專利名稱：用于治療實(shí)體瘤的含有白頭翁根浸膏作為活性成分的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下式(I)代表的常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷 或者來自白頭翁根(Pulsatillae radix)的含有這種化合物的浸膏作為實(shí)體瘤治療藥物的用途。
背景技術(shù)：
白頭翁根是屬于毛莨科族(Ranunculaceae)白頭翁屬(Pulsatilla)的干根(Ki Hwan Bae，韓國草藥(Korean MedicinalHerbs)，1999)。根據(jù)中國藥典，已知白頭翁根具有對血液去熱和去毒的作用。它還被用作消炎藥，收斂劑，止血?jiǎng)┖椭篂a藥，并且用于治療便血，瘧疾，鼻出血和牙出血。它的花稱為白頭翁花(Pulsatillae Flos)，用于治療瘧疾或天花。它的葉稱為白頭翁葉(Pulsatillae Folium)，用于治療腰痛，水腫或心痛。另外，據(jù)報(bào)道白頭翁根煎劑具有抗阿米巴痢疾的抗菌作用和抗毛滴蟲的殺蟲作用。
白頭翁根含有大約9％的皂甙，現(xiàn)在已經(jīng)從中分離了這樣的成分，如原銀蓮花素(protoanemonin)，銀蓮花素，毛莨堿，常春藤苷配基元，樺木酸，和齊墩果酸衍生物和它們的糖苷，如下式(II)所表示 原銀蓮花素 銀蓮花素毛莨堿 常春藤苷配基R＝H常春藤苷配基3-O-b-D-吡喃葡糖苷R＝glcPatensinR＝glc-gal 23-羥基-樺木酸R1＝R3＝H，R2＝OH白頭翁酸R1，R2＝O，R3＝H白頭翁苷AR1＝R3＝H，R2＝ara白頭翁苷BR1＝H，R2＝OH，R3＝glc-glc對于上述成分還沒有充分研究它們的藥學(xué)作用，但是據(jù)報(bào)道原銀蓮花素具有有絲分裂毒性(mitotoxicity)(Vonderbank，F(xiàn).，Pharmazie 5，210，1950)。Li等(Li，R.Z.，等，藥學(xué)學(xué)報(bào)28，326-31，1993)也報(bào)道了毛莨堿通過抑制DNA聚合酶具有抗KB細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
Shimizu等人從朝鮮白頭翁(Pulsatilla cerna)和韓國白頭翁(P.koreana)(Chem.Pharm.Bull.，26，1666，1978)；Yoshihiro等人從白頭翁(Pulsatilla chinensis)(J.Nat.Pro.，62，1279，1999)，Ekabo等人從Serjania salzmanniana Schlecht(J.Nat.Prod.，59，431，1996)分離出常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷。Kang等人也從韓國白頭翁(P.koreana)分離出它，并且再次證實(shí)了它的結(jié)構(gòu)。Yoshihiro等人在上述文章中報(bào)道常春藤苷配基和齊墩果酸衍生物表現(xiàn)出抗HL-60人白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性。他們報(bào)道說從中國白頭翁根(Pulsatilla chinensis)分離的常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷具有弱的抗HL-60的細(xì)胞毒性，即ED50是3.8微克/毫升。然而，大多數(shù)皂甙和很多種天然產(chǎn)物一般表現(xiàn)出這樣水平的細(xì)胞毒性，因此，在其基礎(chǔ)上不能說上述化合物具有抗腫瘤活性。因此，還從來不知道常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷具有抗腫瘤特別是抗實(shí)體瘤的活性。
本發(fā)明的公開本發(fā)明人從草藥包括峨?yún)?Anthriscus sylvestris Hoffman)，白頭翁根等中分離了脫氧鬼臼毒，并且發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)通過抑制血管發(fā)生而抑制實(shí)體瘤細(xì)胞的生長，并且為此獲得一項(xiàng)韓國專利(韓國專利號315200)。本發(fā)明人進(jìn)行了大量研究，從草藥開發(fā)了抗腫瘤藥物。結(jié)果，他們從白頭翁根獲得了一個(gè)級分，該級分在有機(jī)溶劑中溶解性能不好，但是在水中容易溶解，并且從該級分分離出一種抗腫瘤化合物，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于實(shí)體瘤的治療藥物，包括從白頭翁根分離的抗腫瘤化合物，或者從含有這種活性成分的白頭翁根得到的級分。
本發(fā)明的一方面提供用于實(shí)體瘤的治療藥物，包括含有常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷作為活性成分的白頭翁根浸膏。
“實(shí)體瘤”，如這里使用的，指除了血液癌癥之外的任何物質(zhì)性腫瘤(mass tumor)，其中代表性例子是肺癌。
在本發(fā)明中，通過用乙醇水溶液提取白頭翁根，并且通過向其中加入丙酮形成沉淀而獲得水溶性級分(WT)，能獲得含有常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷的白頭翁根浸膏?；蛘?，通過用乙醇水溶液提取白頭翁根，通過向其中加入丙酮形成沉淀而獲得水溶性級分，并且使該級分通過Sephadex LH20柱獲得Rf是0.48至0.5的級分(SPX3)，并且顯示紅色，噴霧硫酸之后加熱則顯示藍(lán)色。
本發(fā)明的一方面提供用于實(shí)體瘤的含有常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷作為活性成分的治療藥物。
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，用50％乙醇提取白頭翁根浸膏，獲得在丙酮中溶解性能不好的級分WT，該級分在Sephadex LH20上進(jìn)一步純化，得到級分SPX3，從該SPX3級分最終獲得純SB365。這種化合物是常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷，并且表現(xiàn)出比臨床藥物多柔比星(adriamycin)更高的抗小鼠肺腫瘤細(xì)胞、LLC(Lewis肺癌)細(xì)胞或者人肺腫瘤細(xì)胞、NCI-H23細(xì)胞形成的實(shí)體瘤的抗腫瘤活性。
特別地，從白頭翁根制備抗腫瘤級分并且從中分離抗腫瘤物質(zhì)的本發(fā)明方法如下。
(1)從白頭翁根制備抗腫瘤級分WT用50％乙醇水溶液提取白頭翁根粉末，然后減壓干燥。為了獲得干燥物質(zhì)，加入5至10倍量的丙酮。振搖混合物，發(fā)3000rpm離心，從中傾析上清液，得到不溶部分。將上述過程重復(fù)兩次。殘留的不溶部分容易溶解于水，并且指定為“WT級分”。該級分具有相對高的抗移植有LLC細(xì)胞的BDF1小鼠和移植有NCI-H23細(xì)胞的裸鼠的抗腫瘤活性。
(2)從級分WT制備級分SPX3
將給定量的級分WT溶解于給定量的各種濃度的甲醇水溶液中，然后在用相同的溶劑穩(wěn)定化過的Sephadex LH20柱上分級分離。在這種情況下，使用80％甲醇水溶液，填裝的柱子的大小是針對500毫克WT級分用60×4厘米，實(shí)現(xiàn)最佳分離。結(jié)果，獲得級分SPX1(試管號26-66)，級分SPX2(試管號66-91)，級分SPX3(試管號91-111)和級分SPX4(試管號111-138)。當(dāng)向硅膠板上鋪展的級分噴灑硫酸并且將平板加熱時(shí)，級分SPX3首先顯示紅色，隨著時(shí)間流逝顯藍(lán)色，并且含有Rf是0.48-0.50的點(diǎn)樣化合物作為主要活性成分。它顯示對移植有LLC細(xì)胞的BDF1小鼠和移植有NCI-H23細(xì)胞的裸鼠有高抗腫瘤活性。
(3)從級分SPX3分離SB365為了從級分SPX3分離表現(xiàn)出抗腫瘤活性的抗腫瘤物質(zhì)，進(jìn)行HPLC獲得純的化合物，SB365。為了鑒定SB365的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行Lieberman-Burchard反應(yīng)，IR，1H-NMR，13C-NMR，和乙醇/硫酸水解作用。結(jié)果，證明SB365是常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷，一種已經(jīng)從白頭翁根中分離出來的皂甙成分。
根據(jù)本發(fā)明的白頭翁根浸膏或者從中分離的純SB365化合物具有弱的抗實(shí)體瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出人意料地顯示極好的抗腫瘤活性。因此，它們能夠解決先前臨床應(yīng)用上的抗腫瘤藥物引起的問題，例如減小由于減少的血細(xì)胞引起的降低的免疫反應(yīng)。還預(yù)期它們對快速分裂細(xì)胞例如造血細(xì)胞等顯示低毒性。
根據(jù)本發(fā)明的白頭翁根級分和SB365可以和常規(guī)使用的藥學(xué)可接受載體混合，并且加工成藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的各種制劑，例如口服給藥的制劑，象溶液，懸浮液等；可注射制劑，象注射液或懸浮液，待用可注射干燥粉末劑等；和局部施用制劑，象軟膏劑，霜?jiǎng)┖腿芤?。特別地，本發(fā)明的活性成分在水中是可溶解的，并且可以溶解于各種溶液，例如生理鹽水、格林溶液和營養(yǎng)溶液等。這樣的藥學(xué)制劑可以靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部給藥。
推薦的本發(fā)明的活性成分對人的劑量在SB365情況下是3.5-8.0毫克/千克體重，在級分SPX3的情況下是20-40毫克/千克體重，或者在級分WT的情況下是200-300毫克/千克體重。最佳劑量是在SB365情況下是6.5毫克/千克體重，在級分SPX3的情況下是25毫克/千克體重，或者在級分WT的情況下是250毫克/千克體重。然而，這樣的劑量也可以根據(jù)患者的年齡、體重、健康狀況、疾病的嚴(yán)重程度適當(dāng)調(diào)節(jié)。
附圖簡要描述

圖1顯示級分WT的硅膠TLC圖案；圖2顯示在Sephadex LH20柱上純化的級分SPX3的硅膠TLC圖案；圖3是級分SPX3的HPLC色譜圖；和圖4是SB365的HPLC色譜圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式從下面的實(shí)施例會(huì)更好地理解本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白描述的具體材料和結(jié)果只是詳細(xì)說明的目的而不是為了也不應(yīng)該認(rèn)為是限制后面權(quán)利要求書中更全面描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1級分WT的制備用500毫升50％乙醇水溶液提取50克白頭翁根粉末三次，減壓干燥提取液，得到22克干燥物質(zhì)。向這種干燥物質(zhì)加入300毫升丙酮，振蕩混合物，并且以3000rpm離心。從中去除上清液得到沉淀。用丙酮反復(fù)處理這種沉淀物兩次。棄除丙酮層，將不溶解部分干燥，得到17.8克干燥物質(zhì)(級分WT)。使得到的級分WT進(jìn)行硅膠TLC(展開劑丁醇∶乙酸∶水比例是4∶1∶1，顯色反應(yīng)硫酸噴加之后加熱)。圖1給出結(jié)果。在圖1中，藍(lán)點(diǎn)Rf在0.48-0.50范圍內(nèi)，相應(yīng)于下文所述本發(fā)明的活性成分。如下面實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1所示，級分WT對移植有LLC細(xì)胞的BDF1小鼠有相對高的抗腫瘤活性(腫瘤生長抑制率57％)。
實(shí)施例2級分SPX的制備使用甲醇和水的混合物溶液(80∶20)，以1毫升/分鐘的流速，在Sephadex LH20柱上(200克，60×4cm)將560毫克級分WT進(jìn)一步分級分離，級分體積是0.5毫升/管。順序?qū)⑦@些級分點(diǎn)樣在硅膠薄層上，并且展開，獲得級分(展開劑丁醇∶乙酸∶水比例是4∶1∶1，顯色反應(yīng)硫酸噴加之后加熱)。圖2給出結(jié)果。在圖2中，通過收集其中較低的點(diǎn)樣在與硫酸反應(yīng)時(shí)顯現(xiàn)黃色的由4個(gè)主要點(diǎn)構(gòu)成的編號26-66的試管，獲得SPX1(139毫克，24.8％)。通過收集由2個(gè)主要點(diǎn)構(gòu)成的編號66-91的試管，獲得SPX2(344毫克，61.4％)。通過收集其中首先顯示紅色然后隨著時(shí)間的進(jìn)程噴施硫酸后加熱而顯示藍(lán)色的編號91-111的試管，獲得SPX3(61毫克，10.9％)。級分SPX3含有Rf在0.48-0.50范圍內(nèi)的點(diǎn)樣為其主要成分。通過收集編號111-138的試管，獲得SPX4(15.7毫克，2.8％)。級分SPX3和SPX4具有相對高純度，在薄層上顯示一個(gè)點(diǎn)。
如下面實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1所示，自給藥起第15天，SPX3表現(xiàn)出60％的腫瘤生長抑制率。相反，SPX1，SPX2和SPX4沒有表現(xiàn)出任何作用，因此可以假設(shè)對硫酸呈現(xiàn)藍(lán)色的物質(zhì)是具有抗腫瘤活性的成分。這種SPX3級分本身可以被用作抗腫瘤藥物。
實(shí)施例3SB365的分離為了從級分SPX3分離純物質(zhì)，如下進(jìn)行HPLC。
反相硅膠(RP-C18，250×10毫米，Metachem制造)被用作固定相，甲醇和水(80∶20)的混合溶液用作流動(dòng)相。檢測波長是210nm，流速是1毫升/分鐘。圖3給出結(jié)果。如在圖3中所示，SPX3由三種主要物質(zhì)組成。從獲得的分級分離的量，Rt是8.5分鐘和10.4分鐘的峰含有少量成分，Rt是23.3分鐘的峰含有主要成分。因此，推定后者具有抗腫瘤活性。如上所述，收集Rt是23.3分鐘的用硫酸顯色藍(lán)色并且是活性成分的物質(zhì)，從31毫克SPX3得到2.8毫克SB365。將收集的Rt是23.3分鐘的級分干燥，并且在如上所述條件下進(jìn)行HPLC測定其純度。圖4給出結(jié)果。從圖4證實(shí)，SB365是一種純物質(zhì)。得到的SB365直接用于下面的結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤活性測定。
如下面實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1和2所示，SB365對移植有LLC細(xì)胞的BDF1小鼠和移植有NCI-H23細(xì)胞的裸鼠分別表現(xiàn)出81％和82.1％的腫瘤生長抑制率，據(jù)說這是極好的抗腫瘤活性。
實(shí)施例4活性化合物SB365的結(jié)構(gòu)鑒定和證實(shí)上面分離的SB365是白色無定形泡沫狀物質(zhì)，m.p.239-241℃，[α]D+23.6(c，0.2，MeOH)，在Liebermann-Buchard反應(yīng)中呈陽性，并因此證實(shí)是糖苷。另外，根據(jù)IR(cm-1)，在3400(br，-OH)，2940(br，C-H)，1695(C＝O)，1455和1040(C-O)出現(xiàn)峰。還從1000-1100和3000-3400范圍內(nèi)的吸收峰推定它是糖苷。
從1H-NMR來看，其具有典型皂甙NMR圖譜。在0.91，0.92，0.98，1.00，1.07和1.21ppm發(fā)現(xiàn)六個(gè)-CH3基團(tuán)，在1.64ppm發(fā)現(xiàn)另一個(gè)-CH3基團(tuán)雙重峰。從這里可以看出該化合物在其糖基中包括一個(gè)鼠李糖基團(tuán)。在6.25(br.)，5.11(1H，J＝7.80Hz)和4.97ppm(1H，J＝6.66Hz)發(fā)現(xiàn)端基異構(gòu)質(zhì)子。因此證實(shí)SB365是具有三個(gè)糖基的糖苷。
根據(jù)13C-NMR，在65.4ppm(C-23)發(fā)現(xiàn)羥甲基，在104.2(C-1’)，106.7(C-1)和101.7ppm(C-1’)發(fā)現(xiàn)三個(gè)端基異構(gòu)碳信號。在122.5ppm(C-12)和144.8ppm(C-13)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)烯碳，并且在180.2ppm(C-28)發(fā)現(xiàn)一個(gè)碳原子。一般情況下，當(dāng)28位鍵合糖時(shí)(180.2ppm→176.2ppm)，出現(xiàn)大約4Hz糖基化高磁場位移。在本發(fā)明中，沒有發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象，因此證明該化合物在28位不具有糖基。
接著，使該化合物在乙醇/硫酸中水解，鑒定其糖基和苷元的結(jié)構(gòu)。比較水解產(chǎn)物，苷元的物理化學(xué)數(shù)據(jù)，13C-NMR和1H-NMR數(shù)據(jù)之后，證實(shí)SB365是常春藤苷配基。此外，比較TLC證明水解的糖是鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖。
在上述分析結(jié)果和公開的文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，證明SB365是常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷。
下面表1給出SB365的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)。
表1 位置1H(ppm) J(Hz)13C(ppm) 位置1H(ppm) J(Hz)13C(ppm)C-1 38.9 阿拉伯糖C-2 26.1 C-1′ 4.97d 6.66104.2C-3 3.28d 10.9 81.0 C-2′ 80.4C-4 43.5 C-3′ 75.4C-5 48.1 C-4′ 76.2C-6 18.1 C-5′ 63.9C-7 32.8 鼠李糖C-8 39.7 C-1″ 6.25br 101.7C-9 47.8 C-2″ 72.3C-10 36.9 C-3″ 72.4C-11 23.9 C-4″ 74.1C-12 5.45s 122.5 C-5″ 69.6C-13 144.8 C-6″ 1.64 5.9418.6C-14 42.1 葡萄糖C-15 28.3 C-1 5.11d 7.80106.7C-16 23.8 C-2 75.0C-17 46.2 C-3 78.5C-18 41.9 C-4 71.2C-19 46.4 C-5 78.8C-20 30.9 C-6 62.5C-21 34.2C-22 33.2C-23 4.36，3.67 重疊 65.4C-24 1.07s 14.0C-25 0.91s 16.0C-26 0.98s 17.4C-27 1.21s 26.3C-28 - 180.2C-29 0.92s 32.8C-30 1.00s 23.7
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1對移植有LLC細(xì)胞的BDF1小鼠的抗腫瘤活性該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠物種是BDF1，并且使用體重18-25克的健康雄性小鼠。在23-24℃范圍內(nèi)控制溫度的地方讓這些動(dòng)物隨意進(jìn)食水和食物，并且用沒有抗生素的小鼠飼料喂養(yǎng)。在C57BL/6小鼠上皮下培養(yǎng)LLC-細(xì)胞14天。取包含LLC-細(xì)胞的組織并且加入滅菌冷生理鹽水(5毫升/克組織)制備細(xì)胞懸浮液。將0.2毫升的細(xì)胞懸浮液皮下移植到BDF1小鼠的腹股溝區(qū)。
自移植之后24小時(shí)起，將上述小鼠分為幾組，每組包括5只小鼠。然后，將樣品級分WT和SPX級分以及SB365溶解于生理鹽水，分別以280毫克/千克(WT)，70毫克/千克(SPX1)，171毫克/千克(SPX2)，30.5毫克/千克(SPX3)，8.1毫克/千克(SPX4)和6.4毫克/千克(SB365)腹膜內(nèi)注射。對陰性對照組只注射生理鹽水，對陽性對照組注射多柔比星(0.5毫克/千克)。腫瘤移植之后24小時(shí)起開始注射方案，連續(xù)7天每天一次施用樣品，停藥一天，然后再連續(xù)進(jìn)行6天。
為了評價(jià)SB365對小鼠的毒性每周對小鼠稱重兩次。按下列式子在施用樣品之后第14和15天對對照組和試驗(yàn)組測定腫瘤體積之后計(jì)算抗腫瘤活性腫瘤體積(mm3)＝長度(mm)×寬度2(mm2)/2腫瘤生長抑制率(％)＝(C-T)×100/C(C對照組平均腫瘤體積，T試驗(yàn)組平均腫瘤體積)。
下面表2中給出了結(jié)果。
表2白頭翁根級分和SB365對移植有LLC細(xì)胞的BDF1小鼠的腫瘤生長抑制率(IR，％)

a)腫瘤細(xì)胞移植之后的天數(shù)。
如上面表2所示，在腫瘤細(xì)胞移植之后第15天，級分WT和SPX3分別表現(xiàn)出55％和60％的腫瘤生長抑制率，而SB365表現(xiàn)出79％的腫瘤生長抑制率，高于多柔比星64％的腫瘤生長抑制率。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2對移植有NCI-H23細(xì)胞的裸鼠的抗腫瘤活性在該試驗(yàn)中，使用從Harlan Co.(USA)獲得的16-25克體重的5周齡雌性裸鼠作為試驗(yàn)用動(dòng)物。小鼠在無菌動(dòng)物室中適應(yīng)環(huán)境1周之后被使用。動(dòng)物室保持22±2℃的溫度，55±5％的濕度，12小時(shí)周期的晝夜周期，這是自動(dòng)控制的。給試驗(yàn)動(dòng)物的固體飼料照射滅菌，飲用水在高壓鍋里滅菌。讓動(dòng)物隨意進(jìn)食飼料和飲用水。使用由國家腫瘤研究中心(National Cancer Institute)(NCI)，USA提供并且保藏在韓國的韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究中心(KoreanResearch Institute of Bioscience and Biotechnology)(KRIBB)的人腫瘤細(xì)胞系。將人腫瘤細(xì)胞中的肺腫瘤細(xì)胞、NCI-H23細(xì)胞移植給裸鼠。以0.3毫升/20克體重的體積對小鼠皮下移植3×107個(gè)細(xì)胞/毫升的腫瘤細(xì)胞。從腫瘤細(xì)胞移植之后除第8天外的第1天至第14天連續(xù)13天每天對小鼠腹膜內(nèi)注射樣品。對每只動(dòng)物測量注射期間生成的腫瘤的大小，還測量其體重的任何變化。腫瘤細(xì)胞移植之后第16天，處死小鼠，分離腫瘤并且稱重。在第1，第5，第9和第14天對陽性對照組腹膜內(nèi)注射多柔比星0.5毫克/千克體重。下面表3中給出結(jié)果。
表3SB365對移植有NCI-H23細(xì)胞的裸鼠的腫瘤生長抑制率(IR，％)

a)腫瘤細(xì)胞移植之后的天數(shù)。
如上面表3所示，在腫瘤細(xì)胞移植之后第16天，6.4毫克/千克的SB365表現(xiàn)出82.1％的高腫瘤生長抑制率。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3細(xì)胞毒性試驗(yàn)從KRIBB獲得腫瘤細(xì)胞A549，SK-MEL-2和MCF-7，并且在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用。如下制備培養(yǎng)基向注射用滅菌蒸餾水中加入一包含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基、100毫升在50℃水浴中加熱30分鐘滅活的胎牛血清(FBS)、2克碳酸氫鈉、100000單位的青霉素和100毫克鏈霉素，用0.1NHCl將混合物的pH調(diào)節(jié)至1升總體積，過濾將混合物消毒，在使用之前貯存在4℃下。每三天繁殖一次維持細(xì)胞。使用含有0.5％胰蛋白酶和2％EDTA生理緩沖鹽水(PBS)的溶液從孔中分出細(xì)胞。
根據(jù)NCI在1989年改進(jìn)的體外測定藥物抗腫瘤活性的Sulforhodamine-B(SRB)方法測定對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
具體地說，用0.5％胰蛋白酶-EDTA溶液從孔中分出細(xì)胞后制備3-5×104細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液。然后，向96-孔板加該細(xì)胞懸浮液(180微升/孔)，平板在37℃，5％CO2的保溫箱中溫育24小時(shí)。
樣品溶解于二甲亞砜(DMSO)并且用培養(yǎng)基或三次蒸餾過的水稀釋獲得實(shí)驗(yàn)要求的濃度，依次稀釋，至0.2％或更小的終濃度。向96-孔板的每一個(gè)孔加入20微升順序稀釋的樣品溶液，然后該平板在37℃，5％CO2的保溫箱中溫育48小時(shí)。在加入樣品溶液的時(shí)間點(diǎn)，收集Tz(零時(shí)間)板，完成溫育之后從Tz板和從每一個(gè)板去除培養(yǎng)基，并且向平板加10％三氯乙酸(TCA)(50微升/孔)。使得到的平板在4℃靜置1小時(shí)將細(xì)胞固定在平板底部。完成細(xì)胞固定之后，用水將平板沖洗5-6次完全去除殘留的TCA溶液，得到的平板在室溫下干燥使之不含有濕氣。
向完全干燥的平板加入50微升的1％乙酸中含有0.4％SRB的染料溶液將細(xì)胞染色30分鐘。然后，用1％乙酸溶液將平板沖洗5-6次完全去除沒有結(jié)合細(xì)胞的SRB。平板在室溫下干燥。向其中加入100微升的10mM Tris溶液使染料溶解。然后在520nm波長下用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器測定OD(光密度)。
如下計(jì)算樣品對腫瘤細(xì)胞的ED50值[50％有效劑量(ng/ml)抑制腫瘤細(xì)胞生長50％的濃度]。Tz值定義為加入樣品之后開始溫育時(shí)間的OD值，C(對照)值定義為沒有用樣品處理的孔的OD值，而T(試驗(yàn))值定義為用樣品處理的孔的OD值。根據(jù)下式，從Tz值，C和T值測定物質(zhì)的細(xì)胞毒性-在Tz≥T的情況下，(T-Tz)/(C-Tz)×100-在Tz＜T的情況下，(T-Tz)/Tz×100從如上所計(jì)算的值，利用Lotus程序數(shù)據(jù)回歸功能獲得樣品的ED50值。
結(jié)果，SB365對人肺腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞，人黑素瘤細(xì)胞SK-MEL2和人乳房腫瘤細(xì)胞MCF7的ED50值分別是＞20微克/毫升，＞10微克/毫升和＞10微克/毫升。因此，SB365對實(shí)體瘤細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒性。
制劑實(shí)施例1含有級分WT的注射液的制備將實(shí)施例1獲得的250毫克WT級分溶解于10毫升生理鹽水，制備注射液。
制劑實(shí)施例2含有級分SPX3的可注射干燥粉末劑的制備將實(shí)施例2獲得的25毫克級分SPX3溶解于10毫升格林溶液，滅菌，然后凍干，制備待用可注射干燥粉末劑。在使用之前用注射用蒸餾水重新配制該粉末劑。
制劑實(shí)施例3含有SB365的注射液的制備將實(shí)施例3獲得的6.5毫克SB365溶解于10毫升格林溶液，滅菌，制備注射液。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的白頭翁根級分WT和SPX3以及從該級分分離的SB365，常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷不只對實(shí)體瘤細(xì)胞具有高細(xì)胞生長抑制率，而且通過溶解于各種溶液包括生理鹽水、格林溶液、或營養(yǎng)溶液而能方便地使用，因?yàn)樗菀兹芙庥谒⑶揖哂凶銐蚋纳葡惹伴_發(fā)的抗腫瘤藥物的副作用的低細(xì)胞毒性。因此，預(yù)期作為用于實(shí)體瘤的治療藥物是非常有用的。
權(quán)利要求
1.一種用于治療實(shí)體瘤的藥物，包括作為活性成分的白頭翁根浸膏，其中白頭翁根浸膏含有常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物，其中通過用乙醇水溶液提取白頭翁根，并且通過向其中加入丙酮形成沉淀而獲得水溶性級分來制備所述白頭翁根浸膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其中以200-300毫克/千克體重的日劑量施用所述白頭翁根浸膏。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物，其中所述白頭翁根浸膏是具有0.48至0.5范圍內(nèi)的Rf、并且顯示紅色、噴霧硫酸之后加熱則顯示藍(lán)色的級分，該級分是通過用乙醇水溶液提取白頭翁根，通過向其中加入丙酮形成沉淀而獲得水溶性級分，并且使該級分通過Sephadex LH20柱而制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物，其中以20-40毫克/千克體重的日劑量施用所述白頭翁根浸膏。
6.一種用于治療實(shí)體瘤的藥物，包括作為活性成分的常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物，其中以3.5-8毫克/千克體重的日劑量施用常春藤苷配基3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基(1→4)]-α-L-吡喃阿糖糖苷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的藥物，其溶解于選自生理鹽水、格林溶液和營養(yǎng)溶液的溶液中用于給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及常春藤苷配基3－O－α－L－吡喃鼠李糖基(1→2)－[β－D－吡喃葡糖基(1→4)]－α－L－吡喃阿糖糖苷或者含有該化合物的白頭翁根浸膏作為用于實(shí)體瘤治療藥物的用途。
文檔編號A61K36/71GK1494910SQ0317879
公開日2004年5月12日 申請日期2003年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月22日
發(fā)明者金松倍, 安丙浚, 金勇 申請人:金松倍