專利名稱：鯊魚肉提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于從鯊魚的肉中提取的一種提取物，以及它對(duì)血管生成的阻礙或抑制作用。特別是，這項(xiàng)發(fā)明是關(guān)于一種從鯊魚的肉中提取的一種提取物，這種提取物是運(yùn)用溶媒提取法，隨后通過除去溶媒來獲得能作為血管生成抑制劑的一種油。
背景說明很久以來，各種各樣鯊魚產(chǎn)品被認(rèn)為對(duì)預(yù)防或治療某些疾病具有功效。特別是鯊魚軟骨粉已被嘗試用來預(yù)防或控制某些癌癥。
血管生成(新血管的生成)對(duì)惡性腫瘤的生存及生長非常重要。這些腫瘤與正常生長或器官相比具有較高的新陳代謝率，因此它們需要更多的血液來滿足獲取更多養(yǎng)份的需求。于是抑制血管生成成為控制或預(yù)防腫瘤生長的一種機(jī)制。
鯊魚軟骨已經(jīng)顯示出抑制血管生成的作用。然而目前的問題是在其使用方面上。為了達(dá)到預(yù)防或治療癌癥的目的，須服用大劑量的鯊魚軟骨粉。所需劑量被認(rèn)為以每1公斤體重至少1克鯊魚軟骨粉的比例服用。而且鯊魚軟骨有一種令人難以接受的氣味和味道。
從鯊魚肝臟中提取的油也已被報(bào)道能減緩癌癥生長?？拱┳饔靡苍S要?dú)w功于鯊魚肝油中的烷基甘油。烷基甘油也存在于牛奶，血液以及免疫系統(tǒng)器官中，如肝臟、脾臟、骨髓和淋巴組織。
鯊魚肝油也被認(rèn)為含有角鯊胺(Squalamine)化合物。動(dòng)物試驗(yàn)報(bào)告顯示角鯊胺能使腫瘤喪失發(fā)展自身血液供給的能力。因此認(rèn)為，鯊魚肝油中所含有的角鯊胺或許對(duì)治療和預(yù)防某些癌癥有作用。
中國專利申請?zhí)朇N01174036A中描述了一種經(jīng)過脫水，冷凍及粉碎等工序處理后的鯊魚肉。據(jù)報(bào)告這種經(jīng)過加工后的肉能預(yù)防癌癥。在專利中沒有對(duì)從肉中獲得提取物這個(gè)過程的描述，也沒有任何血管生成抑制作用的描述。
上述鯊魚產(chǎn)品的缺點(diǎn)是比血管生成抑制活力低，因此必需攝取大劑量的產(chǎn)品。而鯊魚軟骨和器官，例如鯊魚肝臟是價(jià)格相對(duì)來說較昂貴的原材料。
加拿大專利申請?zhí)?,201,025描述了一種含有從多種原料，包括鯊魚肉中提取的物質(zhì)的藥。該藥被描述為對(duì)如丙肝等疾病具有治療作用。沒有任何顯示表明該藥劑具有抑制血管生成的能力，或是對(duì)任何與新生血管有關(guān)的疾病或失調(diào)有效。此外，這種藥劑中所含有的從鯊魚的肉中提取出的物質(zhì)，經(jīng)過了將肉烘干，加熱除去油，然后碾碎肉的工藝過程。文件中沒有提到碾碎的鯊魚肉的構(gòu)成，或什么化合物在加熱過程中被除去的信息。
本項(xiàng)發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)通過溶媒提取法從鯊魚肉中得到的該提取物是一種驚人有效的血管生成抑制物，從而成為一種治療與血管生成相關(guān)的一些疾病或失調(diào)的潛在試劑。
因此本項(xiàng)發(fā)明的目的是為了提供一種從鯊魚肉中經(jīng)溶媒提取法所得到的血管生成抑制物，或至少是提供了一種有效抑制血管生成的替代品。
發(fā)明描述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了從鯊魚肉中提取的，在動(dòng)物身上具有血管生成抑制作用的一種提取物。
本項(xiàng)發(fā)明中的提取物以含有磷脂作為主要成份較為理想。磷脂的最佳含量為提取物重量的20％-40％。典型的磷脂是磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine-PE)和磷酯酰膽堿(phosphatidylcholine-PC)。
進(jìn)一步而言，磷脂脂肪酸最好含有高濃度的DHA(二十二碳六烯酸)，例如DHA為脂肪酸總重量的20-25％。
而且提取物中甘油三酯(triglycerides)的含量小于10％較為適宜。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了從鯊魚肉中提取具有血管生成抑制作用的提取物的方法，包括-使來自一只或多只鯊魚的肉與一種溶媒接觸足夠長的時(shí)間，從而從肉中提取一種或多種物質(zhì)到溶液中，-將肉與溶液分離，和-將溶媒從溶液中除去，從而得到作為血管生成抑制物的提取物。
任何適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶媒或超臨界的CO2也許會(huì)用到。最適宜的溶媒是乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、或是上述溶劑的混合物。
在本項(xiàng)發(fā)明的具體實(shí)施中，鯊魚肉在與溶劑混合前先被冷凍干燥，或被風(fēng)干。
可以使用能將提取液與肉分離的任何方法，然而最好通過過濾法來分離。
可以使用任何種類的鯊魚肉作為原料。然而，最好是選用以下的一種或多種鯊魚的肉斑點(diǎn)星鯊(rig)(檸檬魚lemonfish)，學(xué)鯊(school shark)，魔鬼鯊(ghost shark)，鯖鯊，藍(lán)鯊，象鯊(elephant shark)，鼠鯊和黑尖礁鯊。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種含有從至少一種鯊魚的肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物及其適當(dāng)載體的制藥學(xué)成份。
本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了從鯊魚肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物在針對(duì)某些疾病或失調(diào)的藥劑制造方面的作用。這些疾病或失調(diào)包括癌癥，視網(wǎng)膜病，炎癥，以及關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了運(yùn)用從鯊魚肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物在動(dòng)物身上治療或預(yù)防某些疾病或失調(diào)的方法。這些疾病或失調(diào)包括癌癥，視網(wǎng)膜病，炎癥，以及關(guān)節(jié)炎。盡管發(fā)明中提到了各種各樣的動(dòng)物，但最理想的動(dòng)物是人類。
詳細(xì)說明在這里所說的“鯊魚肉”是指任何部位的鯊魚肉，為了避免疑慮，它將不會(huì)含有任何鯊魚的內(nèi)部器官。
在周圍環(huán)境溫度大約為15-25℃時(shí)，本項(xiàng)發(fā)明中提取物是一種油或油狀物質(zhì)，如糊狀物質(zhì)。在這里所提及的“油”，也包括那些油狀和糊狀特征的物質(zhì)。
這個(gè)提取物的主要成份為磷脂，如磷脂酰乙醇胺(PE)和磷酯酰膽堿(PC)。磷脂的含量通常在重量的20-40％的范圍內(nèi)。
磷脂脂肪酸通常含有二十二碳六烯酸(DHA)，花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)等。與其他產(chǎn)品和魚類提取物不同的是本項(xiàng)發(fā)明的提取物，其脂肪酸組成中含有高濃度(總重量的20-35％)的DHA。從下表可看出，一個(gè)DHA的樣品被發(fā)現(xiàn)是一種強(qiáng)有力的血管生成抑制物。由于本項(xiàng)發(fā)明的提取物含有高濃度的DHA，因此推測DHA是這個(gè)提取物中使其具有抑制血管生成特性的有效成份之一。
一般名 構(gòu)造 樣品濃度 血管生成抑制率一價(jià)不飽和脂肪酸肉豆蔻烯酸 14∶1(n-5) 10μg/ml 58％十六碳烯酸 16∶1(n-7) 5μg/ml 70％十七碳烯酸 17∶1(n-7) 20μg/ml 83％油酸 18∶1(n-9) 100μg/ml0％傘形花子油酸 18∶1(n-12)100μg/ml58％順芥子酸 22∶1(n-9) 200μg/ml30％神經(jīng)酸 24∶1(n-9) 100μg/ml0％
多價(jià)不飽和脂肪酸亞油酸 18∶2(n-6)5μg/ml 82％α-亞油酸 18∶3(n-3)20μg/ml66％花生四烯酸 20∶4(n-6)5μg/ml 84％二十碳五烯酸(EPA) 20∶5(n-3)3μg/ml 100％二十二碳五烯酸 22∶5(n-3)4μg/ml 71％二十二碳六烯酸(DHA)22∶6(n-3)5μg/ml 88％強(qiáng)力抑制劑(濃度為5μg/ml，抑制率大于80％)20∶5，22∶6，20∶4，18∶2優(yōu)良抑制劑(濃度為10μg/ml，抑制率大于90％)22∶5，16∶1中等抑制劑(濃度為20μg/ml，抑制率小于90％)18∶3，17∶1，14∶1無效抑制劑(濃度為100μg/ml，抑制率小于60％)18∶1，22∶1，24∶1本項(xiàng)發(fā)明中的提取物也與其他魚類提取物和產(chǎn)品截然不同，因?yàn)樗母视腿舛润@人地低(重量上小于10％)。
運(yùn)用典型的提取法，一種或多種鯊魚的肉片在經(jīng)過混合，風(fēng)干，及與乙醇之類的溶媒混合的工序后，其體積會(huì)縮小。通常，混合物在室溫下攪拌1-24個(gè)小時(shí)。隨后通過過濾方法將提取液與肉分離。肉片與溶媒混合的工序可以隨意重復(fù)進(jìn)行。然后通過蒸發(fā)脫水法除去溶媒，得到油狀的鯊魚肉提取物。這種油通常含有各種游離型脂肪酸和甘油結(jié)合型脂肪酸。
接下來的實(shí)施例1中描述了二氯甲烷和乙醇的作用。在這里乙醇被預(yù)期為一種理想的溶媒。
實(shí)施例2中描述了鯊魚肉中脂肪酸的組成。除了脂肪酸以外，預(yù)期或許還有其他成份對(duì)鯊魚肉油的抑制血管生成活性起到作用。
實(shí)施例3描述了從被風(fēng)干的藍(lán)鯊(Blue Shark)肉中得到油的提取法。被風(fēng)干的鯊魚粉分別采用乙醇(EtOH)和乙酸乙酯(EtOAc)作為溶媒進(jìn)行提取。這兩種方法所得到油的提取率具有驚人的差異(乙醇13.7％，乙酸乙酯1.6％)。盡管運(yùn)用乙酸乙酯的提取法的提取率較低，但其提取物所具有的獨(dú)特血管生成抑制活性卻較高，這顯示這種提取物含有濃度較高的血管生成抑制性化合物。
從實(shí)施例3的生物試驗(yàn)中可以看出，鯊魚肉油是一種比鯊魚軟骨，鯊魚軟骨提取物，或其他魚油更有效的血管生成抑制物。
這3種方法中得到的油的脂肪酸成份及磷脂成份分別通過氣相色譜分析法及31P NMR方法加以分析。薄層色譜分析法(Thin Layer Chromatography，TLC)也被用來定性分析油中所含有的各種脂質(zhì)。鯊魚肉中的無極性脂質(zhì)的含量較低(用TLC法沒有探測到甘油三酯，但磷脂的含量較高(24％EtOH，34％EtOAc)。鯊魚油中脂肪酸(游離型和甘油結(jié)合型)的低含量暗示在這些提取物中存在一種高濃度的，未測定物質(zhì)。
本項(xiàng)發(fā)明中的提取物可以是以本項(xiàng)發(fā)明過程中所得到的物質(zhì)的再生成形式加以使用。然而，此提取物最好是與食用油混合，例如橄欖油，再制成膠囊，口服使用。此外，提取物也可以與固體載體混合，例如環(huán)糊精(cyclodextrin)，制成片狀，顆粒，或粉末。
為了便于口服，顆粒，粉末或其他類似的形狀也可以制成膠囊或與其他物質(zhì)混合，例如食物。也可以考慮將其溶解于某種溶媒中，通過注射法攝取此提取物。而且，額外的成份，例如維他命E，也可以加入配方中。
血管生成與較廣范圍的疾病和失調(diào)有關(guān)。因此本項(xiàng)發(fā)明中的提取物也許對(duì)這些疾病和失調(diào)具有治療或預(yù)防作用。這些疾病和失調(diào)包括癌癥，視網(wǎng)膜癥，炎癥及關(guān)節(jié)炎，但不僅僅局限于這些。
另外，當(dāng)預(yù)期該提取物對(duì)人類的疾病和失調(diào)具有十分有效的治療和預(yù)防作用的同時(shí)，也認(rèn)為其它動(dòng)物可以受益于該提取物的施用。
實(shí)施例接下來的實(shí)施例進(jìn)一步描述了這個(gè)提取物。對(duì)這個(gè)提取物的分析被認(rèn)為不僅僅局限于以下的實(shí)施例。
實(shí)施例1-檸檬魚的提取物1.5公斤檸檬魚通過攪拌機(jī)被切成小塊，并與1.5升二氯甲烷及3升甲醇在一個(gè)5升的圓錐形瓶中攪拌一整夜。經(jīng)過濾將提取液與肉分離。接下來再取1.5升二氯甲烷與肉混合，并攪拌一整夜。隨后，再次通過過濾將提取液與肉分離，并與前一次的濾出液混合。向兩次所得到的總濾出液中加入鹽溶液(0.88％KCL，1.5L)，并經(jīng)振動(dòng)混合?；旌衔锝?jīng)靜置后，分成兩層。處于下方的二氯甲烷層被取出進(jìn)行再加工，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去溶媒，提取出油(12克，提取率為0.8％)。
實(shí)施例2實(shí)施-例1中所提取的油的脂肪酸組成運(yùn)用氣相色譜儀(Gas Chromatography-GC)對(duì)實(shí)施例1中提取的油的脂肪酸組成加以分析。
在分析之前，脂肪酸(游離型脂肪酸和甘油三酸脂)被轉(zhuǎn)換成脂肪酸甲脂(Fatty Acid Methyl Esters-FAMEs)。待分析的油被溶解在乙烷(0.5ml)中，隨后注入含有1％H2SO4甲醇的密封試管中。這個(gè)試管被置于50℃的水槽中一整晚。之后加入甲醇(2ml)和5％氯化鈉水溶液，有機(jī)層(含有FAMEs)被分離出來。接下來用2％碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)溶液(2ml)清洗。
GC分析所采用的儀器是惠普(Hewlett-Packard)5890 GC。這個(gè)儀器帶有一個(gè)體積為30m×0.25m×0.25μm的EC-Wax(Alltech)柱，其注入壓為10psi。
分析過程中，EC-Wax柱在165℃下持續(xù)3分鐘，隨后溫度以每分鐘4℃的升溫速度，上升到195℃，并保持10分鐘。最后，溫度以每分鐘4℃的升溫速度上升到225℃，并保持12分鐘。FAMEs是通過火焰離子檢測器(FID)來進(jìn)行檢測的。峰值(peaks)通過被測油與各種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)及已知的天然油(例如鱈魚肝油)中的脂肪酸在保持時(shí)間上的比較被加以測定。
分析結(jié)果見表1。鯊魚肉油含有高濃度的DHA(二十二碳六烯酸)。
表1鯊魚肉油的脂肪酸組成脂肪酸百分比14∶0 0.216∶0DMA* 3.416∶0 19.916∶1 0.717∶0 0.517∶1 0.118∶0DMA* 0.518∶1DMA* 1.118∶0 9.618∶1 8.218∶2 1.020∶1 0.520∶4 6.020∶5 2.122∶4 n-6 2.922∶5 n-6 1.022∶5 n-3 5.222∶6 n-3 33.3
*二甲縮醛(dimethylacetal)由縮醛磷脂(磷脂)中的乙烯醚類(vinyl ethers)構(gòu)成。
實(shí)施例3-藍(lán)鯊的提取將冷凍的藍(lán)鯊肉切成2厘米厚的肉片，并置于溫度為35℃，壓力小于2毫巴的真空烤爐中。24小時(shí)后，取出肉片，并將其切成更小的肉片，隨后再次置于烤爐中3-4天。通常經(jīng)過風(fēng)干工序后，鯊魚肉的重量會(huì)減少80％。經(jīng)過風(fēng)干后的鯊魚肉先通過手工弄碎，再放入韋林氏攪切器(Waring blender)中加以粉碎，生成干燥粉末和纖維的混合物。
分別采用乙醇和乙酸乙酯作為溶媒，進(jìn)行2次提取試驗(yàn)。
將鯊魚粉(900克)和溶媒(乙醇或乙酸乙酯，4.5L)混合攪拌一整晚。為了攪拌充份，溶媒與鯊魚粉的混合比例需為5∶1。為避免光線照射，容器用鋁箔包起來。混合物通過Shleicher及Schuell 595濾紙進(jìn)行過濾。隨后，將濾渣與3L新的溶媒混合攪拌一整晚，并將所得混合物進(jìn)行過濾。將兩次提取所得的濾出液混合，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去溶媒。
實(shí)施例4-實(shí)施例3中所提取出的油的脂肪酸的組成象實(shí)施例2中所描述的那樣，將每種提取物中的脂肪酸(游離型和結(jié)合型)轉(zhuǎn)換成甲酯(methyl esters)，通過氣相色譜儀加以分析。
用乙醇溶媒提取法從干燥的藍(lán)鯊粉末中所得的提取物具有較高的油提取率(13.7％)。相反，用乙酸乙酯溶媒提取法所得的油的提取率只有1.6％。
表2藍(lán)鯊粉末提取物
用薄層層析顯示提取物中所存在的各種脂質(zhì)的種類。在無極性TLC板上，每一種提取物都只呈現(xiàn)較少含量(膽固醇和微弱的FFA點(diǎn)，沒有跡象顯示含有甘油三酯)。但是分析顯示提取物中極性脂質(zhì)含量高，例如磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酯酰膽堿(PC)，以及鞘磷脂(SM)。
兩種鯊魚提取物在脂肪酸含量及組成上體現(xiàn)出巨大的不同(表3)。運(yùn)用乙酸乙酯作為溶媒的提取物的脂肪酸總含量為30.1％。相比較而言，運(yùn)用乙醇為溶媒的提取物的脂肪酸總含量非常低，只有7.3％。由此可見，加上乙醇溶媒提取法的高提取率，乙醇比乙酸乙酯能提取出更多的非脂質(zhì)物質(zhì)。
兩種提取物的脂肪酸組成非常相似，都含有高濃度的DHA(二十二碳六烯酸)20.0-22.2％，油酸(18∶1)10.0-12.2％，硬脂酸(18∶0)11.2-14.9％，以及棕櫚酸16.1-19.1％。
表3藍(lán)鯊提取物的脂肪酸組成(wt/wt％)脂肪酸 保持時(shí)間(分鐘)乙醇乙酸乙酯16∶0DMA* 9.40 10.14.516∶0 10.07 19.116.116∶1 10.59 2.0 1.718∶0DMA* 13.74 1.4 0.918∶1DMA* 14.24 4.6 2.318∶0 14.85 11.214.918∶1(n-9) 15.53 12.210.018∶1(n-7) 15.74 4.9 4.518∶2(n-6) 17.16 1.220∶1(n-11) 23.45 1.320∶1(n-9) 23.60 1.720∶4(n-6) 27.04 3.6 6.020∶5(n-3) 29.15 5.9 6.722∶5(n-3) 37.53 5.0 4.822∶6(n-3) 39.10 20.022.3脂肪酸總含量 7.3 30.1(％)*二甲縮醛由縮醛磷脂中的乙烯醚類構(gòu)成。
AA ＝花生四烯酸EPA＝二十碳五烯酸DHA＝二十二碳六烯酸實(shí)施例5-實(shí)施例3中油的磷脂構(gòu)成用31P NMR分辨磷脂。六甲基磷酰胺(HMPA)是定量化的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。31P NMR證實(shí)了利用TLC的觀察結(jié)果這種油含有高濃度的磷脂。這種油中磷脂總水平相當(dāng)高(乙醇提取物為24％，乙酸乙酯提取物為34％)。
表4藍(lán)鯊磷脂成分(wt/wt％)
1PC+AAPC2PE+MPE/LPC？Pl＝磷酯酰肌醇SM＝鞘磷脂PE＝磷酯酰乙醇胺MPE＝一甲基磷酯酰乙醇胺LPC＝溶血磷酯酰膽堿DPE＝二甲基磷酯酰乙醇胺AAPC＝烷基?；柞ヵＤ憠APC＝磷酯酰膽堿實(shí)施例6-在試管中的生物鑒定將實(shí)施例1中準(zhǔn)備好的油利用主動(dòng)脈環(huán)作血管生成抑制的試驗(yàn)。方法基于Nicosia和Ottinetti等，Lab Invest.63115-122(1990)和Brown等，Lab Invest.75539-555(1996))描述的方法。先把大鼠的脂肪及血管周的纖維組織去除，然后把主動(dòng)脈切成2mm厚。把0.4毫升纖維凝膠栓(通過將凝血酶加入溶解于MCDB131中的纖維蛋白原培養(yǎng)液制備)放入24-孔培養(yǎng)板。動(dòng)脈環(huán)被放在每一個(gè)孔中央，然后蓋上0.4毫升纖維凝膠栓。每層纖維凝膠栓蓋上1.5毫升的MCDB131，然后放在37度，3％CO2/97％空氣的環(huán)境下加以培養(yǎng)。待測的鯊魚肉提取物被放入培養(yǎng)基中。每種提取物做3次試驗(yàn)。
約5天之后，微血管會(huì)出現(xiàn)在主動(dòng)脈壞的周圍。在5日至14日之間用數(shù)碼相機(jī)通過相差顯微鏡拍下每個(gè)孔的變化。動(dòng)脈環(huán)周圍生長的微血管的每張照片由NIH1.59軟件測定定。在每個(gè)間隔時(shí)間會(huì)計(jì)算出微血管成長率的平均數(shù)值。
與市面上購買到的魚油和其他鯊魚產(chǎn)品相比，鯊魚肉油顯示出更高的血管生成抑制效果，見表5。
表5魚油和其他鯊魚產(chǎn)品的血管生成抑制活性
將實(shí)施例3中每種油(以及運(yùn)用甲醇所提取的油)的等分，采用類似于前述對(duì)實(shí)施例1油所運(yùn)用的大鼠的主動(dòng)脈環(huán)作試驗(yàn)，分析這種油是否具有調(diào)節(jié)血管生成的能力。
每組待測樣本重復(fù)做3次，得出的結(jié)果是來自這3次的平均數(shù)。此外準(zhǔn)備了另一組3個(gè)孔的對(duì)照組，只加入載體。在待測物質(zhì)存在的情況下，測定了相對(duì)于對(duì)照組的新生血管生長速度。下圖為對(duì)運(yùn)用不同的有機(jī)溶媒所提取的不同濃度的油的血管生成抑制率的評(píng)估。
表6利用鯊魚肉提取物抑制血管生成
這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示出乙醇提取物及甲醇提取物在1-3μg/ml濃度下具有很相近的血管生成抑制率，大約為50％。乙酸乙酯提取物在0.2μg/ml下，其血管生成抑制率為50％，是前者的5倍。
將乙醇提取物與橄欖油混合，在主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)中測定對(duì)血管生成的影響。首先，即使高濃度橄欖油都對(duì)血管生成無抑制。事實(shí)上在濃度為200μg/ml下，它甚至略有促進(jìn)血管生成的作用，引起達(dá)33.6％的刺激。
當(dāng)將乙醇提取物與橄欖油以1份提取物對(duì)4份橄欖油(體積/體積)混合，并在15μg/ml(3μg提取物/ml)下測試時(shí)，測得87.5％的抑制。
當(dāng)將乙醇提取物與橄欖油以1份提取物對(duì)9份橄欖油(體積/體積)混合，并在30μg/ml(3μg提取物/ml)下測試時(shí)，測得85.8％的抑制。
當(dāng)將乙醇提取物與β-環(huán)糊精以1份提取物對(duì)6份β-環(huán)糊精(wt/wt)混合，當(dāng)在15μg/ml(2.5μg提取物/ml)的濃度下保溫時(shí)，測得40％的抑制。
實(shí)施例7-體內(nèi)生物試驗(yàn)把鯊魚肉提取物摻入飲用水中，給大鼠飲用。每種提取物被投于飲用水中，濃度為0.166mg/ml。每兩日更換新的含有提取物的飲用水。更換時(shí)觀察其消耗量，確定提取物的劑量。分別對(duì)運(yùn)用乙醇和乙酸乙酯為溶媒的鯊魚肉提取物做了評(píng)估。另外一組的對(duì)照組自由攝取不含有提取物的飲用水。每組含有6只(Sprague-Dawley)大鼠(雌雄各3只)。
投放提取物2星期后，開始誘導(dǎo)血管生成。誘導(dǎo)血管生成方法是向大鼠腹膜內(nèi)注射48/80化合物。一日2次，持續(xù)4.5日，逐漸增加劑量。
(參照Davis，等，Microvasc.Res.，54178-182(1997))注射化合物16日之后，每只大鼠的血管系統(tǒng)用India墨水來染色，而且其腸及相連的腸系膜窗被切除，鋪在載玻片上曬干。拍攝這些載玻片的數(shù)碼照片，計(jì)算出每個(gè)腸系膜窗被微血管占據(jù)的比例。
最后，測定每組的血管生成平均數(shù)，再采用Student t試驗(yàn)來評(píng)估其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在各時(shí)間點(diǎn)測定的大鼠組的體重如表7所示。
表7體重(克)(增長率％)
表7的結(jié)果顯示出兩組攝取鯊魚提取物的大鼠的體重增加率沒有明顯的差異。它們的生長率與對(duì)照組的相近。這個(gè)評(píng)論同時(shí)適用于雄性及雌性大鼠，雄性的基本生長率比雌性大。試驗(yàn)表明添加了鯊魚肉提取物的飼料對(duì)大鼠的生長上並沒有顯著的影響。
計(jì)算相對(duì)于大鼠體重的提取物攝取量。這個(gè)計(jì)算是在測量了大鼠的體重及其對(duì)飲用水的攝取量的基礎(chǔ)上得出的。
表8鯊魚肉脂類的每日劑量(mg/kg體重)
測得最高劑量是在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)。在化合物48/80給藥期間，大鼠對(duì)水的攝取量顯著地減少，顯示提取物的攝取量相對(duì)減少。所以在這個(gè)時(shí)期用量也是最少的。停止注射48/80化合物后，飲用水的攝取量增加，提取物的攝取量也相對(duì)增加了。
測定了上述的腸系膜窗的體內(nèi)血管生成作用，結(jié)果見表9。
乙醇提取物導(dǎo)致在該劑量血管生成被顯著抑制(46％)。比較中，乙酸乙酯提取物導(dǎo)致在大約同樣的劑量僅有21％抑制。這仍然是顯著的。然而，雖然劑量對(duì)于兩種提取物是大致相同的，已知乙酸乙酯提取物在體外主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)中抑制更強(qiáng)。
表9鯊魚肉提取物血管生成抑制率
實(shí)施例8-抗炎癥作用分析為了評(píng)估鯊魚肉的乙醇提取物在急性炎癥方面的作用，將乙醇提取物添加到飲用水中，分別施給6只大鼠(3只雄性，3只雌性)。這是在引發(fā)急性炎癥開始前一周。對(duì)照組沒有攝取這種提取物。提取物在飲用水中的添加量為0.2mg/ml。
炎癥的引發(fā)是通過在每只大鼠的兩只后足跖注射100微升濃度為2.5％λ-角叉膠溶液，誘導(dǎo)炎癥。在注射之前，測量大鼠的左右足跖的體積，注射4個(gè)小時(shí)后再次測量。測定每只后足的體積差值。
提取物的平均消耗量為雄性大鼠4.67mg/天，雌性大鼠3.75mg/天。
對(duì)于攝取通常飲用水(不含提取物)的6只到大鼠(12只足)，其平均足跖腫脹度為54.21％±2.30(SEM)。對(duì)于攝取提取物的6只大鼠(12只足)，其平均足跖腫脹度為47.06％±2.27(SEM)。這表明提取物對(duì)急性炎癥的抑制反應(yīng)為13.19％±0.20(SEM)。因此，表現(xiàn)出提取物的確有抗炎癥的反應(yīng)性。
實(shí)施例9-配方實(shí)施例鯊魚肉提取物與橄欖油混合物-在橄欖油中添加運(yùn)用乙醇為溶媒提取的鯊魚肉提取物及維他命E油。這種混合物(105mg)被加工制成軟明膠膠囊。混合物中含有提取物(10mg)，維他命E油(5mg)，及橄欖油(90mg)。
鯊魚肉提取物與環(huán)糊精混合物-鯊魚肉提取物與β-環(huán)糊精(85mg)及維他命E(0.075mg)混合在一起。這種混合物被進(jìn)一步加工，制成可直接使用的粉末或顆粒。
雖然參照實(shí)施例描述了本發(fā)明，應(yīng)理解在不違背本發(fā)明的范圍的情況下可進(jìn)行改變或修改。另外，當(dāng)對(duì)于特定特征存在已知等價(jià)物時(shí)，那么這些等價(jià)物也如同在本項(xiàng)說明中被詳細(xì)地加以描述。
工業(yè)應(yīng)用性本項(xiàng)發(fā)明提取物是一種血管生成抑制劑。血管生成與各種各樣的疾病或失調(diào)有關(guān)。因此抑制血管生成也許是預(yù)防或治療這些疾病或失調(diào)的一種方法。這些疾病或失調(diào)包括癌癥、視網(wǎng)膜病、炎癥以及關(guān)節(jié)炎。因此，本發(fā)明的提取物至少對(duì)這些疾病的治療有幫助。
權(quán)利要求
1.一種從鯊魚肉獲得的提取物，其特征在于，該提取物能抑制動(dòng)物的血管生成。
2.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，該提取物具有總提取物重量20-40％含量的磷脂。
3.如權(quán)利要求1或2所述的提取物，其特征在于，該磷脂脂肪酸內(nèi)容物含有20-35％重量的二十二碳六烯酸。
4.如前任一權(quán)利要求所述的提取物，其特征在于，該提取物具有小于總提取物10％重量的甘油三酯含量。
5.如前任一權(quán)利要求所述的提取物，其特征在于，該鯊魚肉是從下列任一獲得的檸檬魚、學(xué)鯊、斑點(diǎn)星鯊、魔鬼鯊、鯖鯊、藍(lán)鯊、象鯊、鼠鯊和黑尖礁鯊。
6.一種從鯊魚肉獲得血管生成抑制性提取物的方法，其特征在于，該方法包括-使來自一種或多種鯊魚的肉與溶劑接觸足夠的時(shí)間，使得從肉提取出一種或多種物質(zhì)到溶液中，-將肉與溶液分開，和-從溶液中除去溶劑，獲得作為血管生成抑制劑的提取物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶劑是有機(jī)溶劑或超臨界CO2。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷或任何這些溶劑的混合物。
9.如權(quán)利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述鯊魚肉在接觸溶劑前風(fēng)干或凍干。
10.如權(quán)利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述肉與溶液通過過濾分離。
11.如權(quán)利要求6-10任一所述的方法，其特征在于，該鯊魚肉是從下列任一獲得的檸檬魚、學(xué)鯊、斑點(diǎn)星鯊、魔鬼鯊、鯖鯊、藍(lán)鯊、象鯊、鼠鯊和黑尖礁鯊。
12.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有從至少一種鯊魚的肉獲得的血管生成抑制性提取物和合適的載體。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述組合物是提取物在食用油中的溶液或懸液。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述油是橄欖油。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，該組合物是提取物和環(huán)糊精的混合物。
16.鯊魚肉的血管生成抑制性提取物的用途，其特征在于，用于制造治療或預(yù)防疾病或紊亂的藥物。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述疾病包括癌癥、視網(wǎng)膜病變、炎癥和關(guān)節(jié)炎。
18.一種使用鯊魚肉獲得的血管生成抑制性提取物治療或預(yù)防動(dòng)物中的疾病或紊亂的方法。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述疾病包括癌癥、視網(wǎng)膜病變、炎癥和關(guān)節(jié)炎。
20.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，該方法參照本文所述的任何實(shí)施例。
21.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該方法參照本文所述的任何實(shí)施例。
22.一種藥物組合物，其特征在于，它含有根據(jù)配方實(shí)施例的權(quán)利要求1所述的提取物。
23.基本如本文所述的權(quán)利要求16所述的用途。
24.基本如本文所述的權(quán)利要求18所述的方法。
全文摘要
從鯊魚的肉中提取的，在動(dòng)物身上具有血管生成抑制作用的一種提取物。一種包括將鯊魚肉與一種溶媒混合；然后將所得的溶液與鯊魚肉分離；接下來除去溶媒，并提取出具有血管生成抑制作用的提取物等工序的一種工藝流程。這種提取物對(duì)與血管生成有關(guān)的疾病，如癌癥，視網(wǎng)膜病，炎癥，以及關(guān)節(jié)炎的治療作用。
文檔編號(hào)A61P19/02GK1477966SQ01819923
公開日2004年2月25日 申請日期2001年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月20日
發(fā)明者P·F·戴維斯, A·D·麥克肯齊, P F 戴維斯, 麥克肯齊 申請人:工業(yè)研究有限公司, 奧它古大學(xué)