專利名稱：藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法，尤其一種用銀杏內(nèi)酯B誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法及其應用。
神經(jīng)干細胞是具有自我增殖和自我更新的屬性，在體外它能在分裂原(mitogen)的作用下不斷增殖，并維持干細胞的特征?，F(xiàn)應用的分裂原主要包括表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維生長因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)。有研究表明EGF和bFGF可促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞增殖，這些細胞可傳40-50多代后仍保持干細胞的特性。近年來的研究揭示，成年嚙齒類和靈長類動物體內(nèi)仍然可通過神經(jīng)干細胞分化形成新的神經(jīng)元。也有研究證實成人腦組織中存在有神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞既可在體外被上述生長因子誘導而增殖，并保持分化成神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的潛能，移植體內(nèi)后又能在宿主的神經(jīng)組織中存活、整合及分化。我們也將培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植到大鼠脊髓損傷處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞不但能存活和遷移，而且分化為神經(jīng)元的數(shù)量比對照組多。這提示移植的神經(jīng)干細胞或在體內(nèi)自身的神經(jīng)干細胞可替代受損傷的或死亡的神經(jīng)元，重建原有的神經(jīng)元回路，起到神經(jīng)傳導通路的中斷作用，修復受損傷的中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能。
銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo bilobo，EGb)是從銀杏科植物葉子中經(jīng)多步驟分離、純化獲得的一種混合物，成份復雜，其主要有效成份為黃酮糖類和烯內(nèi)酯類。已知前者具有清除氧自由基功能，而后者中的內(nèi)酯B是血小板活化因子受體的專一拮抗劑。目前國內(nèi)、外都有EGb的藥劑，主要用于防治心血管系統(tǒng)疾病。最近國內(nèi)、外也用于治療老年性癡呆癥(Alzheimer’s disease，AD)等神經(jīng)退行性疾病，并取得一定的療效。銀杏內(nèi)酯B能否促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元，在國內(nèi)外未見正式文獻報導，更未研究銀杏內(nèi)酯B的這種作用是否有量效關(guān)系。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有研究方法上的不足，設(shè)計一種應用銀杏內(nèi)酯B促進體內(nèi)外神經(jīng)干細胞(分布在中樞神經(jīng)內(nèi))分化為神經(jīng)元的方法，為臨床促進受損傷的中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能修復和藥物新應用提供指導。
本發(fā)明的基本方案包括(1)將銀杏內(nèi)酯B直接作用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞，使神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。
(2)研究以不同濃度的銀杏內(nèi)酯B直接作用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞，在不同時間觀察神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的情況。
(3)進一步，將不同濃度的銀杏內(nèi)酯B注射到動物體內(nèi)，觀察銀杏內(nèi)酯B是否能誘導中樞神經(jīng)本身的神經(jīng)干細胞增殖及分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，替換受損傷的細胞或死亡的細胞，從而更好地促進受損傷的中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能修復。
所述的銀杏內(nèi)酯B是血小板活化因子受體的專一拮抗劑，能促進培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元。神經(jīng)干細胞是指神經(jīng)系統(tǒng)中相對未分化的、具有增殖和分化潛能的細胞，可從發(fā)育中甚至成年的中樞神經(jīng)內(nèi)能分離出來。我們是從新生SD乳鼠的海馬獲取神經(jīng)干細胞；也觀察到成年SD大鼠大腦側(cè)腦室室管膜、海馬和脊髓中央管室管膜有神經(jīng)干細胞。
本發(fā)明的優(yōu)點顯著。本研究選擇一種中藥成分來誘導體內(nèi)、外神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，替換受損傷的細胞或死亡的細胞。對危害人民健康較大的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病如脊髓創(chuàng)傷進行防治基礎(chǔ)性研究，將會有力地推動整個創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治研究領(lǐng)域的發(fā)展。本研究集中力量進行系統(tǒng)的工作，在分子和細胞水平上加強對中樞神經(jīng)創(chuàng)傷后的細胞治療和細胞替換等方面的研究。這對延長人類壽命，提高傷病者生存質(zhì)量，減輕社會和家庭負擔，促進我國社會經(jīng)濟發(fā)展，都具有重要意義。本發(fā)明將使我國的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治水平居于國際領(lǐng)先水平。
下面通過具體實施例對本發(fā)明作詳盡的描述。
銀杏內(nèi)酯B是南京中國藥科大學中藥學院天然藥物化學教研室提取的產(chǎn)品。
體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞及其分化的細胞的制備方法如下選用新生的SD乳鼠，斷頭取出海馬，制成分離細胞懸液。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液和非血清輔助培養(yǎng)液的混合培養(yǎng)液條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，采取懸浮培養(yǎng)方式放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7～10天后將原代培養(yǎng)所形成的神經(jīng)干細胞克隆球分離，進行傳代培養(yǎng)。第2代培養(yǎng)7～10天后，取部分細胞進行鑒定。收集第2代克隆的神經(jīng)干細胞，并接種在24孔培養(yǎng)板中。實驗分成四組對照組，20μg/ml銀杏內(nèi)酯B組，40μg/ml銀杏內(nèi)酯B組和60μg/ml銀杏內(nèi)酯B組。于體外分別培養(yǎng)7d和14d后，用免疫細胞化學方法檢測神經(jīng)元的特異性標記物、生長相關(guān)蛋白、星形膠質(zhì)細胞特異性標記物和少突膠質(zhì)細胞特異性標記物的表達，并計數(shù)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的百分率。
體內(nèi)誘導神經(jīng)干細胞分化的方法如下SD雌性大鼠20只，分為對照組和實驗組，每組5只SD大鼠。
脊髓半橫斷模型的制備和注射BrdU及銀杏內(nèi)酯B用1％戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，正中切開背部皮膚，在手術(shù)顯微鏡做脊髓右側(cè)半橫斷。術(shù)后經(jīng)腹腔注射BrdU(50mg/kg)，2次/天，連續(xù)注射10天。術(shù)后實驗組每天經(jīng)腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 50μg、100μg和150μg三種劑量。對照組不注射銀杏內(nèi)酯B。
本發(fā)明詳細的具體操作技術(shù)說明如下1.體外誘導神經(jīng)干細胞分化(1)神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)在無菌條件下取出SD新生鼠大腦，放入D-Hank’s液中，剔除腦膜，分離出海馬。將海馬剪碎置入離心管中，以1000r/min離心5min，吸去上清液，再加入0.25％胰蛋白酶消化10min(37℃)，用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。隨后離心5min，吸去上清液，加入DMEM/F12(含bFGF 20ng/ml，B27 20μl/ml)的培養(yǎng)液，用吸管吹打成單細胞懸液，過濾，細胞計數(shù)。以1×105/ml的細胞密度移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每隔3d半量置換培養(yǎng)基。培養(yǎng)7～9d后，機械分離克隆球進行傳代。
(2)銀杏內(nèi)酯B對神經(jīng)干細胞的誘導分化將培養(yǎng)的第二代神經(jīng)干細胞收集，以2×105/cm2的細胞密度接種于預先用100μg/ml多聚賴氨酸處理過的兩塊24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上。每塊培養(yǎng)板分對照組、20μg/ml(培養(yǎng)液)銀杏內(nèi)酯B組、40μg/ml(培養(yǎng)液)銀杏內(nèi)酯B組和60μg/ml(培養(yǎng)液)銀杏內(nèi)酯B組，每組6孔。對照組培養(yǎng)液用DMEM/F12(Gibco公司)，另加10％胎牛血清配制。銀杏內(nèi)酯B組的培養(yǎng)液是在對照組培養(yǎng)液中加入了銀杏內(nèi)酯B，濃度分別為20μg/ml，40μg/ml和60μg/ml。將培養(yǎng)板置飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。每隔3d半量置換培養(yǎng)液，培養(yǎng)7d和14d終止。
(3)分化后的細胞鑒定在分別培養(yǎng)7d和14d后，取出24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片。用4％多聚甲醛(以0.1M PB制備，pH＝7.2～7.4)固定30min，0.01M PBS徹底沖洗后。各組做免疫熒光細胞化學染色，檢測神經(jīng)絲蛋白(NF200)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、少突膠質(zhì)細胞特異性蛋白(Oligodendrogin)和生長相關(guān)蛋白(GAP-43)(4)細胞計數(shù)在10×20熒光顯微鏡下，對免疫熒光細胞化學染色NF陽性的細胞進行計數(shù)(以0.25mm2區(qū)域作為計數(shù)單位面積)。每組有6個培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的蓋玻片，每個蓋玻片上隨機選4個計數(shù)單位面積，計數(shù)細胞總數(shù)和染色陽性細胞數(shù)及染色陽性細胞的百分率。計數(shù)單位面積內(nèi)細胞核熒光陽性的細胞總數(shù)，NF染色和細胞核熒光標記的雙陽性的細胞數(shù)，GFAP染色和細胞核熒光標記的雙陽性細胞數(shù)和Nestin染色和細胞核熒光標記的雙陽性細胞數(shù)。用x2進行檢驗。
(5)實驗結(jié)果顯示①神經(jīng)干細胞的原代及傳代培養(yǎng)和鑒定在原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞7～9d后，可獲得大量的呈懸浮生長、大小不一的克隆球。原代的克隆球經(jīng)胰酶消化后將分離的細胞進行傳代培養(yǎng)，又可形成新的細胞克隆球。這些克隆球經(jīng)Nestin和BrdU抗體鑒定呈陽性染色，表明它們是神經(jīng)干細胞，具有分裂增殖能力。
②銀杏內(nèi)酯B對神經(jīng)干細胞誘導分化的結(jié)果銀杏內(nèi)酯B能促進培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。不同濃度的銀杏內(nèi)酯B實驗組，神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的百分率都高于對照組(P＜0.05)，但不同濃度的銀杏內(nèi)酯B實驗組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。不同濃度的銀杏內(nèi)酯B實驗組神經(jīng)干細胞分化為星形膠質(zhì)細胞的百分率都高于對照組(P＜0.05)，并隨銀杏內(nèi)酯B濃度的增加而增高。
2.體內(nèi)誘導神經(jīng)干細胞分化(1)動物分組SD雌性大鼠(體重150～180g)20只，購自中山大學中山醫(yī)學院實驗動物中心。動物隨機分為對照組和實驗組，每組5只SD大鼠。
(2)制備脊髓半橫斷模型和注射BrdU及銀杏內(nèi)酯B1％的戊巴比妥鈉(35～40mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，正中切開背部皮膚，在手術(shù)顯微鏡下暴露T10～T13棘突和椎板，用咬骨鉗撬掉椎板，暴露脊髓T12段，做脊髓右側(cè)半橫斷。徹底止血后縫合肌肉和皮膚切口，并肌肉注射青霉素。術(shù)后所有動物經(jīng)腹腔注射BrdU(50mg/kg)，2次/天，連續(xù)注射10天。術(shù)后實驗組每天經(jīng)腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 50μg/180g、100μg/180g和150μg/180g三種劑量。對照組不注射銀杏內(nèi)酯B。
(3)灌注、固定和取材分別在7天、14天、21天和30天用1％戊巴比妥鈉麻醉動物，4％多聚甲醛(以0.1M PB制備，pH＝7.2～7.4)固定液進行心臟灌流，取T8～L1脊髓節(jié)段，并在同一固定液中后固定4小時，置入30％蔗糖(以0.1M PB制備)液中，置4℃下至沉底，用恒溫冰凍切片機做脊髓T11，T12和T13段的連續(xù)橫切片，厚度為30μm。
(4)熒光免疫細胞化學雙標法染色①0.01MPBS沖洗3次，每次5min。②0.2％TritonX-100，37℃，30min。③正常羊血清溫育，37℃，20min。④滴加一抗(分別為BrdU、NF200、GFAP、Nestin、S-100和GAP-43)，37℃溫育2小時。⑤0.01MPBS沖洗3×5min。⑥滴加生物素化二抗，37℃溫育30min。⑦0.01MPBS沖洗3×5min。⑧滴加SABC復合液，37℃溫育30min。⑨0.01MPBS沖洗3×5min。陰性對照，不加一抗用PBS代替。
(5)實驗結(jié)果銀杏內(nèi)酯B能夠促進受損傷中樞神經(jīng)自身神經(jīng)干細胞的增殖，并向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化，參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建，修復中樞神經(jīng)的功能。
權(quán)利要求
1.一種藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法，其特征是將銀杏內(nèi)酯B作用培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞，誘導其分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞；應用銀杏內(nèi)酯B作用體內(nèi)受損傷的中樞神經(jīng)自身神經(jīng)干細胞，誘導其分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法，其特征是在體外培養(yǎng)應用的銀杏內(nèi)酯B濃度為20～60μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法，其特征是神經(jīng)干細胞的制備方法為選用新生1～2d的純種SD乳鼠，斷頭取腦后分離出海馬，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成分離細胞懸液，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12和非血清輔助培養(yǎng)基B27的混合培養(yǎng)液條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，采取懸浮培養(yǎng)方式放置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；7～10d后將原代培養(yǎng)所形成的神經(jīng)干細胞克隆球用胰蛋白酶和EDTA混合液消化分離，進行傳代培養(yǎng)；細胞培養(yǎng)過程每隔3天半保留換液1次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法，其特征是該方法包括如下步驟(1)將培養(yǎng)的第二代神經(jīng)干細胞收集，以2×105/cm2的細胞密度接種于預先用100μg/ml多聚賴氨酸處理過的兩塊24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上；每塊培養(yǎng)板分對照組、20μg/ml(培養(yǎng)液)銀杏內(nèi)酯B組、40μg/ml(培養(yǎng)液)銀杏內(nèi)酯B組和60μg/ml(培養(yǎng)液)銀杏內(nèi)酯B組，每組6孔；對照組培養(yǎng)液用DMEM/F12，另加10％胎牛血清配制。銀杏內(nèi)酯B組的培養(yǎng)液是在對照組培養(yǎng)液中加入了銀杏內(nèi)酯B，濃度分別為20μg/ml，40μg/ml和60μg/ml；將培養(yǎng)板置飽和濕度、5％C02培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)；每隔3d半量置換培養(yǎng)液，培養(yǎng)7d和14d終止；(2)在分別培養(yǎng)7d和14d后，取出24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片；用4％多聚甲醛(以0.1M PB制備，pH＝7.2～7.4)固定30min，0.01M PBS徹底沖洗后；各組做免疫熒光細胞化學染色，檢測神經(jīng)絲蛋白(NF200)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、少突膠質(zhì)細胞特異性蛋白(Oligodendrogin)和生長相關(guān)蛋白(GAP-43)；(3)在10×20熒光顯微鏡下，對免疫熒光細胞化學染色NF陽性的細胞進行計數(shù)(以0.25mm2區(qū)域作為計數(shù)單位面積)；每組有6個培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的蓋玻片，每個蓋玻片上隨機選4個計數(shù)單位面積，計數(shù)細胞總數(shù)和染色陽性細胞數(shù)及染色陽性細胞的百分率；計數(shù)單位面積內(nèi)細胞核熒光陽性的細胞總數(shù)，NF染色和細胞核熒光標記的雙陽性的細胞數(shù)，GFAP染色和細胞核熒光標記的雙陽性細胞數(shù)和Nestin染色和細胞核熒光標記的雙陽性細胞數(shù)；用x2進行檢驗。
5.藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法的應用，其特征是在體內(nèi)應用銀杏內(nèi)酯B作用受損傷的脊髓自身神經(jīng)干細胞，誘導其增殖和分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法的應用，其特征是包括如下步驟(1)1％的戊巴比妥鈉(35～40mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，正中切開背部皮膚，在手術(shù)顯微鏡下暴露T10～T13棘突和椎板，用咬骨鉗撬掉椎板，暴露脊髓T12段，做脊髓右側(cè)半橫斷；徹底止血后縫合肌肉和皮膚切口，并肌肉注射青霉素；術(shù)后所有動物經(jīng)腹腔注射BrdU(50mg/kg)，2次/天，連續(xù)注射10天；術(shù)后實驗組每天經(jīng)腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 50μg/180g、100μg/180g和150μg/180g三種劑量；對照組不注射銀杏內(nèi)酯B；(2)分別在7天、14天、21天和30天用1％戊巴比妥鈉麻醉動物，4％多聚甲醛(以0.1M PB制備，pH＝7.2～7.4)固定液進行心臟灌流，取T8～L1脊髓節(jié)段，并在同一固定液中后固定4小時，置入30％蔗糖(以0.1M PB制備)液中，置4℃下至沉底，用恒溫冰凍切片機做脊髓T11，T12和T13段的連續(xù)橫切片，厚度為30μm；(3)熒光免疫細胞化學雙標法染色①0.01MPBS沖洗3次，每次5min；②0.2％TritonX-100，37℃，30min；③正常羊血清溫育，37℃，20min；④滴加一抗(分別為BrdU、NF200、GFAP、Nestin、S-100和GAP-43)，37℃溫育2小時；⑤0.01MPBS沖洗3×5min；⑥滴加生物素化二抗，37℃溫育30min；⑦0.01MPBS沖洗3×5min；⑧滴加SABC復合液，37℃溫育30min；⑨0.01MPBS沖洗3×5min；陰性對照，不加一抗用PBS代替。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物誘導神經(jīng)干細胞增殖和分化的方法。將銀杏內(nèi)酯B作用體內(nèi)外的神經(jīng)干細胞，誘導其分化為神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞。本發(fā)明在細胞水平上加強對中樞神經(jīng)創(chuàng)傷后的保護機制、替換受損傷的神經(jīng)元，參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建，修復中樞神經(jīng)的功能。這對延長人類壽命，提高傷病者生存質(zhì)量，減輕社會和家庭負擔，促進我國社會經(jīng)濟發(fā)展有重要意義。
文檔編號A61K31/365GK1446907SQ0311424
公開日2003年10月8日 申請日期2003年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月18日
發(fā)明者曾園山 申請人:中山大學中山醫(yī)學院科技開發(fā)中心, 曾園山