釀酒酵母表達載體及其構(gòu)建和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種釀酒酵母表達載體及其構(gòu)建和應用。所述釀酒酵母表達載體是通過在pYF1274質(zhì)粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入含有生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的融合基因編碼序列構(gòu)建而成的。通過將該釀酒酵母表達載體轉(zhuǎn)化的釀酒酵母生物法生產(chǎn)丁醇，產(chǎn)量達到1.556g/L，這為通過基因工程手段生產(chǎn)生物丁醇提供了有益的幫助。
【專利說明】釀酒酵母表達載體及其構(gòu)建和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種釀酒酵母表達載體及其構(gòu)建和應用，具體涉及一種含有生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的釀酒酵母表達載體及其構(gòu)建，和將此表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中發(fā)酵生物法合成丁醇的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]丁醇是一種重要的有機化工原料，它是多種涂料的溶劑和制造增塑劑和酯類的原料，同時也是繼乙醇后的一種極具發(fā)展前景的能源物質(zhì)，有著十分廣泛的用途。丁醇和乙醇相似，但丁醇在燃料性能和經(jīng)濟性方面比乙醇有著明顯的優(yōu)勢:1)汽油中的主要成分是C5-C12,因此丁醇與汽油的配伍性更好；2) 丁醇具有較高的能量密度，具有較好的燃料經(jīng)濟性；3) 丁醇親水性弱，能與汽油任意比例混合，腐蝕性小，便于管道輸送。
[0003]目前工業(yè)上生產(chǎn)丁醇主要有3種方法:1)羰基合成法；2)醇醛縮合法；3)發(fā)酵法。前兩種方法屬于化學法，是以石油為原料，投資大，技術(shù)設備要求高。而微生物發(fā)酵法的原料價廉，來源廣泛，選擇性好，副產(chǎn)物少，安全無污染。隨著石油儲量的減少和價格持續(xù)上漲，加上石油化工造成的環(huán)境污染問題，促使人們認識到丁醇發(fā)酵的重要性。從長遠的利益出發(fā)，應用微生物發(fā)酵法來獲得生物丁醇是最經(jīng)濟、有效、無污染的根本措施。
[0004]目前國內(nèi)外報道的用于微生物發(fā)酵產(chǎn)丁醇的宿主菌株多采用拜氏梭(Bei jerinckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或其突變株。這些菌株呈現(xiàn)出較強的淀粉酶活力，適用于發(fā)酵玉米和谷類等淀粉質(zhì)原料，導致用于發(fā)酵的原料成本偏高。此外，由于受到丁醇的毒害作用，這些菌株發(fā)酵所獲得的丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率低。這也成為制約丁醇生物生產(chǎn)的主要瓶頸所在。
`[0005]伴隨著代謝工程、基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展和C.acetobutylicum ATCC 824基因組測序的完成，構(gòu)建高轉(zhuǎn)化率，遺傳穩(wěn)定的基因工程菌種生產(chǎn)生物丁醇已成為研究熱點。例如通過基因阻斷技術(shù)，解除代謝過程中存在的產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，構(gòu)建了高丁醇比菌株。此外，許多學者還通過基因工程技術(shù)成功將丁醇合成途徑導入大腸桿菌、釀酒酵母、短乳桿菌、惡臭假單胞菌和枯草芽孢桿菌等中用于生物丁醇的合成。雖然上述菌株發(fā)酵后都能夠獲得丁醇，證明了由非自然宿主生產(chǎn)丁醇是可行的，但產(chǎn)量都是微量的。所以如何應用基因工程技術(shù)，從丁醇合成途徑水平上出發(fā)，通過切斷代謝過程中存在的產(chǎn)物(乙醇和丙酮)和/或組合丁醇合成途徑中的關(guān)鍵酶來構(gòu)建高產(chǎn)丁醇的工程菌種，這對于提高微生物發(fā)酵生物丁醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率具有重要的理論意義。
[0006]由于釀酒酵母作為工業(yè)菌株生產(chǎn)乙醇的巨大成功，因而吸引了許多學者通過構(gòu)建釀酒酵母工程菌株來生產(chǎn)與乙醇僅有兩個碳原子差異的生物丁醇。然而目前所報道過的在釀酒酵母中構(gòu)建不同來源的生物丁醇合成途徑的關(guān)鍵基因，工程菌發(fā)酵后丁醇的產(chǎn)量最高僅為 2.5mg/Lo

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種釀酒酵母表達載體，即通過選擇不同來源于生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因來構(gòu)建表達載體從而提高釀酒酵母發(fā)酵生物法合成丁醇的產(chǎn)量。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種所述釀酒酵母表達載體的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三在于提供所述釀酒酵母表達載體在生物法合成丁醇過程中的應用。
[0010]本發(fā)明所述的釀酒酵母表達載體，是在PYF1274質(zhì)粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的融合基因編碼序列，從而構(gòu)建而成的，命名為PYF 1274-Buta(syn)O。
[0011]所述的6關(guān)鍵酶基因的融合基因，是通過口蹄疫病毒2A蛋白(NP_740461，以下簡稱2A蛋白)將生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的核苷酸序列串聯(lián)而形成，串聯(lián)的具體方式為:EcatoB_2A 蛋白-Cahbd_2A 蛋白-Cacrt_2A 蛋白-Tdter_2A 蛋白-CaadhE2_2A 蛋白-Cbfdh0
[0012]所述的生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶分別是:⑴大腸桿菌的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(EcatoB)，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.1所示；⑵丁醇梭菌的3-羥基丁酰-Cok脫氫酶(Cahbd)，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.2所示；⑶丁醇梭菌的5-巴豆酸酶(Cacrt)，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.3所示；⑷齒垢密螺旋體菌的反式烯脂酰-CoA還原酶(Tdter)，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.4所示；(5)丁醇梭菌的乙醇脫氫酶E(CaadhE2)，其核苷酸序列如SEQ.1DN0.5所示；(6)甲基營養(yǎng)酵母的甲酸脫氫酶(Cbfdh)，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.6所示。這6個基因均是采用釀酒酵母偏愛密碼進行改造的。
[0013]所述的2A蛋白是全部使用酵母偏愛的三聯(lián)子密碼，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.7所示。
[0014]本發(fā)明所述的釀酒酵母表達載體的構(gòu)成方法，包括以下步驟:
[0015]1)生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的合成
[0016]按照釀酒酵母偏愛密碼合成生物法【A1-Sheng Xiong, Quan-Hhong Yao, R1-HePeng,Xian Li，Huiqin Fan，Zong—ming Cheng and Yi Li，Nucleic Acid Research，2004，32(12)，e98:l~10】分別設計6關(guān)鍵酶基因的引物，引物均為5’端至3’端，進而合成生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因。
[0017]2)生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因與口蹄疫病毒2A蛋白的串聯(lián)
[0018]通過連續(xù)延伸PCR【上海農(nóng)業(yè)學報，1999，15，11_16】，將口蹄疫病毒2A蛋白與步驟I)所得的6關(guān)鍵酶基因串聯(lián)形成融合基因Buta(syn)O。
[0019]3)釀酒酵母表達載體pYF1274_Buta(syn)0的構(gòu)建
[0020]利用BamHI和SacI進行雙酶切后，通過T4DNA連接酶將步驟2)中得到的融合基因Buta(Syn)O與pYF1274質(zhì)粒連接。
[0021]4)獲得釀酒酵母表達載體pYF1274_Buta(syn)0
[0022]在上述步驟3)之后，通過質(zhì)粒純化得到該表達載體。
[0023]將上述生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的釀酒酵母表達載體pYF1274-Buta(Syn)0轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中并通過搖瓶發(fā)酵生物法產(chǎn)生丁醇，具體步驟如下:[0024]I)選用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
[0025]2)參照 Steen等的方法(E-J.Steen et al., 2008, Microb Cell Fact., 7:36:1-8)
搖瓶發(fā)酵。
[0026]3)參照 Steen等的方法(E-J.Steen et al., 2008, Microb Cell Fact., 7:36:1-8)丁醇的氣相色譜測定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為釀酒酵母表達載體pYF1274-Buta(syn)0的構(gòu)建方式。
[0028]圖2為不同時間段的丁醇氣相色譜圖。
[0029]圖3為不同時間段的丁醇產(chǎn)量圖。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍,其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0031 ] 本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
[0032]本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》-書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社)。
[0033]實施例1生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的合成
[0034]按照釀酒酵母偏愛密碼合成生物法【A1-Sheng Xiong, Quan-Hhong Yao, R1-HePeng,Xian Li，Huiqin Fan，Zong—ming Cheng and Yi Li，Nucleic Acid Research，2004，32(12)，e98:l~10】分別設計引物合成6關(guān)鍵酶基因，其中引物均為5’端至3’端，合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因。
[0035]⑴乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(EcatoB)的合成引物
[0036]1.AT0B-1: Tm=54, 60mer
【權(quán)利要求】
1.一種釀酒酵母表達載體，其特征在于，是在PYF1274質(zhì)粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入含有生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的融合基因編碼序列構(gòu)建而成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母表達載體，其特征在于，所述的6關(guān)鍵酶融合基因是由口蹄疫病毒2A蛋白與該6關(guān)鍵酶基因的核苷酸序列串聯(lián)而成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的釀酒酵母表達載體，其特征在于，所述的6關(guān)鍵酶融合基因包括:(1) EcatoB,即乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.1所示；⑵Cahbd，即3-羥基丁酰-CoA脫氫酶，其核苷酸序列入SEQ.1D N0.2所示；(3) Cacrt, 5_巴豆酸酶，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.3所示；(4) Tdter,即反式烯脂酰-CoA還原酶，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.4所示；(5)CaadhE2，即乙醇脫氫酶E，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.5所示；(6) Cbfdh，即甲酸脫氫酶，其核苷酸序列如SEQ.1D N0.6所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母表達載體，其特征在于，所述的串聯(lián)方式為EcatoB_2A 蛋白-Cahbd_2A 蛋白 _Cacrt-2A 蛋白 _Tdter-2A 蛋白-CaadhE2_2A 蛋白-Cbfdh。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的釀酒酵母表達載體，其特征在于，所述的2A蛋白的核苷酸序列如SEQ.1D N0.7所示。
6.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: O生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因的合成； 2)生物法合成丁醇用的6關(guān)鍵酶基因與口蹄疫病毒2A蛋白的串聯(lián)； 3)與pYF1274質(zhì)粒連接。
7.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母表達載體的用途，其特征在于，將所述釀酒酵母表達載體轉(zhuǎn)化入釀酒酵母 中通過搖瓶發(fā)酵生物法合成丁醇。
【文檔編號】C12P7/16GK103865951SQ201210552870
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】姚泉洪, 田永生, 彭日荷, 許晶, 王波, 王麗娟, 韓靜 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院