專利名稱：干燥引起皮膚損傷的抑制劑或修復(fù)劑及其評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制或修復(fù)干燥引起的皮膚損傷(或者皮膚皸裂)的化妝品或皮膚科用制劑，以及這些制劑中含有的物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
天然保濕因子(NMF)對(duì)于保持角質(zhì)層的水分發(fā)揮著重要作用(Blank I.H.J.I.Dermatol.，18，433(1952)；Blank I.H.J.I.Dermatol.，21，259(1953))。有報(bào)道指出作為NMF主要成分的氨基酸通過(guò)來(lái)源于角質(zhì)透明蛋白顆粒的絲聚蛋白的分解產(chǎn)生(ScottI.R.等，Biochem Biophys.Acta.，719，110-117(1982)；Horii I.等，J.Dermatol.，10，25-33(1983))。絲聚蛋白是317個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。明確作為NMF主要成分的氨基酸來(lái)源于絲聚蛋白以來(lái)，開(kāi)始不斷研究呈現(xiàn)干燥肌膚的病理與絲聚蛋白之間的相關(guān)性。近年來(lái)，已經(jīng)逐步明確在老年性干皮病、特應(yīng)性疾病等的干燥肌膚中，角質(zhì)層中的氨基酸減少(Horii I.等，Br.J.Dermatol.，121，587-592(1989)；Tanaka M.等，Br.J.Dermatol.，139，618-621(1998))，而且絲聚蛋白的表達(dá)減少(Tezuka T.等，Dermatology，188，21-24(1994)；Seguchi T.等，Arch.Dermatol.Res.288，442-446(1996))。另外，由于環(huán)境干燥出現(xiàn)皮膚皸裂等皮膚問(wèn)題也是眾所周知的。
也許是基于這種情況，在FR2777185-A1中提出了一種處理皺紋用的組合物，其中將刺激絲聚蛋白合成的物質(zhì)與其它活性物質(zhì)組合，所述絲聚蛋白能夠有利作用于保水能力的調(diào)節(jié)。但是，沒(méi)有記載刺激絲聚蛋白合成的物質(zhì)具體是何種物質(zhì)。另外，在特開(kāi)2000-26272號(hào)公報(bào)中記載了下述主旨，即，來(lái)源于白羽扇豆〔Lupinus albus〕種子粉末的蛋白質(zhì)分解處理物具有增加人角化細(xì)胞的絲聚蛋白的mRNA、增加角質(zhì)層厚度的作用。而且，在WO99/47117中記載了含有維生素B3化合物的組合物作為保濕劑發(fā)揮作用，而且能夠增加選自絲聚蛋白、角蛋白和內(nèi)披蛋白(インボクリン)的皮膚蛋白質(zhì)的水平，提高角質(zhì)層吸附或吸收水分的能力。
發(fā)明公開(kāi)如上所述，以前提出了提高絲聚蛋白產(chǎn)量、增加角質(zhì)層厚度的物質(zhì)，或者提高角質(zhì)層吸收水分的能力的物質(zhì)。但是，從參與絲聚蛋白的產(chǎn)生，并維持健康皮膚狀態(tài)這樣一種更廣泛的觀點(diǎn)來(lái)看，大概依然需要提供確認(rèn)了有效性的物質(zhì)或化合物。
本發(fā)明人對(duì)于人角化細(xì)胞中與干燥以及角質(zhì)層水分量有關(guān)的因子進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲聚蛋白的水平以及該基因的表達(dá)會(huì)由于干燥而降低。
而且，發(fā)現(xiàn)某種固定培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相時(shí)，絲聚蛋白基因的表達(dá)量顯著降低，這種現(xiàn)象與上述干燥引起的皮膚損傷具有相關(guān)性。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在使用該培養(yǎng)人角化細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，能夠顯著抑制暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)量降低的物質(zhì)，也能夠抑制或修復(fù)上述干燥引起的皮膚損傷。
本發(fā)明就是基于上述發(fā)現(xiàn)完成的。
因此，按照本發(fā)明，提供一種皮膚外用劑，其中含有對(duì)于抑制人皮膚角質(zhì)層的屏障功能降低來(lái)說(shuō)足夠量的能夠顯著抑制培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)，以及在化妝品和/或皮膚科制劑中允許使用的基質(zhì)或添加劑。
按照本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供一種皮膚外用劑，其中上述能夠顯著抑制絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)是選自甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物、生藥、以及具有抗氧化作用的物質(zhì)中的1種或2種以上。
另外，本發(fā)明還涉及能夠顯著抑制培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)在制備能夠抑制人皮膚角質(zhì)層的屏障功能和保濕功能降低的皮膚外用劑中的用途。
此外，本發(fā)明還涉及抑制或修復(fù)干燥引起的皮膚損傷的方法，其中包括將含有選自甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物、生藥、以及具有抗氧化作用的物質(zhì)中的1種或2種以上的組合物涂敷在人皮膚上的步驟。
另外，按照本發(fā)明的另一種方式，提供用于評(píng)價(jià)化合物等是否能夠防止干燥引起皮膚損傷的方法。該評(píng)價(jià)方法的特征在于，(A)準(zhǔn)備培養(yǎng)的人角化細(xì)胞，(B)在被測(cè)物的存在下將該培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相后，檢測(cè)該角化細(xì)胞中絲聚蛋白基因的表達(dá)能力，然后(C)將檢測(cè)出的絲聚蛋白基因的表達(dá)能力與對(duì)照相比較，以表達(dá)能力的大小作為抑制這種皮膚損傷的能力的指標(biāo)。


圖1是表示培養(yǎng)的人角化細(xì)胞由于干燥(暴露于氣相)引起絲聚蛋白水平相對(duì)經(jīng)時(shí)變化的圖。用試行n＝4～5的平均±SEM值表示。另外，**表示p＜0.01。
圖2是表示培養(yǎng)的人角化細(xì)胞由于干燥(暴露于氣相)引起絲聚蛋白基因表達(dá)水平經(jīng)時(shí)變化的圖。用試行n＝4～6的平均±SEM值表示。另外，**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
圖3是表示甘油抑制培養(yǎng)的人角化細(xì)胞由于干燥(暴露于氣相)引起絲聚蛋白水平降低的效果的圖。成對(duì)的條形圖中右側(cè)表示在10％甘油存在下的培養(yǎng)例(左側(cè)為對(duì)照)。用試行n＝3～6的平均±SEM值表示。另外，**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
圖4是表示甘油和三甲基甘氨酸對(duì)培養(yǎng)的人角化細(xì)胞由于干燥引起絲聚蛋白基因表達(dá)降低的效果的圖。用試行n＝3的平均±SEM值表示。另外，**表示p＜0.01。
圖5是除了使用生藥作為藥物以外，具有與圖4相同含義的圖。另外，各藥物濃度為干燥殘留物濃度0.0025％。另外，n＝3，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。
圖6是除了分別以1mM的濃度使用抗壞血酸和谷胱甘肽作為藥物以外，具有與圖4相同含義的圖。另外，***表示p＜0.001，**表示p＜0.01。
圖7是除了使用亞?；撬嶙鳛樗幬镆酝猓哂信c圖4相同含義的圖。*表示p＜0.05。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明中所說(shuō)的“能夠顯著抑制培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低”是指，采用下述評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，與對(duì)照(不含被測(cè)物質(zhì))體系中上述表達(dá)能力降低相比，在含有被測(cè)物質(zhì)的體系中能夠在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著抑制上述表達(dá)能力的降低。
另外，本發(fā)明中所說(shuō)的“皮膚損傷”是指皮膚皸裂或皮膚上形成小皺紋、皮膚的柔軟性降低等認(rèn)為在健康皮膚上不會(huì)出現(xiàn)的各種形式的變化、皮膚問(wèn)題。
在本發(fā)明中，只要是能夠顯著抑制上述表達(dá)能力降低的物質(zhì)，均包括在本發(fā)明的外用劑、用途和方法的有效成分中。但是，作為這種有效成分的具體實(shí)例，可以例舉甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物、生藥、以及具有抗氧化作用的物質(zhì)。
“甜菜堿化合物及其衍生物”只要是符合本發(fā)明目的的物質(zhì)，可以是甜菜堿(也稱為甘氨酸甜菜堿)及其衍生物、以及相應(yīng)的磺基甜菜堿(甜菜堿的羧基替換成磺基)的兩性離子化合物中包含的任意一種化合物。作為這種衍生物的代表性物質(zhì)，可以例舉甘氨酸甜菜堿的1至3個(gè)N-甲基用其它可以帶有支鏈的飽和或不飽和烴鏈或者下式(CnH2nCONH(CH2)m-)(式中，m和n獨(dú)立地為1～30的整數(shù))表示的用酰胺鍵中斷的該烴鏈代替，或者改變季銨基與羧基或磺基之間的烴鏈長(zhǎng)度(例如碳原子數(shù)2～6)，或者具有多個(gè)甜菜堿殘基作為側(cè)基的聚合物。另外，這些物質(zhì)也可以是環(huán)狀化合物。對(duì)此沒(méi)有限定，作為這種衍生物的具體實(shí)例，除上述物質(zhì)以外，還可以例舉γ-丁內(nèi)銨鹽、癸基甜菜堿、月桂基甜菜堿、肉豆蔻基甜菜堿、十六烷基甜菜堿、硬脂基甜菜堿、二十二烷基甜菜堿、月桂酰氨基丙基甜菜堿、油酰氨基丙基甜菜堿、棕櫚酰氨基丙基甜菜堿、γ-丁內(nèi)銨鹽、月桂基磺基甜菜堿、可可磺基甜菜堿、聚(甲基丙烯酰氧基乙基甜菜堿)、(甲基丙烯酰氧基乙基甜菜堿-甲基丙烯酸2-羥乙酯)共聚物等。優(yōu)選甘氨酸甜菜堿、磺基甜菜堿、聚(甲基丙烯酰氧基乙基甜菜堿)、(甲基丙烯酰氧基乙基甜菜堿-甲基丙烯酸2-羥乙酯)共聚物。
“多元醇及其衍生物”可以例舉1分子中具有2個(gè)以上羥基的化合物及其衍生物，例如氧化乙烯加成物等。作為所述多元醇的具體實(shí)例，例如甘油、1，3-丙二醇、2-甲基-1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、二甘油、赤蘚醇、葡糖酸、1，2，6-己三醇、肌醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。特別優(yōu)選組合使用甘油和以木糖醇為首的糖醇。
“生藥”是指作為藥品或者民間藥或其原料，對(duì)來(lái)源于植物的素材進(jìn)行干燥、切斷、粉碎或提取等操作得到的物質(zhì)，只要遵從本發(fā)明的目的，不問(wèn)植物的科或?qū)佟?duì)此沒(méi)有限定，具體而言作為生藥，可以例舉菊科(Compositae)的酒神菊屬(Baccharis)植物，特別是來(lái)源于Baccharis genistelloids的生藥carqueja(南美)，Achyrocline屬植物，特別是來(lái)源于Achyrocline satureoides的生藥macelamista(南美)，以及蓍草屬(Achillea)植物，特別是來(lái)源于千葉蕃(Achillea millefolium L.)的生藥千葉蕃；唇形科(Labiatae)的百里香屬(Thymus)植物，特別是來(lái)源于百里香(Thymusserphyllum Linne subsp.serphyllum)的生藥百里香提取物，牛至屬(Origanum)植物，特別是來(lái)源于馬郁蘭(Origanum majorana L.)的生藥マジヨラム提取物，黃芩屬(Scutellaria)植物，特別是來(lái)源于黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的生藥黃芩，以及熏衣草屬(Lavandula)植物，特別是來(lái)源于熏衣草(Lavandulaofficinalls)的生藥熏衣草油；薔薇科(Rosaceae)的薔薇屬(Rosa)植物，特別是來(lái)源于Rosa roxburghii的生藥イザヨウバラ果實(shí)，以及李屬(Prunus)植物，特別是來(lái)源于サトザクラ(Prunus lannesiana(Corr.)Wilson var.Spciosa(Koidz)Makino)的生藥サクラリ-フ提取物；金鏤梅科(Hamamelidaceae)的金縷梅屬(Hamamelis)植物，特別是來(lái)源于北美金鏤梅(Hamamelis virginiana L.)的生藥金鏤梅；鹿蹄草科(Pyrolaceae)的鹿蹄草屬(Pyrola)植物，特別是來(lái)源于鹿蹄草(Pyrola japonicus Klenze)的生藥鹿蹄草；以及豆科(Leguminosae)的Eysenhardtia屬植物，特別是來(lái)源于Eysenhardtia polistachya的生藥palo azul(南美)等。雖然對(duì)此沒(méi)有限定，但是優(yōu)選的生藥為生藥palo azul、生藥macelamista和生藥carqueja。
“具有抗氧化作用的物質(zhì)”只要對(duì)皮膚沒(méi)有不良影響，并能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明目的，可以是任何一種化合物或物質(zhì)(混合物、組合物等)。基于不會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生不良影響的觀點(diǎn)，作為具體的物質(zhì)，可以例舉包括在化妝品領(lǐng)域已經(jīng)作為抗氧化劑使用或者提議作為抗氧化劑使用的物質(zhì)的化合物或物質(zhì)。
作為這種化合物，沒(méi)有限定，可以例舉抗壞血酸及其鹽或衍生物。作為鹽或衍生物，例如抗壞血酸鎂、抗壞血酸鈉等，抗壞血酸烷基酯、抗壞血酸磷酸酯、抗壞血酸硫酸酯、抗壞血酸糖苷等抗壞血酸衍生物。更具體地說(shuō)，作為抗壞血酸烷基酯，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、異棕櫚酸抗壞血酸酯、二棕櫚酸抗壞血酸酯、二異棕櫚酸抗壞血酸酯、硬脂酸抗壞血酸酯、異硬脂酸抗壞血酸酯、二硬脂酸抗壞血酸酯、肉豆蔻酸抗壞血酸酯、異肉豆蔻酸抗壞血酸酯、二肉豆蔻酸抗壞血酸酯、二異肉豆蔻酸抗壞血酸酯、2-乙基己酸抗壞血酸酯、二(2-乙基己酸)抗壞血酸酯、油酸抗壞血酸酯、二油酸抗壞血酸酯等，作為其它衍生物，例如抗壞血酸多肽、磷酸抗壞血酸鎂、甲基甲硅烷醇抗壞血酸酯、磷酸抗壞血酸生育酚鉀等。
而且，關(guān)于生育酚及其衍生物，作為該衍生物沒(méi)有限定，可以例舉醋酸生育酚、亞油酸生育酚、煙酸生育酚、琥珀酸生育酚等生育酚酯，以及トコフエレス-5、トコフエレス-10、トコフエレス-12等生育酚的氧化乙烯加成物。另外，還可以例舉含有含硫氨基酸的化合物(包括含硫氨基酸本身)及其中間代謝物，例如乙?；腚装彼?、蛋氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、亞?；撬?、半胱亞磺酸、磺基丙氨酸、硫代半胱氨酸、牛磺酸、黎豆氨酸、胱硫醚、S-烯丙基半胱氨酸、蘑菇香精、乙硫氨酸等。
其中，亞牛磺酸在包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物的主要臟器，例如心臟、腦、肝臟等中含有。另外，也沒(méi)有報(bào)道對(duì)皮膚的刺激、搔癢、斑疹等副作用，是安全性非常優(yōu)良的氨基乙基化合物。另外，亞?；撬嵬ǔ？梢杂砂腚装彼岬饶軌颢@得的硫化合物按照公知的方法制備后使用，也可以使用市售品。因此，本發(fā)明人等更多地規(guī)劃了亞?；撬岬氖褂谩?br> 按照本發(fā)明，上述有效成分可以將以上作為優(yōu)選物質(zhì)例舉的生藥與其它有效成分組合使用，更優(yōu)選將作為生藥的palo azul與甘油以及碳原子數(shù)4～6的糖醇中任意一種組合使用，將作為生藥的palo azul與甘油以及谷胱甘肽或亞?；撬峤M合使用，將作為生藥的生藥paloazul與甘油以及抗壞血酸組合使用，或者將作為生藥的生藥palo azul與甘油以及甜菜堿化合物或其衍生物組合使用。另一方面，甘油以及碳原子數(shù)4～6的任意一種與以上作為具體物質(zhì)例舉的生藥，特別是生藥carqueja(南美)、生藥macelamista(南美)和/或生藥palo azul(南美)的組合也是組合使用有效成分時(shí)優(yōu)選的方式。
另外，以上藥物的配制可以按照其自身公知的方法，例如“廣川藥用植物大事典，木島正夫等編輯，昭和55年，株式會(huì)社廣川書店發(fā)行”記載的方法進(jìn)行。
本發(fā)明的外用劑中，除上述有效成分以外，也可以含有化妝品和/或皮膚科用制劑中常用的基質(zhì)或添加劑，或者其它有效成分。
本發(fā)明的外用劑中，作為有效成分的甜菜堿化合物、多元醇類或具有抗氧化作用的物質(zhì)相對(duì)于外用劑的總重量可以是0.0001～20重量％，優(yōu)選0.01～1.0重量％。另外，生藥由于有效成分含量根據(jù)其劑型發(fā)生改變，因此不能限定，但相對(duì)于制劑總量可以是0.0001～20重量％(按干燥物換算，約5×10-7～2×10-1重量％)，優(yōu)選0.01～1.0重量％(按干燥物換算，約5×10-5～5×10-3重量％)。不管哪種有效成分，對(duì)于其特有的使用方式，只要以按照下述試驗(yàn)方法或評(píng)價(jià)方法得到的結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步考察志愿者試驗(yàn)性地實(shí)際使用的結(jié)果等，皮膚科領(lǐng)域的專家能夠容易地確定上述有效成分發(fā)揮效力的最適用量。
本發(fā)明的外用劑作為化妝品、藥品、保健品適用于皮膚，因此其劑型也可以采取水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、凝膠系、軟膏系、霜?jiǎng)?、?油雙相系、水-油-粉末三相系等廣泛的形態(tài)。也就是說(shuō)，如果是基礎(chǔ)化妝品，適用于洗面產(chǎn)品、化妝水、乳液、面霜、凝膠、精華素(美容液)、美容涂敷劑(pack)、面膜等形態(tài)，在上述多種劑型中可以廣泛適用。作為彩妝化妝品，可以廣泛適用于粉底等形態(tài)。而且，如果是藥品或保健品，可以廣泛適用于各種軟膏等形態(tài)。而且，本發(fā)明皮膚外用劑可以采取的形態(tài)并不受這些劑型和形態(tài)的限制。
上述基質(zhì)成分可以根據(jù)這些劑型和形態(tài)進(jìn)行選擇，而且作為基質(zhì)成分或添加劑，可以例舉水、低級(jí)烷醇、液體油脂、固體油脂、蠟類、酯油、烴油、硅氧烷樹(shù)脂、硅氧烷、陰離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子表面活性劑、低級(jí)烷醇、甾醇類、水溶性高分子、金屬離子多價(jià)螯合劑、中和劑、pH調(diào)節(jié)劑、抗菌劑、香料、色素等。
以上所述的外用劑可以通過(guò)直接給志愿者適用確認(rèn)功效，也可以在此之前，按照作為本發(fā)明另一種方式的評(píng)價(jià)物質(zhì)是否能夠抑制干燥引起皮膚損傷的方法進(jìn)行確認(rèn)。
所述評(píng)價(jià)方法中使用的人角化細(xì)胞，只要通過(guò)在被測(cè)物質(zhì)存在下和不存在下分別進(jìn)行培養(yǎng)，能夠顯著識(shí)別絲聚蛋白的量和基因表達(dá)量的變化，可以是任何細(xì)胞。但是，優(yōu)選使用由來(lái)源于人表皮的正常細(xì)胞以及作為供養(yǎng)層(支持細(xì)胞)的來(lái)源于小鼠的3T3細(xì)胞(ATCC CRL-1658)構(gòu)成的培養(yǎng)細(xì)胞系。這些細(xì)胞系例如可以按照Rheinwald等，Cell 6，331-344(1975)記載的方法進(jìn)行制作，即用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿培養(yǎng)3T3細(xì)胞，用絲裂霉素C進(jìn)行處理，形成支持細(xì)胞層后，在該層上接種人正常角化細(xì)胞，例如在95％空氣-5％二氧化碳環(huán)境中，在37℃下培養(yǎng)至鋪滿。
通常，在被測(cè)物質(zhì)不存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的系統(tǒng)(對(duì)照)優(yōu)選與在被測(cè)物質(zhì)存在的條件下培養(yǎng)的系統(tǒng)(試驗(yàn)系統(tǒng))平行地進(jìn)行處理。也可以預(yù)先在被測(cè)物質(zhì)不存在的各種條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后得到暴露于氣相后絲聚蛋白的量和絲聚蛋白基因的表達(dá)量的值，以這些值作為對(duì)照。
另外，優(yōu)選在培養(yǎng)的人角化細(xì)胞達(dá)到鋪滿后將被測(cè)物質(zhì)添加到試驗(yàn)系統(tǒng)中，直接進(jìn)行短時(shí)間(例如30分鐘)溫育的方式。
這樣培養(yǎng)的人角化細(xì)胞的氣相暴露優(yōu)選在除去培養(yǎng)基后，在例如95％空氣-5％二氧化碳環(huán)境中，37℃下溫育進(jìn)行。這種氣相暴露通?？梢栽诩s6小時(shí)內(nèi)結(jié)束。
這樣進(jìn)行了氣相暴露的培養(yǎng)人角化細(xì)胞按照絲聚蛋白量或絲聚蛋白基因表達(dá)量本身公知的測(cè)定方法，能夠評(píng)價(jià)人角化細(xì)胞由于氣相暴露受到損傷的程度或者被測(cè)物對(duì)該損傷的效力。這種評(píng)價(jià)方法對(duì)于篩選能夠防止皮膚損傷的更有效物質(zhì)有用，所述皮膚損傷是干燥引起的伴有體內(nèi)人角化細(xì)胞的絲聚蛋白降低的皮膚損傷。
以下結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是并不要用這些實(shí)例限制本發(fā)明。在說(shuō)明中使用的百分比只要沒(méi)有特別的說(shuō)明，均為重量標(biāo)準(zhǔn)。
絲聚蛋白基因表達(dá)量的測(cè)定試驗(yàn)(1)培養(yǎng)細(xì)胞使用來(lái)源于人表皮的正常角化細(xì)胞以及來(lái)源于小鼠的3T3細(xì)胞。
(2)培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)基在DMEM-Ham’s F12(3∶1)中含有氫化可的松、霍亂腸毒素、上皮增殖因子、胰島素和10％FBS。
(3)培養(yǎng)按照Rheinwald等，Cell 6，331-344(1975)記載的方法培養(yǎng)。
其概要如下所述。用絲裂霉素C處理3T3細(xì)胞，作為供養(yǎng)層(支持細(xì)胞)使用。將人正常角化細(xì)胞1×105個(gè)細(xì)胞接種在絲裂霉素C處理后的3T3細(xì)胞上，在95％空氣-5％二氧化碳環(huán)境中，37℃下培養(yǎng)至鋪滿。除去培養(yǎng)上清液，進(jìn)行氣相暴露。另外，各被測(cè)物在進(jìn)行氣相暴露30分鐘前添加，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。以未添加被測(cè)物的作為對(duì)照。氣相暴露在37℃下進(jìn)行0～6小時(shí)。
(4)絲聚蛋白量的測(cè)定在上述培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加各被測(cè)物后，由氣相暴露一定時(shí)間的細(xì)胞提取蛋白質(zhì)。按照常規(guī)方法，通過(guò)Western印跡定量絲聚蛋白或絲聚蛋白前體(前絲聚蛋白)。其概要如下所述。對(duì)于提取的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE進(jìn)行電泳后，復(fù)制到PDVF膜上，使用對(duì)絲聚蛋白特異的小鼠單克隆抗體(抗人絲聚蛋白單克隆抗體，anti-HUMAN Filaggrin MAb)作為一次抗體進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。然后，使用通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase)或堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase)標(biāo)記的抗體作為二次抗體進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。反應(yīng)后，通過(guò)使用與標(biāo)記酶對(duì)應(yīng)的色原基質(zhì)進(jìn)行酶反應(yīng)的顯色法或者化學(xué)顯色法進(jìn)行測(cè)定。譜帶的定量使用NIH圖像(解析程序)進(jìn)行。
(5)絲聚蛋白基因表達(dá)量的測(cè)定在上述培養(yǎng)系統(tǒng)中添加各被測(cè)物后，采用AGPC法由氣相暴露一定時(shí)間的細(xì)胞提取RNA。對(duì)于這些RNA，如下所述進(jìn)行RT-PCR。以McKinley-Grant L.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，4848-4852(1989)報(bào)道的絲聚蛋白的堿基序列為基礎(chǔ)，制作對(duì)絲聚蛋白特異的引物。RT-PCR是將mRNA用反轉(zhuǎn)錄酶一次轉(zhuǎn)變成cDNA，以其作為模板，使用上述引物進(jìn)行聚合酶反應(yīng)(公知的反應(yīng))，測(cè)定絲聚蛋白的mRNA。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將電泳后的凝膠浸漬于溴乙錠溶液中后，測(cè)定DNA。DNA譜帶的定量使用NIH圖像(解析程序)進(jìn)行。補(bǔ)正使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)進(jìn)行。
(6)結(jié)果(6-1)將人角化細(xì)胞暴露于氣相時(shí)絲聚蛋白量的經(jīng)時(shí)變化如圖1所示。根據(jù)圖可以得知，人角化細(xì)胞的絲聚蛋白由于干燥顯著降低。
(6-2)通過(guò)上述氣相暴露，人角化細(xì)胞的絲聚蛋白基因表達(dá)量的經(jīng)時(shí)變化如圖2所示。根據(jù)圖可以得知，人角化細(xì)胞的絲聚蛋白基因表達(dá)由于干燥顯著降低。另外，其降低在比較短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)。
(6-3)通過(guò)有無(wú)向培養(yǎng)系統(tǒng)添加該樣品(10％甘油)得到的絲聚蛋白量評(píng)價(jià)對(duì)于人角化細(xì)胞由于暴露于氣相(干燥刺激)對(duì)絲聚蛋白量的損傷的抑制作用。結(jié)果如圖3所示。
(6-4)通過(guò)有無(wú)向培養(yǎng)系統(tǒng)添加該樣品(甘油和三甲基甘氨酸)得到的絲聚蛋白基因表達(dá)量評(píng)價(jià)對(duì)于人角化細(xì)胞由于暴露于氣相(干燥刺激)使絲聚蛋白基因表達(dá)降低的損傷的抑制作用。結(jié)果如圖4所示。
(6-5)通過(guò)有無(wú)向培養(yǎng)系統(tǒng)添加生藥提取物得到的絲聚蛋白基因表達(dá)量評(píng)價(jià)對(duì)于人角化細(xì)胞由于干燥使絲聚蛋白基因表達(dá)降低的損傷的抑制作用。結(jié)果如圖5所示。
(6-6)通過(guò)有無(wú)向培養(yǎng)系統(tǒng)添加抗壞血酸和谷胱甘肽得到的絲聚蛋白基因表達(dá)量評(píng)價(jià)對(duì)于人角化細(xì)胞由于干燥使絲聚蛋白基因表達(dá)降低的損傷的抑制作用。結(jié)果如圖6所示。
(6-7)對(duì)于人角化細(xì)胞由于干燥使絲聚蛋白基因表達(dá)降低的損傷的抑制作用，即，有無(wú)向培養(yǎng)系統(tǒng)添加亞?；撬岬玫降慕z聚蛋白基因表達(dá)量的變化如圖7所示。同時(shí)也顯示出濃度依賴性。
(6-8)對(duì)于培養(yǎng)的人角化細(xì)胞由于干燥引起絲聚蛋白基因表達(dá)降低有效的其它有效成分以及有效成分組合的效力如下述表1和表2所示。表中，以干燥前的基因表達(dá)為100％，以干燥后的基因表達(dá)為0％，用添加藥物產(chǎn)生的基因表達(dá)降低抑制率表示。表1中，有效成分以提取物濃度0.5％添加。另外，在表2中，使用其中所示的有效成分和濃度(重量％)的組合物進(jìn)行試驗(yàn)。
表1

表2

另外，上述恢復(fù)率(％)表示通過(guò)添加各種被測(cè)物質(zhì)，恢復(fù)到未給予干燥刺激的未處理組中絲聚蛋白基因表達(dá)水平的何種程度。
由這些圖和表可以確認(rèn)，本發(fā)明的制劑能夠顯著抑制人角化細(xì)胞由于干燥導(dǎo)致的角質(zhì)層水分量降低，顯著抑制以保持角質(zhì)層水分所必需的氨基酸作為原料的絲聚蛋白量和基因表達(dá)的降低。
以下，列出本發(fā)明制劑的配方例。均可以按照常規(guī)方法配制。另外，制劑中各成分的含量只要沒(méi)有特別的說(shuō)明，均表示重量％。
配方例1(面霜)二十二烷醇 1.0硬脂醇 2.0角鯊?fù)?10.0四辛酸季戊四醇酯 5.0羊毛脂 5.0對(duì)羥基苯甲酸酯 0.3聚氧乙烯二十二烷醇 1.0甘油 10.0生藥提取物(生藥carqueja) 0.2乙?；该髻|(zhì)酸鈉 0.1蒸餾水 余量配方例2(面霜)角鯊?fù)?10.0肉豆蔻酸異丙酯 20.0十甲基環(huán)戊烷己烷 35.0烷基改性羧基乙烯基聚合物 0.05脫水山梨醇單油酸酯 5.0一縮二丙二醇 3.0生藥提取物(生藥macelamista)1.0蒸餾水 余量配方例3(面霜)液體石蠟 10.0八甲基環(huán)四硅氧烷 5.01，3-丁二醇10.0
甘油3.0抗壞血酸衍生物 3.0三甲基甘氨酸0.5羧基乙烯基聚合物0.15黃原膠 0.25硬脂酸 1.5鯨蠟醇 0.5聚氧乙烯(10)單油酸酯1.0硬脂酸單甘油酯 1.0乙醇3.0香料適量蒸餾水 余量配方例4(面霜)鯨蠟硬脂醇(セトステアリルアルコ-ル) 3.5角鯊?fù)? 20.0蜂蠟3.0羊毛脂 5.0對(duì)羥基苯甲酸酯 0.3聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單棕櫚酸酯2.0硬脂酸單甘油酯 2.0生藥提取液(生藥palo azul) 2.0維生素A 2.0香料適量蒸餾水 余量配方例5(面霜)滑石3.0二氧化鈦5.0紅氧化鐵0.5黃氧化鐵1.4黑氧化鐵1.0
單硬脂酸聚氧乙烯脫水山梨醇 0.9三乙醇胺 1.0丙二醇 5.0生藥提取物(或者三甲基甘氨酸或新海藻糖) 1.0硬脂酸 2.2異十六烷醇 7.0硬脂酸單甘油酯 2.0羊毛脂 2.0石蠟 8.0對(duì)羥基苯甲酸酯 適量香料 適量配方例6(面霜)液體石蠟 5.0凡士林 2.0聚甲基硅氧烷 1.0硬脂醇 2.0二十二烷醇 2.0硬化油 1.0角鯊?fù)? 5.0硬脂酸 2.02-乙基己酸十六烷基酯 4.0自身乳化型單硬脂酸甘油酯 2.04-叔-4’-甲氧基苯甲?；淄? 0.1澳洲堅(jiān)果油(マカデミアナツツ油) 1.0偏磷酸鈉 0.02胎盤提取物 1.0對(duì)羥基苯甲酸酯 適量色素 適量甘油 5.0一縮二丙二醇 5.01，3-丁二醇 3.0
植物提取液(生藥palo azul)1.0植物提取液(植物イザヨウバラ果實(shí)) 0.5蒸餾水 余量配方例7(面霜)聚甲基硅氧烷 2.0十甲基環(huán)戊硅氧烷 10.0聚氧乙烯·聚甲基硅氧烷聚合物 3.0二甲基二硬脂基銨鋰錳脫石 3.0政府規(guī)定改性醇 2.0甘油 5.0一縮二丙二醇 3.0聚乙二醇 1.0偏磷酸鈉 0.05植物提取液(生藥palo azul)2.0植物提取液(生藥サクラリ-フ提取物)1.0對(duì)羥基苯甲酸酯 適量乙二胺四乙酸三鈉 0.05色素 適量香料 適量蒸餾水 余量配方例8(面霜)聚甲基硅氧烷 5.0十甲基環(huán)戊硅氧烷 10.0聚氧乙烯·聚甲基硅氧烷共聚物 0.5聚(氧乙烯·氧丙烯)聚甲基硅氧烷共聚物 0.5球狀聚丙烯酸烷基酯 2.0甘油 5.0植物提取液(生藥palo azul)0.05植物提取液(生藥黃芩水SE) 2.01，3-丁二醇 5.0
氯化鈉 2.0偏磷酸鈉 0.05苯氧基乙醇 適量乙二胺四乙酸三鈉 0.05色素 適量香料 適量蒸餾水 余量配方例9(面霜)聚甲基硅氧烷 5.0十甲基環(huán)戊硅氧烷 15.0二十二烷醇 1.0鯊肝醇 1.0白蠟 2.0三(2-乙基己酸)甘油酯 2.0辛酸十六烷基酯 2.0甘油 4.0植物提取液(生藥palo azul) 0.1植物提取液(生藥金鏤梅) 0.2一縮二丙二醇 6.0乙二胺四乙酸三鈉 0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量香料 適量蒸餾水 余量配方例10(面霜)凡士林 1.0聚甲基硅氧烷 2.0角鯊?fù)?2.0甘油 5.0一縮二丙二醇 3.01，3-丁二醇3.0
聚乙二醇 2.0植物提取液(生藥palo azul) 2.0植物提取液(生藥黃芩水SE) 1.0氫氧化鉀 0.25偏磷酸鈉 0.05色素 適量對(duì)羥基苯甲酸酯 適量黃原膠 0.1丙烯酸·甲基丙烯酸烷基酯共聚物 0.1羧基乙烯基聚合物 0.5蒸餾水 余量配方例11(面霜)液體石蠟 8.0凡士林 2.0聚甲基硅氧烷 2.0硬脂醇 2.0二十二烷醇 2.0四辛酸季戊四醇酯 3.0異硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 2.0單硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 2.0親油型單硬脂酸甘油酯 2.04-叔丁基-4’-甲氧基苯甲?；淄?.05對(duì)甲氧基桂皮酸2-乙基己酯 0.5羥乙基纖維素 0.5羧基乙烯基聚合物 0.04乙二胺四乙酸三鈉 0.05植物提取液(生藥palo azul) 1.0植物提取液(生藥熏衣草油) 1.0甘油 5.0一縮二丙二醇 5.0香料 適量對(duì)羥基苯甲酸酯適量蒸餾水余量配方例12(面霜)凡士林2.0聚甲基硅氧烷 2.0二十二烷醇0.5鯊肝醇0.5霍霍巴油 3.0角鯊?fù)?.0四辛酸季戊四醇酯 1.0聚氧乙烯硬化蓖麻油0.5政府規(guī)定改性醇5.0植物提取液(生藥palo azul) 1.5植物提取液(生藥鹿蹄草)0.5甘油 5.01，3-丁二醇 5.0聚乙二醇 2.0氫氧化鉀 0.09對(duì)羥基苯甲酸酯適量乙二胺四乙酸三鈉 0.05色素 適量黃原膠0.05偏磷酸鈉 0.05羧基乙烯基聚合物 0.25蒸餾水余量配方例13(面霜)液體石蠟 10.0聚甲基硅氧烷 5.0角鯊?fù)?.0四(2-乙基己酸)季戊四醇酯 5.0
植物提取液(生藥palo azul) 0.05植物提取液(生藥百里香提取物)2.01，3-丁二醇 5.0赤蘚醇 5.0聚乙二醇5.0氫氧化鉀0.1偏磷酸鈉0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量苯氧基乙醇 適量羥丙基甲基纖維素0.2聚乙烯醇0.2羧基乙烯基聚合物0.1丙烯酸·甲基丙烯酸烷基酯共聚物 0.1色素適量香料適量蒸餾水 余量配方例14(面霜)液體石蠟5.0凡士林 5.0地蠟2.0角鯊?fù)? 15.0蜂蠟0.5二異硬脂酸聚甘油酯 5.0植物提取液(生藥palo azul) 0.05植物提取液(生藥マジヨラム提取物)1.0聚乙烯粉末 適量丙二醇 適量谷氨酸鈉適量絲氨酸 適量甘氨酸 適量尿囊素 適量香料適量氯化鈉 適量蒸餾水 余量配方例15(面霜)烯烴低聚物 8.0凡士林 5.0地蠟4.0角鯊?fù)? 18.0蜂蠟1.0二異硬脂酸聚甘油酯 5.0絲氨酸 適量偏磷酸鈉0.05植物提取液(生藥palo azul) 0.5植物提取液(生藥千葉蕃) 1.0甘油2.01，3-丁二醇 5.0氯化鈉 適量聚乙烯粉末 0.1對(duì)羥基苯甲酸酯 適量香料適量色素適量蒸餾水 余量配方例16(面霜)烯烴低聚物 6.0十甲基環(huán)戊烷硅氧烷 18.0聚氧乙烯·聚甲基硅氧烷共聚物2.0聚甲基苯基硅氧烷1.0硬脂醇 0.5二十二烷醇 1.3澳洲堅(jiān)果油脂肪酸植物甾醇酯 0.3
N-硬脂酰基-L-谷氨酸鈉 0.9二甲基二硬脂基銨鋰蒙脫石0.8甘油4.0植物提取液(生藥palo azul) 5.01，3-丁二醇 5.0氯化鈉 0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量苯氧基乙醇 適量色素適量香料適量蒸餾水 余量配方例17(乳液)聚甲基硅氧烷2.0十甲基環(huán)戊硅氧烷2.0角鯊?fù)? 2.0政府規(guī)定改性醇 5.0甘油5.01，3-丁二醇 5.0聚氧乙烯甲基葡糖苷 5.0植物提取液(生藥palo azul) 0.02氫氧化鉀0.1偏磷酸鈉0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量色素適量羧基乙烯基聚合物0.15丙烯酸·甲基丙烯酸烷基酯共聚物 0.1蒸餾水 余量配方例18(乳液)聚甲基硅氧烷2.0二十二烷醇 0.5
鯊肝醇0.5硬化油3.0角鯊?fù)?.0四(2-乙基己酸)季戊四醇酯 2.0異硬脂酸聚氧乙烯甘油酯1.5單硬脂酸聚氧乙烯甘油酯1.5甘油 5.01，3-丁二醇 5.0赤蘚醇3.0植物提取液(生藥palo azul) 0.05氫氧化鉀 0.05偏磷酸鈉 0.03苯氧基乙醇適量羧基乙烯基聚合物 0.12蒸餾水余量配方例19(乳液)液體石蠟 8.0凡士林3.0十甲基環(huán)戊硅氧烷 1.0二十二烷醇2.0霍霍巴油 1.0硬脂酸1.0二十二烷酸0.5四(2-乙基己酸)季戊四醇酯 3.02-乙基己酸十六烷基酯 3.0自身乳化型單硬脂酸甘油酯 1.5對(duì)甲氧基桂皮酸2-乙基己酯 0.1甘油 8.0植物提取液(生藥palo azul) 5.0一縮二丙二醇 5.0聚乙二醇 5.0
氫氧化鉀0.1偏磷酸鈉0.05乙二胺四乙酸三鈉0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量色素適量香料適量蒸餾水 余量配方例20(乳液)十甲基環(huán)戊硅氧烷15.0聚氧乙烯·聚甲基硅氧烷聚合物3.0澳洲堅(jiān)果油 1.0角鯊?fù)? 2.0羥基硬脂酸膽甾醇酯 0.22-乙基己酸十六烷基酯2.0氯化二硬脂基二甲基銨0.3甘油8.01，3-丁二醇 5.0植物提取液(生藥palo azul) 3.0麥芽糖醇液 2.0乙二胺四乙酸三鈉0.05硅酸鋁鎂0.3對(duì)羥基苯甲酸酯 適量色素適量離子交換水 余量配方例21(乳液)角鯊?fù)? 0.2羥基硬脂酸膽甾醇酯 0.1三(2-乙基己酸)甘油酯0.4聚氧乙烯硬化蓖麻油 0.4二異硬脂酸聚甘油酯 0.3
改性醇5.0甘油 2.0植物提取液(生藥palo azul) 1.0一縮二丙二醇 5.0聚乙二醇 2.0氫氧化鉀 0.6乙二胺四乙酸三鈉 0.05黃原膠0.2羥乙基纖維素 0.03羧基乙烯基聚合物 0.3香料 適量對(duì)羥基苯甲酸酯適量蒸餾水余量配方例22(乳液)凡士林5.0二十二烷醇0.5硬化油1.5霍霍巴油 2.5角鯊?fù)?.0四辛酸季戊四醇酯 3.0聚氧乙烯硬化蓖麻油0.5甘油 5.01，3-丁二醇 5.0聚乙二醇 2.0植物提取液(生藥palo azul) 1.0氫氧化鉀 0.07羧基乙烯基聚合物 0.2對(duì)羥基苯甲酸酯適量色素 適量蒸餾水余量配方例23(乳液)凡士林2.0聚甲基硅氧烷 2.0二十二烷醇0.3鯊肝醇0.3羥基硬脂酸膽甾醇酯0.14-叔丁基-4’-甲氧基苯甲?；淄? 0.1改性醇3.0甘油 8.0植物提取液(生藥palo azul) 1.01，3-丁二醇 4.0聚乙二醇 3.0椰子油脂肪酸水解膠原鉀液 0.2氫氧化鉀 0.08乙二胺四乙酸三鈉 0.05黃原膠0.05羧基乙烯基聚合物 0.22色素 適量對(duì)羥基苯甲酸酯適量香料 適量蒸餾水余量配方例24(乳液)凡士林0.7聚甲基硅氧烷 0.3二十二烷醇0.7角鯊?fù)?.02-乙基己酸十六烷基酯 0.5N-硬脂?；?L-谷氨酸鈉 0.3改性醇3.0甘油 4.0一縮二丙二醇 6.0
1，3-丁二醇 4.0植物提取液(生藥palo azul) 1.0氫氧化鉀0.07偏磷酸鈉0.01黃原膠 0.02羧基乙烯基聚合物0.14色素適量對(duì)羥基苯甲酸酯 適量香料適量蒸餾水 余量配方例25(化妝水)1，3-丁二醇 6.0甘油4.0油醇0.1POE(20)脫水山梨醇單月桂酸酯 0.5POE(15)月桂醇醚 0.5植物提取液(生藥palo azul) 1.0植物提取液(生藥金鏤梅) 0.5乙醇10.0香料適量色素適量蒸餾水 余量配方例26(化妝水)山梨醇 4.0一縮二丙二醇6.0PEG 15005.0POE(20)油醇醚 0.5甲基纖維素 0.2クインズシ-ド提取物 0.1植物提取液(生藥palo azul) 0.5
植物提取液(生藥黃芩水SE) 0.1乙醇 10.0香料 適量色素 適量蒸餾水 余量配方例27(化妝水)1，3-丁二醇 6.0甘油 3.0PEG 4000 3.0橄欖油 0.5POE(20)脫水山梨醇單硬脂酸酯 1.5POE(5)油醇醚 0.3乙醇 10.0植物提取液(生藥palo azul)0.3植物提取液(生藥マジヨラム提取物) 1.5香料 適量色素 適量蒸餾水 余量配方例28(化妝水)一縮二丙二醇 1.0山梨醇 1.0POE(20)油醇醚1.0苯酚磺酸鋅 0.2枸櫞酸 0.1乙醇 15.0植物提取液(生藥palo azul)0.3植物提取液(生藥イザヨイバラ果實(shí)) 1.5香料 適量色素 適量蒸餾水 余量配方例29(化妝水)1，3-丁二醇 6.0一縮二丙二醇 6.0PEG 400 6.0POE(20)脫水山梨醇單月桂酸酯 1.0聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物 1.5乙醇 15.0植物提取液(生藥黃芩水SE) 1.0植物提取液(生藥イザヨイバラ果實(shí)) 0.5香料 適量色素 適量蒸餾水 余量配方例30(面霜)二十二烷醇 1.0硬脂醇 2.0角鯊?fù)? 10.0四辛酸季戊四醇酯 5.0羊毛脂 5.0對(duì)羥基苯甲酸酯 0.3聚氧乙烯二十二烷醇 1.0甘油 10.0亞?；撬?0.1乙?；该髻|(zhì)酸鈉 0.1蒸餾水 余量配方例31(乳液)角鯊?fù)? 10.0肉豆蔻酸異丙酯 20.0十甲基環(huán)戊烷己烷 35.0烷基改性羧基乙烯基聚合物 0.05
脫水山梨醇單油酸酯5.0一縮二丙二醇 3.0谷胱甘肽 1.0蒸餾水余量配方例32(乳液)液體石蠟 10.0八甲基環(huán)四硅氧烷 5.01，3-丁二醇 10.0甘油 3.0抗壞血酸衍生物3.0谷胱甘肽 0.1羧基乙烯基聚合物 0.15黃原膠0.25硬脂酸1.5鯨蠟醇0.5聚氧乙烯(10)單油酸酯 1.0硬脂酸單甘油酯1.0乙醇 3.0香料 適量蒸餾水余量配方例33(面霜)鯨蠟硬脂醇3.5角鯊?fù)?0.0蜂蠟 3.0羊毛脂5.0對(duì)羥基苯甲酸酯0.3聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單棕櫚酸酯 2.0硬脂酸單甘油酯2.0亞牛磺酸 0.1維生素A 2.0
香料 適量蒸餾水 余量配方例34(粉底)滑石 3.0二氧化鈦 5.0紅氧化鐵 0.5黃氧化鐵 1.4黑氧化鐵 1.0單硬脂酸聚氧乙烯脫水山梨醇酯 0.9三乙醇胺 1.0丙二醇 5.0亞?；撬? 1.0硬脂酸 2.2異十六烷醇 7.0硬脂酸單甘油酯 2.0羊毛脂 2.0石蠟 8.0對(duì)羥基苯甲酸酯 適量香料 適量配方例35(面霜)液體石蠟 3凡士林 1聚甲基硅氧烷 1硬脂醇 1.8二十二烷醇 1.6甘油 8一縮二丙二醇 5澳洲堅(jiān)果油 2硬化油 3角鯊?fù)?6
木糖醇 3硬脂酸 2羥基硬脂酸膽甾醇酯 0.52-乙基己酸十六烷基酯4自身乳化型單硬脂酸甘油酯3氫氧化鉀0.15偏磷酸鈉0.05三甲基甘氨酸2DL-α-生育酚2-L-抗壞血酸磷酸二酯鉀 1醋酸DL-α-生育酚0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.05甜茶提取物 0.1對(duì)羥基苯甲酸酯 適量乙二胺四乙酸三鈉0.054-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰基甲烷 0.05二對(duì)甲氧基桂皮酸一(2-乙基己酸)甘油酯0.05紅氧化鐵適量黃氧化鐵適量羧基乙烯基聚合物0.05蒸餾水 余量配方例36(面霜)液體石蠟8凡士林 3聚甲基硅氧烷2硬脂醇 3二十二烷醇 2甘油5一縮二丙二醇4木糖醇 1四(2-乙基己酸)季戊四醇酯4異硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 2
單硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 1親油型單硬脂酸甘油酯2枸櫞酸 0.05枸櫞酸鈉0.05氫氧化鉀0.015Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.1肝臟(カンゾウ)類黃酮0.1棕櫚酸視黃醇(パルミチンレチノ-ル)(100 0.25萬(wàn)單位)醋酸DL-α-生育酚0.1對(duì)羥基苯甲酸酯 適量苯氧基乙醇 適量二丁基羥基甲苯 0.1乙二胺四乙酸三鈉0.054-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲?；淄? 0.01對(duì)甲氧基桂皮酸2-乙基己酯0.1B-胡蘿卜素 0.01聚乙烯醇0.5羥乙基纖維素0.5羧基乙烯基聚合物0.05蒸餾水 余量香料適量配方例37(保濕面霜)液體石蠟10聚甲基硅氧烷2甘油101，3-丁二醇 2赤蘚醇 1木糖醇 1.5聚乙二醇15005角鯊?fù)? 15
四(2-乙基己酸)季戊四醇酯5氫氧化鉀0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.08偏磷酸鈉0.05醋酸生育酚 0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量羥丙基甲基纖維素0.3聚乙烯醇0.1羧基乙烯基聚合物0.2丙烯酸·甲基丙烯酸烷基酯共聚物 0.1蒸餾水 余量配方例38(面霜(不含油))シクロメチコン 30聚氧乙烯·聚甲基硅氧烷共聚物1.5甘油5一縮二丙二醇5木糖醇 3滑石5對(duì)羥基苯甲酸酯 適量Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.03苯氧基乙醇 0.3乙二胺四乙酸三鈉0.02二甲基二硬脂基銨鋰蒙脫石0.5蒸餾水 余量三甲基甲硅烷氧基硅酸0.5球狀硅酸酐 0.5微粒二氧化鈦(疏水化處理品30nm) 7球狀聚乙烯粉末 2聚(氧化乙烯·氧化丙烯)·聚甲基硅氧烷共聚1物配方例39(乳液)液體石蠟7凡士林 3十甲基環(huán)戊硅氧烷2二十二烷醇 2甘油5一縮二丙二醇7聚乙二醇15002木糖醇 2霍霍巴油1異硬脂酸0.5硬脂酸 0.5二十二烷酸 0.5四(2-乙基己酸)季戊四醇酯32-乙基己酸十六烷基酯3單硬脂酸甘油酯 1單硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 1氫氧化鉀0.1六偏磷酸鈉 0.05甘草次酸十八烷基酯 0.05L-精氨酸0.1蜂王漿提取物0.1醋酸生育酚 0.1透明質(zhì)酸鈉 0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量乙二胺四乙酸三鈉0.054-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲?；淄? 0.1對(duì)甲氧基桂皮酸2-乙基己酯0.1黃氧化鐵適量羧基乙烯基聚合物0.15蒸餾水 余量香料 適量配方例40(乳液)聚甲基硅氧烷 2二十二烷醇 1鯊肝醇 0.5甘油 51，3-丁二醇7木糖醇 2赤蘚醇 2硬化油 3角鯊?fù)?6四(2-乙基己酸)季戊四醇酯 2異硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 1單硬脂酸聚氧乙烯甘油酯 1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.1氫氧化鉀 適量六偏磷酸鈉 0.05苯氧基乙醇 適量羧基乙烯基聚合物 0.11蒸餾水 余量配方例41(皺紋護(hù)理用乳液)十甲基環(huán)戊硅氧烷 15三甲基甲硅烷氧基硅酸 5聚氧乙烯·聚甲基硅氧烷共聚物 5甘油 51，3-丁二醇5麥芽糖醇液 2澳洲堅(jiān)果油 2角鯊?fù)?2木糖醇 3
羥基硬脂酸膽甾醇酯 0.52-乙基己酸十六烷基酯 2氯化二硬脂基二甲基銨 0.2L-抗壞血酸硫酸酯二鈉 0.1DL-α-生育酚2-L-抗壞血酸磷酸二酯鉀 0.1醋酸生育酚 0.05魚膠原 0.4硫酸軟骨素鈉 0.01透明質(zhì)酸鈉 0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.1對(duì)羥基苯甲酸酯 適量乙二胺四乙酸三鈉 0.05二對(duì)甲氧基桂皮酸一(2-乙基己酸)甘油酯 0.05硅酸鋁鎂 0.3蒸餾水 余量配方例42(乳液)聚甲基硅氧烷 3十甲基環(huán)戊硅氧烷 4乙醇 5甘油 61，3-丁二醇 5聚氧乙烯甲基葡糖苷 3向日葵油 1角鯊?fù)? 2木糖醇 3氫氧化鉀 0.1六偏磷酸鈉 0.05羥丙基-β-環(huán)糊精 0.1甘草酸二鉀 0.05枇杷葉提取物 0.1L-谷氨酸鈉 0.05
茴香提取物 0.1熏衣草油0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.05對(duì)羥基苯甲酸酯 適量二嗎啉基噠嗪0.1紅氧化鐵適量黃氧化鐵適量黃原膠 0.1羧基乙烯基聚合物0.1丙烯酸·甲基丙烯酸烷基酯共聚物 0.1蒸餾水 余量配方例43(乳液)凡士林 5二十二烷醇 0.4鯊肝醇 0.4甘油71，3-丁二醇 7木糖醇 3聚乙二醇20000 2硬化油 2霍霍巴油2角鯊?fù)? 5異硬脂酸0.4四(2-乙基己酸)季戊四醇酯2聚氧乙烯硬化蓖麻油 0.5月桂基二甲氨基乙酸甜菜堿0.4氫氧化鉀適量焦亞硫酸鈉 0.01六偏磷酸鈉 0.05甘草酸二鉀 0.05三甲基甘氨酸3
熊果苷 3酵母提取物 0.1醋酸生育酚 0.1硫代?；撬?0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.05苦參提取物 0.1苯氧基乙醇 適量紅氧化鐵 適量クインズシ-ド提取物0.1羧基乙烯基聚合物 0.2蒸餾水 余量配方例44(化妝水)乙醇 5甘油 21，3-丁二醇5聚氧乙烯聚氧丙烯癸基十四烷基醚 0.2六偏磷酸鈉 0.03三甲基甘氨酸 1木糖醇 3聚天冬氨酸鈉 0.1DL-α-生育酚2-L-抗壞血酸磷酸二酯鉀 0.1硫代?；撬?0.1綠茶提取物 0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.05鳶尾根提取物 0.1苯氧基乙醇 0.12乙二胺羥乙基乙酸三鈉(HEDTA)0.07羧基乙烯基聚合物鉀 0.09蒸餾水 余量香料 適量配方例45(化妝水)甘油 21，3-丁二醇 4赤蘚醇2木糖醇3Palo azul提取液(生藥palo azul)0.2聚氧乙烯甲基葡糖苷1聚氧乙烯硬化蓖麻油0.5枸櫞酸0.02枸櫞酸鈉 0.08苯氧基乙醇0.25N-椰子油脂肪酸?；鵏-精氨酸乙酯·DL-吡咯 0.1烷酮甲酸蒸餾水余量配方例46(化妝水)乙醇 5甘油 0.1一縮二丙二醇 21，3-丁二醇 6木糖醇6迷迭香油 0.001洋蘇葉油 0.001枸櫞酸0.02枸櫞酸鈉 0.08六偏磷酸鈉0.03羥丙基-β-環(huán)糊精 0.1無(wú)患子提取物 0.1玫瑰果提取物 0.1百合提取物0.1黃柏提取物0.1トゲナシ提取物0.1
樹(shù)莓提取物 0.1熏衣草油 0.1桃仁提取物 0.1Palo azul提取液(生藥palo azul) 0.1精氨酸鈉 0.001蒸餾水 余量工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的外用劑能夠顯著防止人角化細(xì)胞由于干燥引起的角質(zhì)層水分量降低，同時(shí)能夠抑制角質(zhì)層的皮膚屏障功能降低。因此，本發(fā)明能夠在化妝品或皮膚科制劑的制造業(yè)中利用。
權(quán)利要求
1.一種皮膚外用劑，其中含有對(duì)于抑制人皮膚角質(zhì)層的屏障功能降低和保濕功能降低來(lái)說(shuō)足夠量的能夠顯著抑制培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)，以及在化妝品和/或皮膚科制劑中允許使用的基質(zhì)或添加劑。
2.如權(quán)利要求1所述的皮膚外用劑，其中該能夠顯著抑制絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)是選自甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物、生藥、以及具有抗氧化作用的物質(zhì)中的1種或2種以上。
3.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，甜菜堿化合物及其衍生物選自甘氨酸甜菜堿、磺基甜菜堿、γ-丁內(nèi)銨鹽、癸基甜菜堿、月桂基甜菜堿、肉豆蔻基甜菜堿、十六烷基甜菜堿、硬脂基甜菜堿、二十二烷基甜菜堿、月桂酰氨基丙基甜菜堿、油酰氨基丙基甜菜堿、棕櫚酰氨基丙基甜菜堿、γ-丁內(nèi)銨鹽、月桂基磺基甜菜堿、可可磺基甜菜堿、聚(甲基丙烯酰氧基乙基甜菜堿)和(甲基丙烯酰氧基乙基甜菜堿-甲基丙烯酸2-羥乙酯)共聚物。
4.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，多元醇及其衍生物選自甘油、1，3-丙二醇、2-甲基-1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、二甘油、赤蘚醇、葡糖酸、1，2，6-己三醇、肌醇、乳糖醇、麥芽糖醇、甘露糖醇和木糖醇。
5.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，生藥選自菊科(Compositae)的酒神菊屬(Baccharis)植物，特別是來(lái)源于Baccharisgenistelloids的生藥carqueja(南美)，Achyrocline屬植物，特別是來(lái)源于Achyrocline satureoides的生藥macelamista(南美)，以及蓍草屬(Achillea)植物，特別是來(lái)源于千葉蕃(Achilleamillefolium L.)的生藥千葉蕃；唇形科(Labiatae)的百里香屬(Thymus)植物，特別是來(lái)源于百里香(Thymus serphyllum Linnesubsp.serphyllum)的生藥百里香提取物，牛至屬(Origanum)植物，特別是來(lái)源于馬郁蘭(origanum majorana L.)的生藥マジヨラム提取物，黃芩屬(Scutellaria)植物，特別是來(lái)源于黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的生藥黃芩，以及熏衣草屬(Lavandula)植物，特別是來(lái)源于熏衣草(Lavandula officinalls)的生藥熏衣草油；薔薇科(Rosaceae)的薔薇屬(Rosa)植物，特別是來(lái)源于Rosa roxburghii)的生藥イザヨウバラ果實(shí)，以及李屬(Prunus)植物，特別是來(lái)源于サトザクラ(Prunus lannesiana(Corr.)Wilson var.Spciosa(Koidz)Makino)的生藥サクラリ-フ提取物；金鏤梅科(Hamamelidaceae)的金縷梅屬(Hamamelis)植物，特別是來(lái)源于北美金鏤梅(Hamamelis virginiana L.)的生藥金鏤梅；鹿蹄草科(Pyrolaceae)的鹿蹄草屬(Pyrola)植物，特別是來(lái)源于鹿蹄草(Pyrola japonicus Klenze)的生藥鹿蹄草；以及豆科(Leguminosae)的Eys enhardtia屬植物，特別是來(lái)源于Eysenhardtia polistachya的生藥palo azul(南美)。
6.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，具有抗氧化作用的物質(zhì)選自抗壞血酸及其鹽或衍生物、以及含有含硫氨基酸的化合物及其中間代謝產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，具有抗氧化作用的物質(zhì)選自谷胱甘肽和亞?；撬?。
8.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，含有生藥與選自甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物以及具有抗氧化作用的物質(zhì)中的1種以上的組合。
9.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，含有作為生藥的生藥paloazul與甘油以及碳原子數(shù)4～6的糖醇中任意一種，作為生藥的生藥palo azul與甘油以及谷胱甘肽或亞牛磺酸，作為生藥的生藥paloazul與甘油以及抗壞血酸或其鹽或其衍生物，或者作為生藥的生藥palo azul與甘油以及甜菜堿化合物或其衍生物。
10.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，含有作為生藥的生藥paloazul、甘油以及木糖醇。
11.如權(quán)利要求2所述的皮膚外用劑，含有甘油以及碳原子數(shù)4～6的糖醇中任意一種與生藥。
12.一種皮膚外用劑，含有作為生藥的生藥palo azul與甘油以及碳原子數(shù)4～6的糖醇中任意一種，作為生藥的生藥palo azul與甘油以及谷胱甘肽或亞?；撬?，作為生藥的生藥palo azul與甘油以及抗壞血酸或其鹽或其衍生物，或者作為生藥的生藥palo azul與甘油以及甜菜堿化合物或其衍生物。
13.如權(quán)利要求12所述的皮膚外用劑，含有作為生藥的生藥paloazul、甘油以及木糖醇。
14.能夠顯著抑制培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)在制備能夠抑制人皮膚角質(zhì)層屏障功能降低的皮膚外用劑中的用途。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，該能夠顯著抑制絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)是選自甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物、生藥、以及具有抗氧化作用的物質(zhì)中的1種或2種以上。
16.如權(quán)利要求14或15所述的用途，該能夠顯著抑制絲聚蛋白基因表達(dá)能力降低的物質(zhì)含有作為生藥的生藥palo azul與甘油以及碳原子數(shù)4～6的糖醇中任意一種，作為生藥的palo azul與甘油以及谷胱甘肽或亞?；撬?，作為生藥的palo azul與甘油以及抗壞血酸或其鹽或其衍生物，或者作為生藥的生藥palo azul與甘油以及甜菜堿化合物或其衍生物。
17.一種抑制或修復(fù)干燥引起的皮膚損傷的方法，其中包括將含有選自甜菜堿化合物及其衍生物、多元醇及其衍生物、生藥、以及具有抗氧化作用的物質(zhì)中的1種或2種以上的組合物涂敷在人皮膚上的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，該組合物含有作為生藥的paloazul與甘油以及碳原子數(shù)4～6的糖醇中任意一種，作為生藥的paloazul與甘油以及谷胱甘肽或亞?；撬幔鳛樯幍纳巔alo azul與甘油以及抗壞血酸，或者作為生藥的生藥palo azul與甘油以及甜菜堿化合物或其衍生物。
19.評(píng)價(jià)物質(zhì)是否能夠抑制干燥引起皮膚損傷的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，(A)準(zhǔn)備培養(yǎng)的人角化細(xì)胞，(B)在被測(cè)物的存在下將該培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相后，檢測(cè)該角化細(xì)胞中絲聚蛋白基因的表達(dá)能力，然后(C)將檢測(cè)出的絲聚蛋白基因的表達(dá)能力與對(duì)照相比較，以表達(dá)能力的大小作為抑制這種皮膚損傷的能力的指標(biāo)。
20.如權(quán)利要求19所述的評(píng)價(jià)方法，絲聚蛋白基因的表達(dá)能力通過(guò)測(cè)定該人角化細(xì)胞中絲聚蛋白的量或絲聚蛋白的mRNA量確定。
21.如權(quán)利要求19所述的評(píng)價(jià)方法，培養(yǎng)的人角化細(xì)胞是通過(guò)在支持細(xì)胞上培養(yǎng)來(lái)源于人表皮的正常細(xì)胞得到的。
22.如權(quán)利要求19所述的評(píng)價(jià)方法，關(guān)于暴露于氣相后該角化細(xì)胞中絲聚蛋白基因的表達(dá)能力，將被測(cè)物不存在的條件下(對(duì)照)表達(dá)能力降低，而在被測(cè)物存在的條件下能夠抑制這種降低的場(chǎng)合，評(píng)價(jià)為該被測(cè)物能夠抑制干燥引起的皮膚損傷。
23.如權(quán)利要求19所述的評(píng)價(jià)方法，氣相暴露通過(guò)除去培養(yǎng)人角化細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供一種皮膚外用劑，其中含有能夠防止培養(yǎng)的人角化細(xì)胞暴露于氣相引起的絲聚蛋白基因表達(dá)降低的物質(zhì)，例如甜菜堿、多元醇、生藥類或具有抗氧化作用的物質(zhì)作為有效成分。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1484521SQ01821611
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者片桐千華, 平尾哲二, 藤田宏志, 古賀信義, 義, 二, 志 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂