專利名稱：使用有機(jī)溶劑制備的軟骨提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從軟骨組織中提取生物活性組分的方法。尤其是，本方法利用了與水結(jié)合的有機(jī)溶劑，或未與水結(jié)合的有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑在損失其它活性組分的情況下，選擇性地提取出某些活性組分。由此獲得了富含某些蛋白的提取物，或具有某些活性的提取物，可以是抗金屬蛋白酶(稱為抗-MMP-2)活性、抗彈性蛋白酶(稱為抗-PPE)活性，或針對(duì)HUVECs的抗增生活性。
背景技術(shù)：
制備鯊魚(yú)軟骨提取物的方法以及提取物本身在已被國(guó)際申請(qǐng)WO 95/32722，WO 96/23512和WO 97/16197所公開(kāi)。鯊魚(yú)的軟骨提取物已被用來(lái)檢測(cè)抗血管生成(antiangiogenic)、抗溶膠原(anticollagenolytic)、直接的抗腫瘤增生和抗炎活性。
WO 95/32722公開(kāi)了一種制備具有抗血管生成、體外直接抗腫瘤增生和體內(nèi)抗腫瘤活性的鯊魚(yú)軟骨提取物的方法。該制備方法包括將鯊魚(yú)組織混合，在水中將其碎成500μm大小的顆粒；其中的活性組分被抽提至水中；分餾提取物，按順序獲得分子量小于500Kda(0-500餾分)的分子。將液體軟骨提取物在具有額定孔率(nominal porosity)約為1Kda的膜上濃縮，形成了含有分子量小于約500KDa的分子的濃縮液體提取物。該提取物富含分子量為1-500KDa的分子。0-500的餾分進(jìn)一步經(jīng)過(guò)分餾，以形成含有分子量在1-120KDa的抗腫瘤增生分子的多級(jí)提取物。專利WO95/32722并沒(méi)有公開(kāi)回收分子量小于1KDa的組分的特殊過(guò)程。并且，它也沒(méi)有公開(kāi)通過(guò)含有機(jī)溶劑的溶液來(lái)獲得軟骨提取物或其餾分的方法。
國(guó)際申請(qǐng)WO 96/23512公開(kāi)了一種在水溶液中提取任何軟骨來(lái)源的生物活性組分的方法。此外，該出版物還公開(kāi)了和液體鯊魚(yú)軟骨相關(guān)的其它生物活性，例如抗溶膠原和抗炎活性。WO96/23512并沒(méi)有公開(kāi)獲得分子量小于1KDa的組分的方法，也沒(méi)有描述使用含有機(jī)溶劑的溶液的過(guò)程。
國(guó)際申請(qǐng)WO 97/16197公開(kāi)了一種制備富含分子量為0.1-500KDa分子的液態(tài)提取物的方法。盡管該方法會(huì)獲得分子量小于1KDa的組分，但它并沒(méi)有提供獲取分子量特別低的組分的方法。該專利文件也未公開(kāi)任何分離和純化的組分形式。
人們廣泛認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶和新血管形成過(guò)程相關(guān)，促進(jìn)腫瘤初期生長(zhǎng)和形成轉(zhuǎn)移癌(metastases)。相應(yīng)的，具有抗血管生成和/或抗基質(zhì)金屬蛋白酶活性的化合物或制劑被認(rèn)為至少具有下述一種作用抑制新血管形成、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性入侵、抑制轉(zhuǎn)移癌的形成和治療與血管生成相關(guān)的疾病。
由于現(xiàn)在對(duì)鯊魚(yú)軟骨研究興趣的增加，迫切需要有改進(jìn)的方法用于制備、分離、純化以前未知的具有生物活性的組分。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種制備鯊魚(yú)提取物的改進(jìn)方法。
一方面，本發(fā)明提供了一種制備含有生物活性組分的鯊魚(yú)提取物及其餾分的方法，該方法使用了許多條件。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備鯊魚(yú)提取物的方法，該提取物中至少含有抗-MMP、抗-PPE和針對(duì)HUVECs的抗增生活性組分。該方法使用了有機(jī)溶劑。這些溶劑用來(lái)替代純水。相對(duì)于其它組分，這些溶劑允許對(duì)某些可溶性生物活性組分進(jìn)行選擇性富集，而在用純水提取的過(guò)程中，所有的這些其它組分都會(huì)被提取出來(lái)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法將源于鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物的生物活性組分中的0-500分子量的餾分分成兩部分，其中，第一部分含有分子量小于1KDa(0-1餾分)的組分，第二部分含有分子量為1-500KDa(1-500餾分)的組分。
為了將組分的聚集現(xiàn)象減到最小，改善溶解性以及保持穩(wěn)定的溶液形式，可在0-500，0-1和1-500的餾分中加入足夠穩(wěn)定量的蔗糖、或下述一種或幾種合適的穩(wěn)定劑，例如，右旋糖苷(dextran)、FicollTM、果糖、凝膠、葡萄糖、甘氨酸、纖維醇、乳糖、甘露醇和山梨糖醇，也可在制備過(guò)程中的任何步驟加入。此處所提到的餾分、溶液或提取物，用語(yǔ)“含1％w/v的蔗糖”指代含有大約1％w/v蔗糖的單獨(dú)的餾分、溶液或提取物。在0-500、0-1和1-500餾分的生物活性組分具有抗-MMP、抗彈性蛋白酶和抗血管生成活性。溶劑和它們?cè)谒械臐舛葧?huì)影響提取物的性質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種來(lái)源于鯊魚(yú)軟骨的分子量大約為244amu(原子質(zhì)量單位)的組分，在此稱之為AE-986，它具有抗-MMP和抗-腫瘤活性中的至少一種。用來(lái)純化AE-986的材料和方法揭示了該物質(zhì)的某些物化特性，這些特性決定了分離該組分所用的不同的溶劑相和層析系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了一種分離和純化AE-986組分的方法，或分離和純化任何源于鯊魚(yú)的相應(yīng)組分的方法。
本發(fā)明的另一方面提供了一種源于鯊魚(yú)的純化的生物活性化合物，它對(duì)應(yīng)于源于鯊魚(yú)軟骨的分子量為244amu并具有抗-MMP活性的化合物。
另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制MMP酶的方法，該方法包括將可被該酶切割的底物與有效量的一種或多種鯊魚(yú)提取物或餾分相接觸。
本發(fā)明還提供了抑制新血管形成和轉(zhuǎn)移癌形成的方法，該方法包括如下步驟將靶組織與有效量的鯊魚(yú)提取物、溶液、勻漿、懸浮液、餾分諸如0-500、0-1、1-500的餾分，或含1％W/V蔗糖的相同餾分相接觸。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明下面的附圖是本說(shuō)明書(shū)的一部分，用來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明的某些方面。結(jié)合這些圖以及具體實(shí)施方式
的詳述將更有助于理解本發(fā)明。


圖1為在PPE酶實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致50％抑制的不同鯊魚(yú)軟骨提取物的濃度(μg/ml)。已標(biāo)出隨溶劑濃度增加而變化的IC50。
圖2為在MMP-2酶實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致50％抑制的不同鯊魚(yú)軟骨提取物的濃度(μg/ml)。已標(biāo)出隨溶劑濃度增加而變化的IC50。
圖3為在HUVEC酶實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致50％抑制的不同鯊魚(yú)軟骨提取物的濃度(μg/ml)。已標(biāo)出隨溶劑濃度增加而變化的IC50。
圖4表示HPSEC長(zhǎng)度比率和不同溶劑中獲得的提取物的蛋白量之間的關(guān)系。
圖5表示HPSEC矢量角和不同溶劑中獲得的提取物的蛋白量之間的關(guān)系。
發(fā)明詳述生物學(xué)檢測(cè)鯊魚(yú)軟骨提取物、所得的餾分以及AE-986組分的生物特性可通過(guò)下述的至少一種檢測(cè)方法測(cè)得白明膠酶抑制檢測(cè)(GIA)測(cè)定抗-MMP活性的檢測(cè)試驗(yàn)；胚胎血管形成檢驗(yàn)(EVT)測(cè)定抗血管生成活性的檢測(cè)試驗(yàn)；和Lewis肺癌轉(zhuǎn)移小鼠模型(LLC)測(cè)定抗-腫瘤活性的檢測(cè)試驗(yàn)GIA使用商品化試劑盒(Boehringer Mannheim)來(lái)做GIA。GIA用來(lái)檢測(cè)鯊魚(yú)軟骨提取物、所得的餾分以及AE-986組分對(duì)白明膠酶A(MMP-2)活性的抑制能力。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，GIA檢測(cè)過(guò)程如下。在液體軟骨提取物或其衍生物存在或不存在的情況下，將生物素標(biāo)記的白明膠底物和白明膠酶A一起孵育培養(yǎng)。接著，將反應(yīng)混合物加載到鏈霉抗生素蛋白(streptavidin)包埋的微量滴定板(microtiter plate)里。生物素標(biāo)記的白明膠通過(guò)游離的生物素殘基聯(lián)到鏈霉抗生素蛋白包埋的微量滴定板上。如果底物白明膠沒(méi)有被白明膠酶切割，則鏈霉抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶(POD)綴合物連接到白明膠酶-生物素-復(fù)合物上。POD然后將所加的ABTS底物轉(zhuǎn)化成綠色的終產(chǎn)物，它在405nm下測(cè)定。但是，如果生物素標(biāo)記的白明膠被白明膠酶所切割，則只能形成很小的白明膠片段。這些片段結(jié)合到微量滴定板后，不具有結(jié)合鏈霉抗生素蛋白-POD綴合物的能力；因此，也就不會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)。
因而，高白明膠酶活性得到低信號(hào)，低白明膠酶活性(例如，加入抑制劑)得到高水平的信號(hào)。軟骨提取物組分或所得餾分中的活性可能是一種白明膠酶的抑制活性，或者是與白明膠酶和白明膠底物之間相互作用相競(jìng)爭(zhēng)的拮抗活性(例如，結(jié)合白明膠的拮抗劑組分)。
EVT胚胎血管形成檢驗(yàn)(EVT)用來(lái)檢測(cè)鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物的組分或所得的餾分抑制新血管生成(抗血管生成)的能力。
小雞胚胎的正常發(fā)育涉及位于卵黃膜處的外血管系統(tǒng)的形成，卵黃膜能從卵黃攝取營(yíng)養(yǎng)供給胚胎發(fā)育。將抗血管生成物質(zhì)置于卵黃膜時(shí)，它能抑制卵黃膜處的血管形成。
將甲基纖維素片狀物(一種惰性的固態(tài)和透明基質(zhì))放置于血管生成的卵黃膜處的血管外周，該甲基纖維素片含有不同量的鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物組分、或所得的餾分或合適的對(duì)照物。
甲基纖維素片狀物組成的陽(yáng)性對(duì)照物含有1.5mg/ml的2-甲氧基雌二醇。將對(duì)照物和含有樣品的片狀物置于3日齡胚胎的卵黃膜處。這時(shí)候，只有初始的主要血管會(huì)侵入卵黃。將含有陰性對(duì)照物、或一定量的鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物組分，或所得的餾分的甲基纖維素片狀物同時(shí)放置于同一胚胎的卵黃膜處。當(dāng)比較所述組分和陰性對(duì)照物的功效時(shí)，為了盡量減少個(gè)體間的差異，將兩個(gè)片狀物根據(jù)胚胎頭-尾軸對(duì)稱放置。片狀物沉積后，24小時(shí)檢測(cè)血管生成，用血管生成受影響的胚胎百分比來(lái)表示結(jié)果。當(dāng)血管的生長(zhǎng)偏離了原來(lái)的路徑，或生長(zhǎng)路徑受損，或者和陰性對(duì)照物相比片狀物上觀察不到生長(zhǎng)時(shí)，則認(rèn)為血管形成受到了影響。
LLC模型采用Lewis肺癌轉(zhuǎn)移小鼠模型(LLC)來(lái)測(cè)定鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物組分、所得的餾分或AE-986組分抑制肺轉(zhuǎn)移癌形成的能力。
細(xì)胞培養(yǎng)Dr P.Brodt(Brodt P，Cancer Res.，462442，1986)建立了在肺中具有高轉(zhuǎn)移能力的Lewis肺癌克隆M27。該模型非常好用，并能用來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)和體外活性的相互關(guān)系。細(xì)胞在添加有10％的胚胎牛血清和1％的青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，環(huán)境中CO2濃度為5％，并且一周傳代2次。繁殖出很多細(xì)胞，并在早期傳代時(shí)保存細(xì)胞。所有的試驗(yàn)都是使用相同的傳代進(jìn)行的。在腫瘤誘導(dǎo)下，M27細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到70％融合，然后用胰島素-EDTA溶液(0.05％胰島素，不含Ca++或Mg++的0.53mM EDTA-4Na的HBSS溶液)收集。將細(xì)胞離心、洗滌，并重新懸浮(每200μl不含Ca++或Mg++的PBS溶液中有1×106LLC細(xì)胞)。用tryptan blue染色法進(jìn)行細(xì)胞存活性分析，只有存活率超過(guò)95％的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞才能用來(lái)接種。
腫瘤誘導(dǎo)使用C57BL/10雌性小鼠(15-20g)(Charles RiverInc.)來(lái)誘導(dǎo)Lewis肺癌腫瘤。培養(yǎng)一周后，LLC細(xì)胞通過(guò)皮下移植到右側(cè)腋窩，記作第0天。所有的動(dòng)物都在同樣的位置接種。用測(cè)徑器每天監(jiān)控腫瘤的生長(zhǎng)。相對(duì)的腫瘤體積采用如下公式計(jì)算長(zhǎng)度(cm)×[寬度(cm)]2/2，其中長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)于腫瘤最長(zhǎng)的軸，寬度對(duì)應(yīng)于腫瘤的垂直最短軸。當(dāng)初始腫瘤達(dá)到0.5-1.0cm3(接種后10天)時(shí)，具有大約相同尺寸的初始腫瘤的小鼠被隨機(jī)分配到特定的試驗(yàn)組中，每組15只，用耳沖孔方法對(duì)每只小鼠標(biāo)記序號(hào)。
無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行手術(shù)。在皮膚上切一個(gè)小口(0.5-1cm)，小心地將腫瘤和周圍健康組織分離開(kāi)。LLC細(xì)胞(在生長(zhǎng)初期)形成了一個(gè)定位的腫瘤，將其分離非常容易，無(wú)需破壞正常組織。立體鏡檢查顯示，在我們所采用的條件下，在腫瘤接種處無(wú)腫瘤殘余物，且并未觀察到任何肉眼可見(jiàn)的再生長(zhǎng)。
切除后，稱量腫瘤，并用手術(shù)用的不銹鋼夾子閉合傷口，再用聚維酮碘(Providone Iodine)消毒。
效用研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)腫瘤切除后(接種后11天)，用各種測(cè)試樣品(鯊魚(yú)軟骨提取物組分、所得的餾分以及AE-986組分)處理小鼠。用鹽或來(lái)源于軟骨的產(chǎn)品經(jīng)口管飼法每日給藥，持續(xù)2周。使用22G彎曲針來(lái)進(jìn)行口管飼法(0.5ml)。如前面的實(shí)驗(yàn)已說(shuō)明的，去除初始腫瘤后的大約兩周時(shí)間足以在肺表面獲得平均為30-50個(gè)小瘤，兩周以后將動(dòng)物在CO2室中處死。尸檢后，切除雙肺，稱重后在10％Bouin′s固定劑中固定。肺表面轉(zhuǎn)移癌用立體顯微鏡(4×)計(jì)數(shù)。
體重測(cè)量每?jī)商旎蛉鞙y(cè)量一次動(dòng)物的體重，直至死亡。
制備軟骨提取物的方法使用含有機(jī)溶劑的溶液從鯊魚(yú)軟骨中提取活性組分本發(fā)明提供了一種制備鯊魚(yú)提取物的方法，以及獲得、分離或純化該提取物中的生物活性組分的方法，其中至少生物活性組分的一部分不是蛋白質(zhì)。然而，在本發(fā)明的方法中可以使用用來(lái)提取含蛋白組分的離液劑(chaotropic agents)。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“含有機(jī)溶劑的溶液”是指至少包含一部分有機(jī)溶劑的溶液或混合物。含有機(jī)溶劑的溶液可包含一種或多種有機(jī)溶劑，還能包含水。這兒所用的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的組合優(yōu)選為極性溶劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，甲醇和乙醇中的至少一種可用于制備鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物。其它有機(jī)溶劑，例如乙腈、丙醇、異丙醇和丙酮也是可以使用的極性溶劑。有機(jī)溶劑可包含一種或幾種鹵化、醚、質(zhì)子、非質(zhì)子、極性、非極性、堿性、酸性、疏水和親水性的溶劑。
合適的鹵化溶劑包括氯仿、二溴甲烷、丁基氯和二氯甲烷。
合適的醚溶劑包括二甲氧基甲烷、四氫呋喃、二乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二乙醚、三乙二醇二甲醚、叔-丁基乙醚或叔-丁基甲醚。
合適的質(zhì)子溶劑包括(以下是列舉性的，而非限制性的)甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2，2，2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇(ISO)、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、異-丁醇(i-butyl alcohol)、叔-丁醇、2-乙氧基乙醇、二乙二醇、1-，2-，或3-戊醇、新戊醇、叔-戊醇、二乙二醇一甲基醚、二乙二醇一乙基醚、環(huán)己醇、苯甲醚、苯甲基醇、苯酚或丙三醇。
合適的非質(zhì)子溶劑包括(以下是列舉性的，而非限制性的)二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺、N-甲基甲酰胺、乙腈(ACN)、二甲基亞砜(DMSO)、丙腈、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙基甲基酮、乙酸乙酯、環(huán)丁砜(sulfolane)、N，N-二甲基丙酰胺、四甲基脲、硝基甲烷、硝基苯或六甲基磷酰胺。
合適的堿性溶劑或溶液包括2-，3-，或4-皮考啉、吡咯、吡咯烷、氫氧化銨(NH4OH)、三甲基胺(TMA)、嗎啉、吡啶或哌啶。
合適的酸性溶劑或溶液包括三氟乙酸(TFA)、乙酸、丙酸或甲酸。
合適的烴溶劑包括苯、環(huán)己烷、戊烷、己烷、甲苯、環(huán)庚烷、甲基環(huán)己烷、庚烷、乙苯、辛烷、茚(indane)、壬烷或萘。
含有機(jī)溶劑的溶液可包含有機(jī)溶劑的組合和/或有機(jī)溶劑和水的組合。合適的質(zhì)子溶劑和水的組合(以下是列舉性的，而非限制性的)包括水-甲醇、水-丙醇、水-異丙醇和水-丁醇。含水或不含水的合適的非質(zhì)子溶劑組合(以下是列舉性的，而非限制性的)包括水-乙腈、水-二甲亞砜、甲醇-乙腈、甲醇-二甲亞砜、乙醇-乙腈和乙醇-二甲亞砜。
本發(fā)明中有機(jī)溶劑的量可根據(jù)軟骨中所提組分的種類和物理性質(zhì)而變化。一般來(lái)說(shuō)，含有機(jī)溶劑的溶液中所具有的有機(jī)溶劑相對(duì)于溶液總體積是大約0.1，1-100％v/v，大約40-80％v/v，至少1％v/v，至少10％v/v，至少25％v/v，至少50％v/v，至少90％v/v或至少99％v/v。酸或堿溶劑的量根據(jù)溶劑的pKa，可在大約0.1-50％之間變化。為了避免生物組分的破壞和變性，pKa值越極端，則酸或堿溶劑的濃度越小。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種制備鯊魚(yú)軟骨提取物的方法，包括如下步驟a)用一定量的含有機(jī)溶劑的溶液處理鯊魚(yú)軟骨材料，形成了含鯊魚(yú)軟骨可溶性組分的第一混合物；b)分離所述的第一混合物，形成了含有所述可溶性組分的第一種液態(tài)提取物，以及第一種固體物質(zhì)；和c)從所述的第一種液態(tài)提取物中去除有機(jī)溶劑。
該方法還可進(jìn)一步包括步驟a)從所述的第一種液態(tài)提取物中去除足夠量的液體，以形成實(shí)質(zhì)上是干的第二種固體物質(zhì)；b)在上述的第二種固體物質(zhì)中加入水，形成第二混合物；和c)分離所述的第二混合物，形成第一種最終液態(tài)提取物和第三種固體物質(zhì)。
根據(jù)上述的a)-c)形成至少含有鯊魚(yú)軟骨可溶性組分殘余量的第二種和第三種或最終液態(tài)提取物的步驟，可以用含有機(jī)溶劑的溶液對(duì)含有鯊魚(yú)軟骨材料的第一種固體物質(zhì)再提取一次或多次，或用水替代含有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行提取。
步驟b)中液態(tài)和固態(tài)物質(zhì)的分離可以使用本領(lǐng)域任何公知的技術(shù)(以下是列舉性的，而非限制性的)，例如用離心、過(guò)濾、透濾法(diafiltration)、超濾、微過(guò)濾方法將固體沉降，并移去上清液。
如步驟c)中的有機(jī)溶劑的去除，可以使用本領(lǐng)域任何公知的技術(shù)(以下是列舉性的，而非限制性的)，例如蒸發(fā)、凍干法、蒸餾、干燥、加入有機(jī)溶劑吸收劑、液/液萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(rotovapping)。
這兒使用的鯊魚(yú)材料是固體，可是例如粉末、顆粒、棒體或顆粒。在步驟a)之前或在步驟a)中，可將鯊魚(yú)材料均質(zhì)化。此處所說(shuō)的“均質(zhì)化”是指如下方法，其通過(guò)a)增加鯊魚(yú)軟骨的總表面積或比表面積，或者b)促進(jìn)所需組分從軟骨材料中的釋放，從而增加從軟骨材料中提取所需組分的效率。均質(zhì)化可以通過(guò)一種或多種化學(xué)過(guò)程、物理過(guò)程及其結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
將軟骨材料均質(zhì)化的化學(xué)方法包括使用一種或多種化學(xué)劑來(lái)膨脹軟骨材料、分裂或溶解細(xì)胞或軟骨材料中的細(xì)胞外基質(zhì)，和/或增加軟骨材料的多孔性。
這些化學(xué)劑的非限制性實(shí)施例包括去污劑、表面活性劑、離子劑、非離子劑、還原劑、螯合劑、糖基化劑、離液劑、脲、胍、磷脂、糖脂、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉、三硝基甲苯(triton)溶液和其它本領(lǐng)域熟知的這類試劑，或者在JudithNeugebauer(Calbiochem-Novabiochem Corporation，1988)″A Guideto the Properties and Uses of Detergents in Biology andBiochemistry″中所公開(kāi)的試劑。
使軟骨材料均質(zhì)化的物理方法一般會(huì)導(dǎo)致鯊魚(yú)材料的平均顆粒尺寸變小，由此增加了比表面積。可使用下述列舉的一種或幾種方法來(lái)使顆粒尺寸變小，包括粉碎、微粉化、碾磨(milling)、研磨(grinding)、切割(chopping)、高速混合以及本領(lǐng)域內(nèi)熟知的其它使顆粒尺寸變小的方法。
提取溶液可包含提取增強(qiáng)劑，用來(lái)增強(qiáng)從軟骨中提取組分。這些提取增強(qiáng)劑可包含無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、無(wú)機(jī)或有機(jī)堿、聚合物、緩沖液、鹽和本領(lǐng)域熟知的其它類似試劑。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，從軟骨中得到的低分子量材料提取物可由如下方法獲得a)用乙醇(1kg)處理均質(zhì)化的鯊魚(yú)軟骨材料，形成含有鯊魚(yú)軟骨可溶性組分的第一混合物；
b)離心分離所述的第一混合物，形成了含有所述可溶性組分的第一種液態(tài)提取物，以及第一種固體物質(zhì)；和c)從所述的第一種液態(tài)提取物中蒸發(fā)去除乙醇；d)從所述的第一種液態(tài)提取物中蒸發(fā)掉足夠量的液體，以形成實(shí)質(zhì)上是干的第二種固體物質(zhì)；e)在上述的第二種固體物質(zhì)中加入水(1kg)，形成第二混合物；和f)分離所述的第二混合物，形成第一種最終液態(tài)提取物和第三種固體物質(zhì)。
上述步驟c)和d)可以任意組合，以從第一種液態(tài)提取物直接到第二種固體物質(zhì)。
采用上述步驟，從鯊魚(yú)軟骨提取物和重復(fù)提取物中獲得的所有液態(tài)提取物都要分析它們的干重和蛋白濃度(用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford蛋白檢測(cè)法測(cè)定)，作為可溶性組分回收的一個(gè)指標(biāo)。此外，還測(cè)定了抗-MMP活性。在40μl的20×濃縮樣品上進(jìn)行了GIA。結(jié)果列于表1。
表1

表1中所用的“CTRL”(對(duì)照樣品)是指使用純水作為提取溶劑獲得的最終液態(tài)提取物。“SU-MET”是指使用甲醇作為含有機(jī)溶劑的溶液時(shí)獲得的最終液態(tài)提取物。“SU-ETH”是指使用乙醇作為含有機(jī)溶劑的溶液時(shí)獲得的最終液態(tài)提取物?！癝1”“S2”“S3”是指當(dāng)使用所指明的溶劑作為含有機(jī)溶劑的溶液或純水時(shí)，分別獲得的第一最終液態(tài)提取物、第二最終液態(tài)提取物和第三最終液態(tài)提取物。
結(jié)果表明，水溶液和非水性含有機(jī)溶劑的溶液都可以用來(lái)獲得至少具有抗-MMP活性的鯊魚(yú)軟骨生物活性組分。此外，通過(guò)連續(xù)反復(fù)提取鯊魚(yú)軟骨的固體顆?？色@得殘留的活性。
從干重分析和蛋白回收情況看，抗-MMP活性和分離材料的量之間并沒(méi)有明顯的直接關(guān)聯(lián)。
軟骨和純水的比率對(duì)液態(tài)提取物產(chǎn)量的影響根據(jù)本發(fā)明方法的第一個(gè)實(shí)施方式，液態(tài)粗提物按照軟骨(C)和純水(E)以1kg∶1L的比率制備得到。獲得組分的方法包括步驟a)在水溶液中使鯊魚(yú)軟骨均質(zhì)化，直到獲得平均顆粒尺寸小于500微米的軟骨固體顆粒勻漿；b)在所述的水溶液中平衡該勻漿，形成第一混合物，它包括第一種固體物質(zhì)以及含所述生物活性組分的第一種液態(tài)提取物(LE)；c)從所述的第一種固體物質(zhì)中分離出該第一種液態(tài)提取物；d)將所述的第一種液態(tài)提取物進(jìn)行分離，形成了第二種液態(tài)提取物，它含有分子量小于大約500KDa(LE-0-500)的軟骨分子；e)用一個(gè)孔徑為0.22微米的微濾膜來(lái)過(guò)濾所述的第二種液態(tài)提取物，形成了一最終液態(tài)提取物(P-C1-E1，它實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于0-500的餾分)；本發(fā)明方法還可采用不同的軟骨和水的比率來(lái)進(jìn)行，如下

*P是指在分離步驟中形成的滲透物。
對(duì)于根據(jù)上述過(guò)程制得的所有第一種液態(tài)提取物，分析它們的干重、蛋白濃度和抗-MMP活性。結(jié)果如表2。
表2

*GIA在20X濃縮樣品的30μl等分試樣上進(jìn)行。
這些結(jié)果表明，從每千克的鯊魚(yú)軟骨初始材料中可回收20g的可溶性組分。在特定條件下的最大回收量是每千克鯊魚(yú)軟骨(分別為P-C1-E2和P-C1-E3)中獲得19.8(9.9×2)和18.9(6.3×3)g的可溶性組分。
這些結(jié)果表明使用不同的軟骨和純水比率可有效回收干重含量、蛋白含量以及具有抗-MMP活性的組分。
采用相同的軟骨比純水的比率將P-C1-E1中獲得的第一種固體物質(zhì)再提取兩次，以便得到其中包含的組分殘余量。重復(fù)提取第一種固體物質(zhì)的方法包括步驟f)將步驟c)中獲得的第一種固體物質(zhì)用純水處理，形成第二混合物，分離該混合物可得第二種液態(tài)提取物(P-C1-E2-2)和第二種固體物質(zhì)，其中該第二種液態(tài)提取物根據(jù)步驟d)和e)進(jìn)行處理；以及任選步驟g)將所述第二種固體物質(zhì)重復(fù)步驟f)，形成第三種液態(tài)提取物(P-C1-E1-3)和第三種固體物質(zhì)，其中該第三種液態(tài)提取物可用步驟d)和e)處理。
表3概括了上述步驟a)到g)中使用的水和鯊魚(yú)軟骨的量。
表3

對(duì)于上述過(guò)程獲得的所有液態(tài)提取物，分析它們的干重、蛋白濃度和抗-MMP活性。結(jié)果如表4。
表4

*GIA在20X濃縮樣品的30μl等分試樣上進(jìn)行。
這些結(jié)果表明，根據(jù)上述步驟a)到c)得到的一種或多種鯊魚(yú)軟骨提取物可增加鯊魚(yú)軟骨可溶性組分的回收。此外，在同一固體顆粒的第二或第三次提取之后，還可獲得具有抗-MMP活性的組分殘余量。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然可知，通過(guò)改變提取參數(shù)，例如溫度，提取次數(shù)或提取溶劑可以優(yōu)化所回收的固體、蛋白和生物活性組分的量。
軟骨組分中各種分子量餾分的制備方法0-500餾分0-500餾分是含有分子量小于500kDa組分的鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物。國(guó)際申請(qǐng)WO 95/32722，WO 96/23512，和WO97/16197中公開(kāi)了制備0-500餾分的方法。這些現(xiàn)有技術(shù)包括步驟a)在軟骨中的生物活性組分完整保持的條件下，在水溶液中將鯊魚(yú)軟骨均質(zhì)化，直到軟骨變小成為尺寸小于大約500μm的固體顆粒；b)將所述的生物活性組分提取到所述的水溶液中，形成固體顆粒和具有所述生物活性組分的液體粗提物(LE)的混合物；c)從所述的固體顆粒中分離液態(tài)提取物；d)進(jìn)一步分離液態(tài)粗提物，以獲得含有分子量小于大約500kDa(LE-0-500)分子的最終液態(tài)提取物；和e)經(jīng)微濾膜(0.22微米)過(guò)濾LE-0-500，并冷凍得到最終液態(tài)提取物(0-500餾分)。
0-1和1-500餾分0-1餾分是含有分子量小于大約1kDa的組分的鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物。1-500餾分是含有分子量在大約1-500kDa的組分的鯊魚(yú)軟骨液態(tài)提取物。鯊魚(yú)軟骨提取物的0-1和1-500餾分是通過(guò)使用具有截留分子量為1kDa膜的超濾系統(tǒng)來(lái)制備。使用該系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)一次純化循環(huán)就可獲得兩個(gè)軟骨餾分(一個(gè)純化循環(huán)定義為當(dāng)獲得50％滲透物時(shí)停止純化步驟)。1-500餾分含有滯留物(R)，當(dāng)使用純水(純水的終體積和用來(lái)純化的軟骨提取物初始體積相等)進(jìn)行再造時(shí)，和初始的純化用提取物相比，該滯留物包含在1×濃度下分子量為1-500kDa的組分，以及在0.5×濃度下分子量小于大約1kDa的組分。0-1餾分包含滲透物(P)，它僅由1×濃度下分子量小于大約1kDa的組分構(gòu)成。使用超濾系統(tǒng)，1-500餾分進(jìn)一步通過(guò)額外的純化循環(huán)純化，見(jiàn)下表。
表5

根據(jù)上述步驟，制備了多批次的0-1和1-500餾分。為了盡量減少形成聚集體，改善溶解性并保持穩(wěn)定可溶的形式，加入1％w/v的蔗糖水溶液作為提取的穩(wěn)定劑。
根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)首先制備一個(gè)批次的LE-0-500餾分，再按照如下的新步驟獲得0-1和1-500餾分e)用含蔗糖的溶液調(diào)制LE-0-500提取物至終濃度約1％(w/v)，形成含1％蔗糖的LE-0-500餾分；f)使用具有截留分子量為1kDa的膜來(lái)過(guò)濾LE-0-500或含1％蔗糖的LE-0-500，形成含分子量小于約1kDa的軟骨分子的液態(tài)提取物(分別為Pn-0-1和含1％蔗糖的餾分Pn-0-1，其中“n”指表5中的純化循環(huán)數(shù))，并形成含分子量大于約1kDa的軟骨分子的滯留物液態(tài)提取物(分別為Rn-0-1和含1％蔗糖的餾分Rn-0-1，其中“n”指表5中的純化循環(huán)數(shù))；g)通過(guò)一個(gè)約0.22微米孔徑的微濾膜來(lái)微過(guò)濾滯留物和滲透物液態(tài)提取物。
在操作上述步驟時(shí)可以不包括步驟e)，以便制備不含蔗糖的提取物。滯留物液態(tài)提取物可被超濾一次和多次，優(yōu)選4次或更多，循環(huán)純化步驟形成含有分子量小于1kDa的軟骨組分的額外濾液提取物(P1-0-1至P6-0-1)，并形成含有分子量在1-500kDa的的軟骨組分的滯留物提取物(R6-1-500和含1％蔗糖的R6-1500)。液態(tài)提取物優(yōu)選冷凍保藏。
相應(yīng)地，剛才介紹的步驟可用來(lái)制備下述液態(tài)提取物。
1)從LE 0-500中制得的0-500餾分；2)從含1％蔗糖的LE 0-500中制得的含1％蔗糖的0-500餾分；3)從P1-0-1中制得的0-1餾分；4)從含1％蔗糖的P1-0-1中制得的含1％蔗糖的0-1餾分；5)從R6-1-500中制得的1-500餾分；6)從含1％蔗糖的R6-1-500中制得的含1％蔗糖的1-500餾分。
從第二混合物分離得到的第二種固體物質(zhì)可用水重復(fù)提取，回收額外量的鯊魚(yú)軟骨可溶性餾分，其中該第二混合物是用水處理第一種固體物質(zhì)得到的。
分析上述步驟制得的所有液態(tài)提取物的干重和蛋白含量。此外，測(cè)定每一餾分的抗-MMP活性、抗血管生成和抗腫瘤活性。結(jié)果見(jiàn)表6表6

*GIA在20X濃縮樣品的30μl等分試樣上進(jìn)行。
分析結(jié)果表明，0-1餾分以及含1％蔗糖的相同餾分在回收干重大于90％時(shí)，只含有非常少量的，幾乎檢測(cè)不到的蛋白質(zhì)。
但是，在0-1餾分和1-500餾分上都有抗-MMP活性，這說(shuō)明1)至少一個(gè)非蛋白組分是產(chǎn)生該活性所需的，2)一個(gè)以上的組分具有抗-MMP活性?；钚越M分可能是，也可能不是蛋白或多肽。
進(jìn)一步，根據(jù)EVT，僅僅在0-1餾分中檢測(cè)到了抗血管生成活性。我們注意到，由于蔗糖的存在才導(dǎo)致了含1％蔗糖的1-500餾分具有微弱的抗血管生成活性。
給動(dòng)物接種M27腫瘤細(xì)胞(LLC)，結(jié)果引起肺表面顯微鏡可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移瘤節(jié)數(shù)目明顯減少。0-1餾分和0-500餾分均導(dǎo)致轉(zhuǎn)移瘤節(jié)數(shù)目的顯著減少(約30％)。但是，1-500餾分的活性比0-1或0-500餾分的活性更低，這也暗示了0-1餾分中的活性組分至少部分具有抗腫瘤活性。這些結(jié)果還暗示了在1-500餾分中還有其它的抗腫瘤組分。用含1％蔗糖的相同分子量餾分對(duì)一些其它的動(dòng)物組進(jìn)行了試驗(yàn)。雖然目前發(fā)明人還未在不同的試驗(yàn)組中觀察到任何顯著的差異，但是在蔗糖存在下，高分子量的餾分具有活性更高的趨勢(shì)(上表)。發(fā)明人沒(méi)有觀察到任何動(dòng)物體重的減少，這暗示了在LLC模型中軟骨提取物沒(méi)有毒性。
抗-MMP組分的分離和鑒定層析分離和純化已發(fā)現(xiàn)0-500餾分，尤其是在0-1餾分中存在含有生物活性的多種組分，下一步就是分離其中的活性組分。
采用四種不同的方法從0-500餾分中分離和純化含抗-MMP的組分。
方法1步驟1將上面方法獲得的0-500餾分在純水里凍干并復(fù)原(相對(duì)于初始體積為20倍濃度)。復(fù)原材料用超聲波降解15分鐘，以優(yōu)化生物活性組分的溶解性。進(jìn)行分離步驟，例如4℃下2200g離心10分鐘以后，上清液用于進(jìn)一步純化。
步驟2使用一個(gè)固相提取柱(SPE-C18-中性)進(jìn)行吸附層析。
500mg C18吸附劑(upelco No.5-7012，尺寸3cc)填充的SPE柱子用2ml甲醇(100％)處理兩次，再用2ml純水處理3次。加載1ml的20×復(fù)原軟骨提取物到柱上。用1.5ml的純水洗滌吸附珠，具有抗-MMP活性的組分隨兩部分的2.5ml純水被洗脫下來(lái)，一起形成第一洗脫物。
在第一洗脫物中，回收到了大約50％的抗-MMP初始活性。其余50％在加載和洗柱步驟中丟失了。由此可見(jiàn)，中性環(huán)境對(duì)具有抗-MMP活性組分的保留效果較弱。當(dāng)使用層析介質(zhì)時(shí)，對(duì)組分的弱保留效果表明組分的極性或離子性。
步驟3用各種20×復(fù)原的軟骨提取物樣品重復(fù)上述步驟多次后，將相應(yīng)的第一洗脫物收集到一起，并用Speed Vac離心機(jī)來(lái)離心。所得的固體物質(zhì)在純水中復(fù)原至初始所用0-500餾分體積的200倍濃度。超聲處理和離心后，上清液用于下一步提純。
步驟4在中性條件下，用低分離度的半制備型(semi-preparative)HPLC分離上清液中的生物活性組分。使用了Novapack C18HR(7.6×300mm；Waters)柱。流動(dòng)相是磷酸鈉(0.01M pH7)/甲醇(92∶8)。流速和溫度分別保持在2ml/minute和30℃。上述的200×復(fù)原餾分(100μl)注入層析柱上，在等度洗脫條件和UV檢測(cè)(205nm)下，收集到2ml餾分。洗脫時(shí)間是30分鐘。相應(yīng)于保留時(shí)間在11到13分鐘的洗脫出的餾分中，發(fā)現(xiàn)了具有抗-MMP活性的組分。
步驟5各種200×復(fù)原餾分的100μl等分試樣經(jīng)步驟4重復(fù)，將相應(yīng)所要的洗脫出的餾分收集到一起，蒸發(fā)，在純水中復(fù)原至初始所用0-500餾分體積的500×濃度，并超聲處理，離心。上清液用于下一步提純。
步驟6在中性條件下，用高分離度的半制備型HPLC分離步驟5獲得的上清液。高分辨的半制備型HPLC分離步驟類似于步驟4，區(qū)別在于磷酸緩沖液(0.01M，pH7)/甲醇(97∶3)作為流動(dòng)相。對(duì)應(yīng)于保留時(shí)間在23到27分鐘的洗脫餾分中，發(fā)現(xiàn)了具有抗MMP活性的組分。
步驟7重復(fù)步驟6，合并相應(yīng)的含活性組分的洗脫餾分，蒸發(fā)溶劑后形成固體殘留物，在水中復(fù)原該殘留物，至所用的0-500餾分初始體積的500-2000倍濃度，超聲處理并離心，并用于進(jìn)一步的分子量分析和抗-MMP活性檢測(cè)。生物活性組分稱為“AE-986”。
方法2已測(cè)得在pH3下，AE-986在C18相的層析介質(zhì)中有較好的保留效果。因此，對(duì)SPE方法(上述步驟2)和半制備型層析系統(tǒng)(上述步驟4和6)進(jìn)行改進(jìn)。下述條件允許在SPE方法中使用更強(qiáng)的洗液，結(jié)果是產(chǎn)生了更干凈的最終提取物，并且不需要其中一個(gè)半制備型的純化步驟(方法1中的步驟4)。例如，重復(fù)方法1中的步驟1-3。步驟4由下述取代。
步驟4使用上述步驟2中相同的SPE C-18柱子，層析介質(zhì)用2ml甲酸銨(0.01M，pH3)處理3次。將步驟3(在樣品上樣前，用甲酸調(diào)pH至3)中獲得的1ml 200×復(fù)原提取物加載到柱子上。吸附床用2ml的甲酸銨/甲醇(90∶10 pH3)洗滌3次。用1ml甲醇(100％)洗脫AE-986。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯然都知道甲醇洗脫柱子得到的餾分含有水。因此，步驟中的洗脫溶劑可以是其它有機(jī)溶劑，優(yōu)選是極性和/或水混合的有機(jī)溶劑，洗脫溶劑可含有水。
步驟5重復(fù)方法1中的步驟5，但復(fù)原抗-MMP餾分的濃度是4000×。
步驟6
該步驟和方法1中的步驟6相同，但流動(dòng)相是甲酸銨/甲醇(75∶25 pH3)。
步驟7步驟7和方法1中的步驟7相同，但保持如前述步驟6中的4000×的相同濃度。
方法3該方法基本上和方法2相同，但步驟6中甲酸緩沖液的pH從酸性(pH3)改變至中性(大約7)。
方法4在這種純化方法中，一開(kāi)始就用酸性流動(dòng)相。
步驟1用甲酸調(diào)初始0-500餾分(1×濃度)的pH至pH3，然后在2200g下離心10分鐘。得到的上清液在步驟2中使用。
步驟2將上清液加載至酸性條件下的SPE C-18柱(Supelco#5.-7136填塞了10g固相支持物，尺寸60cc)。柱子用120ml甲醇(100％)和120ml甲酸(0.01M，pH3)處理。將500ml的1×酸化軟骨提取物加載到柱子上，用6體積的100ml甲酸(0.01M(pH3)/甲醇90∶10)洗脫。在洗脫物3，4和5中獲得生物活性組分。
步驟3步驟2中的洗脫物3，4和5合并到一起，將溶劑蒸發(fā)至干。稀釋餾分至4000×的原始濃度，形成含AE-986的溶液。
步驟4在制備型HPLC柱上，以pH3的甲酸緩沖液純化AE-986。柱子(Prodigy OSD-prep，10u，250×50mm，from Phenomenex)在室溫條件下走柱。流動(dòng)相是甲酸(0.01M，pH3)/甲醇(70∶30)，流速為15ml/min。注射4ml的4000×濃度的SPE C-18餾分至柱上，并使用UV檢測(cè)(205nm)在等度洗脫條件下的洗脫。以每分鐘的間隔收集餾分1小時(shí)。在33-36分鐘之間洗脫下了具有抗-MMP活性的AE-986。
步驟5合并具有抗-MMP活性的餾分，蒸發(fā)，得到10000×濃縮餾分。
步驟6該步驟和方法2的步驟6相同，但流動(dòng)相是甲酸(0.01M，pH3)/甲醇(75∶25)。將10000×濃縮餾分的500μl等分試樣加載到柱上。在21-23分鐘之間洗脫下了具有抗-MMP活性的組分。
步驟7步驟7和方法1的步驟7相同。如上述的步驟6，保留了4000×的相同濃度。
根據(jù)方法1制備的半純化餾分本發(fā)明第一次披露了HPLC純化的餾分(上述方法1獲得的餾分)中含有抗-MMP活性的組分。經(jīng)上述的LLC模型體內(nèi)檢測(cè)，該純化組分還具有抗腫瘤活性。通過(guò)給予小鼠三種不同濃度的HPLC純化餾分來(lái)檢測(cè)抗腫瘤活性。結(jié)果觀察到一個(gè)鐘形的劑量反應(yīng)曲線，在2.5×濃度劑量(濃度是基于純化步驟時(shí)，并針對(duì)軟骨提取物初始體積的100％的回收，)下有最大功效50％(p＜0.005)。
因?yàn)榭寡苌珊突|(zhì)金屬蛋白酶活性與腫瘤增生和轉(zhuǎn)移癌發(fā)生有密切聯(lián)系，具有抗MMP組分的HPLC純化餾分可能起到了抗腫瘤活性的作用。因此，具有這些活性的組分是治療癌癥的潛在治療藥劑(Tolnay，E.et al.，J.Cancer Res Clin.Oncol.123652-658，1997；Skobe，M.，et al.Nature Medicine，31222-1227，1997)。
根據(jù)方法4制備的半純化餾分這部分的餾分是根據(jù)上述方法4制得的，但步驟2)和3)的實(shí)施如下步驟2將上清液加載至酸性條件下的SPE C-18柱(Supelco#5.-7012填塞了500mg固相支持物，尺寸3cc)。柱子用4ml甲醇(100％)和6ml甲酸(0.01M，pH3)處理。加載10ml的1×酸化軟骨提取物到柱子上，用1.0ml體積的甲酸(0.01M(pH3)/甲醇90∶10)洗脫3次，生物活性組分隨1.0ml的甲醇一起被洗脫下來(lái)。
步驟3
將含生物活性組分的步驟2的洗脫餾分蒸發(fā)干。餾分然后稀釋為初始的40×或20×濃度，形成含AE-986的溶液。
分析該步驟所得的所有液態(tài)提取物的抗-MMP活性。結(jié)果見(jiàn)表7。
表7

*GIA是在20×濃縮樣品的80μl等分試樣上實(shí)施的。
**GIA是在40×濃縮樣品的80μl等分試樣上實(shí)施的。
因此，本發(fā)明提供了一種制備具有抗-MMP活性的特定鯊魚(yú)軟骨餾分的方法。此外，水溶液和含有機(jī)溶劑的溶液均可用于制備至少具有抗-MMP活性的軟骨提取物。雖然0-500和1-500餾分都具有抗MMP活性，經(jīng)本發(fā)明純化的抗MMP組分主要位于0-1kDa部分。在含1％w/v蔗糖的對(duì)應(yīng)餾分中也觀察到了同樣的結(jié)果。最后，采用不同的軟骨和純水的比率可有效回收抗MMP的活性、用不同的溶劑的回收活性采用含有機(jī)溶劑的溶液，也就是乙醇和甲醇得到的結(jié)果，促進(jìn)了發(fā)明人測(cè)試許多其它溶劑，測(cè)定由這些不同溶劑回收的提取物對(duì)酶、增生和血管生成的抑制活性。
軟骨提取物的活性采用下述方法檢測(cè)白明膠酶抑制檢測(cè)(MMP-2)為了測(cè)定液態(tài)軟骨提取物對(duì)金屬蛋白酶活性的抑制，使用一個(gè)商品化試劑盒(BoehringerMannheim)進(jìn)行白明膠酶抑制檢測(cè)(GIA)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在液體軟骨提取物或其衍生物存在下和不存在下，將生物素標(biāo)記的白明膠底物和白明膠酶A(MMP-2)一起孵育培養(yǎng)。接著，將反應(yīng)混合物加到鏈霉抗生素蛋白(streptavidin)包埋的微量滴定板(microtiter plate)里。生物素標(biāo)記的白明膠通過(guò)游離的生物素殘基聯(lián)到鏈霉抗生素蛋白包埋的微量滴定板上。如果底物白明膠沒(méi)有被白明膠酶切割，鏈霉抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶(POD)綴合物則連接到白明膠酶-生物素-復(fù)合物的其余的游離生物素殘基上。POD然后將所加的ABTS底物轉(zhuǎn)化成綠色的終產(chǎn)物，它在405nm下測(cè)定。但是，如果生物素標(biāo)記的白明膠被白明膠酶所切割，只能形成很小的白明膠片段，每一片段帶有一個(gè)生物素殘基。這些片段結(jié)合到微量滴定板后，就不具有結(jié)合鏈霉抗生素蛋白-POD綴合物的能力；因此，也就沒(méi)有顯色反應(yīng)。
彈性蛋白酶抑制檢測(cè)(PPE)為了測(cè)定液態(tài)軟骨提取物對(duì)金屬蛋白酶活性的抑制，使用一個(gè)略微改進(jìn)的商品化試劑盒(Molecular Probes)進(jìn)行彈性蛋白酶抑制檢測(cè)(PPE)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在存在或不存在液體軟骨提取物或其衍生物條件下，將與熒光燃料綴合的可溶性彈性蛋白底物(來(lái)源于牛頸韌帶)(6.25μg/ml)和豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌?PPE；0.0125U/ml)一起孵育培養(yǎng)。經(jīng)彈性蛋白酶消化，釋放出熒光，發(fā)出的熒光經(jīng)熒光微板讀出裝置(505-515nm)檢測(cè)。如果存在彈性蛋白酶抑制劑，例如在液態(tài)軟骨提取物中的抑制劑，會(huì)阻止彈性蛋白的消化并抑制發(fā)光。
體外內(nèi)皮細(xì)胞增生檢測(cè)(HUVEC)為了測(cè)定軟骨提取物在體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生的抑制，進(jìn)行了細(xì)胞增生量化的檢測(cè)。所用的低溫保存的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)是購(gòu)買的，并檢測(cè)了是否有支原體和病毒污染。
解凍HUVECs，根據(jù)廠商指南培養(yǎng)細(xì)胞。為了進(jìn)行檢測(cè)，在96孔無(wú)菌培養(yǎng)板上滴加HUVECs，每孔4000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞吸附6-8小時(shí)以后，加入新鮮培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含不同濃度的鯊魚(yú)軟骨提取物、其衍生物以及陰性和陽(yáng)性對(duì)照物。在有上述合適的檢測(cè)物存在下，細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3天。經(jīng)過(guò)3天的培養(yǎng)，采用Hoescht-33257作為熒光染料的DNA染色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞數(shù)目減少表明存在對(duì)HUVECs增生的抑制效果。
由不同溶劑得到的提取物組分的差異(HPSEC)高壓尺寸排阻色譜法矢量角和比率長(zhǎng)度為了比較每一種提取物所產(chǎn)生的復(fù)雜色譜，我們使用了矢量角。這一方法已廣泛應(yīng)用于含一對(duì)數(shù)據(jù)值的數(shù)據(jù)集合(Brown andDonahue(1988)Applied Spectroscopy.42(2)347)。色譜圖中，在注入后每隔一定間隔周期測(cè)定探測(cè)器信號(hào)，從這些色譜圖中獲得的數(shù)據(jù)可用于比較。兩個(gè)矢量之間的角度表征了兩個(gè)色譜模式間的差異程度，與總的光譜強(qiáng)度無(wú)關(guān)。若色譜間完全吻合，則產(chǎn)生的角度為0。通過(guò)矢量角的比較，可以判斷兩個(gè)不同色譜是否具有相同模式的峰，而不是判斷它們?cè)趶?qiáng)度上有無(wú)差異。為了比較強(qiáng)度差異，采用了額外的統(tǒng)計(jì)工具來(lái)比較矢量的長(zhǎng)度。該工具利用了光譜長(zhǎng)度的比率。若不同光譜間的強(qiáng)度完全吻合，則長(zhǎng)度比率值是1.0。
采用Bradford檢測(cè)法測(cè)定蛋白濃度使用標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板分析檢測(cè)物的蛋白濃度。簡(jiǎn)單地說(shuō)，樣品蛋白和濃度在200μg/ml-800μg/ml的IgGB標(biāo)準(zhǔn)(牛γ球蛋白)溶液蛋白一起溶解于0.03N的NaOH中。20μl的每種樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加到三分之一的微量滴定板的孔中，每孔中加入200μl的染料劑(Coomassie Brilliant Blue G-250 diluted 1/5)。孵育5分鐘后采用板檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)595nm下的吸收。
用不同種類溶劑獲得的提取物的回收研究結(jié)果和復(fù)原的活性結(jié)果見(jiàn)表8-11。在不同溶劑中回收的生物活性化合物性質(zhì)見(jiàn)圖1-3。圖4和5顯示了不同溶劑中的比較性的組分。
表8非質(zhì)子溶劑

表9質(zhì)子溶劑

表10酸性溶劑或溶液

表11堿性溶劑或溶液

結(jié)論基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)屬于肽鏈內(nèi)切酶家族，它能切割胞外基質(zhì)的組分，即便不是所有也是大部分組分。它們?cè)谡{(diào)節(jié)血管生成，也就是新血管形成過(guò)程中具有重要作用。它們?cè)诎┌Y轉(zhuǎn)移上也起著重要作用，這是通過(guò)促進(jìn)基底膜的局部蛋白水解而導(dǎo)致癌細(xì)胞侵入基質(zhì)，接著侵入毛細(xì)細(xì)胞壁進(jìn)入血液循環(huán)。進(jìn)入血液循環(huán)以后，這些腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移并侵入遠(yuǎn)距離的靶組織。這兒，我們?cè)u(píng)價(jià)各種提取物對(duì)兩種不同的蛋白水解酶(MMP-2和PPE)的抑制活性。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶-2，它具有明膠分解活性。PPE是豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌浮Ｒ驗(yàn)榈鞍姿饷妇哂袕椥缘鞍姿饣钚?，任何提取物?duì)PPE有效，則說(shuō)明其對(duì)MMPs有效，MMPs是包含MMP-9在內(nèi)的具有彈性蛋白水解活性的酶。
所有來(lái)源于不同有機(jī)溶劑的軟骨提取物都表現(xiàn)出明顯的抑制活性。能夠抑制50％PPE活性(IC50)的提取物濃度在0.02-0.5μg/ml(干重μg/ml)之間，如圖1所示。由水制得的軟骨提取物的IC50是0.02μg/ml。在由10％甲醇、0.1％甲酸或0.1％銨制得的提取物中也檢測(cè)到了相同的活性。在這些提取物中發(fā)現(xiàn)的抗PPE活性隨著用于獲取軟骨提取物有機(jī)溶劑的濃度增加而降低。這些結(jié)果反映出這些提取物中蛋白濃度的減少。但是，在使用甲酸和銨的情況下，所觀察到的抗PPE效能的下降并不和蛋白濃度的差異相關(guān)聯(lián)，因?yàn)樗麄冊(cè)诿糠N制備條件下是幾乎相同的。有趣的是，MMP-2活性并沒(méi)有受到高濃度的甲酸或銨存在的干擾，IC50是0.03μg/ml，該值與使用純水的提取物的效能基本相同。這說(shuō)明抗PPE對(duì)pH變化敏感。此外，這些結(jié)果揭示了用于制備具有顯著的抗MMP-2活性和低水平抗PPE活性的軟骨提取物的新方法。
如圖2所示，所有的軟骨提取物都表現(xiàn)出抗MMP-2活性，IC50在0.01-0.15μg/ml之間。用純水獲得的參照提取物中測(cè)得的IC50為0.02μg/ml。這些提取物的效能看上去依賴于蛋白濃度，如觀察到的PPE抑制。
血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它不僅涉及MMP，而且涉及內(nèi)皮細(xì)胞增生和分化。使用各種軟骨提取物對(duì)人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增生的影響來(lái)評(píng)價(jià)各自的抗血管生成活性。如圖3所示，這些提取物的抗增生活性(IC50)在0.02-0.5μg/ml之間變化。用水制得的參照軟骨提取物的活性是0.48μg/ml，在提取步驟中有機(jī)溶劑的存在可產(chǎn)生更多的活性提取物。用三甲基胺獲得的提取物效能最大(在由10％和40％TMA制得的提取物中，IC50分別是0.09和0.02μg/ml)。這些意想不到的結(jié)果表明，這種溶劑比水更能富集具有HUVEC抗增生活性和抗血管生成活性的生物活性組分。有趣的是，這些提取物的抗增生活性并不依賴于蛋白濃度，這也說(shuō)明不是蛋白組分引起了抗HUVEC活性。
這些例子說(shuō)明了每一種提取物都是不同的它們具有各種濃度的蛋白(從0-1203mg/ml)，并表現(xiàn)出MMP-2、PPE和HUVEC活性形式。這一結(jié)論也得到了這些提取物的高壓尺寸排阻色譜分析(HPSEC)的支持，其中使用了由水制得的提取物作為參照。該方法表明矢量角的變化在0-60，長(zhǎng)度比率在1-4之間。如預(yù)料的，隨蛋白濃度的變化該差異增加(圖4和5)。此外，和采用水作溶劑制得的參照提取物性質(zhì)類似的提取物也表現(xiàn)出顯著的差異。例如，用10％甲醇制得的提取物和用純水制得的提取物表現(xiàn)出相同的生物活性，但是它們的色譜圖上有較大的差異(角＝6.01，長(zhǎng)度比率1.04)。相反，由銨制得的提取物表現(xiàn)出和甲醇幾乎相同的色譜圖(角＝7.04，長(zhǎng)度-1.08)，但是表現(xiàn)出的活性十分不同，抗PPE活性相當(dāng)程度地減少了。
結(jié)論使用所有測(cè)試溶劑進(jìn)行提取，產(chǎn)生了活性提取物。但是，同由水制得的其中一個(gè)提取物相比，PPE和MMP-2抑制被減小。相反，當(dāng)有機(jī)溶劑用于提取時(shí)，HUVEC活性更高。TMA提取產(chǎn)生了總體上活性最高的提取物。因此，可以推斷出許多種類的溶劑都可用于提取軟骨中的生物活性組分。在這些特定的測(cè)試物中，100％水和40％TMA是最可行的。進(jìn)一步，使用酸或堿溶劑產(chǎn)生的提取物抗PPE活性降低。不管如何，使用不同的溶劑獲得了對(duì)某些組分不同程度的富集。本發(fā)明的提取物能影響腫瘤發(fā)育中的生物過(guò)程。因?yàn)镸MPs和內(nèi)皮細(xì)胞增生是血管生成中的關(guān)鍵現(xiàn)象，這些提取物應(yīng)具有抑制新血管生成的活性，尤其是抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明方法可用于各種來(lái)源的軟骨(來(lái)自鳥(niǎo)、有袋動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物、爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和魚(yú)類)，但是最優(yōu)選是鯊魚(yú)軟骨。
用LC/MS測(cè)定抗MMP組分的分子量用五種多維色譜系統(tǒng)，通過(guò)液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)法來(lái)測(cè)定鯊魚(yú)軟骨餾分的分子量。五種系統(tǒng)中的每一種可參見(jiàn)表12-16。
實(shí)驗(yàn)涉及分離(7∶1)色譜柱洗脫液的MS掃描，以及對(duì)從LC中收集，用于測(cè)定抗MMP活性的餾分的MS掃描。MS和抗MMP生物活性之間的結(jié)合，可特異性地鑒定出所用的每個(gè)色譜系統(tǒng)的洗脫餾分和希望的化合物的滯留時(shí)間。
采用MS負(fù)離子檢測(cè)時(shí)，在引入MS離子源之前，在柱洗脫液中加入氫氧化銨(0.75％v/v，0.15ml/min)溶液?；旌衔锏淖詈髉H是8-10，它改進(jìn)了MS負(fù)離子的形成和檢測(cè)。
表12色譜系統(tǒng)1等梯度C18中性條件(甲酸銨)

檢測(cè)收集到的餾分的抗MMP活性。
表13色譜系統(tǒng)2梯度C18酸性條件(甲酸銨)

檢測(cè)收集到的餾分的抗MMP活性。
表14色譜系統(tǒng)3等梯度C18酸性條件(甲酸銨)

檢測(cè)收集到的餾分的抗MMP活性。
表15色譜系統(tǒng)4梯度NH2酸性條件(甲酸銨)

檢測(cè)收集到的餾分的抗MMP活性。
表16色譜系統(tǒng)5等梯度C18酸性條件(甲酸銨)

檢測(cè)收集到的餾分的抗MMP活性。
通過(guò)注入100μl的500-1000×的純化磷酸鹽終餾分(純化方法1的步驟7中獲得)來(lái)進(jìn)行多維色譜實(shí)驗(yàn)。在該濃度下，MS掃描模式(總離子)沒(méi)有檢測(cè)到AE-986的強(qiáng)信號(hào)和清晰信號(hào)。通過(guò)后續(xù)監(jiān)測(cè)感興趣的區(qū)域(活性餾分)內(nèi)所有單獨(dú)的離子信號(hào)(100-1000amu)，從而檢測(cè)感興趣的峰。
注入濃度高于2000×的純化餾分后，在總離子色譜上和基底峰色譜上出現(xiàn)了一個(gè)對(duì)應(yīng)于AE-986的小峰。
在正離子檢測(cè)模式下(表17)，在感興趣的區(qū)域(AE-986)只有離子245M+1和227可被清晰地檢測(cè)到。在LCQ MS的每一個(gè)設(shè)計(jì)和操作中，觀察到對(duì)應(yīng)于水分子缺失的離子和分子離子(M+1)對(duì)于含有醇官能團(tuán)的被分析物來(lái)說(shuō)是很平常和普遍的。離子245M+1和227的共洗脫圖，以及對(duì)應(yīng)于水分子(H2O)缺失的18amu差異，明顯暗示了存在具有分子量為244的感興趣的單組分，245相當(dāng)于正離子模式下的M+1分子離子。
那些色譜圖的后續(xù)分析表明，從不同的色譜系統(tǒng)中收集到的每一餾分中均存在離子245(M+1)，所述的餾分含有抗MMP活性的組分。
在13.5-15.0分鐘收集到的餾分中檢測(cè)到AE-986，該時(shí)間對(duì)應(yīng)于HPLC C18系統(tǒng)(甲酸銨中性pH7等梯度)上洗脫m/e 245M+1峰的保留時(shí)間14.14分鐘。
在16.5-17.0分鐘收集到的餾分中檢測(cè)到了AE-986，該時(shí)間對(duì)應(yīng)于HPLC C18系統(tǒng)(甲酸銨酸性pH3梯度)上洗脫m/e 245M+1峰的保留時(shí)間16.62分鐘。
在16-18分鐘收集到的餾分中檢測(cè)AE-986，該時(shí)間對(duì)應(yīng)HPLC C18系統(tǒng)(甲酸銨中性pH3等梯度)上洗脫m/e 245M+1峰的保留時(shí)間16.79分鐘。
在14-16分鐘收集到的餾分中檢測(cè)AE-986，該時(shí)間對(duì)應(yīng)于HPLC NH2系統(tǒng)(甲酸銨酸性pH3梯度)上洗脫m/e 245峰的保留時(shí)間14.28分鐘。
在所有檢測(cè)過(guò)的色譜系統(tǒng)中，只有在負(fù)模式下(表18)才能檢測(cè)到感興趣區(qū)域(AE-986)里的離子243和289。此外，這兩種離子的完全共洗脫說(shuō)明在離子243上形成了甲酸加合物。
當(dāng)使用甲酸銨作為流動(dòng)相的緩沖液時(shí)，在負(fù)離子中可經(jīng)常觀察到這一現(xiàn)象。用相同pH下的乙酸銨緩沖液替代甲酸銨緩沖液可證明這一點(diǎn)。在MS檢測(cè)之前，用氫氧化銨溶液堿化柱子的乙酸銨流動(dòng)相。兩系統(tǒng)都表現(xiàn)出離子243的清晰信號(hào)，但是離子289僅在甲酸系統(tǒng)中檢測(cè)到，在第二色譜系統(tǒng)中檢測(cè)到了對(duì)應(yīng)于乙酸加合物的新離子(303)。相應(yīng)地，可以相信AE-986組分具有大約244amu的分子量(243等價(jià)于負(fù)離子模式中的M-1分子離子)。
表17.正離子檢測(cè)

表18負(fù)離子檢測(cè)

經(jīng)驗(yàn)公式和AE-986部分結(jié)構(gòu)的說(shuō)明LC-MS經(jīng)驗(yàn)公式的確定使用質(zhì)譜來(lái)獲得AE-986結(jié)構(gòu)的信息。表19總結(jié)了對(duì)AE-986組分進(jìn)行LC-MS分析的條件。
表19用于LC-MS部分經(jīng)驗(yàn)公式確定的色譜條件

在圖象放大掃描模式下測(cè)定247，246，245的同位素比率，以增強(qiáng)對(duì)這些離子微弱信號(hào)的精確檢測(cè)。所獲得離子246/245(A+1型)和247/245(A+2型)的同位素比率如下表所示。
m/e 247/245峰高(A+2同位素比率)的比率為5.9％，明顯暗示了在分子中存在一個(gè)硫和少數(shù)氧原子。
A+1元素(m/e 246/245峰高)的同位素比率為11.8％，說(shuō)明分子中可達(dá)10個(gè)碳或碳，氮和硫(1)的混合物。
在分子量為244amu時(shí)，分子中僅存在偶數(shù)個(gè)氮(0，2，4)。
LC/MSn結(jié)構(gòu)說(shuō)明通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)AE-986結(jié)構(gòu)得到了部分說(shuō)明。
表20.用于MSn實(shí)驗(yàn)的色譜條件如下

對(duì)分子離子245m/e(M+1)的正離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是缺少18amu(m/e 227.1)和36amu(m/e 209)(次要的)。這些缺少對(duì)應(yīng)于缺少一個(gè)和兩個(gè)水分子(分別為-H2O和-2H2O)，表明在AE-986中存在一個(gè)醇和/或二醇結(jié)構(gòu)。實(shí)際的MS/MS譜見(jiàn)圖5。
在m/e 227離子上進(jìn)行的MS/MS實(shí)驗(yàn)得到了一個(gè)復(fù)雜的光譜圖，它具有AE-986化學(xué)結(jié)構(gòu)的許多特征片段。光譜圖中的片段來(lái)自于m/e 227離子的一個(gè)或兩個(gè)裂解，或者來(lái)自于光譜圖中其它強(qiáng)離子的裂解(例如，m/e 166來(lái)自于209離子的裂解)。結(jié)果，在m/e 227離子的所選片段上又進(jìn)行了進(jìn)一步的MS/MS實(shí)驗(yàn)。所得的MS/MS光譜圖見(jiàn)圖6。
在209m/e離子(M+1-2H2O)上的MS/MS實(shí)驗(yàn)來(lái)源于60amu的缺失，產(chǎn)生了m/e 149，它是羧酸(-CH3COOH)結(jié)構(gòu)缺失的特征。
離子149m/e(M+1-2H2O-CH3COOH)經(jīng)MS/MS重新分析，得到如下片段m/e 105，115，116和134。從149到134所缺失的15很可能對(duì)應(yīng)于CH3的缺失。缺少33和34表明SH和H2S的缺失，因此明顯說(shuō)明AE-986中存在含硫基團(tuán)(硫醇或硫醚)。從m/e 149到105所缺少的44是由于缺失了幾種不同的基團(tuán)。
化學(xué)衍生結(jié)構(gòu)的說(shuō)明將AE-986置于通常用來(lái)酯化羧酸的條件下，如下。
甲基化(HCl/甲醇)為了將純化的餾分甲基化，發(fā)明人將15μl的AE-986純化的餾分(4000X)蒸發(fā)，然后在一個(gè)封閉小瓶中加入100μl的HCl(12N)MeOH/(1∶99)混合物。混合物在45℃保持60-90分鐘，然后蒸發(fā)干燥，溶解于100μl的水中。根據(jù)用于LC/MS結(jié)構(gòu)說(shuō)明的色譜條件注入溶液。
甲基化(BF3/甲醇)為了將純化的餾分甲基化，發(fā)明人將15μl的AE-986純化餾分(4000X)蒸發(fā)，然后在一個(gè)封閉小瓶中加入1001μl的BF3/甲醇溶液?；旌衔镌?5℃保持60-90分鐘，然后蒸發(fā)干燥，溶解于100μl的水中。根據(jù)用于LC/MS結(jié)構(gòu)說(shuō)明的色譜條件注入溶液。
純化餾分的稀釋(4000×)為了確定衍生物的回收，發(fā)明人用85μl的水將15μl的AE-986純化餾分(4000X)稀釋。根據(jù)用于LC/MS結(jié)構(gòu)說(shuō)明的色譜條件分析稀釋溶液。
結(jié)果通過(guò)在AE-986期望保留時(shí)間的信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)BF3/甲醇或H+/甲醇45℃處理1小時(shí)的AE-986組分的衍生物表現(xiàn)出色譜信號(hào)消失95％以上。
這兩種反應(yīng)是公知用于將羧酸轉(zhuǎn)化為它們對(duì)應(yīng)的甲酯的方法。甲基化會(huì)引起AE-986組分的分子量增加，同時(shí)引起色譜系統(tǒng)的保留時(shí)間增加。在此制得的AE-986衍生物的濃度不能用來(lái)檢測(cè)衍生物產(chǎn)品。
物理化學(xué)特性AE-986上的弱酸官能團(tuán)，例如羧酸，可以通過(guò)甲酸緩沖液pH從7降至3時(shí)HPLC C18柱的保留時(shí)間的增加來(lái)確定。這也明顯說(shuō)明在AE-986上存在一個(gè)pKa是大約4或4以上的結(jié)構(gòu)。
如MS/MS數(shù)據(jù)所揭示的，如果在AE-986中存在一個(gè)硫醇或硫醚官能團(tuán)，它會(huì)影響從0-500餾分和軟骨中回收AE-986。因?yàn)榱虼既菀着c其它溶液中的含硫分子(例如蛋白、肽、氨基酸)形成二硫鍵(S＝S)，所以很可能只有AE-986中的自由硫醇才能根據(jù)本發(fā)明被提取出來(lái)。
形成二硫化物加合物一般會(huì)改變含硫醇基團(tuán)分子的物理化學(xué)特性，并影響它們的回收。AE-986的二硫化物加合物可能不能通過(guò)0-500餾分(20×)的直接提取而分離出來(lái)。在提取前，用pH7尤其是pH3(SPE C18 pH3)的三丁基磷酰胺在室溫下處理AE-986溶液15分鐘，可減少AE-986中二硫化物加合物的形成。使用其它二硫鍵裂解劑(cleaving reagengt)，例如二硫蘇糖醇和β-巰基乙醇也可減少AE-986中二硫加成物的形成。
從鯊魚(yú)軟骨中回收和分離生物活性物質(zhì)的上述方法適用于從任何軟骨中提取具有所需生物活性的餾分。
以上描述的發(fā)明結(jié)合有具體的實(shí)施方式。在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可作一些改變。這些改變都屬于由權(quán)利要求所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種從軟骨中制備富含可溶性生物活性組分的提取物的方法，包括如下步驟a)用一定量的含有機(jī)溶劑的溶液處理鯊魚(yú)軟骨材料，相對(duì)于所述溶液中的其它軟骨組分，該有機(jī)溶劑對(duì)所述的可溶性組分進(jìn)行選擇性富集，形成了含鯊魚(yú)軟骨可溶性組分的第一混合物；b)分離所述的第一混合物，形成含有所述可溶性組分的第一種液態(tài)提取物，以及第一種固體物質(zhì)，其中所述的可溶性組分具有至少抗基質(zhì)金屬蛋白酶或抗增生的活性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括步驟a)從所述的第一種液態(tài)提取物中去除足夠量的液體，以形成實(shí)質(zhì)上是干的第二種固體物質(zhì)；b)在上述的第二種固體物質(zhì)中加入水，形成第二混合物；和c)分離所述的第二混合物，形成第一種最終液態(tài)提取物和第三種固體物質(zhì)，其中所述的最終液態(tài)提取物包含所述可溶性組分。
3.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括步驟從所述的第一種液態(tài)提取物中去除所有的有機(jī)溶劑。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有機(jī)溶劑的溶液包括一種或多種堿性、酸性、鹵化、醚、質(zhì)子、非質(zhì)子、極性、非極性、親水或疏水溶劑。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有機(jī)溶劑的溶液包括一種或多種選自下述的有機(jī)溶劑三甲基胺(TMA)、氫氧化銨、三氟乙酸(TFA)、甲酸、氯仿、二溴甲烷、丁基氯和二氯甲烷、二甲氧基甲烷、四氫呋喃、二乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二乙醚、三乙二醇二甲醚、叔-丁基乙醚、叔-丁基甲醚、甲醇、乙醇、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2，2，2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、異-丁醇、叔-丁醇、2-乙氧基乙醇、二乙二醇、1-，2-，或3-戊醇、新戊醇、叔-戊醇、二乙二醇單甲基醚、二乙二醇單乙基醚、環(huán)己醇、苯甲醚、苯甲基醇、苯酚或丙三醇、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氫-2(1H)嘧啶酮(DMPU)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺和N-甲基甲酰胺。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有機(jī)溶劑的溶液包含一種或多種選自下述的有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、異丙醇、三甲胺、丙酮和二甲亞砜。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有機(jī)溶劑的溶液包含選自下述的有機(jī)溶劑的組合甲醇和乙腈、甲醇和二甲亞砜、乙醇和乙腈，乙醇和二甲亞砜。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有機(jī)溶劑的溶液包含一種水和一種有機(jī)溶劑的組合，有機(jī)溶劑選自下述甲醇、丙醇、異丙醇、乙醇、乙腈、三甲胺、三氟乙酸、甲酸和二甲亞砜。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含有機(jī)溶劑的溶液中，有機(jī)溶劑占總?cè)芤后w積的0.1-100％v/v。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑占總?cè)芤后w積的40-80％v/v。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是一種酸或堿溶劑，至少占總?cè)芤后w積的10％v/v。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是一種酸或堿溶劑，至少占總?cè)芤后w積的0.1-1％v/v。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的有機(jī)溶劑是三甲胺10-40％、甲酸0.1-1％、三氟乙酸0.1-1％、異丙醇10-100％、乙腈10-100％或氫氧化銨0.1-1％，所有的百分?jǐn)?shù)都是相對(duì)于溶液總體積的體積百分比。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一種混合物采用一種或多種離心、過(guò)濾、透析以及固體沉降以去除上清液的方法而分離。
15.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的去除液體是通過(guò)蒸發(fā)、凍干法、蒸餾、共沸蒸餾、干燥、液/液萃取、加入有機(jī)溶劑吸收劑和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而進(jìn)行。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的軟骨材料是鯊魚(yú)軟骨。
17.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括步驟用含有機(jī)溶劑的溶液處理軟骨材料的之前、之中或之后，將所述的軟骨材料均質(zhì)化。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的均質(zhì)化由一種或多種物理的和化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)。
19.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包含步驟重復(fù)步驟a)和b)，用固體物質(zhì)來(lái)代替軟骨材料，獲得至少一種進(jìn)一步的液態(tài)提取物，并將所述的至少一種進(jìn)一步的液態(tài)提取物和第一種液態(tài)提取物合并。
20.從鯊魚(yú)以及權(quán)利要求13的方法中制得的軟骨提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用含有機(jī)溶劑的溶液替代純水來(lái)制備軟骨提取物及其餾分的方法。對(duì)用于制備含生物活性物質(zhì)提取物的不同有機(jī)溶劑進(jìn)行測(cè)試。在這些所測(cè)試的溶劑中，40％的三甲胺(在水溶液中)是替代純水的理想溶劑，尤其是在回收對(duì)HUVECs的抗增生活性物質(zhì)上。
文檔編號(hào)A61K35/60GK1491113SQ02804573
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月5日
發(fā)明者E·杜邦, Y·拉昌斯, D·萊薩德, S·奧格, E 杜邦 申請(qǐng)人:萊斯實(shí)驗(yàn)室阿特納公司