專(zhuān)利名稱(chēng)：人成體干細(xì)胞在治療惡性實(shí)體瘤中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及人成體干細(xì)胞在治療惡性實(shí)體瘤中的用途。更具體而言，本發(fā)明涉及人成體干細(xì)胞，特別是人間充質(zhì)干細(xì)胞和人造血干細(xì)胞在制備治療惡性實(shí)體瘤的細(xì)胞制劑中的用途。
背景技術(shù)：
21世紀(jì)社會(huì)在進(jìn)步與發(fā)展，但人類(lèi)仍受眾多疾病折磨。因重大疾病，如心腦血管病、惡性腫瘤、創(chuàng)傷、衰老和遺傳缺陷等所導(dǎo)致的組織器官缺損與功能障礙是人類(lèi)難以攻克的醫(yī)學(xué)難題。干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞治療醫(yī)學(xué)是新型的醫(yī)學(xué)手段，為重大疾病的治療、壽命的延長(zhǎng)、生活質(zhì)量的提高提供了一個(gè)新途徑(Nichols et al. , 1998 ；Pan et al. ,2002 ； Pesce and Scholer,2000 ；Thomson et al.，1998)。干細(xì)胞及其治療性克隆的迅速發(fā)展，將是人類(lèi)歷史上的第三次醫(yī)學(xué)革命，即再生醫(yī)學(xué)治療途徑。干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)與治療的發(fā)展不僅會(huì)帶來(lái)醫(yī)學(xué)史上的革命，也將與我國(guó)構(gòu)建和諧社會(huì)的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)相符合，具有深遠(yuǎn)的科學(xué)意義與社會(huì)效益。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新能力、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。它們可以通過(guò)對(duì)稱(chēng)性分裂維持自身細(xì)胞群的數(shù)量，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體各種復(fù)雜的組織和器官。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)與成體干細(xì)胞。ES細(xì)胞是人體各種組織細(xì)胞的起源。成體干細(xì)胞存在于成體的各種組織中，它們具有多向分化潛能，可以分化為某一組織的多種細(xì)胞。干細(xì)胞的研究與應(yīng)用幾乎涉及了所有的生命科學(xué)和生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，并將在細(xì)胞治療、組織器官移植、基因治療、新基因發(fā)掘與基因功能分析、發(fā)育生物學(xué)模型、新藥開(kāi)發(fā)與藥效、毒性評(píng)估等領(lǐng)域產(chǎn)生極其重要的影響，因此，干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究成果將成為21 世紀(jì)具有巨大潛力的新興高科技產(chǎn)業(yè)之一，其研究水平正逐步成為衡量一個(gè)國(guó)家或地區(qū)科技發(fā)展水平與健康水平的重要標(biāo)志之一。腫瘤干細(xì)胞理論提出后，腫瘤治療理念受到重要的影響，惡性腫瘤的治療不僅僅以化療，放療和手術(shù)為主，也要探索以干細(xì)胞治療惡性腫瘤。骨髓來(lái)源的細(xì)胞(Bone Marrow-Derived Cells, BMDCs)尤其是人造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cell, HSCs) 用于臨床治療重癥再生障礙性貧血及重癥放射病、急性白血病、慢性髓性白血病等血液病方面已取得了巨大成就。二十世紀(jì)70年代，E. D. Thomas開(kāi)創(chuàng)了異基因造血干細(xì)胞移植治療白血病，并獲得 1990年諾貝爾獎(jiǎng)，開(kāi)創(chuàng)了干細(xì)胞治療腫瘤的先河。美國(guó)于2005年10月報(bào)道明尼蘇達(dá)大學(xué)首次成功地應(yīng)用人類(lèi)胚胎干細(xì)胞殺死癌細(xì)胞。這項(xiàng)新的研究揭示出人類(lèi)胚胎干細(xì)胞能夠更好地靶向癌細(xì)胞。人成體干細(xì)胞治療惡性實(shí)體瘤尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本領(lǐng)域需要可用于惡性實(shí)體瘤治療的干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述需要，本發(fā)明人以人間充質(zhì)干細(xì)胞和人造血干細(xì)胞分別與人食管癌細(xì)胞 EC9706或KYSE150融合；并將融合細(xì)胞注入SCID/小鼠和裸鼠以觀察成瘤情況。融合細(xì)胞成瘤數(shù)明顯減少，其體積也縮小。結(jié)果表明人間充質(zhì)干細(xì)胞和人造血干細(xì)胞對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706或KYSE150有抑制作用，為惡性實(shí)體瘤的干細(xì)胞治療提供了理論基礎(chǔ)，并開(kāi)創(chuàng)了惡性腫瘤治療的新途徑。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及人成體干細(xì)胞在制備治療惡性實(shí)體瘤的細(xì)胞制劑中的用途。本發(fā)明的人成體干細(xì)胞可通過(guò)作為藥物組合物的細(xì)胞制劑的形式提供給患有惡性實(shí)體瘤的患者。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的人成體干細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì)胞或人造血干細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的含有人成體干細(xì)胞的細(xì)胞制劑用于治療的惡性實(shí)體瘤為人
食管癌。優(yōu)選地，本發(fā)明提供含有人間充質(zhì)干細(xì)胞或人造血干細(xì)胞的細(xì)胞制劑用于治療人
食管癌。本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑可通過(guò)移植給予受治療者。為通過(guò)移植給予受治療者，細(xì)胞制劑中需要加入適合于移植的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他成分，例如植入后可降解的的生物材料。本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑可通過(guò)靜脈輸注給予受治療者。為通過(guò)靜脈輸注給予受治療者，細(xì)胞制劑中需要加入適合于靜脈輸注的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他成分。本發(fā)明的細(xì)胞制劑還可以包括本領(lǐng)域公知的其他成分，如適合患者接納的材料或基質(zhì)，該基質(zhì)可作為細(xì)胞移植用的三維模板，具有特定的孔徑，例如申請(qǐng)日為2004年6月7 日的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利號(hào)為200480019202. 5，授權(quán)公告號(hào)為CN100447186C的發(fā)明專(zhuān)利中所描述的基質(zhì)。還可以包括生物可降解聚合物如白蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、明膠等，并制作成治療用途的試劑盒的形式。本發(fā)明所述的細(xì)胞制劑可以是非凍存的細(xì)胞制劑或凍存的細(xì)胞制劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，干細(xì)胞移植必須保存足夠量的干細(xì)胞，保存在一定條件下，等移植需要時(shí)，再將保存的干細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)，達(dá)到治療的目的。根據(jù)保存的方法不同，可分為非凍存保存或凍存保存。非凍存保存為零上溫度保存如4°C保存，優(yōu)點(diǎn)是不需要冷凍設(shè)備，不需要在細(xì)胞懸液中添加冷凍防護(hù)劑，也不需要輸用前解凍。缺點(diǎn)是保存時(shí)間受限。凍存保存為零下溫度保存如_79°C的冷凍保存(_80°C保存)或深低溫保存(_196°C )。零下溫度時(shí)細(xì)胞代謝和各種酶的活性幾乎停止，細(xì)胞保存的時(shí)間可以延長(zhǎng)，細(xì)胞保存溫度越低，細(xì)胞活性保存越好。細(xì)胞若深低溫保存之前，必須先控速降溫。制備非凍存的細(xì)胞制劑或凍存的細(xì)胞制劑的方法和設(shè)備都是本領(lǐng)域已知的。在進(jìn)行冷凍保存時(shí)，需要添加冷凍保存劑，以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以使用的冷凍保存劑包括能滲透到細(xì)胞內(nèi)部的甘油、二甲基亞砜、丙二醇、 乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇等，也可以使用非滲透性保存劑如白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、右旋糖酐、乳糖蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)同時(shí)選用滲透性保存劑和非滲透性保存劑中的一種或幾種組合使用。本發(fā)明的細(xì)胞制劑滿(mǎn)足本領(lǐng)域技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，例如符合國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《人
4體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。


圖1 ⑶90和⑶106在各細(xì)胞的表達(dá)。其中FCl兩者陽(yáng)性率為觀.8 %，F(xiàn)C2兩者陽(yáng)性率為74. 9%，F(xiàn)C3兩者陽(yáng)性率為 44. 4%。圖2 顯示CK18在各細(xì)胞的表達(dá)。CK18在hMSCs為陰性表達(dá)外，其余均為陽(yáng)性表達(dá)。圖3:DNA含量分析。hMSC以雞血為內(nèi)參進(jìn)行DNA含量檢測(cè)，EC9706、FCl、FC2和FC3以正常人淋巴細(xì)胞為內(nèi)參進(jìn)行檢測(cè)，MSC為2η，其余均為6η。圖4:軟瓊脂克隆形成。A所示軟瓊脂試驗(yàn)克隆形成試驗(yàn)所成克隆，發(fā)明人每孔做兩個(gè)副孔，圖中只取一個(gè)。B中的EC9706為食管癌細(xì)胞克隆形成多，F(xiàn)CU FC2、FC3為融會(huì)細(xì)胞，腫瘤克隆形成少。對(duì)形成的克隆計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，差異具有顯著性(P <0.01)。圖5 免疫缺陷鼠皮下成瘤。A顯示各組細(xì)胞成瘤大體情況，各組成瘤外觀一致，未見(jiàn)紅色肉瘤樣外觀；FC組成瘤體積明顯小于EC0706組，F(xiàn)Cl組有2只成瘤，F(xiàn)C2組有4只成瘤。B所示為成瘤病理切片分析結(jié)果，各組成瘤性質(zhì)一致，均為鱗狀上皮癌，實(shí)質(zhì)與間質(zhì)分界清楚，腫瘤細(xì)胞成巢狀分布。C中顯示了 EC9706和FC3組成瘤重量的差異性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性(P < 0. 01)，由于FCl組與FC2組瘤重量較小，所以發(fā)明人只對(duì)EC9706和FC3組進(jìn)行了對(duì)比。圖6 hMSCs與KYSE150融合后，裸鼠成瘤的時(shí)間。KYSE150為食管癌細(xì)胞，腫瘤成長(zhǎng)早；hMSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)；FC 為融合細(xì)胞的不同組，腫瘤生長(zhǎng)晚。圖7 hMSCs與KYSE150融合后，各組腫瘤生長(zhǎng)情況。圖8 hMSCs與KYSE150融合后腫瘤重量的變化。KYSE150為食管癌細(xì)胞，腫瘤重量最重；hMSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)； FC為融合細(xì)胞的不同組，腫瘤生長(zhǎng)小，重量輕。圖9 造血干細(xì)胞與EC9706細(xì)胞融合后，各組腫瘤生長(zhǎng)情況。圖10顯示融合細(xì)胞與非融合細(xì)胞成瘤比較。圖11顯示腫瘤重量，細(xì)胞融合方法詳見(jiàn)方法描述。圖12 全基因組cDNA微陣列(microarray)聚類(lèi)分析。紅色表示該基因表達(dá)上調(diào)，綠色表示該基因表達(dá)下調(diào)，顏色深淺表示基因表達(dá)強(qiáng)度。圖13 總RNA電泳檢測(cè)。圖中顯示了消化純化后的電泳結(jié)果，可以看出用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的總RNA質(zhì)量還可以，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
圖14 總RNA消化基因組DNA效果驗(yàn)證。圖中1 5分別以9706、MSC、FC1、FC2和FC3樣品的消化后總RNA為模板普通PCR 擴(kuò)增GAPDH基因；+為陽(yáng)性對(duì)照，NC為陰性對(duì)照。標(biāo)記(Marker, Μ) =TaKaRa DL2000 plus, 條帶大小(從下往上 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp)。從圖中可以看出用于逆轉(zhuǎn)錄的RNA已經(jīng)把基因組DNA消化完全。實(shí)時(shí)(RealTime)PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)圖15 實(shí)時(shí)(RealTime) RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。圖中1 5分別以9706、MSC、FC1、FC2和FC3樣品的lst-cDNA為模板，實(shí)時(shí)PCR 擴(kuò)增GAPDH基因；6 10分另Ij以9706、MSC、FC1、FC2和FC3樣品的lst-cDNA為模板，實(shí)時(shí) PCR擴(kuò)增NM_001946基因。標(biāo)記(Marker, Μ) TaKaRa DL2000plus，條帶大小(從下往上 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp)。從電泳圖結(jié)果可以看出實(shí)時(shí) PCR反應(yīng)特異性都很好。圖 16 實(shí)時(shí)(realtime)-PCR 檢測(cè) DUSP6/MKP3 變化。A所示為GAPDH和DUSP6的溶解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)。B為DUSP6相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)豐度。從圖中可以看出，DUSP6在FC中較EC9706和MSC明顯高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明差異具有顯著性(P < 0. 01)。附注9706為食管癌細(xì)胞。MSC為間充質(zhì)干細(xì)胞。FC1，F(xiàn)C2，F(xiàn)C3 分別為克隆1，2，3。圖17 細(xì)胞周期變化。圖中可見(jiàn)FCG0/G1期細(xì)胞明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有顯著性(P < 0. 01)。圖18 增殖指數(shù)變化。圖中表明FC細(xì)胞的增殖指數(shù)較EC9706明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有顯著性(P < 0. 01)。圖19 裸鼠尾靜脈注射hMSCs細(xì)胞能趨向腫瘤細(xì)胞。圖20 hMSCs與EC9706和Kysel50融合的結(jié)果與機(jī)理。圖21 hMSCs進(jìn)入人機(jī)體的途徑和作用機(jī)理圖。
具體實(shí)施例方式(一 )人成體干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合技術(shù)1)細(xì)胞融合技術(shù)(Robinson，1979)。A. 0. 125%胰酶消化細(xì)胞EC9706細(xì)胞和hMSCs細(xì)胞，制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，B.計(jì)數(shù)，hMSCs EC9706 = 1 10 混合于錐形離心管中，PBS 洗，lOOOrpm，10 分
鐘，三次；C.棄上清，用H-DMEM重懸細(xì)胞，lOOOrpm, 10分鐘；D.小心吸取上清后，輕彈、旋轉(zhuǎn)并搖動(dòng)，使細(xì)胞充分分散成糊狀，置于37°C水浴鍋內(nèi)；E.邊搖邊加入37°C預(yù)溫的50%無(wú)菌PEG1500 1ml，在1分鐘內(nèi)滴完a) 37°C水浴90秒，期間輕輕搖動(dòng)離心管；b)輕輕滴加10ml 37°C預(yù)溫的H-DMEM IOml以終止PEG的作用，并在3分鐘內(nèi)滴完，滴加時(shí)盡可能不攪散細(xì)胞；c) IOOOrp, 10分鐘，吸棄上清；將細(xì)胞接種在3個(gè)IOcm —次性平皿內(nèi)，37°C恒溫、 恒濕培養(yǎng)。2)融合細(xì)胞克隆的挑選與鑒定技術(shù)。3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞表面標(biāo)記。4)軟瓊脂集落形成技術(shù)。5)免疫缺陷鼠移植瘤技術(shù)。2.人成體干細(xì)胞趨向腫瘤細(xì)胞技術(shù)人成體干細(xì)胞治療惡性實(shí)體瘤需要解決給藥途徑問(wèn)題。人成體干細(xì)胞靜脈移植后，人成體干細(xì)胞是否趨向腫瘤組織(靶向性)是人成體干細(xì)胞治療惡性實(shí)體瘤的關(guān)鍵。1)熒光標(biāo)記人成體干細(xì)胞的技術(shù)。2)小動(dòng)物活體成像技術(shù)。( 二)研究結(jié)果1.融合細(xì)胞的篩選鑒定1)流式細(xì)胞儀分選hMSCs是一種間質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞，通常它需要通過(guò)多種標(biāo)記來(lái)鑒定，而且不同的研究人員可能采取的標(biāo)記也不盡相同，通常使用的標(biāo)記有如下幾種陽(yáng)性標(biāo)記CD13，CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105, CD106陰性標(biāo)記CD14，CD31, CD33, CD34, CD36, CD45, CD133發(fā)明人在對(duì)人臍帶源hMSCs進(jìn)行各標(biāo)記檢測(cè)后，選擇了表達(dá)強(qiáng)度較高的⑶90和 ⑶106作為實(shí)驗(yàn)用檢測(cè)標(biāo)記。經(jīng)過(guò)PEG1500誘導(dǎo)hMSCs和EC9706融合后，將得到的含有 hMSCs、EC9706和融合細(xì)胞的混合細(xì)胞在hMSCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以確保hMSCs標(biāo)記的不丟失。 培養(yǎng)3天后，0. 125%胰酶消化，PBS清洗，⑶90染色后上流式細(xì)胞儀分選。得到的⑶90+細(xì)胞繼續(xù)在hMSCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2)融合細(xì)胞克隆的挑選發(fā)明人對(duì)培養(yǎng)的CD90+細(xì)胞并以IO3/皿的密度均勻分散后接種在d= IOcm的一次性培養(yǎng)皿中，10天后在顯微鏡下根據(jù)形態(tài)挑選克隆。發(fā)明人挑選了 90個(gè)克隆，分別培養(yǎng)在12孔板中，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量時(shí)開(kāi)始對(duì)各克隆進(jìn)行驗(yàn)證。3) hMSCs表面標(biāo)記檢測(cè)來(lái)源于hMSCs和EC9706的融合細(xì)胞，在早期理論上應(yīng)該同時(shí)含有hMSCs和EC9706的特征分子。因此，發(fā)明人在得到克隆后選取了⑶90和⑶106兩個(gè)標(biāo)記作為鑒定hMSCs特征的指標(biāo)，對(duì)挑選的每一個(gè)克隆進(jìn)行了上述兩個(gè)標(biāo)記的檢測(cè)(圖 1)。4)上皮特征的檢測(cè)由于EC9706為上皮源性腫瘤細(xì)胞，因此，它應(yīng)該表達(dá)一定的細(xì)胞角蛋白(CK)分子。發(fā)明人對(duì)EC9706進(jìn)行了一系列CK分子的免疫熒光的檢測(cè)，最終選擇了表達(dá)強(qiáng)度較高的CK18作為鑒定EC9706特征的標(biāo)記。CK18陽(yáng)性染色為綠色熒光(圖 2)。5)細(xì)胞DNA含量分析為了進(jìn)一步確定發(fā)明人得到的克隆，發(fā)明人對(duì)所挑選的克隆進(jìn)行了 DNA含量的檢測(cè)，正常hMSCsDNA含量為2η，而EC9706的DNA含量為如，得到的融合細(xì)胞DNA含量應(yīng)該在6η、小于6η或大于6n (如圖3)。在經(jīng)過(guò)以上五步的篩選，發(fā)明人最終挑選出3個(gè)⑶90+、⑶106+、CKlS+且染色體為
76n的克隆，并用這三個(gè)克隆進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2. hMSC與HSC對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞成瘤的抑制作用DhMSC對(duì)EC9706細(xì)胞成瘤的抑制作用發(fā)明人從hMSCs對(duì)實(shí)體瘤治療這一目的出發(fā)，進(jìn)行了細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。而評(píng)價(jià)治療腫瘤療效在細(xì)胞水平的重要實(shí)驗(yàn)通常是對(duì)腫瘤細(xì)胞成瘤能力的檢測(cè)。如果hMSCs對(duì)食管癌具有治療作用，則融合細(xì)胞的成瘤能力必然發(fā)生變化。因此發(fā)明人首先從增殖能力的檢測(cè)進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。通常檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)有軟瓊脂集落形成和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。a.軟瓊脂集落形成軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)是反映非錨著依賴(lài)性生長(zhǎng)的細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，由于它與體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)具有很好的一致性，因此在腫瘤學(xué)的實(shí)驗(yàn)中被廣泛采用?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆細(xì)胞形成率差別也很大，一般原代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，到基本形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。發(fā)明人用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)在體外檢測(cè)融合細(xì)胞的克隆形成能力，3周后，用染料染色觀察， EC9706和融合細(xì)胞均形成了克隆。融合細(xì)胞形成的克隆與EC9706相比，形成的克隆數(shù)量少，而且體積也小，克隆形成率明顯小于EC9706組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)(圖 4)。差異有顯著性，表明細(xì)胞融合對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。2)hMSCs與EC9706融合在免疫缺陷鼠皮下成瘤在軟瓊脂集落形成試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人又進(jìn)行了 hMSCs與EC9706融合后對(duì)免疫缺陷鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。在4周齡雌性SCID鼠左腋窩皮下以5X IO5/只的數(shù)量級(jí)接種細(xì)胞，每組6只SCID鼠。EC9706在第 8天就可在皮下觸及粟粒大小腫塊，而融合細(xì)胞只有FC3在15天時(shí)才可觸及粟粒大小的腫塊，F(xiàn)C1、FC2組在27天時(shí)才可觸及腫塊。接種后5周，引頸處死SCID小鼠。取出成瘤，稱(chēng)重，EC9706組腫瘤重量明顯比融合細(xì)胞組大，且6只全部成瘤，而融合細(xì)胞中FCl只有2只成瘤，F(xiàn)C2組只有4只成瘤，F(xiàn)C3有6只成瘤(表1)。由于FCl和FC2所成腫瘤較小，肉眼就有極顯著的差異，因此發(fā)明人只對(duì)FC3與EC9706組進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。EC9706與FC3相比差異具有顯著性(P <0.01)。瘤組織經(jīng)10%甲醛固定后，石蠟包埋，HE染色病理分析表明，瘤組織為鱗狀上皮癌，癌細(xì)胞呈巢狀分布，實(shí)質(zhì)與間質(zhì)分界清楚。表1 :EC9706和FC細(xì)胞接種裸鼠后的成瘤重量
權(quán)利要求
1.人成體干細(xì)胞在制備治療惡性實(shí)體瘤的細(xì)胞制劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的人成體干細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的人成體干細(xì)胞為人造血干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的惡性實(shí)體瘤為人食管癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的細(xì)胞制劑通過(guò)移植給予受治療者。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的細(xì)胞制劑通過(guò)靜脈輸注給予受治療者。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的細(xì)胞制劑包括非凍存的細(xì)胞制劑和凍存的細(xì)胞制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的凍存的細(xì)胞制劑包含冷凍保存劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述的冷凍保存劑包括甘油、二甲基亞砜、丙二醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、右旋糖酐、乳糖蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及人成體干細(xì)胞在治療惡性實(shí)體瘤中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及人成體干細(xì)胞在制備治療惡性實(shí)體瘤的細(xì)胞制劑中的用途。發(fā)明人以人間充質(zhì)干細(xì)胞和人造血干細(xì)胞分別與人食管癌細(xì)胞融合，并將融合細(xì)胞注入SCID/小鼠和裸鼠，融合細(xì)胞成瘤數(shù)明顯減少，其體積也縮小。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑可以顯著抑制惡性實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102188446SQ201010125040
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者陸士新 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所