專利名稱：在受損神經(jīng)系統(tǒng)中維持神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種維持經(jīng)照射、受損或分離的神經(jīng)細(xì)胞生存力的經(jīng)過(guò)改進(jìn)的含水培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及維持經(jīng)照射、受損或分離的神經(jīng)細(xì)胞生存力的改進(jìn)方法。本發(fā)明還涉及將這種改進(jìn)的培養(yǎng)基用于人類患者神經(jīng)外科的方法。
背景技術(shù)：
研究受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的主要問(wèn)題是維持細(xì)胞生存力。無(wú)法在各種環(huán)境條件下使維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的生存力在培養(yǎng)物中維持較長(zhǎng)時(shí)間，這曾經(jīng)阻止了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效治療方案的發(fā)展。
最近開(kāi)發(fā)了一種在高二氧化碳?xì)夥?5％CO2)下維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織生存力的營(yíng)養(yǎng)平衡鹽溶液(培養(yǎng)基)。NeurobasalTM(Gibco/Invitrogen股份有限公司，Rockville，MD)是能使胚胎大鼠海馬神經(jīng)元在pH 7.3、5％ CO2下生長(zhǎng)最優(yōu)的碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的衍生物并可優(yōu)化胚胎大鼠海馬細(xì)胞的存活率。與DMEM相比，NeurobasalTM含較少NaCl和NaHCO3，這使其滲量降低并含有較少量的半胱氨酸和谷氨酰胺，從而導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)降低。此外，NeurobasalTM含有丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和維生素B12，而這些DMEM都不含有。
盡管神經(jīng)元可在5％CO2氣氛下保持在高碳酸氫鹽培養(yǎng)基中，當(dāng)添加B27(一種獲自Invitrogen公司的激素和抗氧化劑添加物)時(shí)，當(dāng)轉(zhuǎn)移到環(huán)境CO2條件(約0.2％)時(shí)神經(jīng)元迅速死亡。死亡與培養(yǎng)基pH迅速升高至約8.1有關(guān)。
制造和研究神經(jīng)組織和細(xì)胞通常需要在培養(yǎng)箱外使用環(huán)境CO2水平?，F(xiàn)有控制培養(yǎng)箱外細(xì)胞pH的方法包括使用弱緩沖液(如Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基或L 15培養(yǎng)基中使用的緩沖液)并用5-10％CO2連續(xù)吹氣以維持生理pH。然而，一個(gè)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)顯示，環(huán)境CO2會(huì)使培養(yǎng)箱外DMEM的pH迅速升高至約8.1。通常用HEPES緩沖的做法會(huì)減慢，但不能阻止這種實(shí)質(zhì)性的堿化。對(duì)組織連續(xù)吹氣的做法可保持高CO2水平和生理pH，但設(shè)備笨重且成本昂貴。
美國(guó)專利6,180,404(2001.1.30)，該專利屬于本申請(qǐng)相同受讓人并被并入以供參考，提供了在環(huán)境CO2條件下維持神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基含有少于約2000μM碳酸氫鹽(pKa為約6.9-約7.7的緩沖液)、0-約3000μM CaCl2、約0.05-約0.8μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl，0-約4000μM MgCl2、約74000-約103000μM NaCl、約400-約2000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖和約20-約500μM丙酮酸鈉，且其中所述培養(yǎng)基基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。這種培養(yǎng)基的一種形式可以商品名HibernateTM購(gòu)得。優(yōu)選地，這種培養(yǎng)基添加有B27(一種含有效量激素的促進(jìn)生長(zhǎng)的添加物)、必需脂肪酸和抗氧化劑以使神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)。
該領(lǐng)域還需要一種改進(jìn)的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基可維持生理pH，并可在受損的腦和脊髓組織中提供高神經(jīng)細(xì)胞生存力，在受損的腦和脊髓組織中，受到損傷的血液供應(yīng)會(huì)減少CO2和其它營(yíng)養(yǎng)物、激素和/或促進(jìn)再生和/或防止或顯著降低退化的生長(zhǎng)因子。本發(fā)明提供了這種改進(jìn)的培養(yǎng)基。
腦腫瘤是15歲以下兒童和34歲以上青年中的第二大致死腫瘤。腦腫瘤是65歲以上成年中第二大發(fā)展最快的致死腫瘤。與許多其它腫瘤不同，行為改變似乎不會(huì)顯著降低諸如腦腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。盡管約40％或50％的腦癌是良性的，但良性腦癌也會(huì)導(dǎo)致顯著損傷和死亡。美國(guó)每年約有100,000人被診斷患有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。只要腫瘤部位許可，通常可用外科手術(shù)技術(shù)來(lái)除去腦腫瘤。手術(shù)部位(即蛛網(wǎng)膜下隙、腦薄壁組織和切除腔)通常用生理鹽水沖洗，有時(shí)還要用浸在生理鹽水中的物質(zhì)包扎。因此，就需要有可用于神經(jīng)外科以提高神經(jīng)細(xì)胞生存力和/或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和/或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的改進(jìn)培養(yǎng)基和方法。這種改進(jìn)的培養(yǎng)基和方法可用來(lái)沖洗或浸泡手術(shù)位置和/或用來(lái)浸漬或浸透填料(例如，明膠-泡沫海綿)，所述填料在除去腫瘤或其它神經(jīng)組織后仍留在腔內(nèi)。本發(fā)明提供了這種改進(jìn)的培養(yǎng)基和方法。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力的方法，所述方法包括對(duì)腦或脊髓組織施用無(wú)菌含水液體培養(yǎng)基，其中所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.1-約1.2μMFe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl、0-約4000μM MgCl2、約30000-約150000μMNaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4μM亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μM L-肉堿、約3-約80μM乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM腐胺、約20-約500μM丙酮酸鈉以及神經(jīng)元生長(zhǎng)有效量的促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的脫氫表雄酮-4-硫酸鹽(DHEAS)以維持激素水平；通常，有效量的DHEAS是約2-約200μM，更優(yōu)選約5-約100μM。所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(堿性FGF或FGF2)以協(xié)助支持神經(jīng)元的存活和再生；通常有效量的FGF2是約1-約50ng/ml，更優(yōu)選約2-約20ng/ml。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的FGF2是獲自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的堿性人重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。更優(yōu)選地，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有有效量的DHEAS和FGF2。這種優(yōu)選的組合物通常含有約5-約50μM DHEAS和約1-約50ng/ml FGF2，更優(yōu)選約10-約30μM DHEAS和約2-約20ng/ml FGF2。
另一方面，本發(fā)明提供了一種將生存力增強(qiáng)的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的方法，所述方法包括(1)在將干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)之前或之時(shí)用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理所述干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織，和(2)輸遞經(jīng)處理的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)，其中所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.01-約1.2μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl、0-約4000μMMgCl2、約30000-約150000μM NaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4μM 亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μM L-肉堿、約3-約80μM 乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM 腐胺、約20-約500μM 丙酮酸鈉，和對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有效的量的促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，其中所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基的滲量為約200-約270mOsm，含有約5000-約25000μM氫離子緩沖液，緩沖液的pKa為約6.9-約7.7，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的脫氫表雄酮-4-硫酸鹽(DHEAS)以維持激素水平；通常，有效量的DHEAS是約2-約200μM，更優(yōu)選約5-約100μM。所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(堿性FGF或FGF2)，以協(xié)助支持神經(jīng)元的存活和再生；通常有效量的FGF2是約1-約50ng/ml，更優(yōu)選約2-約20ng/ml。特別優(yōu)選的用于本發(fā)明的FGF2是獲自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的堿性人重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。更優(yōu)選地，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有有效量的DHEAS和FGF2。這種優(yōu)選的組合物通常含有約5-約50μM DHEAS和約1-約50ng/mlFGF2，更優(yōu)選約10-約30μM DHEAS和約2-約20ng/ml FGF2。
再在另一方面，本發(fā)明提供了一種有效提高腦或脊髓損傷或手術(shù)后人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力，或有效提高欲輸遞至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織的神經(jīng)細(xì)胞生存力的含水組合物，所述含水組合物含有0-約3000μM CaCl2；約0.1-約1.2μM Fe(NO3)3；約2500-約10,000μM KCl；0-約4000μMMgCl2；約30,000-約150,000μM NaCl；約100-約30,000μM NaHCO3；約250-約4000μM NaH2PO4；約0.01-約0.4μM 亞硒酸鈉；約0.2-約2μM ZnSO4；約2500-約50,000μM D-葡萄糖；約1-約50μM L-肉堿；約3-約80μM乙醇胺；約15-約400μM D(+)-半乳糖；約5-約200μM人白蛋白；約40-約800μM腐胺；約20-約500μM丙酮酸鈉；約0.01-約0.32μM運(yùn)鐵蛋白；0-約120μM L-丙氨酸；0-約2400μM L-精氨酸；0-約30μM L-天冬酰胺；0-約60μM L-半胱氨酸；0-約3000μM L-谷氨酰胺；0-約2400μM甘氨酸；0-約1200μM L-組氨酸；0-約5000μM L-異亮氨酸；0-約5000μM L-亮氨酸；0-約5000μM L賴氨酸；0-約1200μML-甲硫氨酸；0-約2400μM L-苯丙氨酸；0-約500μM L-脯氨酸；0-約2400μM L-絲氨酸；0-約5000μM L-蘇氨酸；0-約500μM L-色氨酸；0-約2400μM L-酪氨酸；0-約5000μM L-纈氨酸；約0.5-約16μM谷胱甘肽(還原的)；約0.1-約10μMα-生育酚；約0.1-約10μMα-生育酚乙酸酯；約0.001-約0.1μM過(guò)氧化氫酶；約0.01-約0.5μM超氧化物歧化酶；約0.001-約0.1μM皮質(zhì)醇；0-約200μM DHEAS；約0.001-約0.1μM孕酮；約0.02-約1μM醋酸視黃酯；約0.1-約5μM胰島素；0-約0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；約0.05-約20μM亞油酸；約0.1-約10μM亞麻酸；0-約2.5μM生物素；0-約100μMD-泛酸鈣；0-約200μM膽堿；0-約100μM葉酸；0-約240μMi-肌醇；0-約200μM煙酰胺；0-約120μM吡哆醛；0-約6μM核黃素；0-約100μM硫胺和0-約1.2μM鈷胺素；其中，所述含水組合物的滲量為約200-約270mOsm，含有約5000-約25000μM氫離子緩沖液，緩沖液的pKa為約6.9-約7.7，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中DHEAS和FGF2使人神經(jīng)元存活的協(xié)同作用。神經(jīng)元在有(實(shí)心圓)或沒(méi)有(空心圓)10μM DHEAS和0-約10ng/ml堿性人重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(獲自Introgen公司，Rockville，MD)的條件下培養(yǎng)6天。數(shù)值是來(lái)自67歲原發(fā)性腦淋巴瘤病例6塊0.3mm2區(qū)域的平均值和S.E.(標(biāo)準(zhǔn)誤差)。三個(gè)最低GFG2濃度的多因素ANOVA F(1，10)＝15.2。注意0濃度被人工置于對(duì)數(shù)x軸上。
圖2基于實(shí)施例，顯示明膠海綿中本發(fā)明無(wú)菌液體培養(yǎng)基在大鼠傘毛-穹隆(fimbria-fornix)損傷中可保持內(nèi)隔膜(medial septum)中經(jīng)過(guò)軸索顯微外科術(shù)(axotomized)的神經(jīng)元的神經(jīng)元密度至少一個(gè)月。鹽水(對(duì)照)和本發(fā)明無(wú)菌液體培養(yǎng)基組中未受損側(cè)的細(xì)胞密度分別為每平方毫米61和62個(gè)細(xì)胞。同時(shí)進(jìn)行第二種對(duì)照(偽受損即未受到損傷)。顯示了每組6只大鼠的平均值+S.E.。概率是t-試驗(yàn)對(duì)比鹽水的結(jié)果。
圖3基于實(shí)施例3，顯示明膠海綿中本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基提高了吸引術(shù)損傷(aspiration lesion)周圍大鼠皮層神經(jīng)元1個(gè)月的存活。圖A用本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(實(shí)心圓)處理明顯優(yōu)于用鹽水處理(實(shí)心三角)的動(dòng)物，且?guī)缀醯扔趥问軗p的腦(未受損的，空心圓)。圖B相對(duì)神經(jīng)元密度，即占未受損側(cè)密度的百分?jǐn)?shù)。比較本發(fā)明的堿性無(wú)菌液體培養(yǎng)基(實(shí)心圓)和用碳酸氫鹽緩沖的本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(方框)和鹽水(空心圓)；通常堿性無(wú)菌液體培養(yǎng)基優(yōu)于用碳酸氫鹽緩沖的無(wú)菌液體培養(yǎng)基。圖C本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基+FGF2(方框)優(yōu)于DMEM+FGF2(菱形)和鹽水(三角)。每個(gè)點(diǎn)都是6個(gè)動(dòng)物測(cè)量值的平均值和S.E.，它是距損傷邊緣的距離的函數(shù)。概率由比較本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基和鹽水或DMEM的兩因素ANOVA確定。
圖4同樣基于實(shí)施例3，顯示與鹽水(方框)和偽受損(三角相比)，置于皮層吸引術(shù)損傷中的明膠海綿內(nèi)的本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(圓圈)可消除神經(jīng)膠質(zhì)增生，該結(jié)果基于GFAP免疫染色。每個(gè)點(diǎn)都是20×400μm面積中象素強(qiáng)度的平均值和S.E.，每次處理有3只大鼠，距損傷邊緣的距離每次增加20μm，損傷位于軟腦膜下1200μm。
圖5A基于實(shí)施例4，顯示在Neurobasal A培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后腦膜瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺。這些細(xì)胞在基質(zhì)上鋪展開(kāi)并增殖，平均細(xì)胞面積達(dá)到3015+453μm2(平均值+/-S.E.，n＝12細(xì)胞)。
圖5B基于實(shí)施例4，顯示培養(yǎng)7天后生長(zhǎng)在本發(fā)明的培養(yǎng)基上的腦膜瘤細(xì)胞未鋪展開(kāi)或增殖(平均面積＝936μm2)(t-試驗(yàn)，比較血清-生長(zhǎng)細(xì)胞，p＝0.0001)。
本發(fā)明的培養(yǎng)基上幾乎沒(méi)有存活細(xì)胞。
圖5C基于實(shí)施例4，顯示在Neurobasal A培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺。這些鋪展在基質(zhì)上并增殖。
圖5D基于實(shí)施例4，顯示培養(yǎng)7天后生長(zhǎng)在本發(fā)明的培養(yǎng)基上的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞未鋪展開(kāi)或增殖。
圖6基于實(shí)施例4、表3，比較了腦膜瘤細(xì)胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基(空心圓)和本發(fā)明的培養(yǎng)基(實(shí)心圓)中的生長(zhǎng)。使腦膜瘤細(xì)胞生長(zhǎng)10天。培養(yǎng)10天后，生長(zhǎng)在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)生融合生長(zhǎng)。用胰蛋白酶處理收集這些細(xì)胞，并將其置于含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基或本發(fā)明的培養(yǎng)基。細(xì)胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，但在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，并有細(xì)胞死亡。
圖7基于實(shí)施例4、表4，比較了各種類型的腫瘤在含有胎牛血清(GIBCO)的Neurobasal A培養(yǎng)基(交叉線柱)和本發(fā)明的培養(yǎng)基(實(shí)心柱)中的生長(zhǎng)。顯示了第6或第7天細(xì)胞的增加，增加是用第6天或第7天的細(xì)胞數(shù)除以開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞數(shù)。對(duì)于這5種連續(xù)腫瘤狀況，本發(fā)明的培養(yǎng)基導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯或抑制以及細(xì)胞死亡，而含有胎牛血清的Neurobasal A培養(yǎng)基使所有原發(fā)性腫瘤的細(xì)胞增殖而使轉(zhuǎn)移腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力的方法，所述方法包括對(duì)腦或脊髓組織施用無(wú)菌含水液體培養(yǎng)基，其中所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.1-約1.2μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl，0-約4000μM MgCl2、約30000-約150000μM NaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4μM亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μML-肉堿、約3-約80μM乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM腐胺、約20-約500μM丙酮酸鈉以及對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有效的量的必需脂肪酸、激素和抗氧化劑。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基提供最少必需的含水培養(yǎng)基以維持神經(jīng)細(xì)胞或組織在含有環(huán)境CO2水平環(huán)境下的生存力，且通常含有少于約2000μM碳酸氫鹽，其滲量為約200-約270mOsm，含有pKa約6.9-約7.7的緩沖液，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。出于本發(fā)明的目的，″基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽″是指所述組合物含有少于約0.4μM硫酸亞鐵、少于約1μM谷氨酸鹽和少于約1μM天冬氨酸鹽；優(yōu)選地，所述組合物不含添加的硫酸亞鐵、谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽；更優(yōu)選地，這些組分的水平接近或就是0。
通常，滲量?jī)?yōu)選約200-約240mOsm。優(yōu)選地，以最終濃度表示，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有500-約2500μM CaCl2、約0.05-約0.6μM Fe(NO3)3、約3000-約8000μM KCl、約300-約2000μM MgCl2、約40000-約103000μM NaCl、約200-約1800μM NaHCO3、約400-約2000μM NaH2PO4、約0.03-約0.2μM亞硒酸鈉、約0.4-約1.5μM ZnSO4、約10000-約40000μM D-葡萄糖、約3-約25μM L-肉堿、約6-約40μM乙醇胺、約30-約200μMD(+)-半乳糖、約80-約400μM腐胺，以及約100-約400μM丙酮酸鈉以及對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有效的量的必需脂肪酸、激素和抗氧化劑。較佳地，優(yōu)選的脂肪酸脂肪酸、激素和抗氧化劑包括約0.001-約0.1μM皮質(zhì)醇、約0.5-約16μM還原的谷胱甘肽、約0.05-約20μM亞油酸、約0.1-約10μM亞麻酸、約0.001-約0.1μM孕酮、約0.02-約1μM醋酸視黃酯，0-約0.6μM3，3&APOS；，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、約0.1-約10μMDL-α生育酚、約0.1-約10μM DL-α生育酚乙酸酯、約5-約200μM人白蛋白、約0.001-約0.1μM過(guò)氧化氫酶、約0.1-約5μM胰島素、約0.01-約0.5μM超氧化物歧化酶和約0.01-約0.32μM運(yùn)鐵蛋白。
所述無(wú)菌含水液體培養(yǎng)基含有pKa約6.9-約7.7的氫離子緩沖液，當(dāng)與神經(jīng)組織接觸時(shí)，其量足以維持pH在約6.9-約7.7的所需范圍。通常，所述氫離子緩沖液的量是約5000-約25000μM。適合用于本發(fā)明的緩沖液包括3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸(MOPS)、碳酸氫鈉、N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、N，N-二-(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、1，3-二氮雜-2，4-環(huán)戊二烯、2-三(羥甲基)氨基乙烷磺酸(TES)等，以及它們的混合物。基礎(chǔ)組合物中優(yōu)選的緩沖液是3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸(MOPS)。碳酸氫鈉在本發(fā)明中有雙重作用。在低水平時(shí)(即通常少于約2000μM)，碳酸氫鈉與氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。此外，如上所述，碳酸氫鈉可作為緩沖液；當(dāng)用作緩沖液時(shí)，碳酸氫鈉當(dāng)然必需是高水平的(高達(dá)約30,000μM)。
本發(fā)明的培養(yǎng)基還含有有效量的至少10種必需氨基酸。優(yōu)選地，用最終濃度表示，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有(1)L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-纈氨酸各約250-約2500μM；(2)約150-約1500μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-酪氨酸各約120-約1200μM；(4)L-組氨酸和L-甲硫氨酸各約60-約600μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各約25-約250μM；(6)約6-約60μM L-丙氨酸；(7)約3-約30μM L-半胱氨酸；(8)約1.5-約15μML-天冬酰胺；(9)約12-約120μM i-肌醇，(10)約10-約100μM煙酰胺；(11)約9-約90μM膽堿；(12)約6-約60μM吡哆醛；(13)硫胺、葉酸和D-泛酸鈣各約2-約40μM；(14)約0.3-約3μM核黃素；(15)約0.1-1.2μM生物素；和(16)約0.05-約1μM維生素B12。
優(yōu)選地，所述促進(jìn)生長(zhǎng)的脂肪酸、激素和抗氧化劑包括約0.002-約0.03μM皮質(zhì)醇、約1-約8μM還原的谷胱甘肽、約1-約10μM亞油酸、約0.2-約5μM亞麻酸、約0.005-約0.06μM孕酮、約0.05-約0.6μM醋酸視黃酯、約0.0005-約0.2μM3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、DL-α生育酚和DL-α生育酚乙酸酯各約0.5-約5μM、約15-約90μM人白蛋白、約0.002-約0.04μM過(guò)氧化氫酶、約0.2-約2μM胰島素、約0.02-約0.25μM超氧化物歧化酶和約0.02-約0.16μM運(yùn)鐵蛋白。
本發(fā)明組合物的推薦組分如下表1所示表1
本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(堿性FGF或FGF2)，以參與支持神經(jīng)元的存活和再生；通常有效量的FGF2是約1-約50ng/ml，更優(yōu)選約2-約20ng/ml。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的FGF2是獲自Introgen公司(Rockville，MD)的堿性人重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
特別優(yōu)選所有的組分都是藥物等級(jí)或更高等級(jí)的。此外，對(duì)于所有人衍生組分，只要可能，通常優(yōu)選使用合成組分或經(jīng)過(guò)處理的組分以減低患者接觸有害試劑(例如朊病毒、HIV等等)的風(fēng)險(xiǎn)。
添加B27添加物(美國(guó)專利6,180,404)的HibernateTM可將活的腦組織在冷凍條件下保持至少一個(gè)月，這樣就可在實(shí)驗(yàn)室之間運(yùn)送活的腦組織。這種用NeurobasalTM代替HibernateTM的無(wú)菌液體培養(yǎng)基也支持任何年齡的成人海馬神經(jīng)元在培養(yǎng)基中再生(Brewer，J.Neurosci.Meth，1997；71143-155)。從大約3歲大的成年大鼠(相當(dāng)于人75歲)的腦中可分離約50％活細(xì)胞。在培養(yǎng)基中，這些細(xì)胞再生出軸突和樹(shù)突，這清楚證明，在分離過(guò)程中經(jīng)過(guò)軸索顯微外科術(shù)后，成人的神經(jīng)元可在無(wú)菌液體培養(yǎng)基中再生。本發(fā)明的這種進(jìn)步擴(kuò)使這種培養(yǎng)基可用于修復(fù)或損傷受損的腦或脊髓。因此，本發(fā)明的這種無(wú)菌液體培養(yǎng)基適合在體內(nèi)臨床保存受損的腦或其它神經(jīng)系統(tǒng)組織中的神經(jīng)元。
本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基促進(jìn)成人神經(jīng)元的存活和再生(Brewer等，J.Neurosci.Methods，2001；10715)。已證明神經(jīng)絲、MAP2和τ細(xì)胞骨架免疫反應(yīng)性的神經(jīng)元特征。培養(yǎng)物可在本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中保持?jǐn)?shù)周，足夠長(zhǎng)來(lái)證明突觸原件的出現(xiàn)。觀察到突觸結(jié)、突觸囊泡和突觸后密度。由于案例數(shù)較少，不能鑒別邊緣組織來(lái)源程度以外的因子，這些來(lái)源可提高神經(jīng)元而不是神經(jīng)膠質(zhì)的頻率。將小的組織切片和本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基結(jié)合可獲得更大成功。早期電灼組織的方法無(wú)法制造或的神經(jīng)元。這里所述的方法，包括用壓力部分止血，獲得組織，然后進(jìn)行必需的電灼以切割表面，不會(huì)對(duì)神經(jīng)外科造成負(fù)擔(dān)。
對(duì)于培養(yǎng)基中有神經(jīng)元再生的40％的組織樣品。在冷卻在轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基(HibernateTM/B27，如美國(guó)專利No.6,180,404所述；www.siumed.edu/BrainBits)之前，腦組織經(jīng)歷了數(shù)分鐘急性局部缺血。Viel等(J.Neurosci.Res.，2001；64311)顯示，甚至在室溫下局部缺血2小時(shí)之后仍可獲得活的大鼠腦神經(jīng)元。然而，如果局部缺血的腦被冷卻至4℃，可在長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)后獲得活的皮層神經(jīng)元。
已經(jīng)證明當(dāng)包含在本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基時(shí)，DHEAS和FGF2協(xié)同促進(jìn)了人皮層神經(jīng)元的存活。FGF是經(jīng)典的皮層神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(Walicke等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986；833012-3016；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986；837537-7541)。腦中的突觸前神經(jīng)元被認(rèn)為依賴于適當(dāng)刺激的突觸后神經(jīng)元釋放的這些營(yíng)養(yǎng)因子。在從數(shù)千腦突觸提取神經(jīng)元時(shí)，需要用外源營(yíng)養(yǎng)支持代替這些神經(jīng)元依賴的FGF是不奇怪的。FGF與神經(jīng)元上的FGF受體結(jié)合(Walicke等，J.Biol.Chem.，1989；2644120-4126)以活化酪氨酸激酶級(jí)聯(lián)(Eckenstein，J.Neurobiol.，1994；251467-1480)。部分神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可抵御培養(yǎng)物內(nèi)(Skaper等，Dev.Brain Res.，1993；711-8；Mattson等，J.Neurochem.，1995；651740-1751)和體內(nèi)(Nakata等，Brain Res.，1993；605354-356)的谷氨酸鹽毒性，這種毒性與抗氧化劑保護(hù)的正調(diào)節(jié)有關(guān)(Mattson等，J.Neurochem.，1995；651740-1751)。因此，有許多FGF神經(jīng)保護(hù)作用的先例。腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)可提供其它營(yíng)養(yǎng)支持(Kirschenbaum等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1995；92210-214；Goldman等，J.Neurobiol，1997；32554-566)。
類固醇DHEAS在本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中的作用機(jī)制還不清楚。DHEAS提高分離的小鼠皮層神經(jīng)元的存活率，并增強(qiáng)腦池內(nèi)感染后的學(xué)習(xí)(learning)(Roberts等，Brain Res.，1987；406357-362)。部分機(jī)制與通過(guò)提高神經(jīng)保護(hù)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(Mao等，Neuro.Report，1998；9759-763)，同時(shí)抑制糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)錄(Cardounel等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1999；222145-149)，從而免遭谷氨酸鹽毒性有關(guān)(Kimonides等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1998；951852-1857)。DHEAS抑制GABA介導(dǎo)的大鼠腦對(duì)氯的攝入(Imamura等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1998；243771-775)，并迅速阻斷分離的海馬神經(jīng)元中的電壓門(mén)控鈣流(Ffrench-Mullen等，Eur.J.PHARMACOL.，1991；202269-272)。所有這些活性都有助于這里報(bào)道的DHEAS對(duì)人和大鼠神經(jīng)元存活的有利作用，但他們認(rèn)為DHEAS和FGF2通過(guò)活化單獨(dú)的通路產(chǎn)生協(xié)同作用以促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)。
根據(jù)發(fā)明者的知識(shí)，以前未報(bào)道高產(chǎn)量的成年人神經(jīng)元。至少10年前就開(kāi)始培養(yǎng)胚胎人神經(jīng)元(Mattson等，Brain Res.，1990；522204-214)，但由于缺乏這種組織和缺少組織供體同意的倫理問(wèn)題，這種組織的應(yīng)用并不常見(jiàn)。將成人腦組織作為外植塊在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)主要產(chǎn)生星形神經(jīng)膠質(zhì)(Gilden等，Comp.Neurol.，1975；161295-306)，這可通過(guò)GFAP染色判斷(Gilden等，J.Neurol.Sci.，1976；29177-184)。Silant等(Appl.Neurophysiol.，1988；5110-20)還報(bào)道了來(lái)自兩名成人的含有血清的外植塊培養(yǎng)物，但沒(méi)有關(guān)于神經(jīng)元的免疫細(xì)胞學(xué)證據(jù)。在其它含有血清的培養(yǎng)物中，MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元的產(chǎn)量?jī)H占平板細(xì)胞的約0.025％(Kirschenbaum等，Cereb.Cortex，1994；4576-589)。通過(guò)對(duì)神經(jīng)絲進(jìn)行免疫染色證明，平鋪在本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(含有FGF2和DHEAS)中的細(xì)胞產(chǎn)生約20％的神經(jīng)元。這種占平板細(xì)胞20％的產(chǎn)量是不含F(xiàn)GF2和DHEAS的本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基產(chǎn)量的約1000倍。平鋪在本發(fā)明培養(yǎng)基上的大腦皮層細(xì)胞產(chǎn)生9,000個(gè)活細(xì)胞/mg，接近分離自大鼠前皮層的10,000細(xì)胞/mg(Viel等，J.Neurosci.Res.，2001；64311-321)。
獲自癲癇癥狀并經(jīng)本發(fā)明的組合物處理的組織有助于解答一些與疾病有關(guān)的基礎(chǔ)性問(wèn)題在培養(yǎng)物上培養(yǎng)組織連接是否可產(chǎn)生陣攣或緊張現(xiàn)象的自發(fā)爆發(fā)活性？興奮突觸/抑制突觸的高重建比例或谷氨酸能細(xì)胞與分離的γ-氨基丁酸能細(xì)胞的比例是否會(huì)隨癲癇原性病變變化？或者，新環(huán)境下軸突和樹(shù)突的再生是否會(huì)導(dǎo)致更加正常的網(wǎng)絡(luò)活性？成人神經(jīng)元似乎與胚胎神經(jīng)元有不同特性(Brewer，Neurobiol.Aging，1998；19561-568；Evans等，J.Neurosci.Meth.，1998；7937-46；Collings等，Brain Res.Bull.，1999；4873-78)。這些成人神經(jīng)元可用于研究高級(jí)人神經(jīng)藥理學(xué)、毒理學(xué)以及為腦抑制開(kāi)發(fā)改進(jìn)的方法。
如上所述，本發(fā)明提供了一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力的方法。該方法包括按上面的描述對(duì)有關(guān)腦或脊髓組織或需要治療的腦或脊髓組織周圍應(yīng)用或施用所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基。所謂需要治療的腦或脊髓組織是與腦或脊髓損傷和/或外傷有關(guān)的組織。在適當(dāng)?shù)那闆r下，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基可以預(yù)防用藥的方式(如在腦手術(shù)之前)應(yīng)用于或施用于腦或脊髓組織。出于本發(fā)明的目的，″腦或脊髓組織″當(dāng)然包括與腦和脊髓關(guān)聯(lián)的組織，但同時(shí)包括全身的神經(jīng)結(jié)締組織。因此，本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基可用來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)再生和/或神經(jīng)生存力，例如在外科連接四肢或其它身體部分，或涉及神經(jīng)損傷的受損四肢或其它身體部分的重建中。
各種輸遞系統(tǒng)是已知的并可用來(lái)應(yīng)用或施用本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基。所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基可以任何常規(guī)途徑應(yīng)用或施用，例如包括灌輸或快速輸注，并可和其它生物活性劑(例如抗生素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、消炎劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體激動(dòng)劑、拮抗劑等)一起施用。通常，優(yōu)選的施用方法取決于被治療的組織和患者的特定狀況。在特定的實(shí)施方案中，可在需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的無(wú)菌液體組合物。例如，這可通過(guò)手術(shù)時(shí)局部灌輸、局部敷貼(如創(chuàng)口貼)、注射、導(dǎo)管或植入(如由多孔性材料、非多孔性材料或膠狀材料形成的植入物、外科包扎物或填充物，包括膜，比如硅酮基膜或纖維)等實(shí)現(xiàn)，但不限于此。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在要治療的組織部位(或成型部位)直接注射施用。
本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基特別適合用于腦外科治療，無(wú)論是由于如腦腫瘤、動(dòng)脈瘤、增生、中風(fēng)或腦損傷。所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基一般可用來(lái)沖洗或浸泡手術(shù)部位和/或用來(lái)浸漬或浸透外科包扎物或填充物(如由多孔性材料、非多孔性材料或膠狀材料形成的植入物，包括膜，比如硅酮基膜或纖維等)，這些包扎物或填充物在除去腫瘤或其它神經(jīng)組織后將留在腔內(nèi)。一種優(yōu)選的手術(shù)包扎材料是Gel-FoamTM海綿。
如果有需要，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基可在一段時(shí)間內(nèi)用控制釋放系統(tǒng)輸遞。因此，例如可使用與含有所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基的貯槽連接的泵?；蛘呖墒褂媒杆鰺o(wú)菌液體培養(yǎng)基的聚合填充材料或其它填充材料，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基可從中以受控方式釋放。當(dāng)然，可根據(jù)需要將這種控制釋放系統(tǒng)設(shè)計(jì)成可補(bǔ)充所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基的樣子；或者采用這種系統(tǒng)，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基可在一段時(shí)間內(nèi)被修飾以滿足患者癥狀和/或所達(dá)到的愈合速度的變化。
如上所述，本發(fā)明還提供了一種將生存力增強(qiáng)的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在將干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)之前或之時(shí)用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理所述干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織，和(2)輸遞經(jīng)處理的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)，其中所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.01-約1.2μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl，0-約4000μM MgCl2、約30000-約150000μM NaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4suM亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μM L-肉堿、約3-約80μM乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM腐胺、約20-約500μM丙酮酸鈉以及對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有效的量的促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，其中所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基的滲量為約200-約270mOsm，含有約5000-約25000μM氫離子緩沖液，緩沖液的pKa為約6.9-約7.7，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。在將細(xì)胞輸遞至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)之前或期間用本發(fā)明的含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理的細(xì)胞(包括干細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)組織)通常有增強(qiáng)的生存力，并更易于在腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)中存活和/或繁殖。更優(yōu)選地，本發(fā)明的含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基可用作植入這種細(xì)胞的輸遞系統(tǒng)或載體。
以下實(shí)施例描述并例證了本發(fā)明的方法和組合物。這些實(shí)施例僅僅是為了例證本發(fā)明，而不是要限制其范圍和精神。除非另有說(shuō)明，所有的比例都以重量表示。那些精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，也可采用這些實(shí)施例中所述材料、條件和過(guò)程的變化。其中引用的所有參考資料在此并入以供參考。
常規(guī)方法。按照人類對(duì)象研究Springfield委員會(huì)(Springfield Committeefor Research on Human Subjects)和UC Irvine IRB許可的方案，腦組織于手術(shù)前在倫理學(xué)上獲自被告知的患者。未除去其它組織且樣本與對(duì)病理學(xué)標(biāo)本的需求不矛盾。與其采用吸引術(shù)來(lái)除去所有組織，不如從皮層入口(access port)或損傷邊緣組織獲得1-3mm厚的組織切片。電灼術(shù)的使用被限制到最小程度以減少氧化自由基和其它神經(jīng)元損傷。將手術(shù)室內(nèi)獲得的組織(198±80mg，平均值±S.D.，n＝8)轉(zhuǎn)移到20ml冰冷的無(wú)菌轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基置于無(wú)菌的50ml聚苯乙烯試管(Corning)。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基是Hibernate A(Brewer等，NeuroReport，1996；71509-1512)，其中加有2％B27培養(yǎng)基添加物(Introgen公司，Rockville，MD)(Brewer等，J.Neurosci.Res.，1993；35567-576)和0.5mM谷氨酰胺。Hibernate A含有D-葡萄糖、丙酮酸鹽、平衡鹽、氨基酸和維生素。B27含有5種抗氧化劑和15種其它組分。盡管在8℃轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基可保持胚胎大鼠腦組織50％的生存力4周，但在4℃這里所用組織大多數(shù)不能存放超過(guò)4周。從冰上轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的層流無(wú)菌被覆物后，在35mm平皿中用解剖刀和鑷子除去組織的腦膜和白質(zhì)，平皿中含有2ml轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。將組織切成0.5mm的切片，用木瓜蛋白酶消化，并分離成單細(xì)胞懸液(見(jiàn)Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71143-155)。在Optiprep密度梯度(Invitrogen)上通過(guò)離心富集細(xì)胞懸液。Optiprep首先用0.8％NaCl 50.549.5(V/V，Optiprep鹽水)稀釋以使22℃的密度為1.15。以后的試驗(yàn)顯示，用10mM MOPS，pH7.4緩沖的鹽水效果最好。稀釋的Optiprep進(jìn)一步用轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(v/v)稀釋以在15ml離心管中制成4個(gè)1ml的梯度底部(0.35∶0.65)、0.25∶0.75、0.2∶0.8、頂部(0.15∶0.85)。將最多6ml細(xì)胞懸液置于Optiprep分級(jí)梯度上部。盡管神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)在所有梯度中都存在，收集小丸(pellet)和碎片(debris)致密帶之間的組分，以最大富集神經(jīng)元(Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71143-155)。以320/mm2的密度將細(xì)胞鋪到上述涂有聚賴氨酸的玻璃蓋玻片上。細(xì)胞培養(yǎng)在Neurobasal A培養(yǎng)基(Invitrogen)中，培養(yǎng)基中含有2％B27、5ng/ml FGF2(堿性人重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，Introgen)和0.5mM谷氨酰胺，并置于含有9％O2和5％CO2的濕潤(rùn)大氣下(Forma，Marietta，OH)。在大多數(shù)試驗(yàn)中，還含有10μg/ml的DHEAS(脫氫表雄酮3-硫酸鹽，Sigma)。DHEAS用10％的牛血清白蛋白稀釋1mg/ml的貯液并無(wú)菌過(guò)濾得到。按照說(shuō)明，用1％BSA/PBS將貯液稀釋500倍，加入EGF(20ng/ml；鼠，Introgen)和NT3(100ng/ml；重組，Regeneron)。每3-4天用新鮮培養(yǎng)基更換一半培養(yǎng)基。
為進(jìn)行免疫細(xì)胞學(xué)研究，培養(yǎng)物用熱的PBS清洗兩次并在PBS中4％的低聚甲醛中固定10分鐘。用PBS清洗兩次后，被GFAP染色的細(xì)胞再在乙酸/乙醇(1∶9，v/v)中固定20分鐘，然后用PBS清洗兩次。非特異性位點(diǎn)被封閉，并將細(xì)胞在5％正常羊血清和0.5％Triton X-100中滲透5分鐘。在22℃，將細(xì)胞和第一抗體在5％羊血清和0.05％Triton中培養(yǎng)1小時(shí)，Triton中含有鼠抗-神經(jīng)絲200(1∶40，Sigma)和兔抗-牛GFAP(1∶2000，Dako)，或鼠抗-MAP2(1∶250，Boeringer-Mannheim)和兔抗-τ(1∶2000)。用PBS清洗4次后，細(xì)胞在22℃和結(jié)合有若丹明的羊抗-兔IgG(重+輕鏈，1∶500，Tago)以及結(jié)合有cy2的羊抗-鼠IgG(重+輕鏈，1∶100，Jackson)一起培養(yǎng)1小時(shí)。用PBS清洗4次后，蓋玻片用Aquamount固定并通過(guò)Nikon 60x/1.4目鏡用Spot cooled CCD照相機(jī)(Diagnostic Instruments)照相。
為進(jìn)行電子顯微鏡電子顯微鏡檢測(cè)(Deitch等，J.Neurosci.，1993；134301-4315)，載玻片上的細(xì)胞在37℃用2.5％戊二醛固定1小時(shí)，直接稀釋到培養(yǎng)基中形成25％的貯液。無(wú)需清洗，進(jìn)一步固定細(xì)胞并在37℃用0.1％OsO4染色0.5小時(shí)。細(xì)胞用0.125M磷酸鈉(pH7.4)清洗并用0.1％OsO4繼續(xù)固定0.5小時(shí)。用3.6％NaCl和水清洗后，細(xì)胞用5％乙酸雙氧鈾水溶液染色1小時(shí)。用水清洗后，細(xì)胞用一系列乙醇脫水，繼以環(huán)氧丙烷。將細(xì)胞倒入充滿Spur樹(shù)脂(Polysciences)的橡膠模具。在60℃聚合3小時(shí)以制成3mm厚的半透明盤(pán)，感興趣的區(qū)域用20x物鏡觀察并用記號(hào)筆圈出。將圈出的區(qū)域移到劃線樹(shù)脂盤(pán)內(nèi)側(cè)。通過(guò)反復(fù)接觸液氮和沸水除去玻璃蓋玻片。用鋸取下標(biāo)記的區(qū)域并將其粘在金屬軸(metal stub)上，以修剪和切片。將90nm金切片沉積在涂有聚醋酸甲基乙烯酯薄膜的狹縫載網(wǎng)上。切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用Hitachi H7顯微鏡在70kV觀察。
實(shí)施例1.人皮層腦組織獲自11例連續(xù)外科病例，包括7例腫瘤病例，3例癲癇病例和1例假性延髓麻痹(suprabulbar palsy)?；颊吣挲g在41-70歲之間。表2總結(jié)了這11例病例的結(jié)果。
表2.培養(yǎng)在B27/Neurobasal A中的人皮層腦外科樣本
1.皮層組織的來(lái)源和/或患者診斷的診斷，l.腦左側(cè)；r.腦右側(cè)。
2.切割和粉碎前組織的重量；n.d.表示未稱重。
3.梯度分離后通過(guò)除去錐蟲(chóng)藍(lán)判斷細(xì)胞產(chǎn)量。
4.培養(yǎng)基的添加物見(jiàn)常規(guī)方法。
5. 6天后，按常規(guī)方法的描述固定培養(yǎng)物并進(jìn)行免疫染色。4-6個(gè)0.304平方毫米的區(qū)域?yàn)樯窠?jīng)絲免疫反應(yīng)陽(yáng)性。當(dāng)有兩組值時(shí)，第二個(gè)值表示對(duì)GFAP的免疫反應(yīng)性。
分離的細(xì)胞的神經(jīng)特征。將細(xì)胞骨架組分作為特異性標(biāo)記來(lái)區(qū)別神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。微管結(jié)合蛋白MAP2和τ通常分別與神經(jīng)元的樹(shù)突和軸突區(qū)域結(jié)合。神經(jīng)絲200是僅限于神經(jīng)元的常見(jiàn)中間絲，而GFAP僅限于星形神經(jīng)膠質(zhì)。所有制品都至少被這些標(biāo)記之一免疫染色。對(duì)于分離自67歲原發(fā)性淋巴瘤病例額葉并培養(yǎng)6天的樣品，這些細(xì)胞顯示神經(jīng)元樣的形態(tài)并對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架元件MAP2和τ免疫染色。較好地，在相圖中看到了分支過(guò)程。MAP2染色清楚顯示了樹(shù)突生長(zhǎng)錐。用τ染色并對(duì)τ進(jìn)行核定位看到了一個(gè)軸突樣的粗細(xì)均勻的纖維。如表2所示，6例神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的3例和3例癲癇中的2例得到的主要是神經(jīng)元而不適神經(jīng)膠質(zhì)。具有神經(jīng)元染色特征的培養(yǎng)物的比例為15-89％。平均有20％的存活平鋪細(xì)胞是具有纖維的細(xì)胞。存活的分離細(xì)胞為每毫克組織9,000個(gè)細(xì)胞(±2,000S.E.，n＝10，表2)。
為提供出現(xiàn)神經(jīng)元的細(xì)胞神經(jīng)元特征的其它形態(tài)學(xué)證據(jù)，將來(lái)自70歲腦膜瘤病例的樣品培養(yǎng)3周以建立突觸，然后再固定并電子顯微鏡檢測(cè)。電子顯微照片顯示了具有微管的均勻纖維，微管是軸突的特征，并顯示了帶有多種均勻直徑清晰小泡的明顯的突觸結(jié)。突觸后密度也是明顯的。不是所有纖維間的接觸都具有突觸特征。基于相差光學(xué)顯微鏡對(duì)纖維接觸區(qū)域的選擇，隨后的電子顯微鏡檢測(cè)顯示突觸形成的頻率約為纖維接觸的10％，這與胚胎大鼠海馬神經(jīng)元不同(Brewer，未公布的結(jié)果)。
患者的年齡與神經(jīng)絲陽(yáng)性細(xì)胞的比例無(wú)關(guān)(R2＝0.03；數(shù)據(jù)未顯示)。獲自患者的組織和由神經(jīng)外科醫(yī)師提供的組織類型從惡性腫瘤變?yōu)榘d癇。50％的惡性腫瘤病例(3/6)和1/3的癲癇病例產(chǎn)生了50％以上神經(jīng)絲陽(yáng)性細(xì)胞。病例數(shù)目不夠大，因此無(wú)法得出進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的最佳患者材料的確切結(jié)論。
營(yíng)養(yǎng)和激素支持的需求。在初步試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了人神經(jīng)元對(duì)FGF2的營(yíng)養(yǎng)需求，這種需求在成年大鼠神經(jīng)元中觀察到(Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71143-155)。對(duì)于對(duì)神經(jīng)絲染色的細(xì)胞，F(xiàn)GF2使陽(yáng)性細(xì)胞的比例從53±10％提高到67±7％(t試驗(yàn)，p＜0.02，n＝6個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域約20個(gè)細(xì)胞，樣品1，表2)。以后的試驗(yàn)都在有FGF2的情況下進(jìn)行。在3例病例中，與FGF2相比，10μg/ml的DHEAS可促進(jìn)存活。各個(gè)病例中，在促進(jìn)神經(jīng)絲陽(yáng)性、神經(jīng)元樣細(xì)胞存活方面，DHEAS和FGF2一樣有效。培養(yǎng)在無(wú)FGF2和DHEAS(A)、或有FGF2(B)、或DHEAS(C)條件下的成年人神經(jīng)元的形態(tài)和神經(jīng)絲染色沒(méi)有顯著差異。在兩個(gè)病例中，DHEAS和FGF2對(duì)存活的綜合效果并不比只有一種要好。然而，在較低濃度時(shí)，DHEAS和FGF2對(duì)存活有協(xié)同作用(圖1)。無(wú)DHEAS時(shí)，存活的ED50接近1ng/ml FGF2。有DHEAS(10μg/ml)時(shí)，ED50降低了10倍，約為0.1ng/ml FGF2(圖1)。將1μg/ml和3μg/ml DHEAS混合可產(chǎn)生0-10μg/ml之間的中間存活率(數(shù)據(jù)未顯示)。在一個(gè)試驗(yàn)中(樣品4，表2)，除FGF2外還加入了營(yíng)養(yǎng)因子NT3或EGF。這些組合物對(duì)于神經(jīng)絲陽(yáng)性細(xì)胞的存活不比單獨(dú)的FGF2更有效。在另一個(gè)試驗(yàn)中(樣品6，表2)，在B27/Neurobasal內(nèi)的FGF2和DHEAS中加入了性激素睪酮和雌二醇，但沒(méi)有效果。
實(shí)施例2在腦外科手術(shù)中，蛛網(wǎng)膜下隙、腦薄壁組織和切除腔通常用生理鹽水沖洗。由于生理鹽水在人開(kāi)顱術(shù)時(shí)被用來(lái)清洗手術(shù)部位，且鹽水可在大鼠皮層損傷中造成神經(jīng)膠質(zhì)增生(Gomez-Pinilla等，J.Neurosci.，1995；152021-2029)，測(cè)試了生理鹽水在維持神經(jīng)元在模型系統(tǒng)(即培養(yǎng)物中的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元)中存活的能力。除去培養(yǎng)基并用鹽水處理這些神經(jīng)元24小時(shí)后，一半以上的細(xì)胞死亡，但所有細(xì)胞都喪失了產(chǎn)生樹(shù)突的能力。48小時(shí)后，鹽水使幾乎所有細(xì)胞死亡。用Neurobasal/B27處理的平行培養(yǎng)物顯示典型的最大存活率約為50-60％。
為評(píng)價(jià)本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基對(duì)腦的作用，在大鼠傘毛-穹隆上建立了大鼠皮層的吸引術(shù)損傷，用培養(yǎng)基清洗損傷，然后將浸透培養(yǎng)基的明膠海綿移植到受損的腔中。以利用儀器不用肉眼的規(guī)程，在36只大鼠上進(jìn)行操作每組6只大鼠，接受浸透以下組合物之一的明膠海綿(1)生理鹽水，植入皮層損傷腔；(2)表1中更優(yōu)選的組合物，用嚙齒動(dòng)物適用的皮質(zhì)酮(0.01-0.05μM)代替皮質(zhì)醇；(3)Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，添加10ng/ml FGF2；(4)表1中更優(yōu)選的組合物，用嚙齒動(dòng)物適用的皮質(zhì)酮(0.01-0.05μM)代替皮質(zhì)醇，并添加5ng/mlFGF2；和(5)對(duì)照(即無(wú)損傷或偽受損)。無(wú)需任何有關(guān)治療的知識(shí)，神經(jīng)科醫(yī)師確定在這些大鼠中獲得了靶傘毛-穹隆的損傷。通過(guò)計(jì)數(shù)中間隔膜中甲酚紫染色的神經(jīng)元確定處理4周后的神經(jīng)元密度。用本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理使神經(jīng)元密度增加了55％(圖2)。用本發(fā)明的培養(yǎng)基處理得到的提高明顯高于用鹽水進(jìn)行的處理(p＝0.01)，且用本發(fā)明的培養(yǎng)基處理的神經(jīng)元的密度接近未受損病例的神經(jīng)元密度。用26mM碳酸氫鈉制備的類似制品的功效稍差(圖2)。通常，添加了FGF2的基礎(chǔ)組合物和單獨(dú)的基礎(chǔ)組合物對(duì)于保持中間隔膜的神經(jīng)元密度一樣有效。因此，上表1中“更加優(yōu)選的范圍”一欄所述的無(wú)菌液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)組分通常是優(yōu)選的。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明的組合物對(duì)于隔開(kāi)神經(jīng)元的作用，這些神經(jīng)元的軸突已被切斷或經(jīng)歷軸索顯微外科術(shù)，這種情況通常發(fā)生在腦或脊髓外科手術(shù)或頭或脊髓損傷中。
實(shí)施例3.用腦損傷模型在體外測(cè)試了用本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基保持神經(jīng)元的生存力。進(jìn)行大鼠皮層吸引術(shù)(直徑約1mm)以產(chǎn)生損傷腔，在腔中填滿浸透(1)鹽水、(2)表1中所列優(yōu)選的本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(即第一種無(wú)菌液體培養(yǎng)基)，或(3)用26mM碳酸氫鈉緩沖液而不是MOPS緩沖液進(jìn)行緩沖的表1的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(即第二種無(wú)菌液體培養(yǎng)基)的明膠海綿?；謴?fù)4周后，通過(guò)固定、石蠟包埋、切片和用甲酚紫染色來(lái)評(píng)價(jià)皮層神經(jīng)元的存活。損傷周圍神經(jīng)元的存活是距損傷邊緣和對(duì)測(cè)的距離的函數(shù)。距損傷邊緣第一個(gè)100μm的圖象顯示，與鹽水相比，無(wú)論用本發(fā)明的哪種無(wú)菌液體培養(yǎng)基，細(xì)胞損失都較小。手術(shù)一個(gè)月后，與鹽水處理相比，用第一種無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理的大鼠神經(jīng)元密度的保存平均增加了27％(裂區(qū)中有一個(gè)塊變量，F(xiàn)(1，10)＝7.1，p＝0.02)(圖3A)。用以碳酸氫鹽緩沖的本發(fā)明的培養(yǎng)基處理的損傷與上述鹽水有相同的作用，但不顯著(F(1，10)＝4.1，p＝0.07)。與偽損傷的動(dòng)物(無(wú)損傷穿顱)，第一種和第二種方面無(wú)菌液體培養(yǎng)基都可幾乎完全保存神經(jīng)元密度。然而，第一種無(wú)菌液體培養(yǎng)基通常可提供較好的保存效果。
至于占皮層未受損對(duì)側(cè)相同區(qū)域神經(jīng)元密度的百分?jǐn)?shù)，用第二種(碳酸氫鹽緩沖的)無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理的損傷與鹽水處理的損傷無(wú)異(圖3B)。然而，用第一種無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理使神經(jīng)元密度在中間距離(200-400μm)甚至高于未受損側(cè)(圖3B)。超過(guò)這一距離，第一種無(wú)菌液體培養(yǎng)基使神經(jīng)元密度高于鹽水處理約15％，但不顯著(F(1，4)＝4，p＝0.09)。損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元的對(duì)側(cè)損失或神經(jīng)纖維網(wǎng)的變化可能是由于缺乏較大區(qū)別造成的。在感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層損傷中，對(duì)側(cè)神經(jīng)纖維網(wǎng)擴(kuò)大，這可能造成神經(jīng)元密度降低。因此，重新測(cè)量了損傷對(duì)側(cè)神經(jīng)元密度的原始數(shù)據(jù)。用鹽水處理觀察到了令人吃驚的對(duì)側(cè)神經(jīng)元密度的大量減少，而第一種無(wú)菌液體培養(yǎng)基顯示出對(duì)對(duì)側(cè)神經(jīng)元密度的較好保存。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基對(duì)于保存神經(jīng)元密度的作用。
還用添加了5ng/ml FGF2的表1的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理了大鼠損傷，和以前公布的添加10ng/ml FGF2的DMEM(Otto等，J.Neurosci.Res.，1989；2283-91)進(jìn)行比較。圖3C顯示添加FGF2的本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基使細(xì)胞密度較之鹽水明顯高出50％，且明顯優(yōu)于添加FGF2的DMEM(p＝0.03)和鹽水(p＝0.002)。這些結(jié)果證明了如本發(fā)明所述的將無(wú)菌液體培養(yǎng)基和FGF2結(jié)合的額外好處。
上述處理后，切片還被脫蠟和對(duì)GFAP(角質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白)免疫染色，以觀察隨腦損傷發(fā)生的神經(jīng)膠質(zhì)增生。測(cè)量免疫染色的密度，它是距吸引損傷邊緣的距離的函數(shù)。圖4顯示了用鹽水處理產(chǎn)生的高密度的神經(jīng)膠質(zhì)增生(Gomez-Pinilla等，J.Neurosci.，1995；152021-2029)。通過(guò)偽受損處理顯示GFAP染色的背景水平。用本發(fā)明的培養(yǎng)基處理的大鼠皮層中損傷GFAP染色明顯降低(本發(fā)明的無(wú)菌液體培養(yǎng)基，p＝0.002)。
實(shí)施例4.測(cè)試了本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物中人腫瘤生長(zhǎng)的作用。5個(gè)連續(xù)腫瘤樣品獲自接受包括損傷切除術(shù)的開(kāi)顱術(shù)患者。將樣品置于4℃的無(wú)菌轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(HibernateTM/B27，如美國(guó)專利No.6,180,404所述；www.siumed.edu/BrainBits)，并通過(guò)冷敷連夜運(yùn)輸。在4℃保存1-3天后，在Mcllwain組織切片機(jī)上將組織切成0.5mm的切片。切片在30℃在Hibernate A(BrainBits)中用木瓜蛋白酶(2mg/ml，Worthington)消化30分鐘，然后在Hibernate A/B27/0.5mM谷氨酰胺(GIBCO)中研磨。將樣品分成兩份并在200×g離心1分鐘。將其中一個(gè)沉淀物再次懸浮在加有0.5mM谷氨酰胺的本發(fā)明培養(yǎng)基；另一個(gè)再次懸浮在加有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基。用錐蟲(chóng)藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，并鋪在2cm2經(jīng)培養(yǎng)物處理的24孔板的聚苯乙烯孔中，它已經(jīng)用50μg/ml聚-D-賴氨酸預(yù)涂布。在37℃、5％CO2和9％O2(Thermo-Forma)培養(yǎng)的第1天和第6或7天，用20x Nikon目鏡通過(guò)Spot cooled CCD照相機(jī)(Diagnostic Instruments)獲得相差圖象。在0.373mm2的12塊鄰近區(qū)域通過(guò)肉眼或Image-Pro+軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)的幫助計(jì)數(shù)分離的相明亮區(qū)域。用標(biāo)準(zhǔn)誤差表示每平方毫米培養(yǎng)物面積的平均細(xì)胞密度。用Plotit軟件(Scientific Programming Enterprises)計(jì)算處理間的t-試驗(yàn)結(jié)果。
生長(zhǎng)在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基內(nèi)的腦膜瘤細(xì)胞在7天后顯示令人吃驚的生長(zhǎng)。這些細(xì)胞分散到基質(zhì)中并增殖，平均細(xì)胞面積達(dá)到3015+453μm2(平均值+/-S.E.，n＝12細(xì)胞)(圖5A)。以同樣密度鋪在本發(fā)明培養(yǎng)基上的相同細(xì)胞在培養(yǎng)7天后沒(méi)有擴(kuò)散或增殖(平均面積＝936μm2)(t-試驗(yàn)，p＝0.0001)(圖5B)；在本發(fā)明的培養(yǎng)基中幾乎沒(méi)有活細(xì)胞。
類似地，生長(zhǎng)在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)展到基質(zhì)中并增殖(圖5C)。相反，生長(zhǎng)在本發(fā)明培養(yǎng)基中的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞在培養(yǎng)7天后沒(méi)有擴(kuò)展或增殖(圖5D)。
使腦膜瘤細(xì)胞生長(zhǎng)10天。培養(yǎng)10天后，生長(zhǎng)在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生融合生長(zhǎng)。用胰蛋白酶處理收集這些細(xì)胞，并將其置于含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基或本發(fā)明的培養(yǎng)基。下面的表3和圖6顯示細(xì)胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，但在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，并有細(xì)胞死亡。
表3
在表4中比較了各種類型腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)。表4中的數(shù)據(jù)顯示了第6或第7天細(xì)胞的增加，增加是用第6天或第7天的細(xì)胞數(shù)除以開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞數(shù)。這些結(jié)果還顯示在圖7中。對(duì)于這5種連續(xù)腫瘤病例，本發(fā)明的培養(yǎng)基導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯或抑制以及細(xì)胞死亡，而含有胎牛血清的Neurobasal A培養(yǎng)基使所有原發(fā)性腫瘤的細(xì)胞增殖而使轉(zhuǎn)移腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。
表4
有上述試驗(yàn)可見(jiàn)，本發(fā)明的培養(yǎng)基可抑制培養(yǎng)物中人腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)腦或脊髓組織施用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.1-約1.2μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl、0-約4000μM MgCl2、約30000-約150000μM NaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4μM亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μML-肉堿、約3-約80μM乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM腐胺、約20-約500μM丙酮酸鈉以及對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有效的量的促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基的滲量為約200-約270mOsm，含有約5000-約25000μM氫離子緩沖液，緩沖液的pKa為約6.9-約7.7，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑包含約0.001-約0.1μM皮質(zhì)醇、約0.5-約16μM還原的谷胱甘肽、約0.05-約20μM亞油酸、約0.1-約10μM亞麻酸、約0.001-約0.1μM孕酮、約0.02-約1μM醋酸視黃酯，0-約0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、約0.1-約10μM DL-α生育酚、約0.1-約10μM DL-α生育酚乙酸酯、約5-約200μM人白蛋白、約0.001-約0.1μM過(guò)氧化氫酶、約0.1-約5μM胰島素、約0.01-約0.5μM超氧化物歧化酶和約0.01-約0.32μM運(yùn)鐵蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基用3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸緩沖。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基用3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸緩沖。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述無(wú)菌含水培養(yǎng)基還含有(1)L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-纈氨酸各約0-約5000μM；(2)約0-約3000μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-酪氨酸各約0-約2400μM；(4)L-組氨酸和L-甲硫氨酸各約0-約1200μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各約0-約500μM；(6)約0-約120μM L-丙氨酸；(7)約0-約60μM L-半胱氨酸；(8)約0-約30μM L-天冬酰胺；(9)約0-約240μM i-肌醇，(10)約0-約200μM煙酰胺，(11)約0-約200μM膽堿，(12)約0-約120μM吡哆醛，(13)硫胺、葉酸和D-泛酸鈣各約0-約100μM，(14)約0-約6μM核黃素，(15)約0-約2.5μM生物素，以及(16)約0-約1.2μM維生素B12。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基(1)L-異亮氨酸、L亮氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-纈氨酸各約0-約5000μM；(2)約0-約3000μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-酪氨酸各約0-約2400μM；(4)L-組氨酸和L-甲硫氨酸各約0-約1200μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各約0-約500μM；(6)約0-約120μM L-丙氨酸；(7)約0-約60μM L-半胱氨酸；(8)約0-約30μM L-天冬酰胺；(9)約0-約240μM i-肌醇，(10)約0-約200μM煙酰胺，(11)約0-約200μM膽堿，(12)約0-約120μM吡哆醛，(13)硫胺、葉酸和D-泛酸鈣各約0-約100μM，(14)約0-約6μM核黃素，(15)約0-約2.5μM生物素，以及(16)約0-約1.2μM維生素B12。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有脫氫表雄酮-4-硫酸鹽。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有脫氫表雄酮-4-硫酸鹽。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述脫氫表雄酮-4-硫酸鹽的量為約2-約200μM。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述脫氫表雄酮-4-硫酸鹽的量為約2-約200μM。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有人FGF2。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有人FGF2。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有人FGF2。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有人FGF2。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述人FGF2的量為約1-約20ng/ml。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述人FGF2的量為約1-約20ng/ml。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述人FGF2的量為約2-約10ng/ml。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述人FGF2的量為約2-約10ng/ml。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基通過(guò)用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基沖洗或灌輸腦或脊髓組織局部用于腦或脊髓組織。
20.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基通過(guò)用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基沖洗或灌輸腦或脊髓組織局部用于腦或脊髓組織。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，用浸漬或滲透有含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基的手術(shù)包扎材料來(lái)施用所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基，所述經(jīng)浸漬或滲透的手術(shù)包扎材料與腦或脊髓組織接觸。
22.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，用浸漬或滲透有含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基的手術(shù)包扎材料來(lái)施用所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基，所述經(jīng)浸漬或滲透的手術(shù)包扎材料與腦或脊髓組織接觸。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，用注射器或泵施用所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基與腦或脊髓組織接觸。
24.一種將生存力增強(qiáng)的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在將干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)之前或之時(shí)用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理所述干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織，和(2)輸遞經(jīng)處理的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)；所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.1-約1.2μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl、0-約4000μM MgCl2、約30000-約150000μM NaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μMNaH2PO4、約0.01-約0.4μM亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μM L-肉堿、約3-約80μM乙醇胺、約15-約400μMD(+)-半乳糖、約40-約800μM腐胺、約20-約500μM丙酮酸鈉以及對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)有效的量的促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，；所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基的滲量為約200-約270mOsm，含有約5000-約25000μM氫離子緩沖液，緩沖液的pKa為約6.9-約7.7，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述促進(jìn)生長(zhǎng)必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑包含約0.001-約0.1μM皮質(zhì)醇、約0.5-約16μM還原的谷胱甘肽、約0.05-約20μM亞油酸、約0.1-約10μM亞麻酸、約0.001-約0.1μM孕酮、約0.02-約1μM醋酸視黃酯、0-約0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、約0.1-約10μM DL-α生育酚、約0.1-約10μM DL-α生育酚乙酸酯、約5-約200μM人白蛋白、約0.001-約0.1μM過(guò)氧化氫酶、約0.1-約5μM胰島素以及約0.01-約0.5μM超氧化物歧化酶和約0.01-約0.32μM運(yùn)鐵蛋白；所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基還含有約2-約200μM脫氫表雄酮3-硫酸鹽和約1-約20ng/ml人FGF2。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織受到所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織的儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)移的影響。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織受到所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織的儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)移的影響。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，在輸遞之前，用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織受到所述干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織和所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基的綜合影響，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基被用作輸遞經(jīng)處理的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的載體。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，在輸遞之前，用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基處理干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織受到所述干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織和所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基的綜合影響，所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基被用作輸遞經(jīng)處理的干細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的載體。
30.一種有效提高腦或脊髓損傷或手術(shù)后人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力，或有效提高欲輸遞至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織的神經(jīng)細(xì)胞生存力的含水組合物，所述含水組合物含有0-約3000μM CaCl2；約0.1-約1.2μM Fe(NO3)3；約2500-約10,000μM KCl；0-約4000μM MgCl2；約30,000-約150,000μM NaCl；約100-約30,000μM NaHCO3；約250-約4000μM NaH2PO4；約0.01-約0.4μM亞硒酸鈉；約0.2-約2μM ZnSO4；約2500-約50,000μM D-葡萄糖；約1-約50μM L-肉堿；約3-約80μM乙醇胺；約15-約400μM D(+)-半乳糖；約5-約200μM人白蛋白；約40-約800μM腐胺；約20-約500μM丙酮酸鈉；約0.01-約0.32μM運(yùn)鐵蛋白；0-約120μM L-丙氨酸；0-約2400μM L-精氨酸；0-約30μM L-天冬酰胺；0-約60μM L-半胱氨酸；0-約3000μM L-谷氨酰胺；0-約2400μM甘氨酸；0-約1200μM L-組氨酸；0-約5000μM L-異亮氨酸；0-約5000μM L-亮氨酸；0-約5000μM L-賴氨酸；0-約1200μM L-甲硫氨酸；0-約2400μM L-苯丙氨酸；0-約500μM L-脯氨酸；0-約2400μM L-絲氨酸；0-約5000μM L-蘇氨酸；0-約500μM L-色氨酸；0-約2400μM L-酪氨酸；0-約5000μML-纈氨酸；約0.5-約16μM還原的谷胱甘肽；約0.1-約10μM α-生育酚；約0.1-約10μM α-生育酚乙酸酯；約0.001-約0.1μM過(guò)氧化氫酶；約0.01-約0.5μM超氧化物歧化酶；約0.001-約0.1μM皮質(zhì)醇；0-約200μM DHEAS；約0.001-約0.1μM孕酮；約0.02-約1μM醋酸視黃酯；約0.1-約5μM胰島素；0-約0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；約0.05-約20μM亞油酸；約0.1-約10μM亞麻酸；0-約2.5μM生物素；0-約100μM D-泛酸鈣0-約200μM膽堿；0-約100μM葉酸；0-約240μM i-肌醇；0-約200μM煙酰胺；0-約120μM吡哆醛；0-約6μM核黃素；0-約100μM硫胺和0-約1.2μM鈷胺素；所述無(wú)菌液體培養(yǎng)基的滲量為約200-約270mOsm，含有約5000-約25000μM氫離子緩沖液，緩沖液的pKa為約6.9-約7.7，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。
31.如權(quán)利要求30所述的含水組合物，所述含水組合物含有約500-約2500μMCaCl2；約0.05-約0.6μM Fe(NO3)3；約3000-約8000μM KCl；約300-約2000μMMgCl2；約40,000-約103,000μM NaCl；約200-約1800μM NaHCO3；約400-約2000μM NaH2PO4；約0.03-約0.2μM亞硒酸鈉；約0.4-約1.5μM ZnSO4；約10,000-約40,000μM D-葡萄糖；約3-約25μM L-肉堿；約6-約40μM乙醇胺；約30-約200μM D(+)-半乳糖；約15-約90μM人白蛋白；約80-約400μM腐胺；約100-約400μM丙酮酸鈉；約0.02-約0.16μM運(yùn)鐵蛋白；約6-約60μM L-丙氨酸；約120-約1200μM L-精氨酸；約1.5-約15μM L-天冬酰胺；約3-約30μML-半胱氨酸；約150-約1500μM L-谷氨酰胺；約120-約1200μM甘氨酸；約60-約600μM L-組氨酸；約250-約2500μM L-異亮氨酸；約250-約2500μM L-亮氨酸；約250-約2500μM L-賴氨酸；約60-約600μM L-甲硫氨酸；約120-約1200μM L-苯丙氨酸；約25-約250μM L-脯氨酸；約120-約1200μM L-絲氨酸；約250-約2500μM L-蘇氨酸；約25-約250μM L-色氨酸；約120-約1200μM L-酪氨酸；約250-約2500μM L-纈氨酸；約1-約8μM還原的谷胱甘肽；約0.5-約5μM α-生育酚；約0.5-約5μM α-生育酚乙酸酯；約0.002-約0.04μM過(guò)氧化氫酶；約0.02-約0.25μM超氧化物歧化酶；約0.002-約0.3μM皮質(zhì)醇；約5-約100μMDHEAS；約0.005-約0.06μM孕酮；約0.05-約0.6μM醋酸視黃酯；約0.2-約2μM胰島素；約0.0005-約0.2μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；約1-約10μM亞油酸；約0.2-約5μM亞麻酸；約0.01-約1.2μM生物素；約2-約40μM D-泛酸鈣；約9-約90μM膽堿；約2-約40μM葉酸；約12-約120μM i-肌醇；約10-約100μM煙酰胺；約6-約60μM吡哆醛；約0.3-約3μM核黃素；約2-約40μM硫胺；約0.05-約1μM鈷胺素和約1-約50ng/ml人FGF2。
32.如權(quán)利要求31所述的含水組合物，所述含水組合物含有約1200-約2400μMCaCl2；約0.1-約0.3μM Fe(NO3)3；約4000-約6000μM KCl；約600-約1000μM MgCl2；約66,000-約86,000μM NaCl；約780-約980μM NaHCO3；約800-約1000μM NaH2PO4；約0.06-約0.1μM亞硒酸鈉；約0.57-約0.77μM ZnSO4；約15,000-約35,000μM D-葡萄糖；約6約18μM L-肉堿；約12-約20NM乙醇胺；約60-約100μM D(+)-半乳糖；約30-約45μM人白蛋白；約160-約200μM腐胺；約130-約330μM丙酮酸鈉；約0.04-約0.08μM運(yùn)鐵蛋白；約10-約30μM L-丙氨酸；約200-約600μM L-精氨酸；約2.5-約7.5μM L-天冬酰胺；約5-約15μM L-半胱氨酸；約300-約700μM L-谷氨酰胺；約200-約600μM甘氨酸；約100-約300μM L-組氨酸；約600-約1000μM L-異亮氨酸；約600-約1000μM L-亮氨酸；約600-約1000μML-賴氨酸；約100-約300μM L-甲硫氨酸；約200-約600μM L-苯丙氨酸；約60-約80μM L-脯氨酸；約200-約600μM L-絲氨酸；約600-約1000μM L-蘇氨酸；約40-約160μM L-色氨酸；約200-約600μM L-酪氨酸；約600-約1000μM L纈氨酸；約2-約4μM還原的谷胱甘肽；約1-約3μM α-生育酚；約1-約3μM α-生育酚乙酸酯；約0.005-約0.02μM過(guò)氧化氫酶；約0.04-約0.12μM超氧化物歧化酶；約0.005-約0.015μM皮質(zhì)醇；約10-約30μM DHEAS；約0.01-約0.03μM孕酮；約0.1-約0.3μM醋酸視黃酯；約0.4-約0.8μM胰島素；約0.02-約0.08μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；約2.5-約4.5μM亞油酸；約0.5-約2μM亞麻酸；約0.2-約0.6μM生物素；約6-約24μM D-泛酸鈣；約20-約40μM膽堿；約4-約14μM葉酸；約20-約60μM i-肌醇；約15-約50μM煙酰胺；約10-約30μM吡哆醛；約0.5-約1.5μM核黃素；約5-約20μM硫胺；約0.1-約0.3μM鈷胺素和約2-約10ng/ml人FGF2。
33.如權(quán)利要求30所述的含水組合物，其中，所述氫離子緩沖液是3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸。
34.如權(quán)利要求31所述的含水組合物，其中，所述氫離子緩沖液是3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸。
35.如權(quán)利要求32所述的含水組合物，其中，所述氫離子緩沖液是3-[N-嗎啉基]丙烷-磺酸。
全文摘要
提供了一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞生存力的方法。該方法包括對(duì)腦或脊髓組織施用含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基，其中所述含水的無(wú)菌液體培養(yǎng)基含有0－約3000μM CaCl
文檔編號(hào)A61K38/02GK1599792SQ02823992
公開(kāi)日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2002年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月2日
發(fā)明者G·J·布魯爾 申請(qǐng)人:南伊利諾斯州立大學(xué)