專利名稱：：基于fmn2基因的細(xì)胞增殖和分化失調(diào)的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供用于診斷細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的方法，用于治療所述失調(diào)的化合物和方法以及用于鑒定可能有效用于治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的藥劑的方法。
背景技術(shù)：
：ARF腫瘤抑制劑是哺乳動(dòng)物中對(duì)抗癌基因活化的細(xì)胞防御的重要成分。高百分比的人白血病(leukaemia)和黑素瘤(melanoma)患者具有ARF突變。ARF敲除小鼠高頻率地發(fā)展腫瘤。ARF通過(guò)HDM2的抑制來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)，從而激活p53，HDM2是p53的E3泛蛋白連接酶。然而，對(duì)P53和ARF敲除小鼠的研究表明還存在p53不依賴性的ARF腫瘤抑制劑通路(圖1)。ARF蛋白集中在細(xì)胞核中，并且在核中定位于核仁和核質(zhì)。發(fā)明_既述本發(fā)明是基于以下的發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)ARF腫瘤抑制劑時(shí)，人成蛋白-2(R)rmin-2，F(xiàn)MN2)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，并且能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21的表達(dá)——這是一種導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯的相互作用。本發(fā)明人使用基于質(zhì)譜的細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)和穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，S卩，SILAC，Ong,S.E.等，Stableisotopelabellingbyaminoacidsincellcultures，silac，asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics(通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物中的氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記，silac，作為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)的簡(jiǎn)單且精確的方法)，Mol.Cell.Proteomics(分子和細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué))1，376-386(2002)，分析了ARF對(duì)核仁蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明FMN2基因表達(dá)水平通過(guò)ARF誘導(dǎo)而得到提高，與p53無(wú)關(guān)。因此，認(rèn)為FMN2基因和/或蛋白質(zhì)可以作為用于治療各種細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的有用標(biāo)記物和藥物。此外，觀察到FMN2抑制具有細(xì)胞毒性作用，并且因此FMN2可以作為有用的藥物靶標(biāo)。FMN2基因首先是通過(guò)全基因組同源性搜索鑒定出的。因此，通過(guò)搜索EST數(shù)據(jù)庫(kù)的FMN同源物，探測(cè)小鼠cDNA文庫(kù)和進(jìn)一步搜索人EST數(shù)據(jù)庫(kù)，Leaser和Leder(2000)鑒定出編碼FMN2的小鼠cDNA和部分人cDNA。序列分析預(yù)測(cè)出1，567個(gè)氨基酸的小鼠蛋白，并且鑒定出的與人蛋白質(zhì)同源的部分序列在其N端享有大約79%的同一性，在其C端享有90%的同一性。它們與果蠅(Drosophila)“cappucciono”蛋白也具有高同源性。FMN2的FHl結(jié)構(gòu)域含有11個(gè)脯氨酸重復(fù)。Northern印跡分析揭示了在所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織和胎兒大腦中6-至7-1ΛFMN2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)。全標(biāo)本包埋(wholemount)原位雜交分析檢測(cè)到在9.5至10.5天時(shí)，小鼠胚胎脊髓和大腦中明顯的FMN2表達(dá)。存在很少描述FMN2分析的出版物，例如，到2010年3月為止，僅有15篇涉及FMN2的手稿可以通過(guò)NCBIPubMed找到。這些出版物中的大部分報(bào)道了小鼠減數(shù)分裂中FMN2和紡錘體重新定位之間的關(guān)聯(lián)性的分析。不存在報(bào)道人或小鼠研究中癌癥/腫瘤抑制劑活性和FMN2之間的關(guān)聯(lián)性的出版物。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供診斷細(xì)胞增殖和/和分化失調(diào)或?qū)ζ湟赘行缘姆椒ǎ龇椒òz測(cè)成蛋白2(FMN》基因和/或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)的步驟，其中FMN2基因/蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)指示細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)。應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)包括FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的提高和/或降低，包括FMN2基因產(chǎn)物活性的變化，這種變化由影響FMN2基因產(chǎn)物的同種型比例或轉(zhuǎn)錄后和/或翻譯后修飾事件的變化引起。FMN2基因/蛋白表達(dá)水平的提高可能與應(yīng)答異常癌基因激活的ARF腫瘤抑制劑的誘導(dǎo)相關(guān)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到FMN2基因/蛋白表達(dá)水平的提高可能進(jìn)一步與例如由一種或多種癌基因的異常激活或缺乏活性P53引起的細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)(如，癌癥)相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)”可以用來(lái)包括各種疾病、病癥和/或癥狀，包括例如腫瘤病癥，如癌癥。在這點(diǎn)上，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明提供的方法不限于特定類型的癌癥的診斷，并且因此可以診斷所有形式的癌、肉瘤或淋巴瘤。例如，可以診斷肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和皮膚癌的情況，以及例如如白血病(leukaemia)的癌癥。自體免疫和/或炎性病癥，如銀屑病(psoriasis)、過(guò)敏癥(allergy)等，也包括在該定義內(nèi)。除了減數(shù)分裂失調(diào)以外，例如，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖和分化失調(diào)”還包括，涉及生殖細(xì)胞增殖的可能導(dǎo)致不育的失調(diào)，或如肝炎(h印atitis)、肝硬化(livercirrhosis)、腎衰竭(renalfailure)、急性肺炎(acutepneumonia)、胃饋蕩(stomachulcer)、心肌梗死(cardicinfarction)、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥(musculardystrophy)禾口腦梗死(cerebralinfarction)這樣的疾病禾口/或病癥。FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的降低可以表示特征在于異常凋亡事件的細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的存在，或?qū)?xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的易感性，異常凋亡事件如例如為神經(jīng)變性疾病(neurodegenerativedisease)禾口急性細(xì)胞變性疾病(acutecellulardegenerativedisease)和/或如缺血性事件的病癥(例如，中風(fēng)(stroke)、心肌梗死(myocardialinfarction)等)。在另一些實(shí)施方案中，在此所述的方法可以用于診斷或鑒定傾向于或易于患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的那些受試者。在傾向于或易于患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的受試者中，F(xiàn)MN2基因和/或蛋白表達(dá)的水平可能升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以相對(duì)于源自健康個(gè)體(即，沒(méi)有患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的那些)的參照或?qū)φ諛悠分写嬖诘腇MN2基因/蛋白表達(dá)的水平來(lái)評(píng)價(jià)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。以這種方式，可以容易地檢測(cè)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)水平的提高和/或降低。術(shù)語(yǔ)“樣品”應(yīng)當(dāng)理解為包括體液的樣品，如全血、血漿、血清、唾液、汗液和/或精液。在其他情況中，可以使用如組織活體切片和/或刮削物這樣的“樣品”。特別地，可以使用來(lái)自皮膚、腫瘤或淋巴結(jié)的活體切片或刮削物。此外，樣品可以包含組織或腺體分泌物，并且可以使用沖洗實(shí)驗(yàn)方案來(lái)獲得分泌至例如肺部中的流體樣品。合適的沖洗實(shí)驗(yàn)方案可以包括支氣管(broncho)-肺部灌洗程序。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚在此所述的每一種樣品可以產(chǎn)生一定量的FMN2核酸(S卩，DNA或RNA)和/或FMN2蛋白、肽(或其片段)。此夕卜，在此所述的方法可以包括提供樣品的第一個(gè)步驟，所述樣品來(lái)自懷疑患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的受試者或處于發(fā)展細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。如所述的，“參照樣品”可以源自未患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)、呈現(xiàn)出“正?！彼降腇MN2基因和/或蛋白表達(dá)的受試者。如在此所述的，從其獲取樣品的受試者，或接受治療的受試者，可以是人或動(dòng)物受試者。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知這些技術(shù)，其可以用于鑒定如上述列出的那些樣品中受到調(diào)節(jié)的FMN2基因和/或蛋白表達(dá)。這些技術(shù)可以包括，例如，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的技術(shù)，如實(shí)時(shí)PCR(也稱為定量PCR)。在本發(fā)明的情況中，實(shí)時(shí)PCR可以用于測(cè)定編碼FMN2蛋白的基因的表達(dá)水平。通常并且為了定量特定核酸序列的表達(dá)水平，可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，將相關(guān)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。優(yōu)選，逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)方案可以使用設(shè)計(jì)來(lái)特異性擴(kuò)增目標(biāo)mRNA序列的引物。此后，可以使用PCR來(lái)擴(kuò)增通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA。通常，使用設(shè)計(jì)來(lái)特異性地與特定序列雜交的引物來(lái)擴(kuò)增cDNA，并且用熒光或放射性標(biāo)記的化合物來(lái)標(biāo)記用于PCR的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知使用標(biāo)記的核苷酸來(lái)定量PCR過(guò)程中產(chǎn)生的DNA的量的技術(shù)。簡(jiǎn)言之，并且例如，可以通過(guò)監(jiān)控PCR循環(huán)過(guò)程中結(jié)合的標(biāo)記的核苷酸的量來(lái)測(cè)定標(biāo)記的擴(kuò)增的核酸的量。關(guān)于在此所述的基于PCR技術(shù)的更多信息可以在例如PCRPrimer=ALaboratoryManual(PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版，由CarlW.Dieffenbach&GabrielaS.Dveksler編輯=ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)和MolecularCloning:ALaboratoryManual(^v^3H:^),JosephSambrook&DavidRussell:ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)中找到?？梢杂糜跍y(cè)定樣品中的FMN2基因表達(dá)水平的其他技術(shù)，包括，例如，Northern和/或Southern印跡技術(shù)。Northern印跡可以用于測(cè)定樣品中存在的特定mRNA的量，并且因此可以用于測(cè)定FMN2基因表達(dá)的量。簡(jiǎn)而言之，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，從細(xì)胞中提取出mRNA，并進(jìn)行電泳。然后可以使用核酸探針來(lái)檢測(cè)和定量樣品中存在的特定mRNA的量，所述核酸探針設(shè)計(jì)來(lái)與目標(biāo)mRNA序列(在這種情況下，是編碼FMN2蛋白的mRNA)雜交(即，與目標(biāo)mRNA序列互補(bǔ)或基本上互補(bǔ))。另外地，或備選地，可以通過(guò)微陣列分析來(lái)鑒定FMN2基因表達(dá)的水平。這樣的方法將涉及DNA微陣列的使用，所述DNA微陣列包含源自FMN2基因的核酸。為了鑒定FMN2基因表達(dá)的水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從樣品中提取出核酸，優(yōu)選mRNA，并將其進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案，如逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，以產(chǎn)生cDNA。優(yōu)選，可以使用對(duì)特定mRNA序列(在這種情況中，為編碼FMN2基因的序列)特異性的引物?？梢詫U(kuò)增的FMN2cDNA進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增步驟，任選在標(biāo)記的核苷酸(如上所述的)的存在下進(jìn)行。此后，可以將任選標(biāo)記的擴(kuò)增的cDNA在允許結(jié)合微陣列的DNA的條件下與微陣列接觸。以這種方式，可以鑒定FMN2基因表達(dá)的水平。此外，可以使用其他技術(shù)，如深度測(cè)序(de印sequencing)和/或焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)，來(lái)檢測(cè)如上所述的任一種樣品(特別是細(xì)胞提取物)中的FMN2序列。關(guān)于這些技術(shù)的更多信息可以在"Applicationsofnext-generationsequencingtechnologiesinfunctionalgenomics(下一代測(cè)序技術(shù)在功能性基因組學(xué)中的應(yīng)用)”，OlenaMorozovaa和MarcoA.Marra,Genomics(基因組學(xué))，第92卷，第5期，2008年11月，第255-264頁(yè)禾口"PyrosequencingshedslightonDNAsequencing(焦憐酸測(cè)序有助于闡明DNA測(cè)序)”，Ronaghi，GenomeResearch(基因組研究)，Vo1.11，2001，第3-11頁(yè)中找到。鑒于以上所述的，本發(fā)明的第二個(gè)方面提供編碼成熟FMN2蛋白的互補(bǔ)DNA(cDNA)和獲得該cDNA的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的cDNA包含圖2和3中所示的一種或多種序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過(guò)位于染色體l，lq43(區(qū)域238321604-238705112)上的基因組DNA的序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾來(lái)形成FMN2cDNA序列。5，-本發(fā)明還包括cDNA序列，其與以上序列及其物種特異性同源物相似。因此，本發(fā)明包括與所鑒定的cDNA序列為85%、90%、95%、89%或99%相同水平的序列。這些同源序列因此可以對(duì)應(yīng)于與相同物種內(nèi)或物種之間的突變相關(guān)的變異，并且可以特別地對(duì)應(yīng)于至少一個(gè)核苷酸的剪截、置換、缺失和/或添加。所述同源序列還可以對(duì)應(yīng)于與遺傳密碼簡(jiǎn)并性或遺傳密碼偏好性相關(guān)的變異，遺傳密碼偏好性對(duì)于科、種或變種是特異性的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種序列比較算法和程序中的任一種來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和/或核酸序列同源性。這樣的算法和程序包括，但決不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))85(8)=2444-2448；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)215(3)403-410;Thompson等，1994，NucleicAcidsRes.(核酸研究)22(2):4673-4680；Higgins等，1996，MethodsEnzymo1.(酶學(xué)方法)266:383-402;Altschul等，1990，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)215(3):403-410；Altschul等，1993，NatureGenetics(自然遺傳學(xué))3266-272)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域公知的基礎(chǔ)局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool，“BLAST”)來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和核酸序列同源性(參見(jiàn)，例如，Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))872267-2268；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)215:403-410；Altschul等，1993，NatureGenetics(自然遺傳學(xué))3:266-272；Altschul等，1997，Nuc.Acids.Res.(核酸研究)25=3389-3402)BLAST程序評(píng)價(jià)了所鑒定的所有高評(píng)分區(qū)段對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且優(yōu)選選擇滿足使用者指定的顯著性閾值(如使用者指定的百分比同源性)的那些區(qū)段。優(yōu)選，使用Karlin的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性公式評(píng)價(jià)高評(píng)分區(qū)段對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(參見(jiàn)，例如，Karlin和Altschul,1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)),87:2267-2268)。與本發(fā)明的序列互補(bǔ)的核苷酸序列理解為意指其核苷酸序列與本發(fā)明的那些序列互補(bǔ)并且方向相反的任何DNA(反向平行序列)。在代表性的片段中，優(yōu)選能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本發(fā)明所述的核苷酸序列雜交的那些。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交意思是選擇溫度和離子強(qiáng)度條件，使得它們?cè)试S維持兩個(gè)互補(bǔ)DNA片段之間的雜交。通過(guò)舉例說(shuō)明的方式，用于限定以上所述的核苷酸片段的目的的雜交步驟的高嚴(yán)謹(jǐn)條件有利地是以下的條件在SSC緩沖液的存在下，在65°C的優(yōu)選溫度下進(jìn)行雜交，IXSSC對(duì)應(yīng)于0.15MNaCl和0.05M檸檬酸鈉。例如，洗滌步驟可以是下述室溫下，2.SSC，0.1%SDS洗滌，接著在68°C下，用1XSSC，0.1%SDS；0.5XSSC,0.1%SDS；0.1XSSC，0.1%SDS洗滌三次，持續(xù)15分鐘。對(duì)于兩個(gè)序列之間的雜交，中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如，在5XSSC緩沖液的存在下，使用60°C的溫度，或低嚴(yán)謹(jǐn)性，例如，在5XSSC緩沖液的存在下，50°C的溫度，各自需要較低的整體互補(bǔ)性。對(duì)于更大或更小大小的寡核苷酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)Sambrook等，1989的教導(dǎo)調(diào)整上述用于大小約300個(gè)堿基的多核苷酸的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。應(yīng)該理解同源多肽用來(lái)指定呈現(xiàn)出與天然多肽相關(guān)的特定修飾的多肽(所述修飾特別地例如為至少一個(gè)氨基酸的缺失、添加或置換，剪截，延伸，嵌合融合和/或突變)，或呈現(xiàn)出翻譯后修飾的多肽。在同源多肽中，優(yōu)選其氨基酸序列呈現(xiàn)出與根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的氨基酸序列至少80%(優(yōu)選90%)同源性或同一性的那些。在置換的情況中，一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸由“等價(jià)”氨基酸替代。表述“等價(jià)”氨基酸在此用來(lái)表示能夠置換基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)中的氨基酸之一然而沒(méi)有實(shí)質(zhì)性地改變相應(yīng)肽的生物學(xué)活性的任何氨基酸，并且如下文所定義的。本發(fā)明還包括主要基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接變體和由其編碼的翻譯的FMN2剪接變體蛋白。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到多腺苷酸化變體和起始密碼子變體，包括編碼這些變體的cDNA序列，也可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明提供的cDNA可以用于產(chǎn)生重組FMN2蛋白，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知用于產(chǎn)生重組蛋白的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方案(參見(jiàn)，例如，GerdGellissen等，2005)。此外，可以將cDNA用于作為檢測(cè)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的手段的測(cè)定或微陣列中。例如，可以在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將獲自如在此詳述的那些樣品的cDNA與核酸(即，DNA)探針(如，從基因組DNA的片段產(chǎn)生的那些)接觸，使得含有與cDNA中存在的那些互補(bǔ)的序列的DNA探針與cDNA之間產(chǎn)生結(jié)合。產(chǎn)生cDNA時(shí)，可以用熒光或放射性標(biāo)記的化合物來(lái)標(biāo)記用于PCR程序的核苷酸。以這種方式，可以容易地檢測(cè)到與微陣列等結(jié)合的cDNA。為了測(cè)定樣品中的FMN2蛋白的水平，可以使用利用能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑的免疫學(xué)技術(shù)。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)理解為指的是完整的FMN2蛋白，及其剪接變體、同種型功能性片段、突變形式和物種特異性同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此所述的方法可以包括在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白與基底締合、相互作用、結(jié)合和/或固定的條件下，將所述基底(或其一部分)與待測(cè)試的樣品接觸的步驟。合適的基底可以包括，例如，玻璃、硝化纖維素、紙、瓊脂糖和/或塑料?；?，如，例如，塑料材料，可以采用微量滴定平板的形式?；蛘?，接觸待檢測(cè)樣品的基底可以包含能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑。優(yōu)選，能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑結(jié)合在基底(或其至少一部分)上。合適的結(jié)合試劑可以包括，例如，抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體和/或其他類型的能夠結(jié)合FMN2蛋白的肽或小分子。將理解這種定義適用于在此提及的所有類型的結(jié)合試劑。因此，可以在允許能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑與樣品中存在的任何FMN2蛋白之間的結(jié)合或相互作用的條件下，將基底(或其一部分)接觸待測(cè)試的樣品?？梢允褂昧硪环N能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑(下文中稱為“一級(jí)結(jié)合試劑”)來(lái)檢測(cè)結(jié)合到基底或能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑上的任何FMN2蛋白。另外地，或備選地，所述一級(jí)結(jié)合試劑可以具有對(duì)FMN2蛋白基底或包含F(xiàn)MN2蛋白和上述能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑的復(fù)合物的親和性，或結(jié)合FMN2蛋白基底或包含F(xiàn)MN2蛋白和上述能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑的復(fù)合物。一級(jí)結(jié)合試劑可以與允許它們得到檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分(下文中稱為“可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分”)綴合。例如，所述一級(jí)試劑可以與能夠通過(guò)比色化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來(lái)報(bào)告水平的酶綴合。這樣綴合的酶可以包括但不限于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AlkP)。另外地，或備選地，一級(jí)結(jié)合試劑可以綴合到熒光分子上，如，例如，熒光團(tuán)，如FITC、若丹明或德克薩斯紅(TexasRed)?？梢跃Y合到結(jié)合試劑上的其他類型的分子包括放射性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)部分。或者，可以通過(guò)另一種對(duì)一級(jí)結(jié)合試劑具有親和性的結(jié)合試劑(下文中稱為“二級(jí)結(jié)合試劑”)來(lái)檢測(cè)結(jié)合到基底或能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑上的任何FMN2蛋白。優(yōu)選，二級(jí)結(jié)合試劑與可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分綴合。結(jié)合FMN2蛋白的一級(jí)結(jié)合試劑(或與其結(jié)合的二級(jí)結(jié)合試劑)的量可以表示測(cè)試樣品中存在的FMN2蛋白的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定FMN2蛋白水平的方法可以采用“浸量尺(dip-stick)”測(cè)試的形式，其中在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白與基底結(jié)合或與基底上結(jié)合或固定的結(jié)合試劑結(jié)合的條件下，將基底(或其一部分)與待測(cè)試的樣品接觸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這些方法可以采用免疫學(xué)測(cè)定的形式，如，例如，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。ELISA可以采用“捕獲”ELISA的形式，其中，將待測(cè)試的樣品接觸基底，并且通過(guò)結(jié)合或固定在基底上的結(jié)合試劑(能夠結(jié)合FMN2蛋白)“捕獲”或結(jié)合樣品中存在的任何FMN2蛋白。或者，可以在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白和基底之間“直接”結(jié)合的條件下，將樣品與基底接觸。以上所述的每一種ELISA方法可以包括“直接”FMN2蛋白檢測(cè)步驟或“間接”鑒定步驟?？梢詫⑸婕斑@些步驟的ELISA稱為“直接”ELISA或“間接”ELISA?！爸苯印盓LISA可以涉及在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白與基底結(jié)合和/或與基底上結(jié)合的結(jié)合試劑結(jié)合的條件下，將待測(cè)試的樣品接觸基底。任選的封閉步驟后，可以通過(guò)能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑(即，一級(jí)結(jié)合試劑)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的FMN2蛋白。優(yōu)選，一級(jí)結(jié)合試劑與可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分綴合?！伴g接”ELISA可以在FMN2蛋白與一級(jí)結(jié)合試劑接觸后，包括另一個(gè)步驟即使用另一種對(duì)一級(jí)結(jié)合試劑具有親和性或特異性的結(jié)合試劑(二級(jí)結(jié)合試劑)的步驟。優(yōu)選，所述二級(jí)結(jié)合試劑可以與可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分綴合?？梢杂糜阼b定樣品中FMN2蛋白水平的其他免疫學(xué)技術(shù)包括，例如，免疫組織化學(xué)，其中在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白和FMN2蛋白結(jié)合試劑結(jié)合的條件下，將結(jié)合試劑，如能夠結(jié)合FMN2蛋白的抗體，與樣品(如上述那些)接觸。通常，在將樣品與結(jié)合試劑接觸之前，用例如去污劑，如TritonXlOO，處理樣品。這樣的技術(shù)可以稱為“直接”免疫組織化學(xué)染色?；蛘?，可以將待測(cè)試的樣品進(jìn)行間接免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)方案，其中，在樣品與FMN2蛋白結(jié)合試劑接觸后，使用另一種對(duì)FMN2蛋白結(jié)合試劑是特異性的、對(duì)FMN2蛋白結(jié)合試劑具有親和性的或能夠結(jié)合FMN2蛋白結(jié)合試劑的結(jié)合試劑(二級(jí)結(jié)合試劑)來(lái)檢測(cè)FMN2蛋白/結(jié)合試劑復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在直接和間接免疫組織化學(xué)技術(shù)中，結(jié)合試劑或二級(jí)結(jié)合試劑可以綴合到可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分上。優(yōu)選，結(jié)合試劑或二級(jí)結(jié)合試劑綴合到能夠通過(guò)比色化學(xué)發(fā)光反應(yīng)報(bào)告結(jié)合的結(jié)合試劑或二級(jí)結(jié)合試劑的水平的結(jié)構(gòu)部分上。還可以使用功能化的納米-懸臂梁生物傳感器(nano-cantileverbiosensor)和相似的裝置來(lái)檢測(cè)FMN2蛋白和同種型、物種特異性同源物和片段(Fritz，J.Analyst(分析雜志),2008,133,855-863)。為了鑒定樣品中存在的FMN2蛋白的水平，可以將免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果與關(guān)于參照樣品進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果相比較。例如，顯示出結(jié)合的FMN2蛋白結(jié)合試劑(或二級(jí)結(jié)合試劑)比參照樣品多或少的樣品可能是由患有或易患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的受試者提供的。利用能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑的應(yīng)用的其他技術(shù)包括，例如，如^iestern印跡或斑點(diǎn)印跡的技術(shù)。Western印跡可以涉及將樣品進(jìn)行電泳，使得分離或解析樣品的組分，例如，蛋白質(zhì)組分。然后將解析的組分轉(zhuǎn)移至基底，如硝化纖維素上。為了鑒定樣品中存在的任何FMN2蛋白，可以在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白和能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑之間結(jié)合的條件下，將基底與能夠結(jié)合FMN2蛋白的結(jié)合試劑接觸。有利地，能夠結(jié)合FMN2蛋白的試劑可以綴合到可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分上?；蛘?，可以將基底與另一種對(duì)能夠結(jié)合FMN2蛋白的結(jié)合試劑具有親和性的結(jié)合試劑接觸。有利地，所述另一種結(jié)合試劑可以綴合到可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分上。在斑點(diǎn)印跡的情況中，可以將樣品或其一部分接觸基底，使得樣品中存在的任何FMN2蛋白結(jié)合或固定在基底上。可以如上所述進(jìn)行任何結(jié)合或固定的FMN2蛋白的鑒定。在上述任一種技術(shù)中，檢測(cè)到的一級(jí)或二級(jí)結(jié)合試劑的量表示樣品中存在的FMN2蛋白的量，或與樣品中存在的FMN2蛋白的量成比例。此外，可以將在此所述的任一種或所有診斷方法中獲得的結(jié)果與源自已知未患有或不易患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的健康受試者的參照或?qū)φ諛悠帆@得的結(jié)果相比較。以上概括所述的測(cè)定在“TheImmunoassayHandbook(免疫測(cè)定手冊(cè))”2005，DavidWild編輯，ElsevierLtd中有更詳細(xì)地描述，其指導(dǎo)本領(lǐng)域的讀者。應(yīng)該理解，除了由例如ARF腫瘤抑制劑的誘導(dǎo)引起的調(diào)節(jié)的(即，提高的或降低的)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)，F(xiàn)MN2基因序列中的一個(gè)或多個(gè)突變的存在也可能導(dǎo)致異常的FMN2基因/蛋白表達(dá)。例如，異?；钚缘膯?dòng)子序列可以引起FMN2基因的異常表達(dá)。核酸序列中的突變可以采取一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加、缺失、倒置和/或置換的形式，并且上調(diào)的FMN2表達(dá)可以由一個(gè)或多個(gè)這些類型的突變的存在引起。因此，如PCR和/或限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的技術(shù)可以用于檢測(cè)已知導(dǎo)致異常(即，升高或降低的)FMN2表達(dá)的突變或特定序列基序的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將核酸的片段(其包括可能帶有突變的FMN2序列的一部分)擴(kuò)增并測(cè)序，以測(cè)定FMN2是否包含突變。或者，可以擴(kuò)增這種類型的片段，并使用合適的寡核苷酸和非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交/洗滌條件(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，2001)進(jìn)行雜交研究。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解也可以使用包含修飾的核堿基(nucleobase)和/或PNA單體的化學(xué)修飾寡核苷酸或非標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸或包含肽核酸的那些。以這種方式，只有精確匹配的寡核苷酸結(jié)合所擴(kuò)增片段的一個(gè)或多個(gè)包含突變的區(qū)域。還適于首先擴(kuò)增包含可能含有或可能不含有突變的序列的DNA片段，并且此后使用擴(kuò)增片段內(nèi)部的引物進(jìn)行進(jìn)一步的PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)該片段是包含天然序列還是包含突變序列，以檢測(cè)突變或相反。這樣的技術(shù)通常稱為巢式PCR。此外，突變可以產(chǎn)生新的限制位點(diǎn)，或?qū)е乱吧突蛱烊籉MN2序列中存在的限制位點(diǎn)的丟失一一通過(guò)RFLP分析可以容易地檢測(cè)到這些變化。包含突變的片段，如果存在，首先可以使用合適的引物來(lái)擴(kuò)增，并且此后將片段進(jìn)行RFLP分析，條件是突變或天然序列具有相應(yīng)的天然或突變序列中不存在的限制位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，在此鑒定的示例性突變導(dǎo)致新限制位點(diǎn)的產(chǎn)生，這可以通過(guò)首先擴(kuò)增包含突變的片段并且此后使用合適的限制酶限制所獲得的片段來(lái)容易地檢測(cè)一一只有包含突變序列的片段將得到限制。本發(fā)明還延伸至試劑盒，其包含一種或多種用于檢測(cè)FMN2序列中的一個(gè)或多個(gè)突變或用于以上所述的更全面的檢測(cè)和探測(cè)實(shí)驗(yàn)方案的寡核苷酸/引物。該試劑盒還可以包含有助于例如測(cè)序、進(jìn)行PCR和/或RFLP分析的其他試劑。這樣的試劑盒還可以包含使用它們來(lái)檢測(cè)FMN2基因中的一個(gè)或多個(gè)突變和任選怎樣解釋突變是否可以導(dǎo)致發(fā)展或易于發(fā)展上述任一種疾病/病癥的說(shuō)明書(shū)。相似地，試劑盒包含一種或多種結(jié)合試劑，如FMN2特異性抗體，并且任選地，可以提供如在此所述的二級(jí)結(jié)合試劑來(lái)檢測(cè)FMN2蛋白。本發(fā)明的寡核苷酸/引物還可以用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多重PCR技術(shù)中，參見(jiàn)，例如，KupersteinG,JackE和NarodSA；GenetTest(遺傳檢測(cè))·10(1):1-7(2006),使得可以鑒定FMN2序列中的突變?？梢杂糜跈z測(cè)樣品(包括FMN2剪接體、起始密碼子和/或多腺苷酸化變體)中FMN2基因和/或蛋白表達(dá)水平的其他方法包括，例如，質(zhì)譜技術(shù)。例如，通過(guò)酶消化(如使用胰蛋白酶分裂)或化學(xué)分裂，可以將分離的蛋白分裂成可預(yù)測(cè)的片段，并且可以在質(zhì)譜儀中檢測(cè)和/或測(cè)量所得肽的質(zhì)量/電荷比。通過(guò)將結(jié)果與使用參照或?qū)φ諛悠?即，包含正常表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)、野生型或非變體FMN2蛋白/基因的樣品)獲得的那些相比較，可以使用質(zhì)譜檢測(cè)到不同樣品中FMN2蛋白和/或基因表達(dá)水平的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，參照或?qū)φ諛悠房梢园没瘜W(xué)標(biāo)記物或通過(guò)結(jié)合重同位素標(biāo)記的FMN2基因和/或蛋白。關(guān)于這些類型的實(shí)驗(yàn)方案的更多信息可以在Aebersold，R.&Mann.Μ.Massspectrometry-basedproteomics(基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)).Nature(自然)422，198-207Q003)，Ong,SE等，Stableisotopelabellingbyaminoacidsincellcultures,silac,asasimpIeandaccurateapproachtoexpressionproteomics(通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物中的氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記，silac，作為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)的簡(jiǎn)單且精確的方法)，Mol.Cell.Proteomics(分子和細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué))1，376-386(2002)中找到。鑒于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)FMN2基因和/或蛋白的抑制具有細(xì)胞毒性作用(參見(jiàn)關(guān)于進(jìn)一步討論和數(shù)據(jù)的詳述)，本發(fā)明的第三個(gè)方面提供能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物，所述化合物用于治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)。第四個(gè)方面提供能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物用于制備治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的藥物的用途。本發(fā)明的第五個(gè)方面提供治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的方法，所述方法包括將能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物施用于需要其的受試者的步驟。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”應(yīng)當(dāng)理解為包括FMN2基因/蛋白表達(dá)相對(duì)于“正?！被颉敖】怠毕到y(tǒng)中產(chǎn)生的FMN2基因和/或蛋白表達(dá)水平的提高和/或降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到“正11?！被颉敖】怠毕到y(tǒng)可以是源自未患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的受試者，或由未患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的受試者提供。能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的化合物可以包括，例如，DNA或RNA寡核苷酸或這些寡核苷酸的化學(xué)修飾衍生物和/或反義寡核苷酸，其能夠與FMN2DNA或RNA特異性地雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的作為小/短干擾和/或沉默RNA的RNA分子，并且在下文中將其稱為siRNA。這些siRNA寡核苷酸可以采取天然RNA雙鏈體或已經(jīng)通過(guò)某種方式(例如，通過(guò)化學(xué)修飾)進(jìn)行了修飾以具有核酸酶抗性的雙鏈體的形式。另外地，或備選地，siRNA寡核苷酸可以采取對(duì)應(yīng)或包含在此所述的siRNA的短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)或質(zhì)粒構(gòu)建體的形式(參見(jiàn)，例如，GregoryJ.Hannon等，2003)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解在此所述類型的反義寡核苷酸可以用于調(diào)節(jié)(例如，抑制、下調(diào)或基本上消除)任何給定基因的表達(dá)。此外，基因表達(dá)或功能的調(diào)節(jié)對(duì)由受到調(diào)節(jié)的基因編碼的任何蛋白的表達(dá)和/或功能具有相似或“敲擊(knock-on)”作用。因此，可以設(shè)計(jì)本發(fā)明提供的(反義)寡核苷酸，以調(diào)節(jié)FMN2基因和/或其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)和功能。通過(guò)分析天然或野生型FMN2序列并借助如BIOPREDsi的算法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)定或通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)對(duì)于這些基因具有最佳敲低(knockdown)作用的核酸序列(參見(jiàn)，例如:http://www.biopredsi.org/start.html)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生并測(cè)試不同寡核苷酸的陣列或文庫(kù)，以測(cè)定它們是否能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸可以是針對(duì)FMN2mRNA的siRNA分子并且具有序列5’-GUAUACCAGGUCUCCUCAA-3’鑒于以上的，在此所述的反義寡核苷酸和/或siRNA分子可以用于⑴治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)，()制備用于治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的藥物或(iii)治療患有細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的受試者的方法中。作為基因表達(dá)的siRNA控制的備選方案，可以通過(guò)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)FMN2表達(dá)的特定snoRNA構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的靶向調(diào)節(jié)。例如，在PCT/GB2008/003211中描述了實(shí)現(xiàn)這一情況的方法。在其他實(shí)施方案中，能夠結(jié)合FMN2蛋白的抗體可以用在細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的治療中。阻斷或中和FMN2蛋白的功能或阻斷FMN2蛋白和其他蛋白(例如，細(xì)胞周期蛋白P21)之間的相互作用的抗體是特別有用的。用于產(chǎn)生多克隆和/或單克隆抗體(mAbs)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且在上述的"TheImmunologyHandbook(免疫學(xué)手冊(cè))”中有描述，并且可以容易地用來(lái)產(chǎn)生對(duì)FMN2蛋白或其片段特異性的抗體，其與任何天然P21競(jìng)爭(zhēng)性地競(jìng)爭(zhēng)。用于細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)治療中的其他化合物可以包括，例如，蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、碳水化合物和其他小的有機(jī)分子。例如，能夠干擾或阻止FMN2和細(xì)胞周期蛋白p21之間的相互作用的化合物可以是特別有用的。這樣的化合物可以采取完整的P21蛋白或其片段的形式。另外地，或備選地，能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物可以特異性地結(jié)合鑒定為對(duì)FMN2功能和/或FMN2蛋白和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)涉及的其他蛋白(例如p21)之間的相互作用重要的FMN2蛋白的特定區(qū)域。在一些情況中，能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物可以間接影響其他基因和/或蛋白(如，例如，p53和/或Hdm2)的表達(dá)和/或功能。其他化合物可以對(duì)其他基因和/或蛋白的表達(dá)和/或功能沒(méi)有影響。本發(fā)明的第六個(gè)方面提供鑒定或獲得調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的試劑的方法，所述方法包括將FMN2基因或蛋白與測(cè)試試劑接觸并檢測(cè)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的任何調(diào)節(jié)的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以在系統(tǒng)(如，例如基于細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞的系統(tǒng))中進(jìn)行如本發(fā)明的第六個(gè)方面中所述的方法，這些系統(tǒng)進(jìn)行了改變以包括FMN2基因和/或表達(dá)FMN2蛋白。例如，可以用包含F(xiàn)MN2基因的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可以采用載體(例如，本領(lǐng)域公知的質(zhì)?；虮磉_(dá)盒)的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將獲自上述方法的結(jié)果與獲自對(duì)照方法的那些相比較，在對(duì)照方法中，已經(jīng)將FMN2基因和/或蛋白不與測(cè)試試劑接觸。以這種方式，可以測(cè)定所述試劑是否能夠調(diào)節(jié)FMN2基因或蛋白的表達(dá)。在FMN2基因或蛋白表達(dá)的水平低于或高于對(duì)照方法中檢測(cè)到的表達(dá)水平的情況中，測(cè)試試劑可以用作FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)齊U。在表達(dá)水平與對(duì)照方法中觀察到的相同的情況中，測(cè)試試劑很可能不能夠調(diào)節(jié)FMN2基因或蛋白的表達(dá)。合適的測(cè)試試劑可以采用核酸(例如，上述的反義寡核苷酸)、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、抗體(及其片段)、碳水化合物和其他小的有機(jī)分子的形式。在第七個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含上述任一種化合物(例如，寡核苷酸、抗體、小的有機(jī)化合物、P21蛋白或其片段)和/或通過(guò)本發(fā)明第六個(gè)方面提供的方法鑒定的并且能夠調(diào)節(jié)FMN2基因/蛋白表達(dá)或功能的任一種試劑，結(jié)合藥物學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。這樣的組合物可以在例如細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)(如上所述的那些)的治療中找到應(yīng)用。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的藥物組合物配制成無(wú)菌藥物組合物。合適的賦形劑、載體或稀釋劑可以包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、磷脂酰膽堿、血清蛋白(如血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(如，磷酸鹽)、甘油、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水鹽或電解質(zhì)，如，硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)硅石、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙烯糖原(polyethyleneglycon)、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂等，或其組合。所述藥物制劑可以例如配制成適于口服、腸道外或局部給藥的形式。為局部給藥配制的藥物組合物可以呈現(xiàn)為膏劑、在水性或非水性液體中的溶液或混懸液、或水包油型液體乳劑。如所述的，本發(fā)明是基于如下觀察FMN2過(guò)表達(dá)在mRNA水平受到ARF誘導(dǎo)的上調(diào)。因此，F(xiàn)MN2基因具有ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子，其自身可以在基因治療領(lǐng)域中找到應(yīng)用。因此，本發(fā)明還延伸至預(yù)防性地或治療性地治療上述任一種疾病/病癥的方法，所述方法通過(guò)將包含處在ARF應(yīng)答性FMN2啟動(dòng)子控制下的基因序列或其片段的DNA構(gòu)建體施用于患有或傾向于發(fā)展上述任一種疾病的患者，其中所述基因序列或其片段能夠表達(dá)在所述疾病和/或病癥的治療中可能有用的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)拷貝，由此所述蛋白質(zhì)的所述一個(gè)或多個(gè)拷貝的表達(dá)治療或改善了所述疾病/病癥。通常，將在細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的治療中可能有用的蛋白質(zhì)以包含處在合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制下的所述基因序列的重組分子的形式施用于受試者，從而在施用于受試者時(shí)，可能有用的蛋白質(zhì)得到表達(dá)。將認(rèn)識(shí)到基因序列或片段可以處于合適的啟動(dòng)子的控制下，如組成型和/或可控制啟動(dòng)子。方便的啟動(dòng)子包括天然FMN2啟動(dòng)子下文中稱為ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子。ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子位于chrl:238，139，341-238，321，875內(nèi)(182468個(gè)堿基)。本發(fā)明人進(jìn)一步表征了啟動(dòng)子區(qū)域，如在實(shí)施例部分中所述。在這點(diǎn)上，F(xiàn)MN2起始密碼子上游約2Kb的區(qū)域已經(jīng)顯示出具有啟動(dòng)子和成為ARF應(yīng)答性的能力。待表達(dá)的蛋白可以是細(xì)胞毒性劑，如胞嘧啶脫氨酶和單純皰疹病毒胸苷激酶等(CestmirAltaner,2008)，其僅作為ARF存在的結(jié)果才表達(dá)，例如，在癌細(xì)胞中。這還可以預(yù)防性地用于施用給可能傾向于發(fā)展上述疾病/病癥的受試者，使得只在發(fā)生ARF激活時(shí)才產(chǎn)生表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供一種用于治療中的重組分子，其包含處在FMN2ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子控制下的編碼蛋白或其片段的基因序列。重組分子可以是質(zhì)粒、噬菌?；虿《据d體的形式。此外，可以生產(chǎn)重組表達(dá)的、或化學(xué)合成的FMN2蛋白，或其功能上重要的片段，并用作與FMN2表達(dá)降低相關(guān)的細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)、或受試者表達(dá)突變或異常形式的FMN2時(shí)的治療或預(yù)防措施。許多用于基因治療中的不同病毒和非病毒載體及其遞送方法是已知的，如腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、脂質(zhì)體、DNA疫苗接種寸。例如，在失調(diào)(如例如細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)，特別是涉及ARF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào))的治療中可能有用的基因，可以與本文所述的FMN2ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子連接。ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子可以借助改造的包含F(xiàn)MN2ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子序列的載體而連接到可能有用的基因上。合適的載體可以包括，例如，質(zhì)粒或核酸盒。然后可以使用載體(可能作為藥物)來(lái)治療上述失調(diào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到通過(guò)基因療法治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的任一種方法可以包括將基因/FMN2ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子復(fù)合物施用于需要其的受試者的步驟，使得基因在FMN2ARF應(yīng)答性啟動(dòng)子的控制下在受試者中得到表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在待治療的失調(diào)與ARF腫瘤抑制劑的誘導(dǎo)相關(guān)的情況中，在此所述的方法和藥物特別有用。還將認(rèn)識(shí)到在此所述的藥物和方法可以涉及將核酸構(gòu)建體直接施用于患病組織(例如，通過(guò)注射到腫瘤中)或通過(guò)上述任一種其他途徑來(lái)給藥。ARF應(yīng)答性FMN2啟動(dòng)子可以包含與備選啟動(dòng)子(如，CMV啟動(dòng)子等)融合的ARF應(yīng)答性元件。詳述現(xiàn)在將參照以下附圖來(lái)詳細(xì)地描述本發(fā)明，所述附圖顯示圖1.ARF腫瘤抑制劑信號(hào)傳導(dǎo)的示意圖。ARF腫瘤抑制劑是對(duì)抗癌基因激活的細(xì)胞防御的重要組分。高百分比的白血病(leukaemia)和黑素瘤(melanoma)患者具有ARF突變。ARF敲除小鼠高頻率地發(fā)生腫瘤。ARF通過(guò)抑制HDM2(其是p53的E3泛蛋白連接酶)來(lái)穩(wěn)定蛋白，從而激活P53。然而，對(duì)p53和ARF敲除小鼠的研究顯示了還存在p53不依賴性的ARF腫瘤抑制劑途徑。圖2a.編碼FMN2的N-端區(qū)域的序列。在外顯子1中存在2個(gè)可能的起始密碼子并且以粗體顯示；圖2b.編碼FMN2的C-端區(qū)域的序列。以粗體顯示siRNA靶向的序列。圖3.FMN2的完整cDNA序列；大寫(xiě)字母顯示FMN2蛋白編碼區(qū)(圖13中的蛋白序列)。小寫(xiě)字母顯示了來(lái)自人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的3’UTR。用下劃線顯示通過(guò)人基因組計(jì)劃預(yù)測(cè)的起始密碼子。用灰色陰影顯示了該研究發(fā)現(xiàn)的新起始密碼子和編碼序列。圖4.FMN2序列的示意圖。FMN2基因位置(從第1個(gè)ATG至TGA)。(ATG)chrl238，321，604-238，704，077(TGA)。序列1從外顯子1的第一個(gè)ATG至外顯子1和外顯子2連接處，使用引物FMN2ExlF2和FMN2Exl_2Rl。序列2從外顯子1的第二個(gè)ATG至外顯子1和外顯子2連接處，使用引物FMN2ExlF3和FMN2Exl-2Rl。序列3從外顯子1和外顯子2連接處至外顯子4結(jié)束，使用引物FMN2Exl-2Fl和FMN2Ex4_5Rl(來(lái)自報(bào)道的起始密碼子)。序列4完整的外顯子5，使用引物FMN2Ex5Fl和FMN2Ex5Rl(來(lái)自報(bào)道的起始密碼子)。序列5從外顯子13開(kāi)始至外顯子18，包括終止密碼子，使用引物FMN2Exl3Fl和FMN2Exl8Rl(來(lái)自報(bào)道的起始密碼子)。箭頭表示我們通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)的位置。圖5.核仁蛋白動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。a.三個(gè)細(xì)胞群中的蛋白質(zhì)組通過(guò)摻入精氨酸的穩(wěn)定同位素衍生物來(lái)編碼(SILAC方法)。用ArgO、Arg6和ArglO通過(guò)代謝來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，持續(xù)至少五次細(xì)胞倍增，然后用IPTG各自處理0、4和8小時(shí)或0、16和M小時(shí)，以誘導(dǎo)pl4ARF。將細(xì)胞混合、純化核仁并通過(guò)質(zhì)譜分析。使用公共零點(diǎn)，將分析重復(fù)三次。b.C.pl4ARF肽的質(zhì)譜，表示遞增量的P14ARF被召集到核仁中。d.pl4ARF的動(dòng)力學(xué)特征。Y軸是pl4ARF的標(biāo)準(zhǔn)化倍數(shù)變化的單位。圖6.測(cè)量核仁蛋白動(dòng)力學(xué)的不同方法的比較。a.在強(qiáng)力霉素(doxycyclin)誘導(dǎo)(5ygπιΓ1)過(guò)程中表達(dá)GFP-ARF的活U20S細(xì)胞，并且成像持續(xù)M小時(shí)。核仁內(nèi)的變化。將GFP熒光信號(hào)(藍(lán)色曲線)與分離的核仁中通過(guò)SILAC檢測(cè)到的誘導(dǎo)的pl4ARF的水平變化相比較。誤差棒是來(lái)自每個(gè)情況中五個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞的熒光測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。b.U20S細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的核仁蛋白和GFP-ARF的表達(dá)模式。圖7.核仁蛋白的動(dòng)力學(xué)特征。a.從第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)到最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示出變化的所有蛋白。b.使用倍數(shù)變化數(shù)據(jù)的3500個(gè)蛋白的分級(jí)群聚。c.在p53陰性E6細(xì)胞中誘導(dǎo)后4小時(shí)，通過(guò)時(shí)間點(diǎn)顯示了前50個(gè)顯示出最大百分比變化的蛋白的時(shí)間過(guò)程變化。圖8.FMN2的表達(dá)模式。固定NARF2(A-H)、E6(L-P)細(xì)胞a.和U20S(A-H)、Hela(L-P)細(xì)胞b.，并且對(duì)DNA(藍(lán)色)、和抗-FMN2抗體或抗-pl4ARF抗體(綠色)，使用DAPI染色。用或不用IPTG將細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)，以誘導(dǎo)外源P14ARF表達(dá)。圖9.ARF激活過(guò)程中的微陣列分析。用IPTG將NARF2細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)，以誘導(dǎo)外源ARF表達(dá)。我們從我們的最終數(shù)據(jù)集中選擇FMN2、HDM2、p21、pl4ARF、環(huán)形體蛋白、B23、核仁蛋白(Nucleoln)、ATM/ATR和核仁纖維蛋白(Fibrillarin)，并顯示為log2比例。圖10.用于FMN2的siRNA方法。用對(duì)照、DNA-PK或FMN2siRNA處理NARF2細(xì)胞，并在用或未用M小時(shí)IPTG誘導(dǎo)的前提下，收集48小時(shí)。圖11·a-b.FMN2耗盡的作用。c.IPTG的作用禾口d.ARF誘導(dǎo)和UV對(duì)FMN2誘導(dǎo)。e.ARF誘導(dǎo)以及對(duì)FMN2與p53締合的影響。圖12.a.FMN2耗盡對(duì)p21表達(dá)的作用。b.Wdc9耗盡對(duì)ARF的FMN2誘導(dǎo)的作用。c-e.用于FMN2的siRNA方法。圖12c顯示了FMN2通過(guò)阻止蛋白質(zhì)組途徑穩(wěn)定p21。圖13顯示了FMN2的蛋白序列和用于抗體生產(chǎn)的抗原區(qū)。顯示了人FMN2氨基酸序列。在該研究中鑒定的新的其他序列顯示為灰色(la.a.-143a.a.)?？乖蛄酗@示為粗體(請(qǐng)參閱方法和圖15A)。商購(gòu)的FMN2抗體(Abnova)的抗原區(qū)也顯示為灰色(也請(qǐng)參閱方法)。圖14顯示了Western印跡的結(jié)果，顯示了用關(guān)于PA^γ和Skp2的siRNA拯救FMN2耗盡。圖15A顯示了FMN2蛋白和結(jié)構(gòu)域的示意圖。示意圖顯示了用于產(chǎn)生單克隆抗體(m22Ab)和多克隆抗體(p31Ab)的蛋白區(qū)域。示意圖還顯示了由其產(chǎn)生了兩個(gè)截短的綴合的多肽mCherry-FMN2Ex6_2和mCherryFMN2Ex13-18的蛋白區(qū)域。圖15B顯示了兩個(gè)抗體p3IAb和m22Ab的共同定位分析；圖15C顯示了p31Ab對(duì)以mCherryF麗2Ex13-18過(guò)表達(dá)的多肽的特異性。圖16A顯示了使用FMN2抗體p31Ab和m22Ab的免疫沉淀(IP)分析的結(jié)果。圖16B和C顯示了進(jìn)一步的IP分析；圖17顯示了FMN2和p21(CIPl)的共同定位；圖18A和18B顯示了檢測(cè)FMN2的啟動(dòng)子的研究的結(jié)果；圖18C顯示了FMN2的啟動(dòng)子和ARF應(yīng)答性增強(qiáng)子元件的示意圖；和圖19顯示了肺原代細(xì)胞和肺癌細(xì)胞之間的FMN2表達(dá)分析的結(jié)果；和圖20顯示了pl4ARF-FMN2途徑的模型。材料和方法穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的核仁蛋白的分離在ARF誘導(dǎo)之前，將細(xì)胞在L-精氨酸、L-精氨酸13C614N4-或L-精氨酸13Cf^N4-標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至少五次細(xì)胞分裂。為了誘導(dǎo)外源P14ARF，將ImM終濃度的IPTG加入所有細(xì)胞中并分別培養(yǎng)4、8、16和對(duì)小時(shí)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)生總共五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用未處理的ArgO細(xì)胞作為公共零時(shí)間點(diǎn)。按照之前所述的(http://WWW.lamondlab.com/f5nucleolarprotocol.htm)，從NARF2和E6分離核仁。將分離的核仁蛋白在NuPAGE4-12%Bis-Tris凝膠上進(jìn)行分離，并切成12片。從凝膠片中提取由凝膠內(nèi)消化(in-geldigestion)得到的肽，脫鹽并在反相C18尖端(reverse-phaseC18tip)上濃縮，并洗脫至96-孔平板中，用于自動(dòng)化質(zhì)譜分析。質(zhì)譜和數(shù)據(jù)分析使用LTQObitrap(ABI)，通過(guò)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜的液相色譜(AgilentHPllOO)(LCMS/MS)，進(jìn)行了質(zhì)譜分析。對(duì)于LTQObitrap，收集四種最強(qiáng)離子的先驅(qū)離子光譜(m/z350-1，500)和產(chǎn)物離子光譜(m/z70-1,500)1秒。以數(shù)據(jù)依賴性模式運(yùn)行LTQ-FT-ICR儀器，以在ICR池中獲取高分辨率的先驅(qū)離子光譜(m/z300-1,500,RV425，000，并且離子累積至10，000，000的目標(biāo)值)。通過(guò)選定的離子監(jiān)控(SIM)掃描按序分離三種最強(qiáng)的離子，用于精確的質(zhì)量測(cè)量(IODa質(zhì)量窗口，R7450，000，和50，000的目標(biāo)累積值)。同時(shí)使用27%的標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量設(shè)定和2，000的目標(biāo)值，將離子在線性離子捕獲中分裂。對(duì)于使用Mascot程序(MatrixScience)和LTQ-FT-ICR數(shù)據(jù)的國(guó)際蛋白指標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白鑒定，需要嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)每個(gè)蛋白至少兩個(gè)匹配的肽，3p.p.m.內(nèi)的質(zhì)量精確性(平均絕對(duì)肽質(zhì)量精確性為0.7p.p.m.)，對(duì)于單獨(dú)的肽高于20的Mascot評(píng)分和高于5的δ評(píng)分。使用顛倒數(shù)據(jù)庫(kù)沈的實(shí)驗(yàn)表明在這些條件下，鑒定了具有兩個(gè)匹配肽的蛋白，具有低于0.的假陽(yáng)性率。每種含精氨酸肽的蛋白比率計(jì)算為每次單掃描質(zhì)譜的Arg6/ArgO和ArglO/ArgO的峰面積比。對(duì)每個(gè)蛋白測(cè)序的所有含精氨酸肽，進(jìn)行了肽比率的平均數(shù)，并且相對(duì)于零標(biāo)準(zhǔn)化(x-1)。對(duì)于小于1的比率，計(jì)算了標(biāo)準(zhǔn)化的反比[1-(1/X)]。使用MS-Quant(http://msquant.sourceforge.net/)(一種內(nèi)部研發(fā)的軟件程序)來(lái)評(píng)價(jià)肽鑒定和肽豐度比率中的確定性?；罴?xì)胞成像將GFP-ARF細(xì)胞在Willco薄玻璃底微孔培養(yǎng)皿(Intracel)中培養(yǎng)，封固于DeltavisionSpectris顯微鏡(AppliedPrecision)上，顯微鏡安裝在透明的環(huán)境室(SolentScientific)中。在60X(NA1.4)PlanApochromat物鏡下將細(xì)胞成像。對(duì)于每個(gè)視野，記錄了隔開(kāi)0.5mm的十二個(gè)光學(xué)切面，并且每個(gè)暴露持續(xù)0.05秒。記錄第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，加入終濃度為5μgml-1的強(qiáng)力霉素，并將細(xì)胞成像2-3小時(shí)(SoftWoRx成像處理軟件，AppliedPrecision)。手工描繪出核仁或核(參見(jiàn)圖6)，并且從兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中測(cè)量了五個(gè)核仁/核。siRNA通過(guò)MWG合成siRNA雙鏈體寡核苷酸，并且按照制造商的說(shuō)明使用Interferin(Polyplus)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，在轉(zhuǎn)染前那天，將細(xì)胞以2XIO5細(xì)胞/孔的濃度涂布于6孔平板中。第二天，用終體積為2.2ml的新鮮培養(yǎng)基中的終濃度為5nM的siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在收集之前，將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時(shí)。除非另外指出，加入IPTG持續(xù)24小時(shí)。在此描述了siRNA序列(對(duì)照CAGUCGCGUUUGCGACUGG,FMN2-GUAUACCAGGUCUCCUCAA)。MG132購(gòu)自MerckChemicals,并且以50μM的終濃度來(lái)使用。細(xì)胞NARF2和NARF2-E6細(xì)胞系由GordonPeters博士提供(CancerResearchUKLondonResearchhstitute(癌癥研究UK倫敦研究所))并且之前已經(jīng)描述過(guò)(Stott等，1998；Brookes等，2002；Rocha等，2003)。NARF2細(xì)胞，是含有異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)-可誘導(dǎo)pl4AKF基因的人骨肉瘤U20S細(xì)胞的衍生物，之前已經(jīng)描述過(guò)(Stott等，1998)。NARF2-E6細(xì)胞是NARF2細(xì)胞的衍生物，但另外含有組成型表達(dá)的人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6蛋白。RNA制備和標(biāo)記根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用DNaseI處理，使用RNeasy迷你試劑盒(QUIAGEN)分離了總NARF2細(xì)胞RNA。用單色的基于微陣列的基因表達(dá)系統(tǒng)(One-ColorMicroarray-BasedExpressionsystem)(AgilentTechnologies)來(lái)標(biāo)記總RNA0微陣列實(shí)驗(yàn)和分析在德國(guó)漢堡的EMBL基因組核心實(shí)驗(yàn)室(EMBL’sGenomicsCoreFacility)進(jìn)行了所有微陣列實(shí)驗(yàn)。通過(guò)NanoDropND-1000UV-VIS分光光度計(jì)分析了標(biāo)記的cDNA質(zhì)量。將標(biāo)記的cDNA在全人基因組寡DNA微陣列(WholeHumanGenomeOligoDNAmicroarray)(人WG4X44k=AgilentTechnologies)上進(jìn)行雜交。根據(jù)制造商的說(shuō)明(AgilentTechnology)，通過(guò)GeneSpringGX軟件分析了掃描的數(shù)據(jù)。結(jié)果我們使用基于質(zhì)譜的細(xì)胞器蛋白組學(xué)和穩(wěn)定的同位素標(biāo)記(S卩，SILAC(圖5a)(參考文獻(xiàn)4-6))分析了ARF腫瘤抑制劑途徑的核仁蛋白動(dòng)力學(xué)。我們進(jìn)行了來(lái)自人ARF可誘導(dǎo)模型細(xì)胞系(稱為NARF2)的核仁蛋白組的定量分析，并且與另一種ARF可誘導(dǎo)的并且是P53陰性的細(xì)胞系(稱為E6(參考文獻(xiàn)1-)進(jìn)行了比較。NARF2是從U20S人骨肉瘤細(xì)胞建立的穩(wěn)定細(xì)胞系。通過(guò)ARF基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，阻止了U20S細(xì)胞中的內(nèi)源性ARF表達(dá)。然而，這些細(xì)胞還含有野生型ARF基因的外源性的可誘導(dǎo)拷貝，可以通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)其在NARF2細(xì)胞中的表達(dá)。E6細(xì)胞系是從NARF2建立的并且表達(dá)滅活p53的人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6蛋白。我們檢測(cè)了來(lái)自ARF蛋白的肽(圖5b)并且比較了NARF2和E6細(xì)胞系中的動(dòng)態(tài)時(shí)間過(guò)程變化(圖5c)。結(jié)果顯示出在IPTG誘導(dǎo)過(guò)程中，兩個(gè)細(xì)胞系中的ARF蛋白水平都顯著升高，與我們預(yù)期的一樣。接著，我們使用來(lái)自熒光顯微鏡活細(xì)胞圖像的信號(hào)強(qiáng)度比較了質(zhì)譜數(shù)據(jù)(圖6)。數(shù)據(jù)集表明了ARF的倍數(shù)變化數(shù)據(jù)與來(lái)自我們的顯微鏡的信號(hào)強(qiáng)度相匹配(圖6a)。我們選擇了一些其他蛋白來(lái)與我們的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并且它們的行為與我們檢測(cè)到的倍數(shù)變化數(shù)據(jù)相匹配(圖6b)。該數(shù)據(jù)記錄了ARF誘導(dǎo)過(guò)程中數(shù)千種核仁蛋白水平的時(shí)間過(guò)程變化(圖7a&b)。例如，成蛋白-2(FMN》(參考文獻(xiàn)7&8)(其在胞質(zhì)分裂中具有作用并且來(lái)自我們?cè)诎┌Y中的數(shù)據(jù))在P53陽(yáng)性和陰性細(xì)胞系的ARF誘導(dǎo)過(guò)程中都有顯著提高(圖7b&c)。該結(jié)果表明成蛋白-2可以是ARF蛋白的新配偶體或可以介導(dǎo)ARF-依賴性下游機(jī)制。我們進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)來(lái)證實(shí)這些細(xì)胞系中用或不用IPTG誘導(dǎo)的FMN2表達(dá)(圖8)。盡管在NARF2和E6細(xì)胞系中，在不用IPTG的情況下，F(xiàn)MN2以低水平表達(dá)，在IPTG處理后M小時(shí)，表達(dá)水平提高。我們?cè)赨20S細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到這種變化，表明FMN2誘導(dǎo)不是IPTG處理本身的結(jié)果。我們還檢查了Hela細(xì)胞中的FMN2表達(dá)水平，因?yàn)樵摷?xì)胞系具有內(nèi)源性ARF表達(dá)。我們檢測(cè)到FMN2表達(dá)比U20S細(xì)胞中的多，所述U20S細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源性ARF。這些數(shù)據(jù)表明ARF和FMN2表達(dá)之間的正相關(guān)性。我們還進(jìn)行了微陣列分析，以測(cè)定這些基因的RNA水平(圖9)。在外源性ARF誘導(dǎo)后，F(xiàn)MN2RNA水平顯示出10倍或更多的高比例增加。該結(jié)果強(qiáng)調(diào)了FMN2mRNA表達(dá)受到ARF的控制，并且因此ARF直接或間接地影響FMN2啟動(dòng)子的表達(dá)。為了分析FMN2蛋白在細(xì)胞中的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了五種siRNA來(lái)抑制FMN2表達(dá)。其中之一成功地抑制了FMN2表達(dá)(圖10)。我們沒(méi)有觀察到對(duì)p53或Hdm2的任何作用，Hdm2是E3泛蛋白連接酶，但細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21得到嚴(yán)重降低(圖10a)。其他實(shí)驗(yàn)表明了FMN2敲低沒(méi)有影響puma水平，但降低了p21。相反，DNA-PK的siRNA敲低引起了puma和p21二者水平的降低(圖IOb)。因此，F(xiàn)MN2顯示出特異性，并且在癌基因激活過(guò)程中穩(wěn)定了P21蛋白水平和/或促進(jìn)了p21表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)是可重復(fù)的并且顯示出FMN2表達(dá)穩(wěn)定了P21或增強(qiáng)了其表達(dá)，或兩者(圖IOc)。其他材料和方法siRNA實(shí)驗(yàn)通過(guò)MWG合成了siRNA雙鏈體寡核糖核苷酸并且按照制造商的說(shuō)明使用Interfection(Polyplus)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，在轉(zhuǎn)染前那天，將細(xì)胞以2XIO5細(xì)胞/孔的濃度涂布于6孔平板中。第二天，用終體積為2.2ml的新鮮培養(yǎng)基中的終濃度為5nM的SiRNA寡核糖核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在收集之前，將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時(shí)。除非另外指出，加入IPTG持續(xù)24小時(shí)。在此描述了siRNA序列(對(duì)照5，-CAGUCGC⑶UUGCGACUGG-3，，F(xiàn)MN2-5'-GUAUACCAGGUCUCCUCAA-3',PA28γ-5'-GAAUCAAUAUGUCACUCUA-3‘,Skp-25，-ACUCAAGUCCAGCCAUAAG-3，)。抗體生產(chǎn)通過(guò)DundeeCellProducts(Dundee細(xì)胞產(chǎn)物)(Dundee，UK)生產(chǎn)了FMN2小鼠單克隆和兔多克隆抗體。合成了用于小鼠腹水雜交瘤克隆的TC上清液的寡肽(CTEHVRAPPAPSRSR,MHSIRTVEIKVPEIEEC,KDSQALQTGELDSAHS)，以建立FMN2_m22Ab(圖15A)，并且合成了寡肽(CRQKKGKSLYKIKPR,CKPRHDSGIKAKISMKT)，以建立FMN2_p21Ab。免疫沉淀按照之前所述的(Trinkle-Mulcahy等，2006)，進(jìn)行免疫沉淀。從NARF2穩(wěn)定細(xì)胞系制備核裂解物。將純化的核重懸浮于RIPA緩沖液中，以溶解蛋白質(zhì)。使用抗-FMN2-m22Ab單克隆抗體和抗-FMN2-p31Ab，將FMN2蛋白免疫沉淀(圖15)。將樣品分成兩份，并且從每份核裂解物的一半中分離出輸入anput)樣品。顯微鏡檢查使用DeltaVisionSpectris熒光顯微鏡(Applied!decision)記錄了所有細(xì)胞圖像。使用60X(NA1.4)PlanApochromat物鏡，將細(xì)胞成像。對(duì)于每個(gè)視野和每次曝光，記錄了0.5μm隔開(kāi)的十二個(gè)光學(xué)切面(SoftWoRx成像處理軟件，AppliedPrecision)。結(jié)果圖14顯示用關(guān)于PA^γ和Skp2拯救FMN2耗盡。使用關(guān)于FMN2(對(duì)于siRNA靶標(biāo)序列的位置，參見(jiàn)圖15)、PA28y、Skp2和對(duì)照(Control)的siRNA,用/不用pl4ARF誘導(dǎo)(+/空白)，在NARF2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)內(nèi)源性FMN2、Skp2、PA^G、p21、pl4ARF和肌動(dòng)蛋白的蛋白水平。對(duì)每個(gè)泳道，上樣等量的NARF2提取物，并且通過(guò)SDAPAGE分離蛋白，進(jìn)行電印跡，并用單克隆抗-PA^γ和多克隆抗-FMN2、抗-Skp2、抗-p21、抗-pl4ARF進(jìn)行探測(cè)，使用抗-肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。FMN2耗盡后觀察到的p21失活通過(guò)PA^ysiRNA/Skp2siRNA的共轉(zhuǎn)染得到了部分拯救。這些數(shù)據(jù)表明FMN2耗盡使p21失活是通過(guò)泛蛋白依賴性降解途徑(Skp2)和泛蛋白不依賴性途徑(ΡΑ^γ)引起的(模型顯示于圖20中)。FMN2特異性抗體的建立。a.通過(guò)注射合成的FMN2寡肽來(lái)建立小鼠單克隆抗-FMN2抗體(m22Ab)和兔多克隆抗-FMN2抗體(p31Ab)(參見(jiàn)圖15A)。為了證實(shí)抗體特異性，將FMN2部分cDNA序列與mCherry紅色熒光蛋白cDNA融合(mCherry-FMN2Ex6-12和mCherry-FMN2Exl3-18)。圖15A還顯示了FMN2蛋白結(jié)構(gòu)，并且指出了用于FMN2敲低的siRNA的位置，用作產(chǎn)生抗-FMN2抗體的抗原的肽序列和基序。2結(jié)構(gòu)域幾乎完全是α螺旋并且可以細(xì)分成具有任意分界線的五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，。這些包括N-端“套索(lasso)”、“接頭(Linker)”區(qū)段、球狀“凸起”亞結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋區(qū)、羧基端“標(biāo)桿(post)2”亞結(jié)構(gòu)域。通過(guò)“套索”與配偶體2的“標(biāo)桿”的獨(dú)特相互作用介導(dǎo)了二聚體形成，呈現(xiàn)出閉環(huán)結(jié)構(gòu)。已經(jīng)提出了DEP結(jié)構(gòu)域可以在將含DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白靶向特定亞細(xì)胞膜位點(diǎn)、甚至可能靶向特定的G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑起選擇作用。圖15B顯示了FMN2m22Ab_p31Ab的共同定位分析。在pl4ARF誘導(dǎo)后，將NARF2細(xì)胞固定，并用小鼠單克隆抗-FMN2抗體(m22Ab)和兔多克隆FMN2抗體(p31Ab)進(jìn)行染色。圖15C顯示mCherry-FMN2部分質(zhì)粒的表達(dá)結(jié)果。用pmCherry-FMN2Ex6_12和pmCHerry-FMN2Exl3-18轉(zhuǎn)染后，將Hela細(xì)胞固定并使用多克隆抗-FMN2抗體(p31Ab)進(jìn)行染色。標(biāo)線為ΙΟμπι。箭頭表示受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。如可以看到的，包括由FMN2-p31Ab識(shí)別的抗原序列的pmCHerry-FMN2Exl3-18的瞬時(shí)表達(dá)受到FMN2_p31Ab的強(qiáng)烈染色。pmCHerry-FMN2Ex6-12瞬時(shí)表達(dá)后，該相同的FMN2_p31Ab抗體沒(méi)有使細(xì)胞染色，pmCHerry-FMN2Ex6-12沒(méi)有包括用作產(chǎn)生抗-FMN2抗體的抗原的肽序列(箭頭)。圖16顯示使用FMN2特異性抗體的免疫沉淀(IP)分析的結(jié)果。按照之前所示(Trinkle-Mulcahy等，2006)，進(jìn)行免疫沉淀。在pl4ARF誘導(dǎo)后分離了NARF2細(xì)胞核裂解物，并將等量裂解物與FMN2多克隆抗體(FMN2p31Ab)或單克隆抗體(FMNan22Ab)混合。還通過(guò)檢查作為核標(biāo)記物的B23蛋白和作為細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記的微管蛋白來(lái)證實(shí)了級(jí)分。對(duì)于每個(gè)泳道，上樣等量的IP提取物，并通過(guò)SDSPAGE分離蛋白，進(jìn)行電印跡并用抗-FMN2抗體進(jìn)行探測(cè)，例如，使用單克隆抗-FMN2的IP和使用多克隆抗-FMN2的印跡(泳道M)(參見(jiàn)圖15A)。如可以看到的，IP后與輸入泳道(未用抗體的裂解物)相比，顯示了FMN2的明顯分離。在FMN2IP中也檢測(cè)到了p21。分離NARF2細(xì)胞核裂解物，使用/不用pl4ARF誘導(dǎo)，并且將等量的裂解物與FMN2多克隆抗體(FMN2p31Ab)混合。對(duì)于每個(gè)泳道，上樣等量的總核裂解物(輸入)、沉淀的樣品(IP)和流出的樣品(FT)，并且通過(guò)SDSPAGE分離蛋白，進(jìn)行電印跡并用包括抗-FMN2m22Ab、抗-PA^γ、抗_Skp2以及作為輸入和FT上樣對(duì)照的抗-B23的抗體進(jìn)行探測(cè)(參見(jiàn)圖16C).將NARF2細(xì)胞固定，并用兔抗-FMN2p31Ab和抗-p21抗體染色，用/不用pl4ARF誘導(dǎo)。圖17顯示了大部分FMN2和p21信號(hào)共同位于核中。該結(jié)果與圖15中所示的IP結(jié)果相一致。構(gòu)建了第一個(gè)ATG(+1)上游的兩個(gè)FMN2啟動(dòng)子缺失質(zhì)粒(圖18A左圖)。用質(zhì)粒mCherry-FMN2p-2k、mCherry-FMN2p-lk或不含啟動(dòng)子的mCherry轉(zhuǎn)染后，將NARF2細(xì)胞固定，并用抗_pl4pARF抗體染色，用/不用P14ARF誘導(dǎo)。如可以看到的，具有FMN2基因上游序列的約2000個(gè)堿基的mCherry-FMN2pjk在pl4ARF誘導(dǎo)的細(xì)胞中得到上調(diào)。然而，只具有FMN2基因上游序列的1000個(gè)堿基的mCherry-FMN2p-lk沒(méi)有顯示出應(yīng)答pl4ARF誘導(dǎo)的上調(diào)(箭頭)(參見(jiàn)圖18A右圖)。使用NARF2-E6細(xì)胞(p53陰性細(xì)胞)進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)圖18B)。這顯示了與NARF2細(xì)胞觀察到的相同結(jié)果。這些結(jié)果表明FMN2基因上游的FMN2啟動(dòng)子/調(diào)控區(qū)(約2000個(gè)堿基)包括一個(gè)或多個(gè)賦予p53不依賴性的ARF誘導(dǎo)的元件。最后，圖18C顯示了FMN2啟動(dòng)子分析的概述。還表征了FMN2啟動(dòng)子區(qū)域，并且確定了ARF可誘導(dǎo)元件(染色體1，+鏈大約從238319604至238321603，基因組瀏覽器)。將人肺原代成纖維細(xì)胞(ATCC-CCL-211)和人肺腺癌細(xì)胞(ATCC-CRL-5868)固定，并用抗-FMN2-p31Ab、抗-FMN2-m22Ab、抗-p21和抗-pl4ARF抗體進(jìn)行染色。圖19顯示了與人肺原代細(xì)胞相比，人肺癌細(xì)胞中的FMN2基因得到上調(diào)，正如我們?cè)谌鏤20S、Hela,NARF2和NARF2-E6細(xì)胞系的組織培養(yǎng)物中所觀察到的，即，癌基因激活后增強(qiáng)的FMN2表達(dá)(還請(qǐng)參閱圖8)。這些數(shù)據(jù)顯示出升高的FMN2表達(dá)可以出現(xiàn)在多種形式的癌癥中以及模式組織培養(yǎng)系統(tǒng)中。圖20。pl4ARF-FMN2途徑的模型。我們發(fā)現(xiàn)了新的p53不依賴性的腫瘤抑制劑途徑。通過(guò)癌基因激活誘導(dǎo)的P14ARF上調(diào)了不依賴于p53的FMN2基因。FMN2直接或間接地抑制了p21降解，包括泛蛋白依賴性和不依賴性途徑。參考文獻(xiàn)1.RochaS.禾口PerkinsN.D.,ARFtheintegratorJinkingNF—kappaB，p53andcheckpointkinases(ARF,整合劑連接NF-κB、p53和檢查點(diǎn)激酶).CellCycle(細(xì)胞周期),6,756-9(2005).2.RochaS.,GarrettΜ.D.,CampbellK.J.,SchummK.,PerkinsN.D.,RegulationofNF-kappaBandp53throughactivationofATRandChklbytheARFtumoursuppressor(通過(guò)ARF腫瘤抑制劑激活A(yù)TR和Chkl來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB和p53).EMBOJ.(歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志),24(6)，1157-69(2005).3.RochaS.,CampbellK.J.,PerkinsN.D.,p53-andMdm2_independentrepressionofNF-kappaBtransactivationbytheARFtumorsuppressor(通過(guò)ARF腫瘤抑制劑對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)移活化的ρ53_和Mdm2_不依賴性抑制)，MolCell(分子細(xì)胞)，1，15-25(2003).4.Andersen,J.S.等，Directedproteomicanalysisofthehumannucleolus(人核仁的定向蛋白質(zhì)組學(xué)分析)，Curr.Biol(當(dāng)代生物學(xué))，12，1-11(2002).5.Andersen,J.S.等，Nucleolarproteomedynamics(核仁蛋白組學(xué)動(dòng)力學(xué))，Nature(自然)，433，77-83(2005).6.Lam,Y.W.,Lamond,A.I.,Mann,M.J.,Andersen,S.AnalysisofnucIeolarproteindynamicsrevealsthenucleardegradationofribosomalproteins(核仁蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析揭示了核糖體蛋白的核降解)，Curr.Biol.(當(dāng)代生物學(xué))，17,749760(2007).7.KatohM.,KatohΜ.,CharacterizationofFMN2geneathumanchromosomelq43(人染色體lq43的FMN2基因的表征)，Int.J.Mol.Med.(分子藥物國(guó)際雜志)，3，469-74(2004).8.LeaderB.等，F(xiàn)ormin_2,polyploidy,hypofertilityandpositioningofthemeioticspindleinmouseoocytes(成蛋白-2，小鼠卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂紡錘體的多倍性、繁殖力減低和定位)，Nat.Cell.Biol(自然細(xì)胞生物學(xué))，12，921-8(2002)·9.Trinkle-Mulcahy,L.,Andersen,J.,Lam,Y.W.,Moorhead,G.,Mann,Μ.,andLamond,Α.I.(2006).Repo-ManrecruitsPPlgammatochromatinandisessentialforcellviability(R印o_Man召集PPlγ至染色質(zhì)，并且是細(xì)胞生活力必需的)，JCellBiol(細(xì)胞生物學(xué)雜志)，172，679-692.10.SambrookJ.等，MolecularCloning(分子克隆)(第三版)，CHSpress,(2001).11.GerdGellissen(編輯)，ProductionofRecombinantproteins(重組蛋白的生產(chǎn))，JohnWiley&Sons(2005).12.GregoryJ.Hannon(編輯)，RNAi:aguidetogenesilencing(RNAi:基因沉默指南)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)(2003).2權(quán)利要求1.一種診斷細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)或發(fā)展所述失調(diào)的易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)成蛋白2(FMN2)基因和/或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)的步驟，其中FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)指示細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)是FMN2基因和/或蛋白表達(dá)水平的提高。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)是癌癥，如癌、肉瘤或淋巴瘤，白血病或自體免疫和/或炎性病癥，如銀屑病、過(guò)敏癥等，減數(shù)分裂失調(diào)，例如，涉及生殖細(xì)胞增殖的導(dǎo)致不育的失調(diào)，或如肝炎、肝硬化、腎衰竭、急性肺炎、胃潰瘍、心肌梗死、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥和腦梗死這樣的疾病和/或病癥。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)是FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的降低，其可以指示細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的存在或發(fā)展細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的易感性。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的特征在于異常的凋亡事件并且可以是神經(jīng)變性疾病，如急性細(xì)胞變性疾病，和/或如缺血性事件這樣的病癥(例如，中風(fēng)、心肌梗死等)。6.一種分離的cDNA序列，其包含圖2或3中所示的一種或多種序列或其同種型、可變剪接形式或翻譯后修飾形式或截短形式。7.—種DNA微陣列，其包含根據(jù)權(quán)利要求6的cDNA，所述DNA微陣列用于根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法中。8.—種重組FMN2蛋白或其片段，其是由根據(jù)權(quán)利要求6的分離cDNA表達(dá)的。9.一種多克隆或單克隆抗體或抗體片段，其能夠與根據(jù)權(quán)利要求8的重組蛋白或片段特異性反應(yīng)。10.根據(jù)權(quán)利要求9的抗體或抗體片段，其與用于根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法中的基底結(jié)合。11.根據(jù)權(quán)利要求9的抗體或抗體片段，其與可檢測(cè)的結(jié)構(gòu)部分綴合，所述結(jié)構(gòu)部分如比色的、熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性標(biāo)記。12.—種試劑盒，其包含一種或多種能夠與FMN2基因或包含一個(gè)或多個(gè)突變的FMN2基因特異性雜交的寡核苷酸/引物。13.—種能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物，其用于治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)。14.能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物用于制備治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的藥物的用途。15.一種治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的方法，所述方法包括將能夠調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的化合物施用于需要其的受試者的步驟。16.一種鑒定或獲得調(diào)節(jié)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)的試劑的方法，所述方法包括將FMN2基因或蛋白與測(cè)試試劑接觸并檢測(cè)FMN2基因和/或蛋白表達(dá)/功能的任何調(diào)節(jié)的步馬聚ο17.一種藥物組合物，其包含能夠調(diào)節(jié)FMN2基因/蛋白的表達(dá)或功能的化合物，并結(jié)合藥物學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。18.—種載體，其包含ARF應(yīng)答性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，所述ARF應(yīng)答性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子用于表達(dá)設(shè)計(jì)用來(lái)治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的基因。19.根據(jù)權(quán)利要求18的載體，其中所述ARF應(yīng)答性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子包含F(xiàn)MN2起始密碼子上游約21Λ的序列。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的載體，其中所述基因是細(xì)胞毒性基因并且待治療的疾病是癌癥。21.一種治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的載體施用于受試者。全文摘要本發(fā)明提供了診斷細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的方法，用于治療該失調(diào)的組合物和方法以及鑒定可能有效用于治療細(xì)胞增殖和/或分化失調(diào)的藥劑的方法。文檔編號(hào)A61K48/00GK102575283SQ201080020496公開(kāi)日2012年7月11日申請(qǐng)日期2010年3月15日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日發(fā)明者安格斯·萊恩·萊蒙德,小野基晴,山田佳代,索尼婭·羅沙申請(qǐng)人:敦提大學(xué)校董事會(huì)