保護(hù)性表型，這可能是通過活化T細(xì)胞分泌合適的神經(jīng)營養(yǎng)因子或其它仍未發(fā)現(xiàn)的因子。本研究證明被其特異性抗原活化的Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞分泌顯著量的BDNF，即一種在神經(jīng)元存活中起主要作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Yan et al，1992；Sendtner et al，1992)。
Cop-1原本設(shè)計(jì)用于模擬髓鞘堿性蛋白(MBP)的活性并誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物炎癥性脫髓鞘疾病EAE。然而發(fā)現(xiàn)它沒有致腦炎作用并且甚至抑制MBP(Teitelbaum et al.，1971)、蛋白脂蛋白(PLP)(Teitelbaumet al.，1996)、或MOG(Ben-Nun et al.，1996)誘導(dǎo)的EAE。Cop-1阻止嚙齒動(dòng)物中EAE發(fā)展并改善人類的多發(fā)性硬化癥。研究已證明Cop-1和MBP抗體間或針對(duì)這些抗原的T細(xì)胞間的部分交叉反應(yīng)(Webbet al.，1973 and Teitelbaum et al.，1988)。Cop-1可作為針對(duì)免疫優(yōu)勢(shì)MBP表位的T細(xì)胞抗原受體的拮抗劑(Aharoni et al.，1998)。它也可結(jié)合多種主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類分子并阻止它們結(jié)合到具有特異性抗原識(shí)別特性的T細(xì)胞(Fridkis-Hareliet al.，1998)。嚙齒動(dòng)物中Cop-1誘導(dǎo)抑制致腦炎T細(xì)胞的調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)在嚙齒動(dòng)物中過繼轉(zhuǎn)移這種T細(xì)胞可阻止MBP(Aharoniet al.，1993)、PLP(Teitelbaum et al.，1996)、或全脊髓勻漿(Aharoni et al.，1997)誘導(dǎo)的EAE發(fā)展。
因此，不同于MBP和其它髓鞘相關(guān)蛋白免疫，Cop 1免疫不誘導(dǎo)EAE，并且缺乏佐劑的Cop 1誘導(dǎo)的T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)特性。損傷后立即免疫接種含Cop 1的IFA，兩天后再加強(qiáng)一次，產(chǎn)生強(qiáng)烈的神經(jīng)保護(hù)作用。這種免疫可能在大約一周內(nèi)達(dá)到其細(xì)胞應(yīng)答的頂峰，但可以合理假設(shè)即使在這之前CNS中的T細(xì)胞數(shù)目將明顯大到足以發(fā)揮至少一些神經(jīng)保護(hù)活性。已知在MBP免疫后，EAE癥狀在10天后出現(xiàn)，表明到那時(shí)免疫應(yīng)答強(qiáng)到足以使致腦炎T細(xì)胞積聚于損傷位點(diǎn)，造成破壞，并產(chǎn)生EAE癥狀。本研究提示，用含Cop 1的IFA免疫，并在兩天后加強(qiáng)后，視神經(jīng)的免疫應(yīng)答足以阻止繼發(fā)性退化。相對(duì)于被動(dòng)轉(zhuǎn)移T細(xì)胞所獲得的應(yīng)答，這種應(yīng)答可能有一定程度的延遲，但它仍在逃過原發(fā)性損傷的神經(jīng)纖維保護(hù)所需的時(shí)間窗內(nèi)。先前對(duì)大鼠視神經(jīng)的研究已經(jīng)表明，在輕度擠壓損傷后一周，由繼發(fā)性退化導(dǎo)致的神經(jīng)元損失大約是25％，損傷后兩周大約是55％(Yoles，1998)。因而，即使應(yīng)答需要一周達(dá)到所需強(qiáng)度，那時(shí)仍有神經(jīng)纖維需要保護(hù)。比較過繼轉(zhuǎn)移活化的Cop 1反應(yīng)性T細(xì)胞和Cop 1主動(dòng)免疫所得的結(jié)果，提示在達(dá)到最大有效需要的時(shí)間內(nèi)兩種治療間沒有顯著性差異，因?yàn)槎咦柚估^發(fā)性退化的程度幾乎相同。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，Cop 1在此處表現(xiàn)出與其已知作用相反的作用；已知Cop 1是一種設(shè)計(jì)用于抑制T細(xì)胞自身免疫的藥物，然而此處它具有的作用要求活化特異性抗髓鞘T細(xì)胞自身免疫。
總之，早期研究已經(jīng)表明大鼠CNS軸突損傷誘導(dǎo)對(duì)抗髓鞘蛋白的自身免疫性T細(xì)胞應(yīng)答，但這太弱不能阻止神經(jīng)纖維的繼發(fā)性退化。本研究中通過使用被CNS交叉識(shí)別但無致腦炎性的共聚物，達(dá)到加強(qiáng)這種免疫應(yīng)答而不伴隨自身免疫病的危險(xiǎn)。對(duì)該共聚物的T細(xì)胞免疫應(yīng)答通過損傷時(shí)的被動(dòng)轉(zhuǎn)移或免疫接種獲得，它提供創(chuàng)傷后維持的有效方法。此處證明的T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用可用于慢性和急性CNS神經(jīng)損傷，其中神經(jīng)元易于退化并需要神經(jīng)保護(hù)。它也可用于防止谷氨酸毒性引起的原發(fā)性和繼發(fā)性退化。T細(xì)胞依賴的免疫性神經(jīng)保護(hù)通過被動(dòng)或主動(dòng)Cop-1免疫獲得，此處結(jié)果也表明它可有效治療小鼠和大鼠中慢性高IOP模型中的谷氨酸誘導(dǎo)的毒性。
作為本研究結(jié)果，實(shí)施例3表明被動(dòng)和主動(dòng)Cop-1免疫都提供對(duì)谷氨酸毒性的有效神經(jīng)保護(hù)，可將接種開發(fā)為一種降低谷氨酸相關(guān)神經(jīng)元毒性的方法。這些觀察有許多有趣的提示(i)作為一種自身免疫病多發(fā)性硬化癥患者的免疫抑制藥，Cop-1可有效作為對(duì)抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的接種；(ii)局部應(yīng)激信號(hào)引起的CNS神經(jīng)元損失可從系統(tǒng)性免疫操作中受益；(iii)同樣的神經(jīng)元，在此情況下是RGC，無論破壞的性質(zhì)和位點(diǎn)，都可從系統(tǒng)性免疫應(yīng)答中受益，盡管該應(yīng)答的抗原特異性可以變化；(iv)盡管明顯不依賴于破壞類型(機(jī)械或生化)，Cop-1的有益活性顯示關(guān)鍵依賴于破壞活化的死亡機(jī)理。實(shí)施例3中，誘導(dǎo)的免疫活性保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗谷氨酸引起的死亡，但不對(duì)抗NMDA引起的死亡；(v)作為一種免疫原，Cop-1可誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)，其機(jī)制不必需要髓鞘蛋白的交叉識(shí)別。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)在抗繼發(fā)性退化的免疫神經(jīng)保護(hù)和自身免疫病的免疫治療之間有重要區(qū)別。前者要求有益T細(xì)胞的主動(dòng)參與，而后者可受益于致腦炎性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)或其抑制。作為一種免疫原，Cop-1在兩種目的中都起作用神經(jīng)元破壞的神經(jīng)保護(hù)作用和自身免疫病治療。可假定其通過誘導(dǎo)“安全”的T細(xì)胞應(yīng)答來完成，一方面它提供神經(jīng)保護(hù)需要的有益的自身免疫性T細(xì)胞應(yīng)答(Moalem et al.，1999a；Moalem et al.，1999b；Kipnis et al.，2000a；Moalem et al.，2000c；and Schwartz et al.，1999)，另一方面該免疫調(diào)節(jié)需要避免自身免疫病(Neuhaus et al.，2000)。
本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中表明，在部分?jǐn)D壓視神經(jīng)的大鼠模型中(Moalemet al.，1999；and Schwartz et al.，1999)和脊髓挫傷中(Haubenet al.，2000a)MBP反應(yīng)性T細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室以前的發(fā)現(xiàn)證明在Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞和CNS髓鞘成分間有體內(nèi)交叉識(shí)別(Kipnis et al.，2000a)。本發(fā)明人建議，通過引發(fā)T細(xì)胞重新活化并因此引起T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成保護(hù)表型，這種識(shí)別可能代表一種可能機(jī)制，解釋軸突損傷后的T細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)。本發(fā)明人進(jìn)一步表明，像MBP反應(yīng)性T細(xì)胞一樣(Moalem et al.，2000)，當(dāng)Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞(實(shí)施例1和2；Kipnis et al.，2000a)被其特異性抗原活化時(shí)分泌顯著量的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，即一種在神經(jīng)元存活中起主要作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Sendtner et al.，1992 and Yan et al.，1992)。實(shí)施例1中，本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)了白質(zhì)物理創(chuàng)傷后T細(xì)胞對(duì)Cop-1的免疫，其中抗Cop-1 T細(xì)胞可與暴露的髓鞘蛋白表位交叉反應(yīng)。實(shí)施例3中本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，Cop-1免疫可以對(duì)抗谷氨酸毒性，在沒有髓鞘抗原可能參與的條件下這直接影響神經(jīng)元細(xì)胞體，這暗示由于其異源性，抗Cop-1 T細(xì)胞可應(yīng)答多種抗原，其中包括與視網(wǎng)膜相關(guān)的抗原。Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞可直接與谷氨酸自身相互作用。這種相互作用可將Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞、或內(nèi)源性T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｗo(hù)性表型。
Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞可能與玻璃體內(nèi)注射的谷氨酸或視網(wǎng)膜內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的細(xì)胞相互作用，谷氨酸注射后24小時(shí)在玻璃體內(nèi)觀察到大量侵入的淋巴細(xì)胞支持這種可能性。注射Cop-1的小鼠中，侵入的淋巴細(xì)胞可能包括一些對(duì)Cop-1特異的細(xì)胞。結(jié)合Cop-1反應(yīng)性T細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)移與Cop-1主動(dòng)免疫有相似作用的發(fā)現(xiàn)，本觀察結(jié)果提示接種作用實(shí)際上由T細(xì)胞介導(dǎo)，而不是體液免疫或Cop-1本身。作為繼發(fā)性退化的載體，因?yàn)楣劝彼嵩谠l(fā)性攻擊一段距離處及時(shí)出現(xiàn)(Yoles et al.，1998)，在直接谷氨酸毒性中24小時(shí)治療窗可能意味著在CNS創(chuàng)傷情況下Cop-1治療窗大大加寬。有趣的是要注意當(dāng)由NMDA誘導(dǎo)毒性攻擊時(shí)，Cop-1沒有保護(hù)作用。這與本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的研究相一致，其中顯示NMDA導(dǎo)致幾乎立即的死亡信號(hào)，而沒有凋亡的明顯跡象。并且除了NMDA受體拮抗劑外也沒有明顯的治療機(jī)會(huì)。因此Cop-1免疫對(duì)NMDA誘導(dǎo)毒性無效不讓人驚奇。Cop-1活化作為神經(jīng)保護(hù)劑而非抑制劑是否依賴于其給藥途徑仍有待確認(rèn)。對(duì)CNS抗原特異的T細(xì)胞、或?qū)徊娣磻?yīng)性抗原如Cop-1特異的T細(xì)胞局部積聚如何介導(dǎo)CNS攻擊后的神經(jīng)保護(hù)也還未知。
實(shí)施例3中的研究中證明的T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用有可能用于這種CNS神經(jīng)的急性和慢性損傷，其中神經(jīng)元容易退化并且可進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)(Schwartz et al.，2000a；Schwartz et al.，2000b；Dobleet al.，1999；和Grunblatt et al.，2000)。慢性疾病青光眼經(jīng)常伴隨IOP，并且是失明的主要原因。然而經(jīng)常看到即使IOP保持在正常范圍內(nèi)疾病仍可繼續(xù)發(fā)展，這提示機(jī)械壓縮可能不是視神經(jīng)破壞的唯一原因，因此除降低眼內(nèi)壓外，治療也應(yīng)包括神經(jīng)保護(hù)性治療(綜述見Osborne et al.，1999；Schwartz et al.，2000c；和Weinrebet al.，1999)。例如最近研究表明，大鼠眼內(nèi)壓升高模型中，谷氨酸拮抗劑(Chaudhary et al.，1998)或一氧化氮合酶抑制劑(Neufeldet al.，1999)處理減弱視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡。然而，盡管在病變位點(diǎn)可能有益，但這些藥劑對(duì)生理反應(yīng)的干擾可能對(duì)正常組織有害，導(dǎo)致不期望的副作用。因此從臨床觀點(diǎn)來看，更好的方法是利用并增強(qiáng)組織自身的防御機(jī)制。
從臨床觀點(diǎn)來看，即使當(dāng)壓力仍保持很高時(shí)也能獲得神經(jīng)保護(hù)的本發(fā)現(xiàn)潛在有很大優(yōu)點(diǎn)。這是因?yàn)榧词箟毫档秸Ｋ?，?duì)于青光眼患者來說也不一定安全，其中殘存的神經(jīng)元比正常神經(jīng)元更敏感(Agis，2000)。進(jìn)一步，將IOP降到這些患者可能認(rèn)為安全的水平，即12mmHg，不一定可行。
此處已完全描述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明精神和范圍以及無不當(dāng)實(shí)驗(yàn)的情況下，在寬范圍的等價(jià)參數(shù)、濃度和條件內(nèi)可同樣進(jìn)行。
與此處具體實(shí)施方案相聯(lián)系本發(fā)明已經(jīng)描述，同時(shí)應(yīng)該明白它可以進(jìn)一步修改。本申請(qǐng)意味著覆蓋本發(fā)明的任何變化、用途或改編，一般地，在遵循本發(fā)明原理的情況下并包括那些偏離于本公開的，如本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的、已知或常規(guī)實(shí)踐所包括的，以及附屬權(quán)利要求范圍內(nèi)、前已闡明的基本特征所適用的內(nèi)容，這些都在本申請(qǐng)范圍內(nèi)。
此處引用的所有參考文獻(xiàn)，包括期刊論文或摘要、公開或相應(yīng)的美國或外國專利申請(qǐng)、授權(quán)的美國或外國專利、或任何其它參考文獻(xiàn)，都全部在此引作參考，包括引用參考文獻(xiàn)中出現(xiàn)的所有數(shù)據(jù)、表、圖和文本。另外，此處引用參考文獻(xiàn)所引用的參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也全部在此引作參考。
對(duì)已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的參考無論如何都不是承認(rèn)，本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨冈谙嚓P(guān)領(lǐng)域的公開、傳授或暗示。
前面對(duì)具體實(shí)施方案的描述將完全披露本發(fā)明的一般性質(zhì)，由此通過應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的知識(shí)，其他人很容易修改和/或改編該具體實(shí)施方案供多種應(yīng)用，而不需不當(dāng)試驗(yàn)、也不需偏離本發(fā)明的一般概念。因此，基于此處給出的原理和指導(dǎo)，這種改變和修改意味著在所公開實(shí)施方案等價(jià)的意思和范圍內(nèi)。應(yīng)該明白此處術(shù)語和名詞的目的是描述而不是限制，因此本說明書中的的術(shù)語和名詞應(yīng)根據(jù)此處給出的原理和指導(dǎo)，并結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)，由技術(shù)人員來解釋。
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序列表<110>M.埃斯森巴奇-施瓦爾茨E.約勒斯J.基普尼斯<120>共聚物1和相關(guān)肽和多肽及其處理過的T細(xì)胞在神經(jīng)保護(hù)性治療中的用途<130>EIS-SCHWARTZ18 PCT<150>06/209，799<151>2000-06-07<150>09/620，216<151>2000-07-20<160>33<170>人工序列合成構(gòu)建體<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>1Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>2Ala Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>3Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>4Ala Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>5<211>15<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>5Ala Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>6Lys Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>7Ala Glu Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>8<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>8Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>9<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>9Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>10<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>10Ala Ala Lys Tyr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>11Ala Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>12Glu Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>13<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>13Glu Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>14<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>14Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>15<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>15Ala Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>16<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>16Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>17<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>17Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>18<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>18Ala Lys Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>19<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>19Ala Glu Ala Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>20<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>20Lys Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>21<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>21Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>22<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>22Ala Ala Glu Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>23<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>23Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>24<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>24Ala Ala Lys Tyr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>25<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>25Ala Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>26<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>26Glu Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>27<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>27Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>28<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>28Ala Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>29<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>29Ala Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>30<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>30Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>31<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>31Ala Tyr Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>32<211>15<212>PRT<213>人工序列合成構(gòu)建體<400>32Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala1 5 10 15<210>33<211>22<212>PRT<213>人<400>33Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Gly His Pro Ile Arg Ala Leu Val1 5 10 15Gly Asp Glu Ala Glu Leu20
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞避免谷氨酸毒性的方法，包括向有需要的個(gè)體給予有效量的(a)已用Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽活化的活化T細(xì)胞；或(b)Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)有需要的個(gè)體在從CNS切除腫瘤后或CNS手術(shù)后進(jìn)行術(shù)后治療以保護(hù)CNS細(xì)胞避免谷氨酸毒性。
3.一種治療由谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病的方法，包括向具有由谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病的個(gè)體給予有效量的(a)已用Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽活化的活化T細(xì)胞；或(b)Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述損傷或疾病包括脊髓損傷、鈍器傷、穿透性創(chuàng)傷、出血性中風(fēng)、或缺血性中風(fēng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述損傷或疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病、老年癡呆、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、面神經(jīng)(Bell’s)麻痹、青光眼、亨亭頓舞蹈癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、持續(xù)癲癇、非動(dòng)脈炎性視神經(jīng)病、或維生素缺乏。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述損傷或疾病是癲癇癥、健忘癥、焦慮、痛覺過敏、精神病、癲癇發(fā)作、氧化應(yīng)激、或阿片耐受和依賴。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述損傷或疾病與眼內(nèi)壓異常升高有關(guān)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述損傷或疾病是自身免疫病以外的疾病。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其中所述給藥步驟包括向所述個(gè)體給予有效量的活化T細(xì)胞，這些細(xì)胞已用Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽活化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述NS特異性活化T細(xì)胞是自體T細(xì)胞、或來自有親緣關(guān)系的供體的異體T細(xì)胞、或HLA匹配或部分匹配的、半異體或全異體供體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述T細(xì)胞是已被保存的自體T細(xì)胞或來源于自體CNS細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述T細(xì)胞是半異體T細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其中所述給藥步驟包括向所述有需要的個(gè)體給予有效量的Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽是Cop 1。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽是Cop 1相關(guān)肽或多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽是以促進(jìn)個(gè)體主動(dòng)免疫從而建立臨界T細(xì)胞應(yīng)答的方式給藥。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其中所述Cop 1相關(guān)肽或多肽是一種無規(guī)共聚物，它與髓鞘堿性蛋白(MBP)有功能性交叉反應(yīng)并可以在抗原呈遞中與MBP競爭MHC II類分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述無規(guī)共聚物含有一種氨基酸，它選自以下各組中至少3組中的每一組(a)賴氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；和(d)酪氨酸和色氨酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述無規(guī)共聚物含有四種不同的氨基酸，每種選自組(a)到(d)的不同一組。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述四種不同氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述無規(guī)共聚物包含三種不同的氨基酸，每種選自(a)到(d)的三組中的不同一組。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述無規(guī)共聚物包含酪氨酸、丙氨酸和賴氨酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述無規(guī)共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和賴氨酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述無規(guī)共聚物包含賴氨酸、谷氨酸和丙氨酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述無規(guī)共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸。
26.保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞避免谷氨酸毒性或治療由谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病的一種藥物組合物，其中含有有效量的Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽和可藥用載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物組合物，其中含有有效量的Cop 1。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物組合物，其中含有有效量的Cop 1相關(guān)肽或多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的藥物組合物，其中所述Cop 1相關(guān)肽或多肽是一種無規(guī)共聚物，它與髓鞘堿性蛋白(MBP)有功能性交叉反應(yīng)并可以在抗原呈遞中與MBP競爭MHC II類分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物含有一種氨基酸，它選自以下各組中至少3組中的每一組(a)賴氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；和(d)酪氨酸和色氨酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物包含四種不同的氨基酸，每種選自組(a)到(d)的不同一組。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述四種不同氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物包含三種不同的氨基酸，每種選自(a)到(d)的三組中的不同一組。
34.根據(jù)權(quán)利要求31或33的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物包含酪氨酸、丙氨酸和賴氨酸。
35.根據(jù)權(quán)利要求31或33的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和賴氨酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求31或33的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物包含賴氨酸、谷氨酸和丙氨酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求31或33的藥物組合物，其中所述無規(guī)共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸。
38.Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽在制備用于保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞避免谷氨酸毒性的藥物中的用途。
39.Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞避免谷氨酸毒性中的用途。
40.Cop 1或Cop 1相關(guān)肽或多肽在治療由谷氨酸毒性引起或加劇的損傷或疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供治療中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過給予活化T細(xì)胞來起到治療作用，該T細(xì)胞可以識(shí)別Cop1或Cop1相關(guān)肽或多肽抗原，促進(jìn)神經(jīng)再生、或防止或抑制神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元退化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療包括給予Cop1或Cop1相關(guān)肽或多肽，以促進(jìn)神經(jīng)再生、或防止或抑制神經(jīng)系統(tǒng)中，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元退化?；罨疶細(xì)胞已由Cop1或Cop1相關(guān)肽或多肽的存在而被活化，它可以單獨(dú)給藥或與Cop1或Cop1相關(guān)肽或多肽組合一起給藥。
文檔編號(hào)A61P25/18GK1462190SQ01806591
公開日2003年12月17日 申請(qǐng)日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月7日
發(fā)明者M·埃斯森巴奇-施瓦爾茨, E·約勒斯, J·基普尼斯 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司