專(zhuān)利名稱(chēng)：：用作體外和體內(nèi)dna轉(zhuǎn)染與基因治療載體的完整微細(xì)胞的制作方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及使用完整細(xì)菌微細(xì)胞將寡核苷酸和多聚核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞，尤其但不專(zhuān)屬于基因治療的背景中。本發(fā)明還涉及一種藥學(xué)上兼容的方法，用于提純完整的細(xì)菌微細(xì)胞。Salser等人的一項(xiàng)U.S.patentNo.4,497,796闡述了在1980年左右可用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種早期方法。特別的，Salser等人公布使用DNA共沉淀技術(shù)和磷酸鈣將編碼二氫葉酸還原酶的基因(其能夠產(chǎn)生甲氨蝶呤耐藥性)轉(zhuǎn)染至小鼠的L1210細(xì)胞或骨髓細(xì)胞中。Salser等人還提到了“許多其他方法……，用于將遺傳物質(zhì)插入細(xì)胞”，除了“病毒載體”外，還包括某些細(xì)胞融合技術(shù)“細(xì)胞-細(xì)胞融合涉及將包裹在核膜中的有限數(shù)量的染色體融入細(xì)胞中；……微細(xì)胞融合；……與含有質(zhì)粒DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合；以及與用DNA包裹的紅細(xì)胞影融合”(第18-30行，第5欄；引用被省略)。這些技術(shù)的共同點(diǎn)是使用一種通過(guò)單層膜界定的含有DNA的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在存在細(xì)胞融合促進(jìn)劑，例如聚乙烯乙二醇(PEG)的條件下，將其與目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸。哺乳動(dòng)物細(xì)胞與細(xì)胞結(jié)構(gòu)融合，形成一種雜交細(xì)胞，后者所含有的DNA被釋放入前者的細(xì)胞質(zhì)中并傳輸至雜交細(xì)胞的細(xì)胞核中，隨后該雜交細(xì)胞可能表達(dá)DNA。Salser公布的內(nèi)容提到了“紅細(xì)胞影”，即缺乏細(xì)胞質(zhì)成分但保持原始形態(tài)學(xué)的紅細(xì)胞殘余物，以及“細(xì)菌原生質(zhì)”，或者被剝離了外膜(細(xì)胞壁)的細(xì)菌細(xì)胞，其典型的通過(guò)水解酶或抑制肽聚糖合成的抗生素產(chǎn)生。Salser等人還間接提到了使用簡(jiǎn)化細(xì)胞結(jié)構(gòu)的第三種類(lèi)型，即微細(xì)胞原生質(zhì)。微細(xì)胞是大腸桿菌或其他細(xì)菌細(xì)胞的一種無(wú)核形式，其通過(guò)在分離DNA的細(xì)胞分裂二分體中干擾協(xié)調(diào)機(jī)能產(chǎn)生。原核染色體的復(fù)制物被聯(lián)接至正常的二分體，其涉及細(xì)胞中隔的形成。例如，在大腸桿菌中，min基因的突變，比如minCD，可以在細(xì)胞分裂過(guò)程中解除對(duì)細(xì)胞極處隔膜形成的抑制作用，導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)正常的子細(xì)胞和一個(gè)無(wú)核微細(xì)胞(deBoer等人，1992年；Raskin&deBoer，1999年；Hu&Lutkenhaus，1999年；Harry，2001年)。除了min操縱子突變外，還可以通過(guò)一類(lèi)影響隔膜形成的其他基因重排或突變，例如在枯草桿菌的divIVB1中產(chǎn)生無(wú)核細(xì)胞(Reeve和Cornett，1975年；Levin等人，1992年)。還可以在細(xì)胞分裂/染色體分離過(guò)程中通過(guò)在蛋白質(zhì)的基因表達(dá)水平進(jìn)行干擾形成微細(xì)胞。例如，minE的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致極性分裂并產(chǎn)生微細(xì)胞。類(lèi)似的，染色體分離的缺陷也可能產(chǎn)生少染色體微細(xì)胞，例如枯草桿菌中的smc突變(Britton等人，1998年)，枯草桿菌中的spoOJ缺失(Ireton等人，1994年)，大腸桿菌中的mukB突變(Hiraga等人，1989年)，以及大腸桿菌中的parC突變(Stewart和D’Ari，1992年)?？梢蕴峁┓词交虍a(chǎn)物。例如，當(dāng)cafA通過(guò)一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒過(guò)度表達(dá)時(shí)，可以提高細(xì)胞分裂的比例和/或在復(fù)制后抑制染色體的分離(Okada等人，1994年)，導(dǎo)致連鎖細(xì)胞和無(wú)核微細(xì)胞的形成(Wachi等人，1989年；Okada等人，1993年)。微細(xì)胞與在某些情況下同時(shí)產(chǎn)生并釋放的其他小泡截然不同，后者與微細(xì)胞相反，它們不是特殊基因重排或游離基因表達(dá)所產(chǎn)生的。這種其他小泡的例子有細(xì)菌氣泡，它是小膜泡(Dorward等人，1989年)。在例如農(nóng)桿菌、芽孢桿菌、博爾德氏桿菌、埃希氏菌、奈瑟氏菌、假單胞菌、沙門(mén)氏菌和志賀氏菌等數(shù)種細(xì)菌中已經(jīng)觀察到了氣泡。細(xì)菌氣泡可以通過(guò)比如操縱生長(zhǎng)環(huán)境(Katsui等人，1982年)以及使用外源性膜失穩(wěn)劑(Matsuzaki等人，1997年)產(chǎn)生。存在其他亞細(xì)菌成分，比如細(xì)菌影(Lubitz等人，1999年)，它是當(dāng)phiX174溶解基因E表達(dá)時(shí)，在多種革蘭氏陰性菌中形成的細(xì)菌空殼。細(xì)菌影的形成來(lái)自一種穿透細(xì)菌細(xì)胞包膜的跨膜管道結(jié)構(gòu)。由于細(xì)胞內(nèi)的高滲透壓，細(xì)胞質(zhì)成分被排出至周?chē)橘|(zhì)中，導(dǎo)致形成細(xì)菌細(xì)胞空殼。因?yàn)樵思?xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒復(fù)制依賴(lài)于染色體復(fù)制，所以在上述異常細(xì)胞分裂過(guò)程中，質(zhì)?？梢苑蛛x入正常的子細(xì)胞和微細(xì)胞中。因此，來(lái)自重組min大腸桿菌的微細(xì)胞攜帶大量的質(zhì)?？截?，具有除染色體外的全部細(xì)菌細(xì)胞成分，并且已經(jīng)被用作比如體外表達(dá)質(zhì)粒編碼基因的研究中。參見(jiàn)Brahmbhatt(1987年)，Harlow等人(1995年)和Kihara等人(1996年)。Brhambhatt(1987年)證明，例如，大腸桿菌微細(xì)胞可以攜帶含有20kbDNA插入物的重組質(zhì)粒，不含有任何染色體DNA，并且能夠同時(shí)表達(dá)9種或更多種重組蛋白質(zhì)。這種無(wú)復(fù)制性但具有代謝活性的完整微細(xì)胞已經(jīng)被用于分析質(zhì)粒運(yùn)載基因所編碼的蛋白質(zhì)。但是，在Salser等人所提到的“微細(xì)胞融合”背景中，微細(xì)胞被剝離外膜以產(chǎn)生一種類(lèi)似于細(xì)菌原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)，當(dāng)與PEG或其他細(xì)胞融合促進(jìn)劑一起培養(yǎng)時(shí)，其能夠與靶細(xì)胞融合。同樣與細(xì)菌原生質(zhì)相仿，這種微細(xì)胞原生質(zhì)必須保存在等張條件下以防止?jié)B透性溶解，并且它們極易受到酶的攻擊。因此，它們不適合用于基因治療。另外，隨著其他更方便的轉(zhuǎn)化方法的出現(xiàn)，Salser等人所說(shuō)的微細(xì)胞技術(shù)便陷于無(wú)用的境地。新近，基因治療的進(jìn)展已經(jīng)突出了多種用于介導(dǎo)外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)入受體哺乳動(dòng)物基因組的方法。參見(jiàn)Romano等人(1998，1999年)，Balicki和Beutler(2002年)以及Wadhwa等人(2002年)的回顧。由于嚴(yán)重的安全性考慮，這些技術(shù)的臨床應(yīng)用，比如腺病毒和重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用，已經(jīng)被擱置。目前轉(zhuǎn)化方法學(xué)所提出的直觀問(wèn)題是用野生型病毒進(jìn)行重組、插入和致癌潛力、病毒誘導(dǎo)的免疫抑制、病毒載體攜帶治療性DNA大片段的能力有限、減毒病毒的毒性回復(fù)、重組病毒的制造和分布困難、穩(wěn)定性差以及不良反應(yīng)，例如現(xiàn)有免疫性造成的炎癥反應(yīng)。能夠解決這些問(wèn)題的方法將提供顯著的收益，使得基因治療更加安全并且更加有效。已經(jīng)研究了活的減毒細(xì)菌載體作為人類(lèi)基因治療的基因傳輸載體，包括沙門(mén)氏菌(Darji等人，1997年；Paglia等人，2000年；Urashima等人，2000年)，志賀氏菌(Sizemore等人，1995年；Grillot-Courvalin等人，2002年)，李斯特氏菌(Dietrich等人，1998年)和侵襲性大腸桿菌(Grillot-Courvalin等人，1998年)。但是，細(xì)菌載體具有顯著的局限性，因?yàn)榛畹募?xì)菌盡管被減毒，還必須經(jīng)過(guò)操作以攜帶吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)以使足夠數(shù)量的重組DNA逸出至哺乳動(dòng)物細(xì)胞液與細(xì)胞核中。這種操作對(duì)于大量的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體而言困難較大并且或許是不可能的。此外，只有少數(shù)細(xì)菌種類(lèi)的減毒細(xì)菌突變體是已知的，例如沙門(mén)氏菌、大腸桿菌以及志賀氏菌的芳香氨基酸生物合成基因突變體。由于許多細(xì)菌種類(lèi)的減毒突變體仍然未知，細(xì)菌基因傳輸系統(tǒng)就無(wú)法使用大組的細(xì)菌性細(xì)胞內(nèi)病原體。由于部分染色體DNA可以被轉(zhuǎn)染至接受基因治療的人或動(dòng)物宿主體內(nèi)的其他微生物群落中，故細(xì)菌載體提出了有關(guān)染色體DNA存在的其他問(wèn)題。由于可能出現(xiàn)新型的有毒和/或耐藥菌，這種細(xì)菌物種之間的混雜DNA轉(zhuǎn)染是不符合要求的。
發(fā)明內(nèi)容為了說(shuō)明這些和其他需要，本發(fā)明根據(jù)一方面提供了一種組合物，其含有(i)重組的完整微細(xì)胞以及(ii)一種藥學(xué)上可接受的載體，其中微細(xì)胞含有一種治療性核酸分子，其編碼例如白介素-2。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該組合物含有的污染細(xì)胞少于1個(gè)污染親代細(xì)胞/107、108或109個(gè)微細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明為重組完整微細(xì)胞在藥物制劑中的使用提供了含有治療性核酸分子的微細(xì)胞，用于治療疾病或通過(guò)將該藥物給予細(xì)胞、組織或器官以改變特性的方法。在此范圍內(nèi)治療的疾病可以是比如腫瘤，或者一種獲得性疾病，比如艾滋病、肺炎、肺氣腫，或者由先天性代謝失調(diào)產(chǎn)生的疾病，比如囊性纖維化。換句話說(shuō)，該治療可以影響特性，比如繁殖能力或者與一種變態(tài)反應(yīng)原或傳染劑相關(guān)的免疫反應(yīng)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供了一種遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括(i)提供含有由一種核酸序列，優(yōu)選編碼治療性表達(dá)產(chǎn)物的核酸序列所組成質(zhì)粒的重組完整微細(xì)胞，以及隨后(ii)將微細(xì)胞與具有噬菌作用或內(nèi)吞作用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相接觸，使得微細(xì)胞被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞噬，后者借此產(chǎn)生核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。微細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的接觸可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。前面提到的質(zhì)粒也可以含有功能為調(diào)節(jié)成分的第二核酸片段，例如促進(jìn)子、終止物、增強(qiáng)子或一種信號(hào)序列，其經(jīng)過(guò)操作連接至第一核酸片段。另外，質(zhì)粒可以含有一種指示成分，例如一種編碼綠色熒光蛋白的核酸片段。根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種提純方法，其包括將含有微細(xì)胞的樣品通過(guò)(i)一系列橫向流動(dòng)濾器以及隨后(ii)通過(guò)終端濾器，借此將微細(xì)胞與該樣品中的污染物分離以獲得純化的微細(xì)胞制劑。此方法選擇性的包括用抗生素處理提純的微細(xì)胞制劑。還可以選擇一個(gè)預(yù)備步驟，對(duì)含有微細(xì)胞的樣品進(jìn)行差速離心。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該系列橫向流動(dòng)濾器包括(A)至少一個(gè)或兩個(gè)孔徑大于或等于0.45微米的濾器以及(B)至少一個(gè)或兩個(gè)孔徑小于或等于0.2微米的濾器。圖1顯示了一幅正常細(xì)菌細(xì)胞分裂以及min基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致微細(xì)胞形成的示意圖。圖2顯示了一幅用于產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞細(xì)菌株的質(zhì)粒制劑示意圖。特別的，該圖顯示了可用于生成一種產(chǎn)傷寒桿菌來(lái)源微細(xì)胞細(xì)菌株的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。顯示了克隆的插入DNA以及環(huán)形質(zhì)粒載體部件的素描。質(zhì)粒的名稱(chēng)以粗體顯示在插入DNA的左側(cè)以及環(huán)形載體圖的內(nèi)部。在使用PCR引物產(chǎn)生克隆的地方，引物編號(hào)顯示在鄰近虛線箭頭處。圖3顯示了一幅可用于產(chǎn)生一種產(chǎn)微細(xì)胞細(xì)菌株的質(zhì)粒制劑示意圖。特別的，該圖顯示了一種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生一種產(chǎn)志賀氏痢疾桿菌2a來(lái)源微細(xì)胞的細(xì)菌株。圖4顯示了一幅可用于產(chǎn)生一種產(chǎn)微細(xì)胞細(xì)菌株的質(zhì)粒制劑示意圖。特別的，該圖顯示了一種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，以生成一種產(chǎn)李斯特單胞菌來(lái)源微細(xì)胞的細(xì)菌株。圖5顯示了經(jīng)傷寒桿菌來(lái)源的微細(xì)胞轉(zhuǎn)染的小鼠巨噬細(xì)胞的透射電子顯微鏡像。對(duì)于每一幅照片提供了轉(zhuǎn)染后的時(shí)間和放大倍數(shù)。照片顯示了巨噬細(xì)胞空泡內(nèi)的微細(xì)胞樣電子致密顆粒(箭頭)。圖6顯示了微細(xì)胞介導(dǎo)的基因傳輸至乳腺癌細(xì)胞和異種基因表達(dá)。照片A顯示用非重組微細(xì)胞轉(zhuǎn)染96小時(shí)后的對(duì)照乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3，標(biāo)記物為抗HER-2抗體，檢測(cè)物為與Alexafluor結(jié)合的第二抗體。照片B顯示了用攜帶pEGFP-C1質(zhì)粒的重組微細(xì)胞轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，SK-BR-3細(xì)胞中GFP的表達(dá)(GFP的真核表達(dá))。照片C顯示了用微細(xì)胞/pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的SK-BR-3細(xì)胞，標(biāo)記物為抗HER-2抗體，檢測(cè)物為與Alexafluor結(jié)合的第二抗體。圖像可以用共焦顯微鏡觀察。圖7顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-C1質(zhì)粒的重組微細(xì)胞和滅活傷寒沙門(mén)氏菌14天后的小鼠血清抗GFP反應(yīng)。在圖例以及圖8-10的圖例中，10*8和10*9分別代表108和109。圖8顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-C1質(zhì)粒的重組微細(xì)胞和滅活傷寒沙門(mén)氏菌14天后的小鼠血清抗LPS反應(yīng)。圖9顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-C1質(zhì)粒的重組微細(xì)胞14天后，小鼠的血清抗GFP反應(yīng)。圖10顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-C1質(zhì)粒的重組微細(xì)胞14天后，小鼠的血清抗LPS反應(yīng)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明者已經(jīng)測(cè)定具有完整細(xì)胞壁的微細(xì)胞(“完整微細(xì)胞”)是用于在體外或體內(nèi)將寡核苷酸與多聚核苷酸(總的說(shuō)來(lái)，“核酸分子”)傳輸至宿主細(xì)胞(優(yōu)選人或動(dòng)物體內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的有效載體。因此，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)完整的微細(xì)胞可以被哺乳動(dòng)物細(xì)胞所吞噬，就像吞噬取得微細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞(“親代細(xì)菌細(xì)胞”)那樣。另外還發(fā)現(xiàn)，令人驚訝的，完整重組微細(xì)胞的成分被宿主細(xì)胞吞噬后，經(jīng)過(guò)這種方式的處理，至少有一些來(lái)自微細(xì)胞的質(zhì)粒DNA能夠逃脫降解并被運(yùn)輸穿過(guò)胞漿，直至宿主細(xì)胞核，隨后宿主細(xì)胞可以表達(dá)該質(zhì)粒DNA。因此，依據(jù)本發(fā)明，將一種攜帶需要進(jìn)行異源性表達(dá)之DNA的完整微細(xì)胞在體內(nèi)或體外與一種能夠以細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌致病原的方式吞噬親代細(xì)菌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相接觸。出于同樣的原因，那種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這里表示為“有吞噬能力的”，能夠吞噬微細(xì)胞并表達(dá)所討論的DNA。在完整微細(xì)胞被給定類(lèi)型宿主細(xì)胞吞噬的過(guò)程中涉及到多種機(jī)制，而本發(fā)明在這方面不依賴(lài)于任何一種特殊機(jī)制。例如，噬菌作用是一種經(jīng)過(guò)良好證明的程序，其中巨噬細(xì)胞以及其他吞噬細(xì)胞，例如嗜中性粒細(xì)胞，通過(guò)伸展偽足覆蓋顆粒表面直至完全包裹顆粒來(lái)攝入顆粒。盡管被描述為“非特異性”的噬菌作用，在此過(guò)程中仍然顯示涉及到特異性受體。見(jiàn)Wright&Jong(1986年)；Speert等人(1988年)。因此，一種形式的噬菌作用涉及表面配體與偽足膜上配體受體之間的相互作用(Shaw和Griffin，1981年)。這種由特殊受體介導(dǎo)的附著步驟被認(rèn)為依賴(lài)于細(xì)菌表面的粘附因子。至于毒性更低的細(xì)菌，例如不產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌，噬菌作用還可以在缺乏噬菌細(xì)胞受體的表面配體的條件下發(fā)生。例如，參見(jiàn)Pikaar等人(1995)。因此，本發(fā)明包括但不局限于具有或缺乏表面粘附因子的完整微細(xì)胞的使用，其保持了它們親代細(xì)菌細(xì)胞的特性，并且為噬菌細(xì)胞(例如“具備噬菌能力”的宿主細(xì)胞)所吞噬，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主要噬菌細(xì)胞類(lèi)型是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。另一種吞噬過(guò)程是內(nèi)吞作用，其中細(xì)胞內(nèi)致病原的示例為進(jìn)入哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞并在那里復(fù)制的沙門(mén)氏菌、埃希氏菌、志賀氏菌、哈比特屬菌、假單胞菌和乳酸桿菌等菌屬。在這一點(diǎn)上的兩種基本機(jī)制是內(nèi)涵素依賴(lài)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，又稱(chēng)作“被膜小窩內(nèi)吞作用”(Riezman，1993年)以及內(nèi)涵素非依賴(lài)的內(nèi)吞作用(Sandvig&Deurs，1994年)。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)一種具吞噬能力的細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用(例如，“具內(nèi)吞能力的”宿主細(xì)胞)吞噬完整的重組微細(xì)胞并表達(dá)微細(xì)胞所攜帶的DNA時(shí)，可以涉及一種或兩種機(jī)制。代表性的具內(nèi)吞能力的細(xì)胞有乳腺上皮細(xì)胞、胃腸道內(nèi)的腸細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞以及尿道和膀胱上皮細(xì)胞。本發(fā)明尤其可以用于將核酸分子導(dǎo)入具吞噬能力的細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，用于改善或另外治療疾病或改變與患者的特殊細(xì)胞、組織或器官類(lèi)型相關(guān)的特性。為了進(jìn)行此項(xiàng)描述，這些分子被劃分為“治療性核酸分子”。例如，給定治療性核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯可以用于治療腫瘤或一種獲得性疾病，比如艾滋病、肺炎、肺氣腫，或糾正先天性代謝失調(diào)，比如囊性纖維化。治療性核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯還可能實(shí)現(xiàn)絕育性滅菌，包括野生動(dòng)物的絕育性滅菌。依據(jù)本發(fā)明，通過(guò)給予治療性核酸分子，在患者體內(nèi)表達(dá)，影響與相應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)原和感染因子相關(guān)的免疫反應(yīng)，還能夠抵抗變態(tài)反應(yīng)原介導(dǎo)的炎性疾病以及感染因子介導(dǎo)的炎性疾病。一種治療性核酸分子還可以具有一種表達(dá)產(chǎn)物，或者有一種表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后變體的下游產(chǎn)物，能夠減少與移植相關(guān)的免疫后遺癥或幫助促進(jìn)組織生長(zhǎng)和再生。換句話說(shuō)，表達(dá)產(chǎn)物或相關(guān)的翻譯后介質(zhì)可以是一種蛋白質(zhì)，其代表為促紅細(xì)胞生成素，一種生長(zhǎng)因子比如TGF-β，一種細(xì)胞因子比如IL-2、IL-10、IL-12或其他白介素，一種血清無(wú)色蛋白酶抑制劑，或者一種抗體比如CTLA4-Ig，其能夠?yàn)樗拗魈峁┧璧氖芤?。其他?lèi)型的該種蛋白包括，沒(méi)有限制的，α-、β-和γ-球蛋白，胰島素，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，促紅細(xì)胞生成素，腫瘤壞死因子，MGF，腺苷脫氨酶，腫瘤表面相關(guān)抗原比如病毒、突變或錯(cuò)誤表達(dá)的抗原(CDK4，β-連接素，GnT-V，Casp8)，腫瘤特異性抗原比如MAGE、BAGE、GAGE、PRAME和NY-ESO-1，分化抗原比如酪氨酸酶、Melan-A/MART-1、gp100和TRP-1/gp75，以及過(guò)度表達(dá)的抗原比如Her2/neu和CEA。治療性核酸分子的進(jìn)一步分類(lèi)示例為分別編碼囊性纖維化跨膜調(diào)解器(CFTR)，VIII因子或其他血液蛋白，低密度脂蛋白受體，β-葡糖腦苷脂酶，α-和β-半乳糖苷酶，胰島素，甲狀旁腺素，α-1-抗胰蛋白酶，fasR以及fasL的DNA。依據(jù)本發(fā)明，由宿主細(xì)胞進(jìn)行的治療性核酸分子的表達(dá)能夠提供一種所需的化合物，其能夠調(diào)解靶向免疫反應(yīng)或干擾病變。例如，一種治療性核酸分子可以用于反義或核糖酶治療。在此背景下，反義治療涉及引介一種依據(jù)本發(fā)明的多聚核苷酸序列拷貝，使得拷貝的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與多聚核苷酸序列相應(yīng)的信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行原位雜交。這種雜交能夠典型的防止轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被翻譯成蛋白或者開(kāi)始破壞mRNA的降解途徑。治療性核酸還可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編碼短干擾RNA二聯(lián)體(siRNA’s)。更確切的說(shuō)，siRNA’s已經(jīng)顯示能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制目標(biāo)基因。干擾RNA(RNAi)的這種過(guò)程是一種發(fā)生于動(dòng)物、人類(lèi)以及植物中的，序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因靜默法，并且由與被靜默基因同源的雙鏈(ds)RNA所發(fā)動(dòng)。在多種細(xì)胞類(lèi)型中已經(jīng)成功的顯示了SiRNA的病毒介導(dǎo)傳輸能夠特異的減少目標(biāo)基因的表達(dá)(Haibin等人，2002年)。對(duì)于所有這些以及其他各種治療性核酸分子的使用，本說(shuō)明采用的標(biāo)題為“基因治療”，它的意思也包含短語(yǔ)“基因轉(zhuǎn)染”、“基因傳輸”以及“基于基因的疫苗”，涉及用于將治療性核酸分子在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞的方法學(xué)或系統(tǒng)，就像例如U.S.patentNo.5,399,346中所描述的。因此，本發(fā)明的含微細(xì)胞組合物可以用于達(dá)到原位治療效果，以及用于在體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞然后將其介導(dǎo)入患者體內(nèi)。依據(jù)本發(fā)明，適合于體內(nèi)和體外方法的細(xì)胞可以是那些具有吞噬能力的細(xì)胞，例如噬菌細(xì)胞和上皮細(xì)胞。如上所述，基因治療可以治療或防止遺傳性或獲得性疾病或病癥。治療性核酸分子編碼一種產(chǎn)物，比如功能性RNA(例如，反義或siRNA)或一種肽、多肽或蛋白，需要其在體內(nèi)產(chǎn)生。例如，所關(guān)心的遺傳物質(zhì)可以編碼一種具有治療價(jià)值的激素、受體、酶或(多)肽。這種方法可以導(dǎo)致非整合的被轉(zhuǎn)染DNA的短暫表達(dá)、染色體外復(fù)制以及被轉(zhuǎn)染復(fù)制子比如游離基因的表達(dá)，或者被轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)整合入宿主細(xì)胞的染色體組DNA。治療性核酸分子可以是一種基因的正常對(duì)應(yīng)物，其編碼的蛋白質(zhì)功能異?；蛟诩膊顟B(tài)下以異常水平存在，通常是這樣，例如囊性纖維化中的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)性調(diào)解器(Kerem等人，1989年；Riordan等人，1989年；Rommens等人，1989年)，鐮刀狀細(xì)胞貧血中的β-球蛋白，以及地中海貧血中的任一種α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。如上所述，治療性核酸分子可以具有一種反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或小的干擾RNA。因此，依據(jù)本發(fā)明，使用一種經(jīng)過(guò)操作含有質(zhì)粒的完整微細(xì)胞，基因治療可以改善特性為α-球蛋白相對(duì)于β-球蛋白過(guò)度產(chǎn)生的β-地中海貧血，該質(zhì)粒整合了一種序列，其具有與α-球蛋白mRNA的目標(biāo)序列相對(duì)的反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在腫瘤的治療中，依據(jù)本發(fā)明適合使用的治療性核酸分子可以具有一種序列，其相應(yīng)于或來(lái)自與腫瘤抑制相關(guān)的基因，例如p53基因、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因、以及編碼腫瘤壞死因子的基因。依據(jù)本發(fā)明，通過(guò)這種方法可以治療多種實(shí)體腫瘤-癌、乳頭瘤以及疣。在這一點(diǎn)上的代表腫瘤包括結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、頭部和頸部腫瘤以及淋巴瘤。作為例證的乳頭瘤是鱗狀細(xì)胞乳頭瘤、脈絡(luò)叢乳頭瘤以及喉部乳頭瘤。疣病的實(shí)例為生殖器疣、足底疣、疣狀表皮發(fā)育不良以及惡性疣。用于本發(fā)明的一種治療性核酸分子還可以含有一個(gè)DNA片段，其編碼將無(wú)活性前體藥物轉(zhuǎn)化成一種或多種細(xì)胞毒性代謝物的酶，使得在體內(nèi)引入前體藥物時(shí)，有效的靶細(xì)胞被強(qiáng)迫，可能與鄰近細(xì)胞一起，進(jìn)行自殺。Spencer(2000年)，Shangra等人(2000年)以及Yazawa等人(2002年)回顧了該種非人類(lèi)來(lái)源和人類(lèi)來(lái)源“自殺基因”的臨床前以及臨床使用。非人類(lèi)來(lái)源自殺基因的例子包括那些分別編碼HSV-胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(rk)、胞嘧啶脫氨酶(CDA)+尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)染酶、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)染酶(GPT)、硝基還原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，DeoD)、細(xì)胞色素P450(CYP4B1)、羧肽酶G2(CPG2)以及D型氨基酸氧化酶(DAAO)的基因。人類(lèi)來(lái)源自殺基因的例子包括分別編碼羧肽酶A1(CPA)、脫氧胞苷激酶(dCK)、細(xì)胞色素P450(CYP2B1，6)、LNGFR/FKBP/Fas、FKBP/Caspases以及ER/p53的基因。依據(jù)本發(fā)明的自殺基因療法可以用于治療艾滋病。該方法已經(jīng)使用自殺載體進(jìn)行了測(cè)試，一旦經(jīng)處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被HIV-1感染，該載體就表達(dá)一種毒性基因產(chǎn)物。在被HIV-1感染后，這些載體使用HIV-1調(diào)節(jié)成分，Tat和/或Rev來(lái)誘導(dǎo)毒性基因比如α-白喉毒素、胞嘧啶脫氨酶或干擾素-a2的表達(dá)(Curiel等人，1993年；Dinges等人，1995年；Harrison等人，1992a；Harrison等人，1992b；Ragheb等人，1999年)。使用本發(fā)明的重組微細(xì)胞法，在HIV感染后，細(xì)胞可以被這些載體轉(zhuǎn)換并比未轉(zhuǎn)換細(xì)胞清除的更快，以細(xì)胞死亡為代價(jià)防止病毒的復(fù)制。通過(guò)本發(fā)明的方法引入的一種核酸分子可以包括一種指示成分。指示成分典型的通過(guò)編碼一種在其他情況下宿主無(wú)法產(chǎn)生的多肽，使得它的重組宿主具有易于檢測(cè)的表型或特性，經(jīng)過(guò)表達(dá)后，該多肽可以被組織學(xué)或原位分析，比如體內(nèi)成像技術(shù)所檢測(cè)到。例如，依據(jù)本發(fā)明的完整微細(xì)胞所傳輸?shù)囊环N指示成分可以編碼一種能夠在吞噬性宿主細(xì)胞中產(chǎn)生比色分析或熒光分析改變的蛋白，該變化可以通過(guò)原位分析檢測(cè)并且是轉(zhuǎn)錄活性的一種定量或半定量函數(shù)。這些蛋白的示例包括酯酶、蛋白酶和其他酶，它們的活性能夠產(chǎn)生一種可檢測(cè)的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。優(yōu)選的實(shí)施例是大腸桿菌β-半乳糖苷酶，其通過(guò)裂解產(chǎn)靛青底物吲哚-β-D-半乳糖苷來(lái)導(dǎo)致色彩變化，以及一種熒光素酶，其能夠氧化一種長(zhǎng)鏈醛(細(xì)菌熒光素酶)或一種雜環(huán)羧酸(熒光素)，伴隨光的釋放。在此范圍內(nèi)同樣有用的是一種指示成分，其能夠編碼水母Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白(GFP)，正如Prasher等人所述(1995年)。兩項(xiàng)已經(jīng)發(fā)布的PCT申請(qǐng)，WO095/21191(公布了編碼一種238個(gè)氨基酸的GFP脫輔基蛋白的多聚核苷序列，該脫輔基蛋白含有從氨基酸65至氨基酸67組成的發(fā)色團(tuán))和WO095/21191(公布了A.VictoriaGFP脫輔基蛋白cDNA的一種變體，其提供了一種肽，具有改變的熒光特性)舉例說(shuō)明了GFP相關(guān)技術(shù)的領(lǐng)域，并且Heim等人(1994年)報(bào)告了一種突變GFP，其特性為激發(fā)振幅提高了4至6倍。其他類(lèi)型的指示成分涉及一種表達(dá)產(chǎn)物，其能夠使重組微細(xì)胞抵抗毒素。例如，neo基因能夠保護(hù)宿主抵抗毒性水平的抗生素G418，而一種編碼二氫葉酸還原酶的基因能夠產(chǎn)生甲氨蝶呤耐藥性，并且氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)染酶(CAT)基因能夠賦予對(duì)氯霉素的耐藥性。用作指示成分的其他基因包括那些能夠轉(zhuǎn)化宿主微細(xì)胞以表達(dá)特異細(xì)胞表面抗原，例如病毒外殼蛋白比如HIVgp120或皰疹gD的基因，其易于為免疫測(cè)定所檢測(cè)到。按照本發(fā)明方法引介的核酸分子還可以具有操作連接至調(diào)節(jié)成分，例如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子和/或信號(hào)序列的所需編碼片段。一種合適的啟動(dòng)子可以是組織特異性或者甚至腫瘤特異性的，如同治療范圍所規(guī)定的那樣。當(dāng)啟動(dòng)子偏向于在特定的組織中激活，并且因此在靶組織中生效，促進(jìn)操作連接的結(jié)構(gòu)序列表達(dá)時(shí)，它是“組織特異性”的。組織特異性啟動(dòng)子的范疇包括，例如白蛋白和a1-抗胰蛋白酶各自的肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；彈性蛋白酶I基因控制區(qū)，其在胰腺泡細(xì)胞中是具有活性的；胰島素基因控制區(qū)，在胰腺β細(xì)胞中具有活性；小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)，其在睪丸、乳房、淋巴和肥大細(xì)胞中具有活性；髓磷脂基礎(chǔ)蛋白基因控制區(qū)，其在大腦的少突細(xì)胞中具有活性；以及促性腺釋放激素基因控制區(qū)，其在下丘腦細(xì)胞中具有活性。參見(jiàn)Frain等人，(1990年)，Ciliberto等人(1985年)，Pinkert等人(1987年)，Kelsey等人(1987年)，Swift等人(1984年)，MacDonald(1987年)，Hanahan(1985年)，Leder等人(1986年)，Readhead等人(1987年)以及Mason等人(1986年)。還有偏向于在某些腫瘤細(xì)胞或本質(zhì)是腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，依據(jù)本發(fā)明其可以用于治療不同的腫瘤。此類(lèi)腫瘤細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的示例有酪氨酸酶啟動(dòng)子，目標(biāo)為黑色素瘤；MUC1/Df3啟動(dòng)子，目標(biāo)為乳腺癌；雜交myoD增強(qiáng)子/SV40啟動(dòng)子，表達(dá)目標(biāo)為橫紋肌肉瘤(RMS)；癌胚抗原(CEA)啟動(dòng)子，其為CEA表達(dá)細(xì)胞比如大腸癌細(xì)胞特異性的，以及己糖激酶II型基因啟動(dòng)子，目標(biāo)為非小細(xì)胞肺癌。參見(jiàn)Hart(1996年)，Morton&Potter(1998年)，Kurane等人(1998年)以及Katabi等人(1999年)。依據(jù)本發(fā)明，可以使用一種信號(hào)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物的分泌或?qū)⒁环N表達(dá)產(chǎn)物定位至特殊的細(xì)胞室。因此通過(guò)完整微細(xì)胞傳輸?shù)囊环N治療性多聚核苷酸分子可以包括一個(gè)位于合適的閱讀框架中的信號(hào)序列，使得所關(guān)心的表達(dá)產(chǎn)物由吞噬細(xì)胞或其子代分泌，從而影響周?chē)募?xì)胞，與所選擇的治療范例相一致。信號(hào)序列的示例包括U.S.patentNo.5,143,830中描述的溶血素C末端分泌序列，U.S.patentNo.5,037,743中公開(kāi)的BAR1分泌序列，以及U.S.patentNo.6,025,197中描述的zsig32多肽的信號(hào)序列部分。如上所述，本發(fā)明的完整重組微細(xì)胞保持體內(nèi)完整性的能力使得它們可以用于基因治療。完整微細(xì)胞不攜帶重組細(xì)菌細(xì)胞例如，志賀氏痢疾桿菌、李斯特單胞菌、大腸桿菌或傷寒沙門(mén)氏菌中存在的細(xì)菌染色體組DNA，而其他細(xì)胞已經(jīng)用其將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。參見(jiàn)Sizemore等人(1995年)；Gentschev等人(2000年)；Catic等人(1999年)；Dietrich等人(1998年)；以及Courvalin等人(1995年)。因此，依照本發(fā)明使用完整微細(xì)胞的基因治療不會(huì)伴有與使用重組細(xì)菌和將一種細(xì)菌或耐抗生素標(biāo)記基因無(wú)意識(shí)的轉(zhuǎn)染至患者固有微生物菌叢相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，必須通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性從患者體內(nèi)清除重組細(xì)菌，因此重組細(xì)菌不適合用于對(duì)患有例如腫瘤或艾滋病的免疫受損患者進(jìn)行基因治療?？梢詮娜魏胃锾m氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性來(lái)源的細(xì)菌細(xì)胞中制備微細(xì)胞。由于本發(fā)明使用完整微細(xì)胞而不是微細(xì)胞原生質(zhì)，本發(fā)明不需要并且優(yōu)選不涉及對(duì)微細(xì)胞進(jìn)行任何抗生素或化學(xué)預(yù)處理。可以通過(guò)min基因的突變，例如minCDE基因序列的部分缺失來(lái)生成產(chǎn)微細(xì)胞細(xì)菌株，如下面的實(shí)例1和2中所示。為了獲得重組的完整微細(xì)胞，依據(jù)本發(fā)明，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)所選擇產(chǎn)微細(xì)胞菌株的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不局限于使用電穿孔(Shigekawa&Dower，1988年)，化學(xué)方法(Hanahan，1983年)，往復(fù)式載體(Marcil&Higgins，1992年)以及結(jié)合作用(Firth等人，1996年)或傳導(dǎo)(Davis等人，1980年)。為了這種轉(zhuǎn)化，將來(lái)自任何真核、原核或合成來(lái)源的治療性核酸分子插入一種合適的市售或終端用戶(hù)專(zhuān)有的質(zhì)粒載體中。所選擇的DNA可以被操作連接至所需控制成分，用于體內(nèi)的基因傳輸和/或DNA在吞噬重組微細(xì)胞的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選在體外對(duì)重組微細(xì)胞進(jìn)行分析以確保它們能夠?qū)⒅亟M質(zhì)?；駾NA序列傳輸至靶細(xì)胞核，并且在靶細(xì)胞中發(fā)生重組基因的表達(dá)。對(duì)表達(dá)的檢測(cè)將取決于異源性基因的特性。可以通過(guò)多種方法監(jiān)測(cè)表達(dá)，包括免疫學(xué)、組織化學(xué)或活性檢驗(yàn)。熒光標(biāo)記基因的表達(dá)可以通過(guò)顯微鏡觀察，并且此特性提供了一種特別方便的檢驗(yàn)。例如，處于真核基因表達(dá)啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子控制下的編碼綠色熒光蛋白的基因，可以在質(zhì)粒上通過(guò)重組微細(xì)胞轉(zhuǎn)染至真核靶細(xì)胞(參見(jiàn)下面)。另外，使用合適的DNA或RNA探針，northern印跡分析或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)可以用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄。如果可以獲得異源性基因所編碼多肽的抗體，Western印跡分析、免疫組化或其他免疫學(xué)技術(shù)均可用于評(píng)價(jià)多肽的產(chǎn)生。如果異源性基因是一種酶，則也可使用合適的生化檢驗(yàn)。例如，如果異源性基因編碼抗生素耐藥性，那么測(cè)定被感染細(xì)胞對(duì)抗生素的耐藥性可以用于評(píng)價(jià)抗生素耐藥基因的表達(dá)。可以通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物中的DNA傳輸效率來(lái)評(píng)價(jià)推定宿主(“靶”)細(xì)胞的吞噬能力。因此，可以對(duì)靶腫瘤進(jìn)行活檢，所產(chǎn)生的組織樣品將以傳統(tǒng)方式使用，通過(guò)培養(yǎng)獲得代表腫瘤細(xì)胞，以測(cè)定其吞噬本發(fā)明中攜帶，例如，一種合適指示成分的重組微細(xì)胞的能力。除了測(cè)定這種主要細(xì)胞培養(yǎng)物外或者另外，依據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)測(cè)試治療方案中關(guān)鍵類(lèi)型組織的代表細(xì)胞系來(lái)測(cè)量吞噬微細(xì)胞的能力。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的文獻(xiàn)很多，例如Freshner(1992)。依據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)數(shù)種方法從母細(xì)胞中提純重組微細(xì)胞。一種方法使用例如Reeve(1979年)和Clark-Curtiss等人(1983年)所描述的蔗糖梯度法，隨后用抗生素，比如慶大霉素進(jìn)行處理(200微克/毫升，2小時(shí))以殺滅殘存的活菌。使用傳統(tǒng)方法所獲得的最佳純度為1個(gè)污染母細(xì)胞/106-107個(gè)微細(xì)胞。依據(jù)本發(fā)明，對(duì)于體內(nèi)使用而言，所需劑量高于106并且可能高達(dá)1010/每劑，按照前述污染比率，將轉(zhuǎn)化為10,000個(gè)活母細(xì)胞/每劑。這種污染水平會(huì)是致命的，尤其是在免疫受損的患者中。另外，傳統(tǒng)方法使用含有梯度形成劑的介質(zhì)，比如蔗糖、甘油或Percoll·，它們的存在對(duì)于體內(nèi)使用是有害的，正如現(xiàn)在所考慮的。因此，Percoll·的毒性將其限制于“僅用于研究目的”的范圍內(nèi)，而用于產(chǎn)生梯度的蔗糖會(huì)產(chǎn)生高滲透壓，導(dǎo)致微細(xì)胞發(fā)生生理學(xué)改變。因此，為了應(yīng)用于依據(jù)本發(fā)明之基因治療，優(yōu)選將母細(xì)胞污染最小化并使用生物兼容性更好的介質(zhì)。為了達(dá)到這些目標(biāo)，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將橫向流動(dòng)過(guò)濾(供液與膜表面平行)與終端過(guò)濾(供液與膜表面垂直)聯(lián)合使用會(huì)有意想不到的好處。通常的，參見(jiàn)Forbes(1987年)。在這種聯(lián)合前可以選擇進(jìn)行差速離心，在低離心力下除去一部分細(xì)菌細(xì)胞并從而使微細(xì)胞的上清液濃縮。還可以選擇在聯(lián)合后進(jìn)行抗生素處理以殺滅殘存親代細(xì)菌細(xì)胞。橫向流動(dòng)過(guò)濾可以依靠濾器的孔徑將微細(xì)胞從更大的污染物，比如親代細(xì)菌細(xì)胞，以及更小的污染物，比如細(xì)菌氣泡、游離內(nèi)毒素、核酸細(xì)胞碎片以及多余的液體中分離。為了從更大的污染物中分離微細(xì)胞，橫向流動(dòng)濾器的標(biāo)稱(chēng)孔徑應(yīng)當(dāng)允許微細(xì)胞透過(guò)濾器，而留下更大的細(xì)菌細(xì)胞。優(yōu)選0.45微米的孔徑用于此目的，因?yàn)槲⒓?xì)胞的直徑大約為0.4微米，而細(xì)菌細(xì)胞更大。為了從更小的污染物中分離微細(xì)胞，橫向流動(dòng)濾器的標(biāo)稱(chēng)孔徑應(yīng)當(dāng)允許更小的污染物透過(guò)濾器，而留下微細(xì)胞。優(yōu)選0.2微米的孔徑用于此目的，其他更小的污染物都小于0.2微米。在此條件下有效的使用活性流動(dòng)濾器典型的需要至少有一個(gè)步驟涉及大孔徑，大約0.45微米，然后至少有一個(gè)步驟涉及小孔徑，大約0.2微米。在連續(xù)橫向流動(dòng)過(guò)濾的步驟之間或之中，可以進(jìn)行透濾以盡可能多的回收微細(xì)胞。橫向流動(dòng)過(guò)濾的使用可以容納攜帶大量顆粒物質(zhì)的懸濁液，例如細(xì)菌培養(yǎng)物，其攜帶的細(xì)胞負(fù)荷為1011至1013個(gè)細(xì)菌和微細(xì)胞群體/升培養(yǎng)物。為了使濾器淤塞與隨后的微細(xì)胞丟失最小化，可以將細(xì)菌/微細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋?zhuān)瑑?yōu)選稀釋5至10倍。稀釋后還能使用適當(dāng)?shù)牡痛髿鈮号c流率。為了在橫向流動(dòng)過(guò)濾后除去殘存的親代細(xì)胞殘余物，進(jìn)行終端過(guò)濾。為此，優(yōu)選使用大約0.45微米的孔徑進(jìn)行至少一次終端過(guò)濾。通常，過(guò)濾可以提供適合于轉(zhuǎn)基因研究的微細(xì)胞無(wú)菌制劑。為了進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，優(yōu)選進(jìn)一步用抗生素處理以降低細(xì)菌細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。例如，可以用含有親代細(xì)菌株敏感抗生素的生長(zhǎng)介質(zhì)重懸微細(xì)胞。事先可以用傳統(tǒng)技術(shù)測(cè)定為此應(yīng)給予抗生素的合適數(shù)量。連續(xù)橫向流動(dòng)過(guò)濾/終端過(guò)濾排列，正如所述，不但省卻了梯度形成劑的使用，還提供了超過(guò)10-7的純度(也就是少于1個(gè)親代細(xì)胞/107個(gè)微細(xì)胞)。優(yōu)選純度超過(guò)10-8，并且更優(yōu)選近似于10-9的純度。連續(xù)橫向流動(dòng)過(guò)濾/終端過(guò)濾還提供了更好的質(zhì)量控制。另外，無(wú)需氨卞青霉素、環(huán)絲氨酸或其他抗生素的耐藥基因，如Clarke-Curtiss和Curtiss(1983)的技術(shù)所需的。此外，與Sancar等人(1979年)描述的方法不通，連續(xù)純化法不使用任何破壞DNA的射線；因此，使用通過(guò)連續(xù)橫向流動(dòng)過(guò)濾/終端過(guò)濾排列制備的微細(xì)胞所傳輸?shù)闹委熜院怂岱肿硬缓蟹派渚€誘導(dǎo)的非特異性突變。本發(fā)明中實(shí)質(zhì)由重組微細(xì)胞組成的組合物(更確切的說(shuō)，一種化合物，其包括該微細(xì)胞和其他不對(duì)組合物的DNA傳輸質(zhì)量產(chǎn)生不當(dāng)影響的成分)可以使用一種和多種生理學(xué)上可接受的載體和賦形劑，通過(guò)傳統(tǒng)方法制造。用于注射的配方可以以單位劑量的形式，例如在安瓿或小瓶，或在多劑容器中提供，含有或不含輔助額外的防腐劑。配方可以是溶液、懸濁液或在油性或水性媒介中的乳劑，并可以含有配劑，比如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。合適的溶液是接受者血液的等張液，其示例有生理鹽水、林格氏液以及右旋糖溶液。另外，微細(xì)胞可以是凍干粉的形式，用于與合適的媒介，例如無(wú)菌、無(wú)熱源水或生理鹽水重新復(fù)原。微細(xì)胞還可以制成長(zhǎng)效制劑。這種長(zhǎng)效配方可以通過(guò)移植(例如，皮下或肌肉內(nèi))或者肌肉內(nèi)注射給藥。本發(fā)明的含有微細(xì)胞組合物可以通過(guò)各種途徑給藥至哺乳動(dòng)物身體的各種部位，以獲得所需的局部或全身治療效果?？梢酝ㄟ^(guò)例如口服、將制劑用于體腔、吸入或吹入、或經(jīng)腸道、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、門(mén)脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜、皮下、腫瘤內(nèi)或皮內(nèi)給藥完成傳輸。所考慮應(yīng)用的特性同樣影響(或者受影響)用于傳輸治療性核酸分子的重組微細(xì)胞細(xì)菌源的選擇。例如，沙門(mén)氏菌、埃希氏菌和志賀氏菌屬攜帶的附著因子能夠被胃腸道中腸細(xì)胞上的內(nèi)吞作用介導(dǎo)受體所識(shí)別，可能適合于口服給藥，用于傳輸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有效的治療性核酸分子。類(lèi)似的，來(lái)自幽門(mén)螺旋桿菌的微細(xì)胞攜帶胃上皮細(xì)胞特異性的附著因子，適合于目標(biāo)為胃癌細(xì)胞的口服傳輸。對(duì)于來(lái)自假單胞菌屬的完整微細(xì)胞，其攜帶的附著因子能夠?yàn)榉紊掀ぜ?xì)胞所識(shí)別，則吸入或吹入可能是理想的給藥方法；將編碼比如CFTR蛋白的治療性核酸分子傳輸至囊性纖維化患者的肺部。來(lái)自乳酸桿菌的微細(xì)胞攜帶尿道和膀胱上皮細(xì)胞特異的附著因子，非常適合于將治療性核酸分子從尿道內(nèi)傳輸至尿道或膀胱腫瘤。本發(fā)明可以用于傳輸一列核酸分子，它可以是cDNA和染色體組DNA或RNA，并且其方向可以是順義或反義。依照本發(fā)明，在完整微細(xì)胞中存在的核酸分子可以是質(zhì)粒、表達(dá)載體或其他遺傳結(jié)構(gòu)的形式，但不能是來(lái)自產(chǎn)生微細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞的染色體組DNA。適合于在本發(fā)明中使用的序列包括來(lái)自真核、原核或合成來(lái)源的任何所需DNA或RNA序列，其能夠受控于真核基因表達(dá)啟動(dòng)子的翻譯和轉(zhuǎn)錄控制，或能夠使用來(lái)自宿主細(xì)胞的反激活因子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)例1從革蘭氏陰性細(xì)菌，傷寒沙門(mén)氏菌，大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌中產(chǎn)生細(xì)菌微細(xì)胞如這里所述(A，B和C)以及圖2和3所示，從革蘭氏陰性細(xì)菌中產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞細(xì)菌株。常規(guī)材料和方法在下面的例子中所用的細(xì)菌株列在并請(qǐng)參考表1。所有的細(xì)菌都生長(zhǎng)自保存于-80攝氏度的甘油原料。沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌以及李斯特菌株都生長(zhǎng)在胰酶解酪蛋白大豆肉湯(TSB)(BBL牌，購(gòu)自BactoLabs，Liverpool，NSW，Australia)中。根據(jù)制造商的說(shuō)明制備成30克/升，并在121攝氏度高壓滅菌15分鐘。液體培養(yǎng)物生長(zhǎng)于37攝氏度的搖動(dòng)培育箱內(nèi)。通過(guò)放置于XLD瓊脂(木糖-賴(lài)氨酸-去氧膽酸鹽)盤(pán)上分別產(chǎn)生紅色和黃色群落來(lái)區(qū)分志賀氏菌株與大腸桿菌。XLD購(gòu)自O(shè)xoid(Melbourne，Australia)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明制備成53克/升，然后煮沸2分鐘。在液體和固體媒介中按照下列濃度使用抗生素氨卞青霉素，100微克/毫升，氯霉素，30微克/毫升，卡那霉素，30微克/毫升。表1.所用的細(xì)菌株當(dāng)需要時(shí)，將菌株生長(zhǎng)于補(bǔ)充1％葡萄糖的M9最小培養(yǎng)基中。根據(jù)菌株加入額外的補(bǔ)充成分。對(duì)于大腸桿菌株ENIh003，加入1mM維生素B1。對(duì)于志賀氏痢疾桿菌株ENSf001，用0.4mM絲氨酸、0.2mM脯氨酸、0.001％苯丙氨酸、0.001％色氨酸、0.001％組氨酸、0.002毫克/毫升纈氨酸、0.0125毫克/毫升煙堿酸、0.001％維生素B1以及0.0225毫克/毫升蛋氨酸補(bǔ)充M9培養(yǎng)基。使用QiaprepSpinMiniprep試劑盒(QiagenInc.，Victoria，Australia)提純質(zhì)粒DNA。使用來(lái)自《分子生物學(xué)》(第2章，第I節(jié)，2.4部分；JohnWiley&Sons，Inc.)中現(xiàn)行規(guī)程的基本規(guī)程制備沙門(mén)氏菌、志賀氏菌以及大腸桿菌菌株的染色體組DNA。除了DeepVentDNA聚合酶購(gòu)自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA，USA)外，所用的全部限制和修飾酶均購(gòu)自Promega(Madison，WI，USA)或Roche(CastleHill，NSW，Australia)。通過(guò)如上述修改的傳統(tǒng)方法(Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSonsInc.)來(lái)提純李斯特單胞菌(ENLM001)的染色體組DNA。將1.5毫升過(guò)夜培養(yǎng)物的樣品以13,200rpm離心3分鐘，棄去上清液。在含有2.5毫克/毫升溶解酶的1毫升TE緩沖液(10mMTrispH8.0；1mMEDTApH8.0)中重懸細(xì)菌細(xì)胞，并在37攝氏度下培養(yǎng)1小時(shí)。然后加入RNAseA至終濃度為15毫克/毫升，將溶液在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。接著加入100微克/毫升蛋白酶K以及0.5％SDS，將混合物在37攝氏度下進(jìn)一步培養(yǎng)1小時(shí)。隨后，將200微升5MNaCl徹底混入溶液，再混入160微升CTAB/NaCl溶液(10％CTAB溶于0.7MNaCl)。然后將該混合物在65攝氏度下培養(yǎng)10分鐘。用等體積的氯仿/異戊基乙醇提取樣品，然后用等體積的苯酚/氯仿/異戊基乙醇進(jìn)行提取。用0.6體積的異丙醇和1/10體積的5M醋酸鈉沉淀染色體組DNA。在用TE緩沖液重懸之前，經(jīng)乙醇洗滌并空氣干燥DNA小球。PCR引物合成并購(gòu)自Sigma-Genosys(CastleHill，NSW，Australia)。所遵循的基本PCR規(guī)程如下。用于50微升PCR的反應(yīng)成分包括1×緩沖液，200微摩爾dNTPs，每種引物各50pmol，1單位DeepVentDNA聚合酶，50pmol染色體組DNA模板(質(zhì)粒用25pmol)，用無(wú)核酸酶水定容至50微升，PCR發(fā)生于0.2ml的試管中，在來(lái)自ThermoHybaid(Ashford，Middlesex，UK)的GradientPCRExpressThermalcycler中進(jìn)行。獲取minCDE基因簇的PCR條件如下94攝氏度下持續(xù)4分鐘；然后在94攝氏度下持續(xù)35秒鐘，60攝氏度下持續(xù)30秒鐘，72攝氏度下持續(xù)2.5分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；接著進(jìn)行終循環(huán)94攝氏度下持續(xù)35秒鐘，60攝氏度下持續(xù)35秒鐘，72攝氏度下持續(xù)5分鐘。獲取ΔminCDE盒的PCR條件如下94攝氏度下持續(xù)4分鐘；然后在94攝氏度下持續(xù)35秒鐘，60攝氏度下持續(xù)30秒鐘，72攝氏度下持續(xù)2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；接著進(jìn)行終循環(huán)94攝氏度下持續(xù)35秒鐘，60攝氏度下持續(xù)35秒鐘，72攝氏度下持續(xù)4分鐘。獲取ΔminCDE∷Cml盒的PCR條件如下94攝氏度下持續(xù)4分鐘；然后在94攝氏度下持續(xù)35秒鐘，60攝氏度下持續(xù)30秒鐘，72攝氏度下持續(xù)3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；接著進(jìn)行終循環(huán)；94攝氏度下持續(xù)35秒鐘，60攝氏度下持續(xù)35秒鐘，72攝氏度下持續(xù)6分鐘。在Sambrook等人(1989年)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECUULARBIOLOGY(JohnWiley&Sons，Inc.，NJ，USA)中描述了所遵循的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)規(guī)程。使用能夠通過(guò)LeicaDC照相機(jī)和LeicaIM照片管理軟件進(jìn)行照片分析的LeicaModelDMLB光學(xué)顯微鏡，經(jīng)顯微鏡測(cè)定所產(chǎn)生的微細(xì)胞。用暗視野顯微鏡在40×或油浸的100×放大倍數(shù)下觀察樣品。用1.5％瓊脂糖封閉玻片上的蓋玻片。通過(guò)將10％體積放在胰酶解酪蛋白大豆瓊脂平板上并在37攝氏度下培養(yǎng)過(guò)夜來(lái)測(cè)定每批微細(xì)胞的純度。該方法能夠常規(guī)提供非常高的純度，可達(dá)1個(gè)污染細(xì)胞/109個(gè)微細(xì)胞。將微細(xì)胞懸濁液在含有合適的親代細(xì)菌敏感抗生素的TSB中重懸，并將培養(yǎng)物在37攝氏度下培養(yǎng)并搖動(dòng)4小時(shí)以殺滅所有殘存親代細(xì)菌。例如，傷寒沙門(mén)氏菌minCDE菌株被測(cè)定為對(duì)氨卞青霉素敏感，因此將微細(xì)胞懸濁液在含有50微克/毫升氨卞青霉素的TSB中培養(yǎng)4小時(shí)以確保如果存在任何殘余細(xì)菌，則它們都會(huì)被殺滅。然后通過(guò)在10.000g離心30分鐘收集微細(xì)胞，在1×BSG緩沖液中洗滌4次(以清除培養(yǎng)基)并按所需的體積重懸，用于下游實(shí)驗(yàn)。從傷寒沙門(mén)氏菌的兩種不同菌株中產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞菌株在圖2中顯示了質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的示意圖。在表1、2和3中分別顯示了所用的細(xì)菌株、質(zhì)粒和PCR引物。采用FASTA分析法(Pearson和Lipman，1988年)將大腸桿菌minCDE基因序列，參見(jiàn)Mori(1996年)，用于在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源DNA序列。發(fā)現(xiàn)來(lái)自S.typhi基因組(CT18)的TYPN3contig101DNA序列與大腸桿菌minCDE序列同源。根據(jù)這些數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物ENOL001和ENOL002，并用于啟動(dòng)來(lái)自傷寒沙門(mén)氏菌株ENIh008的完整minCDE基因的合成，作為一種EcoRI-minCDEHindIII片段。將這種片段克隆入pNEB193的EcoRI/HindIII位點(diǎn)，產(chǎn)生標(biāo)明為pEN001的一種質(zhì)粒，其在大腸桿菌株JM109中繁殖產(chǎn)生菌株ENE001。引物ENOL003和ENOL004的設(shè)計(jì)為從pEN001的minCDE盒中刪除總共1081bp的序列，同時(shí)插入含有獨(dú)特Kpnl、SmaI和XbaI限制位點(diǎn)的16個(gè)堿基對(duì)(bp)作為未來(lái)插入一個(gè)或更多標(biāo)記基因的位點(diǎn)。所缺失的序列包括從minC基因3’未端開(kāi)始的386個(gè)堿基對(duì)，minD基因上游的23堿基對(duì)插入序列以及從minD基因5’末端開(kāi)始的672個(gè)堿基對(duì)。這導(dǎo)致質(zhì)粒pEN002中的ΔminCDE缺失盒(755個(gè)堿基對(duì))隱匿于菌株ENE003中。將來(lái)自PHSG415(圖2，表2)的氯霉素耐藥基因，1330-堿基對(duì)HaeII片段/鈍尾克隆入pEN002的SmaI位點(diǎn)以獲得質(zhì)粒pEN003，其攜帶ΔminCDE∷CmlR缺失盒，其中CmlR基因以順時(shí)針?lè)较蚩寺?。這被指定為菌株ENE006。表2.本研究中所用的質(zhì)粒使用引物ENOL001與ENOL002，通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從質(zhì)粒pEN003中擴(kuò)充ΔminCDE∷CmlR缺失盒，將其鈍化并克隆入自殺質(zhì)粒pGP704的SmaI位點(diǎn)(圖2，表2)。將命名為pEN005的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入菌株ENIh001(SM10λpir；表1)以產(chǎn)生菌株號(hào)ENE007。在結(jié)合實(shí)驗(yàn)中使用菌株ENE007作為供體菌株，而傷寒沙門(mén)氏菌株ENIh007和ENSm083(表1)作為受體。過(guò)夜，將供體與受體的靜態(tài)培養(yǎng)物生長(zhǎng)于37攝氏度的TSB中。在一個(gè)濾器中混合培養(yǎng)物，以1∶3的供體受體比率在TSA板上的HybondN+膜上搭配結(jié)合，并在37攝氏度培養(yǎng)8小時(shí)?；厥占?xì)胞并在無(wú)菌鹽水溶液中洗滌兩遍。在鹽水中重懸細(xì)胞小球，并涂在150mmPetri板上。將板在37攝氏度下培養(yǎng)近72小時(shí)。在含有1.5％葡萄糖和30微克/毫升氯霉素的M9最小培養(yǎng)基上選擇前接合體。由于額外的營(yíng)養(yǎng)缺陷要求，在這些條件下逆選擇供體菌株，同時(shí)由于氯霉素敏感性，受體機(jī)制無(wú)法生長(zhǎng)。因此該實(shí)驗(yàn)選擇攜帶質(zhì)粒編碼的氯霉素耐藥性的傷寒沙門(mén)氏菌前接合體。通過(guò)將分離物在含有氨卞青霉素(Amp)或氯霉素(Cml)的M9最小培養(yǎng)基上來(lái)在集落中篩查所需的CmlR和Amps顯型。從顯示CmlR的ENE007×ENIh007結(jié)合的79種分離物中，總共發(fā)現(xiàn)18種分離物是Amps的。類(lèi)似的，從ENE007×ENSm083結(jié)合的56種分離物中，總共發(fā)現(xiàn)19種分離物是Amps的。為了確定分離物是否在染色體中缺失了minCD基因，通過(guò)暗視野顯微鏡在40×放大倍數(shù)下觀察過(guò)夜培養(yǎng)物。在全部27種分離物的混合培養(yǎng)物中都觀察到了微細(xì)胞。所有分離物都顯示微細(xì)胞的存在而微細(xì)胞中不存在親代對(duì)照菌株。用4-0沙門(mén)氏菌體凝聚血清(兔)ZC13(MurexDiagnostics，Norcross，GeorgiaUSA)測(cè)定純化微細(xì)胞的凝集作用。重組細(xì)菌株生長(zhǎng)于產(chǎn)生重組微細(xì)胞的最佳實(shí)驗(yàn)室條件下。使用例如那些在Sambrook等人(1989年)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)媒介來(lái)完成細(xì)菌生長(zhǎng)，并使用最佳生長(zhǎng)條件，其易于為傳統(tǒng)技術(shù)所測(cè)定。從志賀氏痢疾桿菌中產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞菌株。圖3描述了從志賀氏痢疾桿菌血清型2b中遺傳構(gòu)造一種產(chǎn)微細(xì)胞菌株的相應(yīng)步驟?？寺∫?guī)程類(lèi)似于構(gòu)造產(chǎn)微細(xì)胞傷寒沙門(mén)氏所遵循的規(guī)程，上面已經(jīng)詳細(xì)的描述過(guò)。為了從志賀氏痢疾桿菌血清型2b(表1)中克隆minCDE基因簇，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)了PCR克隆引物來(lái)為完整的志賀氏痢疾桿菌血清型2a基因組序列尋找進(jìn)展中的排序方案。攜帶EcoRI和HindIII尾的PCR引物ENOL059和ENOL060分別(表3)被用于擴(kuò)充來(lái)自志賀氏痢疾桿菌血清型2b提純基因組DNA的18008bpminced基因簇。將所擴(kuò)充片段克隆入質(zhì)粒pNEB193(表2)的EcoRI和HindIII位點(diǎn)，形成質(zhì)粒pEN055。插入DNA經(jīng)過(guò)排序，并被證實(shí)為來(lái)自親代志賀氏菌的minCDEDNA。表3.在本研究中所用的寡核苷酸。在相應(yīng)DNA片段前的括號(hào)中顯示了限制酶位點(diǎn)和DNA序列特性。(F)和(R)分別代表前向和反向PCR引物。在反向PCR反應(yīng)中使用PCR引物ENOL062和ENOL063(表3)和質(zhì)粒pEN055作為模板DNA獲得缺失minCDE基因簇。這導(dǎo)致缺失271bp(minC的3’末端區(qū)域)，23bp(minC和minD之間的基因間序列)，和608bp(minD的5’末端區(qū)域)。同時(shí)，PCR引物序列插入了一個(gè)攜帶KpnI-SmaI-XbaI限制位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)。用SmaI消化PCR產(chǎn)物并轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生質(zhì)粒pEN056。從質(zhì)粒pHSG415(表2)中凝膠提純作為一種1330bpHaeII片段的CmlR標(biāo)記物，用T4DNA聚合酶鈍化末端并克隆入質(zhì)粒pEN056的SmaI位點(diǎn)。新的ΔminCDE∷CmlR質(zhì)粒命名為pEN057。通過(guò)使用引物ENOL059和ENOL060(表3)并使用質(zhì)粒pEN057作為模板的PCR獲得ΔminCDE∷CmlR盒。將2,272bp片段末端鈍化克隆入自殺質(zhì)粒pGP704的EcoRV位點(diǎn)(表2)。新的自殺質(zhì)粒被命名為pEN060，而攜帶它的SM10λpir菌株被命名為ENE105。使用濾器配對(duì)結(jié)合將質(zhì)粒pEN060從ENE105轉(zhuǎn)染至志賀氏痢疾桿菌株ENSf001(表1)，受體供體比例為5∶1，將受體和供體的過(guò)夜培養(yǎng)物(靜態(tài)生長(zhǎng))以所計(jì)算的比例在TSA板的HybondN+膜上混合，并在37攝氏度培養(yǎng)過(guò)夜?；厥占?xì)胞并洗滌2遍，然后在含有補(bǔ)充成分以及30微克/毫升氯霉素的選擇性最小培養(yǎng)基上析出。由于營(yíng)養(yǎng)缺陷的需要(供體)或抗生素敏感性(受體)，供體和受體不能在這種介質(zhì)上生長(zhǎng)，因此所發(fā)現(xiàn)的任何菌落都應(yīng)當(dāng)是接合后個(gè)體。采集到三十二(32)種分離物并將它們補(bǔ)綴在含有補(bǔ)充物與30微克/毫升氯霉素的新鮮最小培養(yǎng)基板上。將32種接合后個(gè)體在37攝氏度培養(yǎng)過(guò)夜后，補(bǔ)綴至含有補(bǔ)充物與100微克/毫升氨卞青霉素的新鮮最小培養(yǎng)基板上，然后在37攝氏度培養(yǎng)24-48小時(shí)。所有32種分離物都能在氨卞青霉素上生長(zhǎng)，顯示整個(gè)質(zhì)粒已經(jīng)完全整合。在暗視野顯微鏡(40×)或油浸(100×)下檢查每種分離物。發(fā)現(xiàn)3種分離物存在微細(xì)胞。將分離物在含有30微克/毫升氯霉素的XLD板上劃線以證實(shí)分離物是志賀氏菌而非大腸桿菌供體。當(dāng)用志賀氏痢疾桿菌凝集血清(BIODESIGNInternational，Saco，Maine，USA)測(cè)試時(shí)，分離物還顯示強(qiáng)陽(yáng)性的凝集反應(yīng)。質(zhì)粒純化以及凝膠電泳分析證實(shí)在接合后個(gè)體中不存在游離體形式的供體質(zhì)粒。從大腸桿菌中產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞菌株已知大腸桿菌與志賀氏菌的基因組之間具有98％的遺傳同源性，故本研究的目的是測(cè)定異源性ΔminCDE基因序列是否可以用于產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞菌株，尤其是基因組序列關(guān)系密切時(shí)。因此使用濾器配對(duì)接合將質(zhì)粒pEN060(攜帶來(lái)自志賀氏痢疾桿菌的ΔminCDE∷CmlR；圖3)從ENE195(表1)轉(zhuǎn)染至大腸桿菌株ENIh003(JM109；表1)，受體供體比例為3∶1。將受體和供體的過(guò)夜培養(yǎng)物(靜態(tài)生長(zhǎng))以所計(jì)算的比例在TSA板的HybondN+膜上混合，并在37攝氏度培養(yǎng)過(guò)夜?；厥占?xì)胞并洗滌2遍，然后在含有補(bǔ)充成分以及30微克/毫升氯霉素的選擇性最小培養(yǎng)基上析出。由于營(yíng)養(yǎng)缺陷的需要(供體)或抗生素敏感性(受體)，供體和受體不能在這種介質(zhì)上生長(zhǎng)，因此所發(fā)現(xiàn)的任何菌落都應(yīng)當(dāng)是接合后個(gè)體。采集到106種分離物并將它們補(bǔ)綴在含有補(bǔ)充物與30微克/毫升氯霉素的新鮮最小培養(yǎng)基板上。在37攝氏度培養(yǎng)過(guò)夜后，將分離物補(bǔ)綴至含有補(bǔ)充物與100微克/毫升氨卞青霉素的新鮮最小培養(yǎng)基板上，并在37攝氏度培養(yǎng)24-48小時(shí)。所有106種分離物都能在氨卞青霉素上生長(zhǎng)，提示整個(gè)質(zhì)粒已經(jīng)完全整合。在暗視野顯微鏡(40×)和油浸(100×)下觀察了二十四(24)種分離物。6種分離物顯示存在微細(xì)胞。盡管在過(guò)去使用了許多不同的常規(guī)誘變和定點(diǎn)誘變規(guī)程，本發(fā)明是第一個(gè)顯示在本研究中所采用的獨(dú)特克隆/定點(diǎn)誘變規(guī)程是通用的，并且能夠可靠的用于從一列革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌中產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞菌株(下面顯示的例2)。例2從李斯特單胞菌中產(chǎn)生微細(xì)胞正如所述，在這個(gè)例子里，可以從革蘭氏陽(yáng)性菌中產(chǎn)生產(chǎn)微細(xì)胞菌株。圖4中顯示了質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的示意圖。細(xì)菌株、質(zhì)粒和PCR引物分別列在表1、表2和表3中。為了克隆來(lái)自李斯特單胞菌的基因組，使用引物ENOL038和ENOL048(表2)并用李斯特單胞菌基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR。使用Platinum·PfxDNA聚合酶試劑盒(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)進(jìn)行體積為50微升的PCR反應(yīng)。反應(yīng)物包括1×Pfx緩沖液，2mM硫酸鎂，0.2mMdATP，dTTP，dGTP和dCTP，每種引物各50pmol，以及1個(gè)單位Pfx聚合酶。循環(huán)條件包括一個(gè)94攝氏度下的變性步驟，持續(xù)2分鐘；接著是35個(gè)循環(huán)94攝氏度下持續(xù)30秒，55攝氏度下持續(xù)30秒以及68攝氏度下持續(xù)2分鐘；然后在68攝氏度下進(jìn)行最終擴(kuò)展步驟，持續(xù)5分鐘。將每種PCR反應(yīng)混合物各取2-5微升樣品，在用溴化乙錠著色的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行觀察。從瓊脂糖凝膠上切下，然后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用422型洗提器(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)進(jìn)行電洗提，使擴(kuò)充的minCD片段純化。用SacI和HindII消化minCD片段(1，556bp)，并定向克隆入質(zhì)粒pNEB193的相應(yīng)位點(diǎn)(表2；圖4)。通過(guò)限制酶消化與凝膠電泳分析描述在菌株ENIh003(表1)中轉(zhuǎn)化的重組克隆。將正確的克隆(命名為pEN045的質(zhì)粒)排序以證實(shí)minCD基因的身份。使用引物ENOL039和ENOL040(表3)在質(zhì)粒pEN045中的克隆minCD片段上進(jìn)行PCR刪除。引物分別攜帶限制酶位點(diǎn)XbaI和KpnI，作為ΔminC和ΔminD之間選擇標(biāo)記物的插入位點(diǎn)。用于刪除minCD和觀察片段的條件如上所述，但另外有一個(gè)4分鐘的擴(kuò)展步驟。隨后用XbaI和KpnI消化ΔminCD片段，并用422型電洗提器通過(guò)電洗提進(jìn)行純化，作為與選擇標(biāo)記物綁縛的制劑。在pEN045中ΔminC與ΔminD基因之間的KpnI和XbaI位點(diǎn)上插入來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的兩種不同的抗生素選擇標(biāo)記物。使用來(lái)自枯草桿菌質(zhì)粒pMK4(表2)的氯霉素耐藥性標(biāo)記物(CmlR)和來(lái)自血鏈球菌質(zhì)粒pVA838(表2)的紅霉素耐藥性標(biāo)記物(EmR)分別構(gòu)建質(zhì)粒pEN062和pEN063(圖4)。使用表2中所列和圖4中所顯示的含有XbaI和KpnI位點(diǎn)的寡核苷酸通過(guò)PCR擴(kuò)增每種標(biāo)記物。使用與如上所述相同的反應(yīng)體積和反應(yīng)物濃度進(jìn)行CmR和EmR的PCR。循環(huán)條件包括一個(gè)94攝氏度下的變性步驟，持續(xù)2分鐘；接著是35個(gè)循環(huán)94攝氏度下持續(xù)30秒，55攝氏度下持續(xù)1分鐘以及68攝氏度下持續(xù)2分鐘；然后是一個(gè)68攝氏度下的擴(kuò)展步驟，持續(xù)5分鐘。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用MinElute試劑盒(QiagenInc，Victoria，Australia)對(duì)PCR片段進(jìn)行凝膠提純。然后用KpnI和XbaI消化CmR和EmR，在MinElute柱上提純，并連結(jié)至pEN045中ΔminC與ΔminD基因之間的相應(yīng)位點(diǎn)上。通過(guò)使用酶EcoRI和DdeI(CmR)以及EcoRI和AvaI(EmR)的限制酶消化來(lái)描述JM109重組體，分別得到菌株分離物ENE110和ENE112。為了李斯特單胞菌和大腸桿菌SM10λpir(ENIh001)之間的接合實(shí)驗(yàn)，使用接合質(zhì)粒pGP704構(gòu)建了4種新型質(zhì)粒。改造質(zhì)粒pGP704使其包含由neo基因編碼的卡那霉素耐藥標(biāo)記物(KmR)，或者用于在革蘭氏陽(yáng)性菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制的KmR以及ori。前者的作用是在缺乏革蘭氏陽(yáng)性復(fù)制源時(shí)作為自殺質(zhì)粒，而neo基因(KmR)的作用是作為質(zhì)粒存在的標(biāo)志。相比之下，后者的作用是作為接合實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。使用表3中所列的一組寡核苷酸通過(guò)PCR從pRB373中擴(kuò)充將含有neo基因的DNA片段以及包含革蘭氏陽(yáng)性ori的neo基因。PCR反應(yīng)體積與反應(yīng)物濃度如上所述。循環(huán)條件包括一個(gè)94攝氏度下的變性步驟，持續(xù)2分鐘；接著是35個(gè)循環(huán)94攝氏度下持續(xù)30秒，55攝氏度下持續(xù)1分鐘以及68攝氏度下持續(xù)2分半鐘；然后是一個(gè)68攝氏度下的長(zhǎng)擴(kuò)展步驟，持續(xù)5分鐘。使用MinElute柱從瓊脂糖凝膠中純化產(chǎn)物。用EcoRI切割含有neo基因以及neo基因加上革蘭氏陽(yáng)性ori的片段，并連接入pGP704的EcoRI位點(diǎn)(圖4)。這個(gè)過(guò)程產(chǎn)生名為pEN064和pEN066的質(zhì)粒。然后將來(lái)自pEN062和pEN063的ΔminCD∷CmlR或ΔminCD∷EmR分別切割成SacI-HindIII片段，末端鈍化并連接入質(zhì)粒pEN064和pEN066的EcoRV位點(diǎn)，以產(chǎn)生如圖4所示的4種不同的質(zhì)粒pEN069、pEN071、pEN073和pEN075。將4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入ENIh001(大腸桿菌SM10λpir)分別產(chǎn)生菌株ENE124、ENE126、ENE128和ENE130。因此ENE124包含具有ΔminCD∷CmR和neo基因(KmR)的質(zhì)粒，而ENE126另外還含有革蘭氏陽(yáng)性ori。類(lèi)似的，ENE128包含具有ΔminCD∷EmR和neo基因(KmR)的質(zhì)粒，而ENE130另外還含有革蘭氏陽(yáng)性ori。將4種菌株ENE124、ENE126、ENE128和ENE130作為供體菌株用于李斯特單胞菌(ENLM001)的接合實(shí)驗(yàn)。接合實(shí)質(zhì)上按照Trieu-Cuot等人(1991年)的描述進(jìn)行。所有的菌株都生長(zhǎng)至中對(duì)數(shù)期并以2∶1的比例(受體∶供體)混合，定容至1毫升。在BHI中洗滌接合混合物2遍，然后在1mlBHI中重懸。將200微升涂布在BHI板的0.45微米硝化纖維膜濾器(Millipore)上，并在37攝氏度下培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)后，將硝化纖維膜切成條狀并放在3毫升BHI中。使用劇烈的渦流從濾膜中除去細(xì)菌細(xì)胞。將300微升樣品在含有BHI、萘啶酸(Nal；50微克/豪升)、腸桿菌素(Col；多粘菌素E)(10微克/毫升)以及氯霉素(10微克/毫升)或紅霉素(10微克/毫升)的大平板上析出。將平板在37攝氏度下培養(yǎng)48小時(shí)，然后收集菌落。將菌落補(bǔ)綴至含有卡那霉素(15微克/毫升)的BHI/Nal/Col板以及含有氯霉素(10微克/毫升)或紅霉素(10微克/毫升)的BHI/Nal/Col板上，用于抗生素敏感性測(cè)定。所有的接合后個(gè)體都顯示一種抗生素特征，提示minCD缺失的染色體整合而沒(méi)有質(zhì)粒的整合。也就是說(shuō)，所有的接合后個(gè)體都能生長(zhǎng)于含有內(nèi)標(biāo)記紅霉素或氯霉素的抗生素板上，而接合后個(gè)體都不能生長(zhǎng)于含有卡那霉素的板上(KmR由供體質(zhì)粒上的neo基因編碼)。使用暗視野顯微鏡(40×)和油浸(100×)檢測(cè)了超過(guò)100種接合后個(gè)體的微細(xì)胞表型。在顯微鏡下，與親代細(xì)胞(ENIh001和ENLm001)相比，在李斯特單胞菌親代桿群體中所有的分離物都顯示出不同數(shù)量的微細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這個(gè)結(jié)果與minCD缺失的整合以及正常旁中心分裂的破壞是一致的。選擇了30種接合后個(gè)體進(jìn)行再次培養(yǎng)以測(cè)試微細(xì)胞表型的保持情況。在確認(rèn)保持的情況下，將分離物作為甘油原料儲(chǔ)存，用于未來(lái)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)例3.提純來(lái)自細(xì)菌的微細(xì)胞通過(guò)下面的獨(dú)創(chuàng)性方法來(lái)提純微細(xì)胞。這個(gè)例子詳細(xì)描述了來(lái)自minCDE-傷寒沙門(mén)氏菌的微細(xì)胞的提純過(guò)程。相同的程序還用于提純來(lái)自附加min突變菌株的微細(xì)胞，包括傷寒沙門(mén)氏菌的兩種突變體，以及大腸桿菌、志賀氏痢疾桿菌以及李斯特單胞菌各自的一種突變體。將此程序優(yōu)化并重復(fù)超過(guò)50次以產(chǎn)生純化的微細(xì)胞。這種方法是可靠的，并且從10升細(xì)菌培養(yǎng)物中常規(guī)能夠產(chǎn)生108至109的純化微細(xì)胞。從50毫升含抗生素氯霉素和卡那霉素(終濃度為50微克/毫升)TSB內(nèi)的甘油原料中產(chǎn)生一種傷寒沙門(mén)氏菌minCDE-/pEGFP-C1培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在37攝氏度下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。將2.5毫升等分過(guò)夜培養(yǎng)物用于接種在1升(裝在2升的帶擋板錐形瓶中)含有上述抗生素的TSB中，并將5瓶在37攝氏度下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。(A)預(yù)制備(階段1)使用經(jīng)過(guò)一個(gè)0.2微米濾器的無(wú)菌軟管，用1型水(MQ)充滿100升的Bioprocess袋。通過(guò)蠕動(dòng)泵將18升無(wú)菌程序水轉(zhuǎn)染至兩個(gè)含有2升10×BSG的20升高壓滅菌大玻璃瓶中。一個(gè)大玻璃瓶用于稀釋微細(xì)胞懸濁液，另一個(gè)用于透濾。(B)差速離心和預(yù)制備(階段2)將細(xì)菌培養(yǎng)物在2000g離心10分鐘(SorvallLegendT/RT；TTH750rotor)。將上清液輕輕倒入裝有一個(gè)0.2微米通風(fēng)濾器和一個(gè)快速斷開(kāi)裝置的5升無(wú)菌大玻璃瓶中。移注過(guò)程在一個(gè)II級(jí)生物危害櫥中進(jìn)行。密封大玻璃瓶，將無(wú)菌導(dǎo)管連接至5升大玻璃瓶，導(dǎo)管的另一端連接至含有20升如上所述1×BSG的預(yù)填充20升大玻璃瓶。攜帶微細(xì)胞的懸濁液從5升大玻璃瓶泵入20升大玻璃瓶，產(chǎn)生1∶5的稀釋度。(C)微細(xì)胞連續(xù)提純系統(tǒng)將來(lái)自Sartorius的3個(gè)橫向流動(dòng)系統(tǒng)串聯(lián)在一起。一式兩份，將0.45微米SartoconSliceCassette濾器裝在前兩個(gè)切片固定器中，并將一個(gè)0.2微米SartoconSlice濾器盒裝在最后一個(gè)固定器中。用轉(zhuǎn)矩扳手將每個(gè)濾器元件的轉(zhuǎn)矩固定為20Nm(牛頓·米)。每個(gè)部件通過(guò)清潔元件連接至一個(gè)泵。接上進(jìn)料、保留物以及透過(guò)物的管道。在連接大玻璃瓶之前，用6升1N氫氧化鈉以2bar的壓力內(nèi)部洗滌整個(gè)系統(tǒng)15分鐘。這個(gè)步驟可以?xún)?nèi)部消毒各種軟管和濾器。通過(guò)反轉(zhuǎn)液體流動(dòng)的泵方向從系統(tǒng)中排出氫氧化鈉，并進(jìn)行通量率檢測(cè)以確保適當(dāng)?shù)臑V器清洗。檢測(cè)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明(Sartorius使用說(shuō)明書(shū))進(jìn)行。在進(jìn)行微細(xì)胞過(guò)濾前保證可接受的通量率，其對(duì)保留物為3000至3600毫升/分，對(duì)透過(guò)物為800毫升/分。系統(tǒng)仍攜帶高pH值，因此通過(guò)用無(wú)菌的1×PBS(pH7.4)沖洗并回流通過(guò)每個(gè)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行中和，直至PBS池的pH測(cè)量值位于7.0至8.0的范圍內(nèi)。然后接上大玻璃瓶(20升)。微細(xì)胞懸濁液(25升)裝在第一個(gè)大玻璃瓶中，其通過(guò)一條軟管連接至第一個(gè)0.45微米濾器盒。為了防止濾器結(jié)垢，在進(jìn)行過(guò)濾步驟時(shí)稀釋微細(xì)胞懸濁液(即透濾)。稀釋劑(20升1×BSG)裝在第二個(gè)大玻璃瓶中。因此，在第一個(gè)橫向流動(dòng)濾過(guò)步驟中，微細(xì)胞懸濁液濾過(guò)體積為45升。起初關(guān)閉滲透閥，微細(xì)胞懸濁液以2bar的壓力泵至0.45微升濾器表面，持續(xù)5分鐘。這使濾器得以適應(yīng)微細(xì)胞懸濁液介質(zhì)。然后打開(kāi)滲透閥，微細(xì)胞懸濁液透過(guò)(壓力為2bar，600毫升/分鐘)0.45微米濾器，并將透過(guò)物收集在第三個(gè)大玻璃瓶中。隨著第一個(gè)大玻璃瓶中的體積減少，不濾過(guò)固體的數(shù)量增加，因此當(dāng)?shù)谝粋€(gè)大玻璃瓶中的體積降至15升時(shí)接通透濾。這樣可以稀釋第一個(gè)大玻璃瓶中的固體，防止濾器結(jié)垢并使第三個(gè)大玻璃瓶中的微細(xì)胞回收最大化。一旦第三個(gè)大玻璃瓶中的透過(guò)物體積達(dá)到大約12.5升，調(diào)節(jié)第二個(gè)0.45微米橫向流動(dòng)濾器以適應(yīng)第三個(gè)大玻璃瓶中的微細(xì)胞懸濁液。當(dāng)?shù)谌齻€(gè)大玻璃瓶中的體積達(dá)到15升的標(biāo)記，打開(kāi)滲透閥，允許微細(xì)胞懸濁液透過(guò)，進(jìn)入第四個(gè)大玻璃瓶。在這個(gè)階段，微細(xì)胞懸濁液中更大的親代細(xì)菌污染物被清除。下一階段是除去懸濁液中更小的污染物，比如細(xì)菌氣泡、游離內(nèi)毒素、核酸、細(xì)胞碎片以及過(guò)多的液體。這通過(guò)經(jīng)由一個(gè)0.2微米橫向流動(dòng)濾器的過(guò)濾來(lái)完成。微細(xì)胞的直徑大約為0.4微米，因此不能透過(guò)0.2微米的孔徑。另一方面，細(xì)菌氣泡的大小(直徑)范圍是0.05微米至0.2微米，因此可以濾出。其他污染物也小于0.2微米，因此在此濾過(guò)步驟中唯一保留的成分是微細(xì)胞以及任何殘余的親代細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)?shù)谒膫€(gè)大玻璃瓶中的體積達(dá)到大約15升時(shí)，調(diào)節(jié)0.2微米橫向流動(dòng)濾器以適應(yīng)第四個(gè)大玻璃瓶中的微細(xì)胞懸濁液。然后打開(kāi)滲透閥，允許透過(guò)物進(jìn)入第五個(gè)大玻璃瓶中的廢液，同時(shí)保留微細(xì)胞并在第四個(gè)大玻璃瓶中濃縮。由于加入了透濾系統(tǒng)，微細(xì)胞被連續(xù)稀釋并過(guò)濾，保證在程序結(jié)束時(shí)徹底的清除污染物。因此濃縮步驟將微細(xì)胞懸濁液的體積從45升的初始體積減少至大約4升。(D)微細(xì)胞懸濁液的緩沖液交換通過(guò)用1×BSG透濾來(lái)清除微細(xì)胞懸濁液中殘余的鹽、介質(zhì)成分以及低分子量廢物。如前所述裝配并均衡器械，微細(xì)胞懸濁液放在第一個(gè)4升大玻璃瓶中，20升無(wú)菌1×BSG(透濾介質(zhì))裝在第二個(gè)大玻璃瓶中。橫向流動(dòng)元件裝有兩個(gè)0.1微米濾器盒以確保微細(xì)胞不能通過(guò)而所有小于0.1微米的污染物都被清除。接通泵并調(diào)節(jié)速度以提供0.5bar的壓力。打開(kāi)滲透閥，微細(xì)胞懸濁液通過(guò)進(jìn)料管流到0.1微米濾器上。微細(xì)胞通過(guò)保留物管回到第一個(gè)大玻璃瓶。廢物流過(guò)透過(guò)物管并被收集在第三個(gè)大玻璃瓶中。這減少了微細(xì)胞懸濁液的體積，因此接通透濾系統(tǒng)將1×BSG泵入第一個(gè)大玻璃瓶。這個(gè)步驟持續(xù)補(bǔ)充微細(xì)胞懸濁液的體積，保持它始終為4升。該程序持續(xù)進(jìn)行，直至第二個(gè)大玻璃瓶排空，將微細(xì)胞懸濁液的緩沖液替換5遍。(E)微細(xì)胞懸濁液的無(wú)菌過(guò)濾在這個(gè)階段，微細(xì)胞懸濁液仍然攜帶某些親代細(xì)菌污染物，因?yàn)?.45微米橫向流動(dòng)濾器并非無(wú)菌濾器。因此，除去所有殘余親代細(xì)菌以獲得體外和體內(nèi)使用的最佳微細(xì)胞懸濁液是很重要的。將來(lái)自先前步驟的4升微細(xì)胞懸濁液在無(wú)菌1×BSG中初始稀釋至20升。用2升無(wú)菌1×BSG預(yù)濕裝載大表面積(500平方厘米)0.45微米濾器的終端濾器元件，并按照生產(chǎn)商的說(shuō)明檢測(cè)完整性。以700毫升/分鐘(即慢流率以防止迫使親代細(xì)菌細(xì)胞穿過(guò)0.45微米濾器)的流率將微細(xì)胞懸濁液抽吸通過(guò)終端濾器。濾器留下細(xì)菌細(xì)胞，而微細(xì)胞可以通過(guò)，經(jīng)由濾出液管道進(jìn)入第二個(gè)大玻璃瓶。(F)純化微細(xì)胞的濃縮將20升懸濁液中的純化微細(xì)胞濃縮至更小的體積。但是，由于體積大并且在實(shí)踐中無(wú)益于離心技術(shù)，所以這個(gè)步驟不易于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的離心和小球重懸技術(shù)完成。濃縮步驟通過(guò)下面4個(gè)階段進(jìn)行。階段1將微細(xì)胞懸濁液以0.5bar的壓力泵出第一個(gè)大玻璃瓶，通過(guò)一個(gè)清潔元件泵至一個(gè)100kDa橫向流動(dòng)濾器上。微細(xì)胞通過(guò)保留物管道返回第一個(gè)大玻璃瓶，而透過(guò)的液體通過(guò)滲透廢物管收集在第二個(gè)大玻璃瓶中。階段2一旦微細(xì)胞懸濁液的體積降至4升，則該程序終止，并且懸濁液被轉(zhuǎn)染至第三個(gè)無(wú)菌4升大玻璃瓶中。與用于處理上述更大體積的12.5毫米軟管相比，后者裝配有直徑6.4毫米的軟管。這減少了管道的空隙體積。由于進(jìn)料和保留物管都是直徑12.5毫米的管道系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了一種適配器來(lái)將軟管裝配在瓶蓋貼封中。類(lèi)似的，設(shè)計(jì)了一種適配器來(lái)裝配進(jìn)料和保留物管更大的鉆孔管道系統(tǒng)。如同前一階段那樣進(jìn)行第二個(gè)濃縮階段，直至微細(xì)胞進(jìn)一步減至大約200毫升。階段3將200毫升微細(xì)胞懸濁液轉(zhuǎn)染至一個(gè)含有用于進(jìn)料和保留物的內(nèi)瓶管道系統(tǒng)的改良Schott瓶中。瓶管道系統(tǒng)鉆孔穿過(guò)Scott瓶的頂蓋，并用Marprene管道系統(tǒng)和硅密封。在瓶蓋上也攜帶一個(gè)通氣濾器(0.2微米)。為了進(jìn)一步減少空隙體積，用無(wú)菌6.4毫米Marprene管道取代先前所用的進(jìn)料、清潔元件以及保留物管道系統(tǒng)，并用更小的泵取代先前所用的泵。同前進(jìn)行濃縮步驟(100kDA橫向流動(dòng)濾器)，直至微細(xì)胞體積減少至50毫升。階段4將高度純化的微細(xì)胞懸濁液在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)染至一支50毫升的Falcon管中。實(shí)例4.來(lái)自革蘭氏陰性與革蘭氏陽(yáng)性minCD菌株的微細(xì)胞的掃描電子顯微鏡特性使用來(lái)自傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、志賀氏痢疾桿菌、李斯特單胞菌以及相應(yīng)親代細(xì)胞的微細(xì)胞的掃描(SEM)和透射(TEM)電子顯微照片測(cè)定各種微細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和尺寸。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，將攜帶微細(xì)胞的細(xì)菌培養(yǎng)物以13,200rpm離心20分鐘，然后在含有2.5％戊二醛的PBS中重懸，并在室溫下固定40分鐘。將樣品離心并用蒸餾水洗滌3次。對(duì)于TEM，按照下列程序進(jìn)行。為了替換溶液，將細(xì)胞在10,000rpm離心1分鐘，吸去上清液，然后使用渦流混合器在新試劑中重懸細(xì)胞。加入試劑的次序?yàn)?a)四氧化鋨的0.1M二甲胂酸鹽(pH7.2)溶液-10分鐘，(b)4％醋酸鈉的蒸餾水溶液-1分鐘，(c)乙酸雙氧鈾的蒸餾水溶液-5分鐘，(d)70％乙醇-5分鐘，(e)100％乙醇-5分鐘，(f)100％丙酮-5分鐘，(g)丙酮與Spurr’s環(huán)氧樹(shù)脂單體的1∶1混合物-30分鐘，(h)純Spurr’s環(huán)氧樹(shù)脂-在60攝氏度下固化48小時(shí)。借助金剛石刀具采用ReichertUltracutE超微切片機(jī)從固化的樹(shù)脂塊上切下片段。將片段用乙酸雙氧鈾染色10分鐘，然后用檸檬酸鉛染色2分鐘。用HitachiH-7000透射電子顯微鏡檢測(cè)片段，所用電子束能量為75千伏(UniversityofNewSouthWales，NSW，Australia)。用AnalySisMegaViewII廣視野CCD相機(jī)記錄數(shù)字影像。對(duì)于高分辨率掃描電子顯微鏡，按照下面的方法進(jìn)行。為了替換溶液，將細(xì)胞以13,200rpm離心20分鐘，吸去上清液，然后使用渦流混合器將細(xì)胞在新試劑中重懸。目的是從細(xì)胞上洗下所有離子和生物材料并讓它們懸浮于少量的蒸餾水中。加入試劑的次序?yàn)?a)1毫升蒸餾水-重新丸化，(b)1毫升蒸餾水-重懸，(c)將250微升沉積于清潔黃銅試樣板上，(d)在30攝氏度下干燥過(guò)夜，(e)在用于顯微鏡觀察前，置于Xenosput清潔真空噴射涂布機(jī)中涂上2納米金屬鉻。用HitachiS-900場(chǎng)致發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測(cè)涂層后的樣本，所用電子束能量為3千伏(UniversityofNewSouthWales，NSW，Australia)。用ImageSlave數(shù)字轉(zhuǎn)換器記錄不同放大倍數(shù)的數(shù)字影像。結(jié)果顯示來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的微細(xì)胞直徑都是大約400納米，除了李斯特單胞菌外，SEM看到它們的表面都有皺紋，大概是由于脂多糖細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的緣故。所有種類(lèi)微細(xì)胞和親代細(xì)菌的表面超微結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的差別。TEM結(jié)果顯示李斯特單胞菌微細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)僵硬，預(yù)期為革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞膜。在顯微鏡電子束下，沙門(mén)氏菌、志賀氏痢疾桿菌以及大腸桿菌的細(xì)胞膜更易于萎陷。在全部樣品中都觀察到微細(xì)胞形成事件，即不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂。實(shí)例5.微細(xì)胞被哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞攝取為了顯示重組微細(xì)胞被巨噬細(xì)胞攝取，首先需要加入一種示蹤劑比如GFP，使得重組微細(xì)胞可以被清楚的從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中看出來(lái)。因此，將質(zhì)粒pEGFP轉(zhuǎn)化入產(chǎn)傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌minCDE微細(xì)胞的菌株，以檢測(cè)微細(xì)胞是否能穩(wěn)定攜帶EGFP并發(fā)出綠色熒光。質(zhì)粒pEGFP(表2)示一種細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒，其從lac啟動(dòng)子中表達(dá)野生型綠色熒光蛋白(EGFP；最大激發(fā)488納米；最大發(fā)射507納米)的紅移變體。質(zhì)粒主干是pUC19、pPD16.43的衍生物(Fire等人，1990)，其能夠提供一種高拷貝數(shù)的復(fù)制源以及一種氨卞青霉素耐藥基因，用于在細(xì)菌細(xì)胞中增殖并篩選。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染入傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌minCDE菌株，并將重組細(xì)菌在腦心灌注肉湯(BHI；DifcoLaboratories，Detroit，MichiganUSA)中培育，直至OD600達(dá)到0.6。從混合培養(yǎng)物中分離并提純微細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察(熒光顯微鏡DMLM，LeieaMicrosystems)。結(jié)果顯示所有微細(xì)胞都發(fā)出亮綠色熒光，而從非重組傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌minCDE菌株(對(duì)照)中提純的微細(xì)胞不顯示任何綠色熒光。按照30分鐘、1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、2天、1周以及2周的間隔用熒光顯微鏡觀察保存的微細(xì)胞(4攝氏度和室溫下)。結(jié)果顯示微細(xì)胞完整無(wú)缺，并在整個(gè)研究中持續(xù)發(fā)出亮綠色熒光。因此質(zhì)粒pEGFP提供了一種示蹤劑(發(fā)綠色熒光的微細(xì)胞)，可以用于追蹤重組微細(xì)胞被哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比如巨噬細(xì)胞，以及其他細(xì)胞比如腫瘤細(xì)胞的攝取。這些結(jié)果表明，由于缺少染色體編碼的蛋白酶，重組蛋白一經(jīng)表達(dá)或分離入微細(xì)胞，就能夠在顯著的時(shí)段內(nèi)保持穩(wěn)定(可能直至微細(xì)胞的細(xì)胞完整性受損)。將取自美國(guó)細(xì)胞、菌種庫(kù)(ATCC)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞以105/阱的細(xì)胞密度進(jìn)行體外培養(yǎng)，并用純化的，攜帶來(lái)自傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌的質(zhì)粒pEGFP的重組微細(xì)胞，按照50∶1和100∶1的微細(xì)胞巨噬細(xì)胞比例進(jìn)行傳染。在巨噬細(xì)胞傳染千，通過(guò)熒光顯微鏡觀察純化的微細(xì)胞以證實(shí)大多數(shù)微細(xì)胞攜帶EGFP并因此能夠發(fā)出亮綠色熒光。作為陽(yáng)性對(duì)照，將攜帶相同質(zhì)粒的傷寒沙門(mén)氏菌aroA-菌株SL3261(表1)也用于按照相同的細(xì)菌巨噬細(xì)胞比例來(lái)轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞。同樣按照實(shí)驗(yàn)傳染細(xì)胞的相同方法處理陰性對(duì)照(非傳染的巨噬細(xì)胞)。將培養(yǎng)板在37攝氏度下以1000克離心10分鐘。對(duì)于微細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究，加入抗生素慶大霉素(100微克/毫升)和氨卞青霉素(200微克/毫升)以殺滅任何殘存的活親代細(xì)菌細(xì)胞。也用相同的抗生素處理殺滅陽(yáng)性對(duì)照沙門(mén)氏菌。將板在5％CO2中37攝氏度下培養(yǎng)30分鐘，然后用PBS洗滌3遍。對(duì)于傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源的微細(xì)胞/巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將載玻片用4％的甲醛固定40分鐘，然后用0.2％的三硝基甲苯X-100透過(guò)。用溶于含有5％BSA的磷酸緩沖液的5％正常山羊血清(NGS)非特異性封閉染色后，將蓋玻片與抗脂多糖(LPS)抗體(兔4-O沙門(mén)氏菌體凝聚血清；1∶200稀釋?zhuān)籑urexBiotech，Dartford，England)一起在室溫下培養(yǎng)4小時(shí)。將細(xì)胞在PBS中洗滌3遍并與溶于PBS-BSA的第二抗體(1∶1000)，AlexaFluor594(MolecularProbes，Eugene，OR，USA；山羊抗小鼠IgG結(jié)合物，激發(fā)590納米，發(fā)射617納米)一起培養(yǎng)。將板與第二抗體在黑暗中培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS洗滌3遍，每次持續(xù)5分鐘。用甘油包埋蓋玻片并用共焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌來(lái)源的微細(xì)胞都被培養(yǎng)物中20％至30％的巨噬細(xì)胞所吞噬。微細(xì)胞發(fā)出亮綠色熒光，并與巨噬細(xì)胞相關(guān)。除了小的非特異性背景熒光外，對(duì)照非重組傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌來(lái)源的微細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)與巨噬細(xì)胞相關(guān)性綠色熒光點(diǎn)。對(duì)照重組傷寒沙門(mén)氏菌aroA-菌株也產(chǎn)生與兩種重組微細(xì)胞所見(jiàn)類(lèi)似的結(jié)果。為了證實(shí)綠色熒光點(diǎn)位于巨噬細(xì)胞內(nèi)，即為被吞噬的微細(xì)胞，而不僅僅是粘附于細(xì)胞表面，拍攝了傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源的微細(xì)胞-巨噬細(xì)胞相互作用的三維照片(使用矢狀和冠狀面)。在冠狀面和矢狀面中，微細(xì)胞位于巨噬細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)明微細(xì)胞已經(jīng)被巨噬細(xì)胞所吞噬。另外，綠色熒光點(diǎn)的抗-O4LPS標(biāo)記(加入第二抗體AlexaFlour593后的黃色熒光)顯示綠色熒光點(diǎn)實(shí)際上是表達(dá)EGFP的微細(xì)胞而不是人工背景熒光。使用陽(yáng)性對(duì)照沙門(mén)氏菌也觀察到類(lèi)似結(jié)果，顯示在微細(xì)胞表面保存了細(xì)胞經(jīng)受體介導(dǎo)被巨噬細(xì)胞攝取所需的細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)。實(shí)例6.微細(xì)胞攝取以及在巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體中的分解為了顯示微細(xì)胞在巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)結(jié)局，對(duì)經(jīng)傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源微細(xì)胞傳染的小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行了TEM研究。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW246.7在T25燒瓶中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基內(nèi)培育至-50％融合。將大約107/100微升的微細(xì)胞直接加入燒瓶中的培養(yǎng)基內(nèi)，并如實(shí)例5中所述進(jìn)行巨噬細(xì)胞傳染程序。采用的微細(xì)胞巨噬細(xì)胞近似比例為10∶1。在傳染后30分鐘、60分鐘和2小時(shí)的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。還另外包括一個(gè)未接受微細(xì)胞的燒瓶作為陰性對(duì)照。細(xì)胞經(jīng)過(guò)胰蛋白酶化&丸化收集，并在4％的戊二醛(500微升)中固定。通過(guò)TEM處理并分析樣品(UniversityofNewSouthWales，Sydney，Australia)。結(jié)果顯示早至傳染后30分鐘，在巨噬細(xì)胞空泡中就觀察到了近似于微細(xì)胞大小(400納米)的電子致密顆粒(圖5，照片A-F)。隨著時(shí)間的推移(60分鐘和2小時(shí))，電子致密顆粒顯得完整性更差，表面不規(guī)則并且丟失電子密度。為了證實(shí)空泡內(nèi)電子致密顆粒是微細(xì)胞所吞噬的，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，但有一點(diǎn)不同，在傳染后的各個(gè)時(shí)間間隔后，在室溫下將細(xì)胞固定(4％多聚甲醛，0.1％戊二醛)30分鐘，用PBS洗滌并通過(guò)輕柔的細(xì)胞刮擦將其收集在1.5毫升PBS中。處理樣品用于免疫金-TEM(EMUnit，ICPMR，WestmeadHospital，Sydney，Australia)。將樣品輕柔的形成丸狀，并通過(guò)冰凍替代法處理。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，將樣品用1∶200稀釋的第一抗體(抗傷寒沙門(mén)氏菌脂多糖[4因子，B組特異性]；AbbottMurex，USA)標(biāo)記，然后加入結(jié)合金(10納米)的第二抗體。用PhilipsCM-120BioTWIN電子顯微鏡在80kV進(jìn)行觀察。捕捉照片至4489型KodakEM感光乳劑膠片上。結(jié)果顯示金標(biāo)記的抗-O4-LPS抗體能夠明確的鑒定微細(xì)胞，因此在巨噬細(xì)胞空泡中觀察到的電子致密顆粒就是傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源的微細(xì)胞。在未用微細(xì)胞傳染的對(duì)照巨噬細(xì)胞中未觀察到金標(biāo)記。這個(gè)資料還顯示，在更晚的時(shí)間點(diǎn)上，在空泡中觀察到與微細(xì)胞無(wú)關(guān)的金顆粒。在更晚的時(shí)間點(diǎn)上，游離于微細(xì)胞外的金顆粒數(shù)量顯著增長(zhǎng)，這也與失去細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞電子密度的微細(xì)胞的數(shù)量增加有關(guān)。這些資料顯示微細(xì)胞遵循通過(guò)巨噬細(xì)胞展示的抗原攝取與處理的經(jīng)典途徑，其包括將外來(lái)顆粒攝入早期吞飲泡，然后經(jīng)過(guò)吞飲泡-溶酶體融合，在酸性吞噬溶酶體中分解抗原。在傳染的晚期游離于微細(xì)胞外的金顆?？赡茱@示了從微細(xì)胞的處理與消化中釋放的LPS。這些結(jié)果顯示重組微細(xì)胞不但被哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比如巨噬細(xì)胞所吞噬，并且在胞內(nèi)空泡，推測(cè)是吞噬溶酶體中被降解。實(shí)例7.經(jīng)微細(xì)胞轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞表達(dá)異源性蛋白為了檢測(cè)攜帶編碼EGFP(在細(xì)菌細(xì)胞或微細(xì)胞中不表達(dá))的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)質(zhì)粒的重組微細(xì)胞是否能夠?qū)①|(zhì)粒傳輸至哺乳動(dòng)物細(xì)胞核并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)EGFP，進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)。如實(shí)例5所述，將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7的細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并用攜帶質(zhì)粒pEGFP-Cl(表2)的純化重組傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌與志賀氏痢疾桿菌來(lái)源的微細(xì)胞進(jìn)行傳染。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用三維共焦顯微鏡觀察傳染的細(xì)胞。結(jié)果顯示大約20％的巨噬細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，提示重組微細(xì)胞在巨噬細(xì)胞內(nèi)，推測(cè)為在吞噬溶酶體中被分解，并且至少一部分被釋放的質(zhì)粒DNA在表達(dá)綠色熒光蛋白前被細(xì)胞核所攝取。對(duì)照巨噬細(xì)胞，即用非重組微細(xì)胞轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)綠色熒光。EGFP在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的表達(dá)至少需要48小時(shí)。這個(gè)結(jié)果與用BioRadGenepulser電穿孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-Cl的陽(yáng)性對(duì)照巨噬細(xì)胞中所觀察到的結(jié)果類(lèi)似。為了進(jìn)一步證實(shí)EGFP在微細(xì)胞轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)并非背景熒光，對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源的微細(xì)胞重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。在此情況下，用甲醛固定后，將蓋玻片與抗GFP單克隆抗體(ClontechLaboratories，PaloAlto，CA，USA；1∶300稀釋)一起培養(yǎng)，并在4攝氏度下培養(yǎng)過(guò)夜。用PBS洗滌蓋玻片3遍(每次洗滌5分鐘)，并將其與溶于PBS/BSA的2％正常山羊血清一起培養(yǎng)20分鐘。用PBS洗滌蓋玻片兩遍并用溶于PBS(1∶1000稀釋)的第二抗體AlexaFluor594-抗小鼠IgG結(jié)合物進(jìn)行處理。使用紅(570納米)色和綠色(488納米)熒光顯色濾光器通過(guò)共焦顯微鏡觀察蓋玻片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中觀察到的綠色熒光點(diǎn)(在488納米時(shí)激光激發(fā))與紅色熒光點(diǎn)(在570納米時(shí)激光激發(fā))完全相同。當(dāng)使用兩種激光時(shí)，綠色和紅色熒光信號(hào)被定位相同，并顯示出一種黃色熒光。另外，當(dāng)使用Leica3D成像軟件構(gòu)建3D像時(shí)，發(fā)現(xiàn)熒光位于巨噬細(xì)胞內(nèi)。這些結(jié)果顯示所觀察到的綠色熒光點(diǎn)是由于巨噬細(xì)胞表達(dá)EGFP蛋白造成的，因?yàn)榭笹FP單克隆抗體(紅色熒光)也識(shí)別相同的位點(diǎn)。結(jié)果證實(shí)重組微細(xì)胞的確在宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞中被分解，釋放出質(zhì)粒DNA，并且此DNA能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外來(lái)蛋白。這表明通過(guò)重組的完整微細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)基因治療是可行的。當(dāng)重組微細(xì)胞被引入患者體內(nèi)后，可以通過(guò)針對(duì)患者體內(nèi)基因產(chǎn)物的適當(dāng)檢驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)或評(píng)估異源基因產(chǎn)物的存在，例如對(duì)于紅細(xì)胞特異性表達(dá)，可以通過(guò)患者的外周血紅細(xì)胞檢驗(yàn)來(lái)完成。如上所述，所選擇的部分檢驗(yàn)是異源性基因產(chǎn)物的功能，并且易于檢測(cè)。實(shí)例8.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因傳輸至人乳腺癌細(xì)胞以及那里的基因表達(dá)采用純化自攜帶質(zhì)粒pEGFP-C1(只表達(dá)真核基因；表2)的重組傷寒沙門(mén)氏菌minCDE-菌株的微細(xì)胞來(lái)感染人乳腺癌細(xì)胞(SK-BR-3)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和96小時(shí)，通過(guò)共焦顯微鏡觀察細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，使用非重組微細(xì)胞轉(zhuǎn)染SK-BR-3細(xì)胞，并進(jìn)行類(lèi)似于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的觀察。將SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞(來(lái)源ATCC，參考No.HTB-30)在6阱板中的蓋玻片上培養(yǎng)，并生長(zhǎng)至大約50％融合。向細(xì)胞中加入攜帶真核GFP-表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-1的微細(xì)胞，并在1000克離心10分鐘以使微細(xì)胞/SK-BR-3細(xì)胞接觸。將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，然后加入G-418(400毫克/毫升)，某些阱中不加G-418。進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)后，用4％甲醛將全部蓋玻片固定1小時(shí)。將蓋玻片與PBS-BSA(2％BSA溶于PBS中)一起培養(yǎng)20分鐘，并用PBS洗滌一次。將蓋玻片與抗Her-2-抗體一起在4攝氏度下培養(yǎng)過(guò)夜(Serotec，單克隆小鼠抗人IgG；1∶100稀釋)。用PBS洗滌細(xì)胞3遍，每次洗滌持續(xù)5分鐘，并與AlexaFluor594結(jié)合的第二抗體(MolecularProbe，山羊抗小鼠IgG結(jié)合物，激發(fā)590納米，發(fā)射617納米；在PBS-BSA中1∶1000稀釋)一起在黑暗中培養(yǎng)1小時(shí)。用PBs洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌5分鐘，并用不變色介質(zhì)(MolecularProbe)處理蓋玻片。通過(guò)3維共焦顯微鏡觀察全部蓋玻片(用紅色濾光器波長(zhǎng)568nm和綠色濾光器波長(zhǎng)488nm進(jìn)行激發(fā))。結(jié)果顯示大約10％的乳腺癌細(xì)胞明確表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中的綠色熒光蛋白(見(jiàn)圖6，照片A-C)。這在對(duì)照細(xì)胞顯示的正常背景熒光上清晰可見(jiàn)。用抗Her-2抗體(紅色熒光)可以明確的識(shí)別細(xì)胞。這個(gè)結(jié)果顯示，重組微細(xì)胞能夠以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異源性表達(dá)的方式，將哺乳動(dòng)物基因表達(dá)質(zhì)粒DNA傳輸至非噬菌細(xì)胞，例如上皮乳腺癌細(xì)胞。例9.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因傳輸以及在Balb/c小鼠體內(nèi)的基因表達(dá)為了檢測(cè)重組微細(xì)胞能否將外來(lái)基因傳輸至體內(nèi)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，用攜帶質(zhì)粒pEGFP-C1(只表達(dá)真核基因；表2)的重組傷寒沙門(mén)氏菌minCDE-來(lái)源微細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)疫苗接種，并與用攜帶相同質(zhì)粒的傷寒沙門(mén)氏菌ΔaroA菌株免疫接種的小鼠相比較。如實(shí)例3中所述純化重組微細(xì)胞。如下制備傷寒沙門(mén)氏菌(SL3261ΔaroA菌株，表1)。將TSB中的傷寒沙門(mén)氏菌過(guò)夜培養(yǎng)物的1∶100接種物接種于五(5)毫升胰解酪蛋白大豆肉湯(TSB，BectonDickinson，PaloAlto，CA，USA)中，并在37攝氏度下?lián)u動(dòng)生長(zhǎng)，直至在600納米下測(cè)得的光密度(O.D.)達(dá)到0.5。然后將細(xì)菌與150微升/毫升的慶大霉素(Sigma-Aldrich，CastleHill，NSW，Australia)和150微升/毫升的氨卞青霉素(Roche)一起在37攝氏度下另外搖動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。通過(guò)以8000rpm離心將殺死的細(xì)菌和微細(xì)胞丸化、重懸并在BSG(磷酸緩沖鹽水[PBS；1.44克磷酸氫二鈉，0.24克磷酸二氫鉀，0.2克氯化鉀，8.0克氯化鈉，溶于1升蒸餾水中，pH7.4]中洗滌3次。根據(jù)表4中的日程表，用100微升重組微細(xì)胞和重組滅活傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)數(shù)組8只6周大的Balb/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。一組8只小鼠保持不接種疫苗作為陰性對(duì)照。在接種前和初次疫苗接種后第14天通過(guò)眼內(nèi)靜脈切開(kāi)對(duì)小鼠進(jìn)行放血。在第23天，使用腹膜內(nèi)注射12毫克苯巴比妥鈉將動(dòng)物全部麻醉并在處死小鼠前通過(guò)心臟穿刺收集1毫升血液。將血液在微離心機(jī)(Eppendorf，Hamburg，Germany)以3000rpm離心10分鐘，并收集血清用于EKISA檢驗(yàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱(chēng)重并每日觀察毒性體征。表4.在Balb/c小鼠體內(nèi)進(jìn)行基因傳輸?shù)奶幚砼渲眠M(jìn)行ELISA檢驗(yàn)以檢測(cè)是否有針對(duì)GFP的抗體產(chǎn)生，是否重組微細(xì)胞能夠體內(nèi)傳輸哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1。還檢測(cè)了各組的傷寒沙門(mén)氏菌脂多糖(LPS)抗體水平。如下實(shí)施間接ELISA法。用0.5微克/毫升的rEGFP(Clontech，PaloAlto，CA，USA)或LPS抗原(Sigma)涂布九十六(96)阱微量滴定板(GreinerGMBH，Germany)，50微升/阱。用1％BSA(Sigma)涂板作為陰性對(duì)照。將板密封并在4攝氏度培養(yǎng)過(guò)夜。將板倒置以除去抗原溶液，并向每個(gè)阱加入200微升阻滯緩沖液(0.05％Tween-20[Sigma]，溶于PBS的1％BSA)，然后在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。除去阻滯緩沖液并用清洗緩沖液(0.05％Tween-20，PBS)將板洗滌2次，每次5分鐘。將用于EGFP和LPS的血清樣品與阻滯緩沖液分別按1∶80和1∶300稀釋。下一步，向每個(gè)阱中加入100微升樣品，并在室溫下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)1小時(shí)。然后用清洗緩沖液洗滌板3遍，每次5分鐘。將第二抗體，即結(jié)合堿性磷酸酶的抗小鼠免疫球蛋白(γ-&輕鏈Chemicon，Temicula，CA，USA)或結(jié)合AP的抗LPS單克隆抗體(IgGl同型，BiodesignInternational，Saco，Maine，USA)在阻滯緩沖液中稀釋?zhuān)⑾蛎總€(gè)阱中加入100微升，隨后在室溫下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)1小時(shí)。用清洗緩沖液洗滌阱3次，然后加入100微升PNPP(p-磷酸硝基苯底物；Zymed，SanFrancisco，CA，USA)。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，讀取在405納米下的吸光率。通過(guò)加入30微升0.5M氫氧化鈉來(lái)終止反應(yīng)。通過(guò)Studentt檢驗(yàn)(p)來(lái)檢測(cè)ELISA數(shù)據(jù)的顯著性。結(jié)果顯示在圖7中。在接種疫苗后第14天，在腹膜內(nèi)給藥108個(gè)重組微細(xì)胞的小鼠中觀察到對(duì)EGFP強(qiáng)烈而顯著的抗體反應(yīng)(當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)p＜0.02)，并且所觀察到的抗體反應(yīng)強(qiáng)于使用最高劑量的滅活傷寒沙門(mén)氏菌所獲得的反應(yīng)。只有當(dāng)攜帶哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEGFP-C1的重組微細(xì)胞不但被腹膜巨噬細(xì)胞吞噬，而且在胞內(nèi)空泡(推測(cè)為吞噬溶酶體)中被降解，并且至少有一些質(zhì)粒DNA拷貝逃離吞噬溶酶體并進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞核時(shí)，才能觀察到EGFP蛋白的抗體。將從細(xì)胞核中產(chǎn)生EGFPmRNA，并在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)EGFP。在巨噬細(xì)胞中，EGFP是一種外來(lái)蛋白，因此預(yù)期它將被加工并通過(guò)MHC呈現(xiàn)肽。這個(gè)過(guò)程將導(dǎo)致針對(duì)EGFP肽的抗體反應(yīng)。與使用滅活傷寒沙門(mén)氏菌的對(duì)照相比，使用抗重組微細(xì)胞的抗EGFP抗體反應(yīng)將更高。還測(cè)量了抗LPS反應(yīng)以確定對(duì)基因治療傳輸載體，重組微細(xì)胞的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示抗LPS抗體反應(yīng)是顯著的，并且對(duì)于重組微細(xì)胞(p＝0.0004)和滅活傷寒沙門(mén)氏菌(p＝0.001)而言是相似的。參見(jiàn)圖8。這個(gè)結(jié)果表明微細(xì)胞至少保持了在親代細(xì)菌細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的LPS結(jié)構(gòu)。到第23天時(shí)，抗EGFP抗體反應(yīng)與未經(jīng)免疫的對(duì)照(重組微細(xì)胞和滅活傷寒沙門(mén)氏菌兩者的對(duì)照都)已經(jīng)沒(méi)有差別。這并不令人驚奇，因?yàn)闆](méi)有使用增強(qiáng)免疫以保持抗體反應(yīng)。第23天的抗LPS反應(yīng)與第14天所見(jiàn)類(lèi)似。這也沒(méi)有出乎意料，因?yàn)橐阎狶PS是一種潛在免疫原，其能夠誘導(dǎo)高而且持久的抗體滴度。實(shí)例10.在Balb/c小鼠中使用不同給藥方法的微細(xì)胞介導(dǎo)的體內(nèi)基因傳輸與基因表達(dá)如實(shí)例3中所示制備重組微細(xì)胞。按照表5中所顯示的進(jìn)度表，用100微升重組微細(xì)胞(含有質(zhì)粒pEGFP-C1；表2)對(duì)數(shù)組8只6周大的Balb/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。一組8只小鼠保持不接種疫苗，作為陰性對(duì)照。在初次疫苗接種后第14天通過(guò)眼內(nèi)靜脈切開(kāi)對(duì)小鼠進(jìn)行放血，并如實(shí)例9中所述收集血清。表5.在Balb/c小鼠中使用不同重組微細(xì)胞給藥方法的體內(nèi)基因傳輸處理配置如前所述進(jìn)行ELISA檢驗(yàn)以確定是否有針對(duì)GFP的抗體產(chǎn)生，以及是否更高劑量的重組微細(xì)胞或者3次給藥使得動(dòng)物產(chǎn)生比2次給藥更大的抗體反應(yīng)。同時(shí)測(cè)定了各個(gè)組的傷寒沙門(mén)氏菌脂多糖(LPS)抗體水平。結(jié)果顯示在圖9中。在接種疫苗后第14天，在腹膜內(nèi)給藥108個(gè)重組微細(xì)胞的小鼠中觀察到非常顯著的抗EGFP抗體反應(yīng)(與對(duì)照相比p＜0.001)。接種109個(gè)微細(xì)胞的小鼠顯示出更大的抗EGFP抗體反應(yīng)(與對(duì)照相比p＝0.0006)，并且此劑量產(chǎn)生的抗體水平顯著高于108的低劑量(p＝0.004)。當(dāng)小鼠被2次或3次給藥重組微細(xì)胞時(shí)，針對(duì)EGFP蛋白的抗體反應(yīng)沒(méi)有顯著差別，提示在這個(gè)例子中兩次給藥可能已經(jīng)足夠達(dá)到基因治療的目的。同時(shí)測(cè)量了抗LPS反應(yīng)，以檢測(cè)針對(duì)重組微細(xì)胞的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示抗LPS抗體反應(yīng)具有顯著性(p＝0.0004)。參見(jiàn)圖10。參考文獻(xiàn)CITEDPUBLICATIONSBalicki&Beutler，“Genetherapyofhumandisease，”Medicine(Baltimore)8169(2002).Brahmbhatt，“CloningandmolecularcharacterizationoftherfbgeneclusterofSalmonellatyphimurium，”P(pán)h.D.Thesis，UniversityofAdelaide，Australia(1987).Brittonetal.，“CharacterizationofaprokaryoticSMCproteininvolvedinchromosomepartitioning，”GenesDev.121254(1998).Brückner，“AseriesofshuttlevectorsforBacillussubtilisandEscherichiacoli，”Gene122187(1992)Caticetal.，“IntroductionofproteinorDNAdeliveredviarecombinantSalmonellatyphimuriumintothemajorhistocompatibilitycomplexclassIpresentationpathwayofmacrophages，”MicrobesInfect.1133(1999).Cilibertoetal.，“Cell-specificexpressionofatransfectedhumanalpha1-antitrypsingene，”Cell.41531(1985).Clark-Curtiss&Curtiss，“AnalysisofrecombinantDNAusingEscherichiacoliminicells，”MethodsEnzymol.101347(1983).Courvalinetal.，“Genetransferfrombacteriatomammaliancells，”C.R.Acad.Sci.III3181207(1995).Curieletal.，“Long-terminhibitionofclinicalandlaboratoryhumanimmunodeficiencyvirusstrainsinhumanT-celllinescontaininganHIV-regulateddiphtheriatoxinAchaingene，”Hum.GeneTher.4741(1993).Davisetal.，ADVANCEDBACTERIALGENETICSAMANUALFORGENETICENGINEERING(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1980).deBoeretal.，“RolesofMinCandMinDinthesite-specificseptationblockmediatedbytheMinCDEsystemofEscherichiacoli，”J.Bacteriol.17463(1992).Dietrichetal.，“Deliveryofantigen-encodingplasmidDNAintothecytosolofmacrophagesbyattenuatedsuicideListeriamonocytogenes，”NatureBiotechnol.16181(1998).Dingesetal.，“HIV-regulateddiphtheriatoxinAchaingeneconferslong-termprotectionagainstHIVtypeIinfectioninthehumanpromonocyticcelllineU937，”Hum.GeneTher.61437(1995).Dorwardetal.，“ExportandintercellulartransferofDNAviamembraneblebsofNeisseriagonorrhoeae，”J.Bacteriol.1712499(1989).Fireetal.，“AmodularsetoflacZfusionvectorsforstudyinggeneexpressioninCaenorhabditiselegans，”Gene93189(1990).Firthetal.，“StructureandfunctionoftheFfactorandmechanismofconjugation，”inESCHERICHIACOLIANDSALMONELLACELLULARANDMOLECULARBIOLOGY2nded.(1996)，atpages2377-2401.Forbes，“Crossflowmicrofiltration，”AustralianJ.Biotechnology130(1987).Frainetal.，“Bindin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2個(gè)孔徑為大約0.45微米的濾器，以及至少1個(gè)孔徑為大約0.2微米的濾器。14.根據(jù)權(quán)利要求13的一種方法，其進(jìn)一步包括用抗生素處理該純化微細(xì)胞制劑的步驟。15.重組完整微細(xì)胞在藥物的制備過(guò)程中的用途，該微細(xì)胞含有治療性核酸分子，用于治療疾病或通過(guò)將該藥物給予細(xì)胞、組織或器官以改變特性的方法。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種由重組完整微細(xì)胞組成的組合物，該微細(xì)胞含有一種治療性核酸分子。本發(fā)明還公開(kāi)了用于提純這種微細(xì)胞制劑的方法。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了一種遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括(i)產(chǎn)生可利用的重組完整微細(xì)胞，其含有一種由第一核酸片段組成的質(zhì)粒，以及(ii)將微細(xì)胞與具有吞噬能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，使得微細(xì)胞被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞噬，其隨后產(chǎn)生第一核酸片段的一種表達(dá)產(chǎn)物。文檔編號(hào)A61K48/00GK1599797SQ02824377公開(kāi)日2005年3月23日申請(qǐng)日期2002年10月15日優(yōu)先權(quán)日2001年10月15日發(fā)明者H·布拉姆哈特,J·麥克戴爾米德申請(qǐng)人:恩吉尼克分子傳遞私人有限公司