專利名稱：豬牙皂總皂苷及其制備方法與其在制備藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥豬牙皂總皂苷及其制備方法，以及該總皂苷在制備治療免疫性炎癥藥物中的應用，具體為提取分離豬牙皂總皂苷，用于制備治療鼻炎和類風濕關節(jié)炎的藥物。
背景技術：
鼻炎和類風濕關節(jié)炎為臨床常見病和多發(fā)病，鼻炎的發(fā)生主要與過敏反應有關，而類風濕關節(jié)炎屬于自身免疫性疾病，兩者均屬于免疫性炎癥的范疇。目前，治療鼻炎主要采用特非那丁等抗組胺藥物或曲尼司特、酮替芬等抗過敏藥物，這些藥物對鼻炎的慢性化和反復發(fā)作療效較差或無效。對于類風濕關節(jié)炎，目前主要采用非甾體抗炎藥(雙氯滅痛、阿司匹林等)和免疫抑制劑(6-巰基嘌呤等)進行治療，但這些藥物均存在明顯的不良反應，如前者損傷胃腸道粘膜導致消化性潰瘍，后者作用選擇性差，易于誘發(fā)感染等。因此，有效成分明確、質量可控且安全高效的中藥有效部位在研制鼻炎或類風濕關節(jié)炎治療藥物方面，具有潛在的價值。
豬牙皂為豆科植物皂莢Gleditsia sinensis Lam.已衰或受傷后所結之果實。在中醫(yī)臨床，主要用于治療中風口噤、喉痹、痰喘、痞滿積滯、癰腫、疥癩和頭瘡等(中藥大辭典，上海人民衛(wèi)生出版社，1977，1144-1147)。豬牙皂富含皂苷類成分，現已從其正丁醇部位分離、鑒定了十余種齊墩果烷型三萜皂苷[Phytochemistry 1999，52(4)715-722；J.Nat.Prod.1999，62877-881；J.Nat.Prod.1999，62740-745；Chem.Pharm.Bull.1999，47388-393]。迄今為止尚未發(fā)現有關豬牙皂皂苷類成分生物活性或臨床研究的文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是如何利用現代提取分離技術獲得中藥豬牙皂的有效部位總皂苷，以及研究其在制備抗免疫性炎癥藥物中的應用，如在治療鼻炎、類風濕關節(jié)炎方面的用途。
本發(fā)明要解決的技術問題還包括研究豬牙皂總皂苷可供工業(yè)化生產的制備方法，以及豬牙皂總皂苷的組成，因為在中藥提取物中主要化學成分清楚明確有利于工業(yè)化生產中進行質量控制，從根本上保證療效和制劑質量的穩(wěn)定性。
為解決上述技術問題，現提供技術方案如下。
一種抗免疫性炎癥的豬牙皂總皂苷，其特征在于按重量百分比計，含有總三萜皂苷50-95％，該總三萜皂苷主要為齊墩果烷型三萜皂苷化合物。
所述的豬牙皂總皂苷，其特征在于可單獨或與其它中藥及中藥提取物組配，用于制備抗免疫性炎癥的藥物。
所述的豬牙皂總皂苷，其特征在于可與藥學上可接受的載體混合，用于制備抗免疫性炎癥的藥物。
前述的豬牙皂總皂苷，其特征在于抗免疫性炎癥藥物為治療鼻炎和治療類風濕關節(jié)炎藥物。
一種抗免疫性炎癥豬牙皂總皂苷的制備方法，其特征在于取豬牙皂，以乙醇提取，將提取液減壓回收至無醇味，得乙醇提取物；在該乙醇提取物中，加入乙醇至含醇量為5-15％，離心后取上清液，上樣于D101型大孔吸附樹脂柱，再分別以水和不同濃度乙醇梯度洗脫，收集60％乙醇洗脫物，回收溶劑后得豬牙皂總皂苷；或者，取上述乙醇提取物，先用氯仿萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收溶劑后得豬牙皂總皂苷。
所述方法的特征為30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶劑用量為6-7ml/g藥材，提取時間為1-3小時，合并乙醇提取液，減壓回收至無乙醇味，得乙醇提取物；取乙醇提取物，加入適量乙醇，調整乙醇濃度至12％，經離心，上清液上樣于D101型大孔吸附樹脂柱，分別以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脫，合并60％乙醇洗脫物，減壓回收，得到的干浸膏狀物即為豬牙皂總皂苷；或者，取乙醇提取物，用氯仿萃取1-3次，每次使用溶劑量為500ml/1kg藥材，然后再用500ml/1kg藥材的正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，得到的干浸膏狀物即為豬牙皂總皂苷。
前述方法的特征為使用60％的乙醇，乙醇提取次數為3次，提取時間為每次2小時；氯仿萃取次數為3次，正丁醇萃取次數為3次。
本發(fā)明的豬牙皂提取物的較詳細的制備方法如下將豬牙皂磨碎成粉末，以30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶劑用量為6-7ml/g，提取時間為1-3小時，合并乙醇提取液，減壓回收至無乙醇味，加入適量乙醇，調整乙醇濃度至15％，經離心，上清液上樣于D101型大孔吸附樹脂柱，充分吸附后，再分別以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脫，合并60％乙醇洗脫物，減壓回收，得到的干浸膏狀物即為豬牙皂總皂苷。
本發(fā)明的豬牙皂提取物還可以按照下列方法制備得到將豬牙皂磨碎成粉末，以30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶劑用量為6-7ml/g，提取時間為1-3小時，合并乙醇提取液，減壓回收至無乙醇味，用氯仿萃取所得的濃縮液1-3次，每次使用溶劑量為500ml/1kg藥材，然后再用500ml/1kg藥材的正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，得到的干浸膏狀物即為豬牙皂總皂苷。
在上述兩種制備方法中，乙醇提取的優(yōu)選濃度為60％，優(yōu)選提取次數為3次，優(yōu)選提取時間為2小時，氯仿的優(yōu)選萃取次數為3次，正丁醇的優(yōu)選萃取次數為3次。
發(fā)明人經過深入研究，發(fā)現本發(fā)明豬牙皂總皂苷主要由齊墩果烷型三萜皂苷組成，其中總皂苷的含量為50-95％。在該總皂苷中含有下列8種三萜皂苷化合物，分別以GS-1～GS-8表示。 GS-1R1＝OH R2＝CH2OH R3＝CH3(6′＝S)GS-2R1＝OH R2＝CH3(6＝S) R3＝CH3(6′＝S) GS-4R1＝HR2＝CH(6＝S)R3＝HGS-3R1＝HR2＝CH3(6＝S) R3＝CH2OH GS-5R1＝OH R2＝CH2OH R3＝Gal 本發(fā)明豬牙皂總皂苷在小鼠的口服LD50為3.428g/kg，該提取物100，200mg/kg口服給藥，對抗原(卵白蛋白)和組胺所致大鼠搔抓鼻部、打噴嚏反應及鼻腔血管通透性升高具有抑制作用，因此，可用該總皂苷作活性成分制備治療鼻炎的藥物。
本發(fā)明豬牙皂總皂苷100，200mg/kg口服給藥，明顯抑制佐劑關節(jié)炎大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性足跖腫脹，角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹及醋酸所致小鼠扭體反應，表明該提取物抑制急慢性炎癥和疼痛。因此，可用該總皂苷作活性成分制備治療類風濕關節(jié)炎及其它炎癥相關性疾病的藥物。
建議臨床患者使用豬牙皂總皂苷的劑量約為200mg/次，一天三次。具體可遵醫(yī)囑。
本發(fā)明豬牙皂總皂苷還可以作為活性成分與其它中藥提取物/有效部位或與藥學上可接受的賦型劑一起用于制備藥物組合物，該藥物組合物可采用制劑學的常規(guī)方法制備成各種劑型，如膠囊、片劑、丸劑、口服液、顆粒劑、酊劑等胃腸道給藥劑型及注射液等胃腸外給藥劑型。
方法稱取豬牙皂粗粉1kg，加入60％乙醇6.5L，加熱回流2小時，重復三次，合并乙醇提取液，減壓回收至無乙醇味，得到濃縮液，用500ml氯仿萃取所得的濃縮液3次，然后再用500ml的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，得到的干浸膏狀物164g。常規(guī)定性實驗后，經紫外分光光度法測定，該干浸膏中含有60.5％的皂苷類成分。
實例2、本發(fā)明豬牙皂總皂苷的急性毒性昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22g，給藥前禁食10小時，將50只小鼠隨機分為5組，每組10只，取按本發(fā)明實例1中方法1制備的豬牙皂總皂苷(下同)，分別口服給予5，4.25，3.613，3.071，2.61g/kg，劑間比為1∶0.85，給藥體積為0.2ml/10g體重，給藥后連續(xù)飼養(yǎng)并觀察7天，記錄各組小鼠的中毒癥狀和死亡情況，并對死亡小鼠解剖，肉眼觀察內臟病變，按Bliss法計算LD50及95％可信限。
結果，小鼠口服本發(fā)明豬牙皂總皂苷后，自發(fā)活動減少、倦怠、臥伏、進食量減少，死亡發(fā)生在給藥后的前2日內，對死亡小鼠肉眼尸檢，未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器發(fā)生明顯病變。由此推算豬牙皂總皂苷的LD50值為3.428g/kg。
表1本發(fā)明豬牙皂總皂苷在小鼠的口服急性毒性劑量對數劑量動物數死亡數死亡率機率單位LD50值及(g/kg)(x)(只) (只) (％)(Y) 95％可信限50.6991010 100 / LD503.4284.25 0.62810880 5.84 g/kg3.6130.55810660 5.2595％可信限3.0710.48710330 4.48 3.141～2.61 0.41710110 3.72 3.741g/kg實例3、本發(fā)明豬牙皂總皂苷對卵白蛋白引起大鼠過敏性鼻炎的影響雄性SD大鼠，體重180～220g，腹腔注射卵白蛋白1mg及氫氧化鋁凝膠10mg，其后隔日注射1次，共7次。從第14天始，每日在大鼠兩側鼻腔內滴入1mg/ml卵白蛋白生理鹽水溶液10μl，共7次。末次滴注后立刻觀察30分鐘內大鼠打噴嚏及擦鼻的次數，試驗藥物于卵白蛋白末次滴注前1小時口服給予。
由表2可見，豬牙皂總皂苷(100，200mg/kg)明顯抑制卵白蛋白所致過敏性鼻炎大鼠的噴嚏和搔抓鼻部反應。特非那丁10mg/kg亦呈現顯著的抑制作用。
表2 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對卵白蛋白引起大鼠過敏性鼻炎的影響(x±SD)組別 劑量 動物數 噴嚏次數擦鼻次數(30分鐘)(30分鐘)對照組 - 722.1±6.4 28.9±8.2豬牙皂總皂苷50 717.7±5.2 23.5±7.4100 714.8±3.6*15.3±4.7**200 712.2±4.4**12.0±3.3**特非那丁10 715.1±4.1**16.5±5.5***P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較實例4、本發(fā)明豬牙皂總皂苷對組胺引起的大鼠鼻炎的影響雄性SD大鼠，體重180～220g，大鼠口服給予試驗藥物后1小時，兩側鼻腔內滴入1M組胺生理鹽水溶液10μl，觀察30分鐘內大鼠打噴嚏及擦鼻的次數。
由表3可見，本發(fā)明豬牙皂總皂苷(100，200mg/kg)明顯減少組胺所致鼻炎大鼠的噴嚏次數，對搔抓鼻部反應呈抑制趨勢。特非那丁10mg/kg則呈現顯著的抑制作用。表3 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對組胺引起大鼠鼻炎的影響(x±SD)組別 劑量 動物數 噴嚏次數擦鼻次數(mg/kg) (30分鐘)(30分鐘)對照組 - 7 35.5±8.2 21.3±6.4豬牙皂總皂苷50 7 30.3±7.5 18.4±6.8100 7 26.3±5.4*16.7±6.4200 7 24.8±5.5**15.2±5.6特非那丁10 7 22.5±3.7**14.1±4.6***P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較實例5、本發(fā)明豬牙皂總皂苷對卵白蛋白、組胺引起大鼠鼻腔血管通透性升高的影響雄性SD大鼠，體重180～220g，分別以主動致敏大鼠和正常大鼠觀察卵白蛋白及組胺引起的鼻腔血管通透性升高，大鼠的致敏方法同過敏性鼻炎試驗，在初次免疫后第14天，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg，麻醉后自氣管向鼻腔插管，固定后將此插管與恒流泵相連(0.25ml/min)，以37℃生理鹽水沖洗鼻腔10分鐘，其后大鼠尾靜脈注射1％Evans藍生理鹽水溶液5ml/kg，3分鐘后收集灌流液10分鐘。在致敏大鼠和正常大鼠，灌流液中分別含卵白蛋白1mg/ml和組胺40μg/ml，自鼻腔收集的灌流液經1200×g離心10分鐘，620nm處比色測定上清液中的Evans藍濃度，受試藥物于抗原或組胺灌流前1小時口服給藥。
由表4可見，本發(fā)明豬牙皂總皂苷(100，200mg/kg)明顯抑制卵白蛋白所致過敏性鼻炎大鼠的鼻腔血管通透性，50mg/kg呈抑制趨勢，特非那丁10mg/kg呈現顯著的抑制作用。表4 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對卵白蛋白引起大鼠鼻腔血管通透性升高的影響(x±SD)組別 劑量 動物數 Evans藍濃度抑制率(mg/kg)(μg/ml) (％)對照組 - 70.66±0.16豬牙皂總皂苷 5060.47±0.1828.8100 70.39±0.18**40.9200 70.33±0.12**50.0特非那丁 1070.35±0.18**47.0**P＜0.01，與對照組比較由表5可見，本發(fā)明豬牙皂總皂苷200mg/kg明顯降低組胺所致大鼠的鼻腔血管通透性，100mg/kg呈抑制趨勢，特非那丁10mg/kg呈現顯著的抑制作用。
表5 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對組胺引起大鼠鼻腔血管通透性升高的影響(x±SD)組別 劑量 動物數Evans藍濃度 抑制率(mg/kg)(μg/ml)(％)對照組 - 6 2.12±0.49豬牙皂總皂苷 50 6 2.00±0.375.71006 1.86±0.2212.32006 1.56±0.25**26.4特非那丁 10 6 1.60±0.34**24.5**P＜0.01，與對照組比較實例6、本發(fā)明豬牙皂總皂苷對大鼠佐劑關節(jié)炎的影響將乳酪分枝桿菌(Difco)研磨后與液體石蠟混合，配成10mg/ml，高壓滅菌后制成弗氏完全佐劑。雄性SD大鼠右后足跖皮內注射上述佐劑50μl，同時在尾部距尾根約3cm處皮內注射50μl，分別于注射前和注射后不同時間測量大鼠左、右足跖容積，以注射前后的差值表示腫脹度。在佐劑注射后第16天，大鼠左后足腫脹明顯，按腫脹度及體重將大鼠分組，實驗組口服給予本發(fā)明豬牙皂總皂苷50，100，200mg/kg，陽性對照組口服給予雙氯滅痛10mg/kg，對照組給予等體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)7天，在佐劑注射后第16、22天，測量大鼠右后足跖腫脹度(原發(fā)反應)及左后足跖腫脹(繼發(fā)反應)，并于第22天按下列標準評價大鼠左后足跖病變程度。0無紅腫；1小趾關節(jié)稍腫；2趾關節(jié)和足跖腫脹；3踝關節(jié)以下的足爪腫脹；4包括踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹。
由表6、表7可見，本發(fā)明豬牙皂總皂苷100，200mg/kg口服給藥，連續(xù)7天，顯著抑制大鼠佐劑關節(jié)炎的原發(fā)性和繼發(fā)性腫脹，減輕大鼠足跖的繼發(fā)性病變。表6 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對佐劑關節(jié)炎大鼠原發(fā)性足跖腫脹的影響(x±SD，n＝8)組別 劑量 右后足跖腫脹度(ml)(mg/kg)d16 d22對照組 -1.21±0.33 1.38±0.22豬牙皂總皂苷50 1.17±0.28 1.14±0.29100 1.36±0.31 0.73±0.30**200 1.40±0.27 0.61±0.24**雙氯滅痛10 1.26±0.33 0.55±0.25****P＜0.01，與對照組比較表7、豬牙皂總皂苷對佐劑關節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足跖腫脹的影響(x±SD，n＝8)組別 劑量 左后足跖腫脹度(ml)積分(mg/kg) d16 d22對照組 -0.38±0.12 0.54±0.16 3.5±0.8豬牙皂總皂苷 50 0.37±0.10 0.47±0.14 3.0±0.6100 0.41±0.14 0.31±0.21**2.4±0.9*200 0.40±0.13 0.28±0.12**1.9±1.1**雙氯滅痛 10 0.37±0.13 0.25±0.10**1.7±0.8***P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較實例7、本發(fā)明豬牙皂總皂苷對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響雄性SD大鼠，實驗組口服給予本發(fā)明豬牙皂總皂苷50，100，200mg/kg，陽性對照組口服給予雙氯滅痛10mg/kg，對照組給予等體積的蒸餾水，1小時后，各鼠右后足跖皮下注射滅菌的1％角叉菜膠生理鹽水懸液0.1ml，分別于注射前和注射后1、3小時測量大鼠右足跖容積，以注射前后的差值表示腫脹度。
由表8可見，本發(fā)明豬牙皂總皂苷100，200mg/kg口服給藥，明顯減輕角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹。表8 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響(x±SD，n＝8)組別 劑量 右后足跖腫脹度(ml)(mg/kg)1h 3h對照組 - 0.34±0.13 0.71±0.21豬牙皂總皂苷50 0.29±0.08 0.52±0.17100 0.20±0.14*0.38±0.17**200 0.18±0.06**0.29±0.15**雙氯滅痛10 0.21±0.07**0.33±0.14***P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較實例8、本發(fā)明豬牙皂總皂苷對醋酸致小鼠扭體反應的影響小鼠50只，隨機分為5組，實驗組口服給予本發(fā)明豬牙皂總皂苷50，100，200mg/kg，陽性對照組口服給予雙氯滅痛20mg/kg，對照組給予等體積的蒸餾水，1小時后，腹腔注射0.7％醋酸生理鹽水溶液10ml/kg，觀察30分鐘內的小鼠扭體反應次數。
由表9可見，本發(fā)明豬牙皂總皂苷100，200mg/kg口服給藥，顯著抑制醋酸所致小鼠扭體反應。
表9 本發(fā)明豬牙皂總皂苷對醋酸致小鼠扭體反應的影響(x±SD，n＝10)組別 劑量扭體次數(mg/kg) (20min)對照組 - 47.2±10.3豬牙皂總皂苷 5038.1±9.5100 25.5±10.8**200 21.3±8.5**雙氯滅痛 2029.5±10.6****P＜0.01，與對照組比較
權利要求
1.一種抗免疫性炎癥的豬牙皂總皂苷，其特征在于按重量百分比計，含有總三萜皂苷50-95％，該總三萜皂苷主要為齊墩果烷型三萜皂苷化合物。
2.根據權利要求1所述的豬牙皂總皂苷，其特征在于可單獨或與其它中藥及中藥提取物組配，用于制備抗免疫性炎癥的藥物。
3.根據權利要求1所述的豬牙皂總皂苷，其特征在于可與藥學上可接受的載體混合，用于制備抗免疫性炎癥的藥物。
4.根據權利要求2或3所述的豬牙皂總皂苷，其特征在于所述的抗免疫性炎癥藥物為治療鼻炎和治療類風濕關節(jié)炎藥物。
5.一種抗免疫性炎癥豬牙皂總皂苷的制備方法，其特征在于取豬牙皂，以乙醇提取，將提取液減壓回收至無醇味，得乙醇提取物；在該乙醇提取物中，加入乙醇至含醇量為5-15％，離心后取上清液，上樣于D101型大孔吸附樹脂柱，再分別以水和不同濃度乙醇梯度洗脫，收集60％乙醇洗脫物，回收溶劑后得豬牙皂總皂苷；或者，取上述乙醇提取物，先用氯仿萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收溶劑后得豬牙皂總皂苷。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征為30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶劑用量為6-7ml/g藥材，提取時間為1-3小時，合并乙醇提取液，減壓回收至無乙醇味，得乙醇提取物；取乙醇提取物，加入適量乙醇，調整乙醇濃度至12％，經離心，上清液上樣于D101型大孔吸附樹脂柱，分別以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脫，合并60％乙醇洗脫物，減壓回收，得到的干浸膏狀物即為豬牙皂總皂苷；或者，取乙醇提取物，用氯仿萃取1-3次，每次使用溶劑量為500ml/1kg藥材，然后再用500ml/1kg藥材的正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，得到的干浸膏狀物即為豬牙皂總皂苷。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征為使用60％的乙醇，乙醇提取次數為3次，提取時間為每次2小時；氯仿萃取次數為3次，正丁醇萃取次數為3次。
全文摘要
一種治療免疫性炎癥的豬牙皂總皂苷，主要由齊墩果烷型三萜皂甙組成，可單獨或與藥學上可接受載體混合，用于制備治療免疫性炎癥藥物，尤其適用于制備治療鼻炎和類風濕關節(jié)炎的藥物，用特非那丁及雙氯滅痛作為對照，豬牙皂總皂苷療效明確。
文檔編號A61P37/00GK1429834SQ0216009
公開日2003年7月16日 申請日期2002年12月31日 優(yōu)先權日2002年12月31日
發(fā)明者戴岳, 葉文才, 符麟軍 申請人:中國藥科大學