專利名稱：包含纖連蛋白ed－b結(jié)構(gòu)域的特異抗體的綴合物和其在檢測和治療腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用結(jié)合放射性核素的新肽診斷和治療腫瘤的新方法。
背景技術(shù)：
腫瘤如果不形成新的血管(血管發(fā)生)其重量在一定程度上不能再增加，針對許多腫瘤已經(jīng)報道了微血管密度與腫瘤侵染力之間的關(guān)系(Folkman(1995)，Nature Med.1，27-31)。另外，血管發(fā)生參與導(dǎo)致失明的大多數(shù)眼部疾病(Lee等，Surv.Ophthalmol.43，245-269(1998)；Friedlander，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，9764-9769(1996))。能選擇性定向血管發(fā)生標(biāo)記物的分子產(chǎn)生診斷和治療腫瘤及其它的特征在于血管增殖，如糖尿病視網(wǎng)膜病變及年齡相關(guān)性黃斑變性的疾病的臨床機(jī)會。血管發(fā)生的標(biāo)記物在與腫瘤相關(guān)血管的大多數(shù)侵潤性實(shí)體腫瘤中表達(dá)，并由此易于受靜脈內(nèi)注入的特異性結(jié)合劑影響(Pasqualini等，(1997)，Nature Biotechnol.，15，542-546；Neir等(1997)，Nature Biotechnol.15，1271-1275)。定向閉塞新血管系可使腫瘤梗死及壞死(O′Reilly等(1996)，Nature Med.2，689-692；Huang等(1997)，Science 275，547-550)。
纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域，是在小鼠，大鼠和人體內(nèi)相同的一個91個氨基酸的序列，通過選擇性剪接插入纖連蛋白分子中，特異性聚集在新血管結(jié)構(gòu)周圍(Castellani等(1994)，Int.J.Cancer 59，612-618)，可以作為分子干涉的目標(biāo)。目前通過熒光技術(shù)確實(shí)已經(jīng)示出抗ED-B單鏈Fv抗體片段(scFv)選擇性聚集在攜帶腫瘤的小鼠的腫瘤血管周圍，抗體親和性指導(dǎo)了定向過程(Neri等(1997)，Nature Biotechnol.15，1271-1275；WO 97/45544)。
另外，具有亞納摩爾解離常數(shù)的特異結(jié)合纖連蛋白ED-B結(jié)構(gòu)域的抗體和抗體片段及其放射標(biāo)記的衍生物于WO 99/58570中描述。這些高親和性人抗體片段之一稱為L19的125I標(biāo)記的抗體片段的生物分布已經(jīng)在攜帶腫瘤的小鼠中加以研究(Tarli等，Blood，第94卷，No.1(1999)，p.192-198)。包含L19抗體的放射標(biāo)記的綴合物及其在檢測和處理血管發(fā)生中的應(yīng)用于WO 01/62800中揭示。
在甲醇酵母(Pichia pastoris)中與纖連蛋白的B同種型的ED-B結(jié)構(gòu)域結(jié)合的功能化單鏈Fv抗體片段的重組生產(chǎn)已經(jīng)加以描述(Marty等，Protein Expression and Purification 21，156-164(2001))。
另外，用99mTc通過C末端半胱氨酰肽放射標(biāo)記scFv抗體片段由George等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第92卷pp.8358-8362，1995，及Verhaar等，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996加以描述。
然而，臨床上仍需要提供具有改良的藥物動力學(xué)性質(zhì)的抗體片段，而且其可易于用放射性同位素標(biāo)記，例如用锝或錸標(biāo)記，因?yàn)檫@些放射性核素特別適合于放射性藥物。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供具有改良的藥物動力學(xué)性質(zhì)的抗體片段，特別是具有靶特異性和/或體內(nèi)穩(wěn)定性，并可以易于結(jié)合放射性核素例如锝或錸。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了包含一種肽的化合物，所述肽包含aa)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(extra domain B，ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的序列，包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR3和/或LCDR3或其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的序列，其包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR1區(qū)的最多3個氨基酸、HCDR2區(qū)的最多8個氨基酸、HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸、LCDR1區(qū)的最多6個氨基酸、LCDR2區(qū)的最多4個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；或者ac)SEQ ID NO1(L19)的序列或SEQ ID NO1的變體，所述變體缺失，插入和/或取代最多30個氨基酸，其與SEQ IDNO1所示肽具有相同功能；及ba)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均單獨(dú)代表任何天然發(fā)生的氨基酸，或者bb)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均單獨(dú)代表天然發(fā)生的氨基酸，或者bc)一個氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之間的一個整數(shù)，其中aa)，ab)或ac)的C末端通過一個肽鍵與SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端結(jié)合。
所述化合物優(yōu)選是單鏈抗體片段，特別是scFv片段。另外，所述化合物優(yōu)選與放射性同位素綴合，例如锝放射性同位素如94mTc，99mTc，錸如186Re，188Re，或其它同位素如203Pb，67Ga，68Ga，43Sc，44Sc，47Sc，110mIn，111In，97Ru，62Cu，64Cu，67Cu，68Cu，86Y，88Y，90Y，121Sn，161Tb，153Sm，166Ho，105Rh，177Lu，72As及18F。
本發(fā)明還描述了一種藥物組合物，其包含作為活性劑的上述化合物及生理學(xué)合適的佐劑，稀釋劑和/或載體。
本發(fā)明還描述了一種肽的應(yīng)用，所述肽包含aa)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的序列，包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR3和/或LCDR3或其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的序列，其包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR1區(qū)的最多3個氨基酸、HCDR2區(qū)的最多8個氨基酸、HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸、LCDR1區(qū)的最多6個氨基酸、LCDR2區(qū)的最多4個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ac)SEQ ID NO1(L19)所示序列或者SEQ ID NO1的變體，所述變體缺失，插入和/或取代最多30個氨基酸并與SEQ IDNO1所示肽具有相同功能，及ba)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均單獨(dú)代表任何天然發(fā)生的氨基酸，或者
bb)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均單獨(dú)代表任何天然發(fā)生的氨基酸，或者bc)一個氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之間的一個整數(shù)，其中aa)，ab)或ac)的C末端通過一個肽鍵與SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端結(jié)合，以結(jié)合放射性同位素，例如锝或錸的放射性同位素。
抗體片段L19通過以下序列(SEQ ID NO1)闡明(VH)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFSSFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYYADSVKGRETI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS(接頭)GDGSSGGSGG ASTG(VL)EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVSSSFLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQQTGRIPPTFG QGTKVEIK最多30個氨基酸的缺失，插入和/或取代是SEQ ID NO1的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1 3，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個氨基酸的缺失，插入和/或取代。然而，在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)內(nèi)，所述要求保護(hù)的肽，例如SEQ ID NO1所示肽的氨基酸(aa)缺失，插入和/或取代所致的變異應(yīng)不超過下表1所示的最大變異(HCDR重鏈的CDR；LCDR輕鏈的CDR)。
表1

CDR根據(jù)E.A.Kabat等，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，U.S.Department of Health and Human Services，NationalInstitutes for Health，Bethesda，MD，5th Edition，1991闡明。
優(yōu)選的肽包含SEQ ID NO1(L19)所示序列或者SEQ ID NO1的變異，所述變異為缺失，插入和/或取代最多20個氨基酸。
包含表1所示CDR序列的變異和特別是SEQ ID NO1的缺失，插入和/或取代所致的與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能的變異的一種肽，定義為與纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域結(jié)合的一種肽，其用BIAcore測定的解離常數(shù)Kd在亞納摩爾范圍(即小于10-9)(見WO 99/58570，實(shí)施例2和表2)。
優(yōu)選的氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQ ID NO5)及Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO6)。最優(yōu)選的是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQ ID NO5)。
優(yōu)選的氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)及Gly-Cys-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO8)。最優(yōu)選的是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)。
在包含氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)的化合物中，優(yōu)選其中n代表整數(shù)6的那些化合物。
優(yōu)選的锝或錸的放射性同位素是同位素94mTc，99mTc，186Re和188Re。最優(yōu)選的是放射性同位素99mTc。
發(fā)明詳述單鏈抗體片段L19(SEQ ID NO1)預(yù)先用125I標(biāo)記以研究這種化合物在攜帶腫瘤的小鼠中的生物分布(Tarli等，Blood，第94卷，No.1(1999)，p.192-198)。結(jié)果示出可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)選擇性定向腫瘤血管。然而令人驚奇地發(fā)現(xiàn)單鏈抗體片段L19當(dāng)與ba)，bb)或bc)肽綴合并用锝或錸的放射性同位素標(biāo)記時，其藥物動力學(xué)性質(zhì)充分改良。同位素99mTc是常規(guī)臨床SPECT的放射標(biāo)記，歸因于其放射化學(xué)性質(zhì)(易于通過99Mo/99mTc發(fā)生器獲得，激發(fā)140KeV單一γ光子，具有高光子流量，及半衰期為6小時)及其成本效率。針對治療性應(yīng)用，特別優(yōu)選用化學(xué)類似的同位素186Re和188Re標(biāo)記(Hsieh，B.T.等，Nucl.Med.Biol.1999，26(8)，967-972；973-976，Zamora，P.O.等，Anticancer Res.，1997，17(3B)，1803-1838)。
本發(fā)明的肽是抗纖連蛋白的胞外ED-B結(jié)構(gòu)域的重組scFv抗體L19(SEQ ID NO1)的衍生物，通過

圖1所示遺傳工程產(chǎn)生。產(chǎn)生了以下肽L19(SEQ ID NO1)L19His1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKAAALEHHHHHH(SEQ ID NO9)AP381 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC(SEQ ID NO10)AP391 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC A(SEQ ID NO11)L19-GlyCysGlyCys1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC(SEQ ID NO12)L19-GlyCysGlyCysAla1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC A(SEQ ID NO13)所述肽的生產(chǎn)在以下實(shí)施例中詳細(xì)描述(見實(shí)驗(yàn)部分)。
抗體片段L19最初通過在大腸桿菌中(E.coli)表達(dá)而產(chǎn)生(見WO 99/58570)。然而，為大規(guī)模生產(chǎn)scFv抗體片段，發(fā)現(xiàn)這種表達(dá)系統(tǒng)未盡如人意。對另一種表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，特別是甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了測試。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)酵母例如甲醇酵母，其通常能表達(dá)高生物活性的抗體片段，例如片段AP39，但為生物制藥的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)所必需的每升培養(yǎng)物高產(chǎn)量表達(dá)最多250mg抗體片段僅能通過組成型表達(dá)載體(例如pGAP)達(dá)到，用甲醇誘導(dǎo)的載體(例如pPIC9K)不能達(dá)到。這種組成型表達(dá)系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是其與可誘導(dǎo)的酵母表達(dá)相比發(fā)酵程序簡便及充分。出乎意料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)使用一種表達(dá)盒時才觀測到抗體片段，例如片段AP39的正確信號序列加工，所述表達(dá)盒中所述片段的N末端與來自α信號序列的Kex2切割位點(diǎn)直接融合。
所述肽適于診斷及治療應(yīng)用，尤其診斷及治療侵染性腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的診斷應(yīng)用是SPECT(單光子發(fā)射計算機(jī)X線斷層攝影術(shù))及PET(正電子發(fā)射X線斷層攝影術(shù))。
上述肽特別適于用上述放射性同位素標(biāo)記，例如锝和錸的放射性同位素，優(yōu)選放射性核素94mTc，99mTc，186Re和188Re。為標(biāo)記所述肽，首先將所述肽用合適的還原劑還原，所述還原劑例如氯化亞錫或Tris(2-羧乙基)磷化氫(TCEP)。所得還原的肽呈現(xiàn)SH基團(tuán)，所述SH基團(tuán)能與99mTc發(fā)生器洗脫物或188Re發(fā)生器洗脫物及氯化亞錫反應(yīng)為本發(fā)明化合物(詳見以下實(shí)施例)。間接標(biāo)記通過預(yù)先綴合一種螯合配體及隨后絡(luò)合放射性同位素如銦，釔，鑭系元素等而進(jìn)行。所述鰲合配體優(yōu)選衍生自乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，環(huán)己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)，乙二醇-O，O′-雙(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-雙乙酰(HBED)，三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)，1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N-四乙酸(DOTA)，1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)及1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(TETA)，所述肽化合物的胺或硫羥基團(tuán)。所述鰲合配體具有合適的偶聯(lián)基團(tuán)，例如活性酯，馬來酰亞胺，硫代氨基甲酸鹽或α-鹵代乙酰胺部分。為將螯合配體與氨基基團(tuán)例如賴氨酸殘基的ε-NH2基團(tuán)綴合，不需要預(yù)先還原所述肽化合物。放射標(biāo)記的肽適于放射性診斷及放射性治療應(yīng)用。
所得放射標(biāo)記的肽在動物實(shí)驗(yàn)中示出未曾預(yù)料的優(yōu)勢。例如，在裸鼠中出現(xiàn)標(biāo)記的肽，例如99mTc-標(biāo)記的AP39(SEQ ID NO11)的排泄達(dá)到70％或更多，例如在24小時內(nèi)通過腎排泄80.63％，而針對用125I標(biāo)記的L19(SEQ ID NO1)，在裸鼠中在24小時內(nèi)通過腎的排泄僅為67.79％。標(biāo)記的肽例如99mTc-標(biāo)記的AP39的腫瘤與血液比率為5∶1或更多，優(yōu)選8∶1或更多，例如在5小時后為大約10∶1，而針對用125I標(biāo)記的L19，這個比率僅為大約3∶1。這是與用99mTc標(biāo)記的其它scFv抗體相比的一個未曾預(yù)料的特性，所述99mTc標(biāo)記的其它scFv抗體通常示出較少有利的生物分布特性。例如，Verhaar等，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996報道了一種99mTc-標(biāo)記的scFv抗體，其示出在24小時后腫瘤與血液比率僅為4∶1，在24小時后腎蓄積為9％，這與本發(fā)明所述肽的數(shù)值相比非常高，例如針對99mTc-標(biāo)記的AP39為1.3％(見以下實(shí)施例13)。
另外，本發(fā)明標(biāo)記的肽例如99mTc-標(biāo)記的AP39的體內(nèi)穩(wěn)定性與用125I標(biāo)記的L19的體內(nèi)穩(wěn)定性相比更高。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在注射一種肽例如99mTc-標(biāo)記的AP39之后2小時，由于代謝物所致，血清中放射活性僅為10％或更低，例如為3％，而在注射用125I標(biāo)記的L19之后2小時，由于代謝物所致，血清中放射活性為49％，所述代謝物可以是游離碘。所述肽例如99mTc-標(biāo)記的AP39的改良的體內(nèi)穩(wěn)定性也可以通過其與靶ED-B的結(jié)合能力延長所反映。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在注射所述肽例如99mTc-標(biāo)記的AP39之后2小時，血清中50％或更多例如74％的放射活性能結(jié)合ED-B，而在注射125I標(biāo)記的L19之后2小時，血清內(nèi)僅27％的放射活性可結(jié)合ED-B。本發(fā)明的化合物還示出高度腫瘤蓄積。例如，Tc-99m-AP39和In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39在注射后1小時呈現(xiàn)高度腫瘤蓄積，分別為10.7％(Tc-99m)或12.9％(In-111)注射劑量每克(ID/g)。由此，腫瘤吸收與其它已知In-111或Tc-99m標(biāo)記的抗體片段相比明顯較高(例如Kobayashi等，J.Nuc.Med.，Vol.41(4)，pp.755-762，2000；Verhaar等，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996)。
所述化合物適于診斷和治療應(yīng)用。它們優(yōu)選通過腸胃外給予，更優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射而應(yīng)用于患者。針對放射診斷應(yīng)用，人體劑量優(yōu)選在0.1-1mg/人，針對放射治療應(yīng)用為0.1-100mg/人。
生產(chǎn)及標(biāo)記本發(fā)明化合物的方法在以下實(shí)施例中更充分舉例示出。這些實(shí)施例只是舉例示出了本發(fā)明而無限制之意。
實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)生L19衍生物抗纖連蛋白剪接變體的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的一種重組抗體(scFvL19，簡稱L19)作為起始物。scFv L19已經(jīng)通過噬菌體展示選擇從合成的人抗體全部組成成分中分離(Neri等，1997，Nature Biotechnol.151271；Pini等1998，J.Biol.Chem.27321769)。這種重組抗體片段是所謂的單鏈抗體片段形式(scFv)并由通過接頭序列連接的VH和VL區(qū)域組成(見SEQ ID NO1)。這種scFv L19對ED B具有特別高的親和性(Kd5.4×10-11M)。
通過遺傳操縱產(chǎn)生L19的多種衍生物(見圖1)。為修飾L19，將scFv編碼DNA通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增，使用編碼額外序列的引物進(jìn)行，并克隆入表達(dá)載體中。
L19衍生物L(fēng)19無額外末端修飾L19 HisC-末端His6結(jié)構(gòu)域(His標(biāo)簽)，用于Ni鰲合層析及結(jié)合放射性同位素
AP38C-末端GlyGlyGlyCys結(jié)構(gòu)域，用以(通過Cys)結(jié)合可以用于治療和診斷中的物質(zhì)(例如放射性同位素)AP39C-末端GlyGlyGlyCysAla結(jié)構(gòu)域，用以(通過Cys)結(jié)合可以用于治療和診斷的物質(zhì)(例如放射性同位素)L19-GlyCysGlyCysC-末端GlyCysGlyCys結(jié)構(gòu)域，用以(通過Cys)結(jié)合可以用于治療和診斷的物質(zhì)(例如放射性同位素)L19-GlyCysGlyCysAlaC-末端GlyCysGlyCysAla結(jié)構(gòu)域，用以(通過Cys)結(jié)合可以用于治療和診斷的物質(zhì)(例如放射性同位素)L19衍生物的重組生產(chǎn)所述L19衍生物在原核及真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)。
a)在大腸桿菌中生產(chǎn)L19將編碼多種L19衍生物(AP38，AP39，L19-GlyCysGlyCys，L19-GlyCysGlyCysAla，L19，L19His)的DNA序列克隆入具有IPTG可誘導(dǎo)啟動子及氨芐青霉素抗性標(biāo)記的原核表達(dá)載體中(pDN5，Pini等，1997，J.Immunol.Methods 206171；Pini等，1998，J.Biol.Chem.27321769；pET，Novagen)。為使重組蛋白可能分泌入周質(zhì)中，使用該載體生產(chǎn)一種表達(dá)盒，其中scFv的N末端與Pel B信號序列融合。通過用這種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(TG1，BL21 DE3和HB2151)，隨后進(jìn)行氨芐青霉素選擇，可以確定穩(wěn)定的生產(chǎn)菌株。為生產(chǎn)scFv，將這些菌株在存在1％葡萄糖的情況下在生長相(37℃)培養(yǎng)以阻抑啟動子。培養(yǎng)物中scFv的表達(dá)通過加入IPTG及在30℃孵育最多16小時而誘導(dǎo)。可溶的及抗原結(jié)合scFv物質(zhì)可以分離自大腸桿菌的完整提取物，分離自周質(zhì)部分或者，分離自培養(yǎng)上清，這被證實(shí)在純化和生產(chǎn)中特別有效。在培養(yǎng)體積為最多10升的搖瓶及發(fā)酵罐中進(jìn)行生產(chǎn)。
b)在甲醇酵母中生產(chǎn)L19衍生物將L19His，AP38，AP39，L19-GlyCysGlyCys和L19-GlyCysGlyCysAla編碼DNA序列通過PCR擴(kuò)增并克隆入大腸桿菌和表達(dá)載體pPIC9K和pGAP(Invitrogen)中，以在甲醇酵母中進(jìn)行生產(chǎn)。為表達(dá)異源基因，pPIC9K含有一個甲醇可誘導(dǎo)的啟動子(AOX1)，pGAP含有GAPDH酶的組成型啟動子。另外，這些載體分別含有一個遺傳霉素抗性基因和一個zeocin抗性基因以選擇/擴(kuò)增外源基因，及一個信號序列(來自酵母α因子)以表達(dá)和分泌重組產(chǎn)物。AP39表達(dá)盒用于編碼一個融合蛋白(α因子信號序列+L19衍生物)，其僅含有用于消除信號序列的一個Kex2切割位點(diǎn)，不含天然α因子加工的其它切割位點(diǎn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PP克隆通過將線性化載體電穿孔入甲醇酵母株(例如將pPIC9K-AP39電穿孔入GS115中，將pGAP-AP39電穿孔入X33)中及隨后經(jīng)遺傳霉素或zeocin選擇而確定。可以使用這些克隆生產(chǎn)所述可溶的分泌蛋白L19衍生物。將克隆在BMGY培養(yǎng)基或基本礦物質(zhì)培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)。針對基于pPIC的克隆，在表達(dá)相期間加入甲醇以誘導(dǎo)啟動子。重組產(chǎn)物具有正確加工的末端及高抗原結(jié)合活性。根據(jù)培養(yǎng)條件和加工控制，可以達(dá)到的產(chǎn)量(每升培養(yǎng)上清未純化的生物活性產(chǎn)物) 是例如pPIC9K-AP39/GS115(搖瓶5mg/l，發(fā)酵罐10-15mg/))；pGAP-AP39/X33(搖瓶30-40mg/l，發(fā)酵罐100-250mg/l)。
使用親和性層析(rProtein A，Streamline Pharmacia或ED B抗原層析柱)及隨后的大小排阻層析從甲醇酵母或大腸桿菌培養(yǎng)上清中純化L19衍生物。純化的AP39級分用于進(jìn)一步加工，其具有同源二聚體結(jié)構(gòu)(具有大部分共價連接的亞單位)和高抗原結(jié)合活性。
實(shí)施例2a合成還原的AP38[還原的L19-(Gly)3-Cys-OH]向240μg(4.29nmol)的S-S-二聚AP38于156μl PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)/10％甘油中的溶液中加入50μl TCEP-溶液(14.34mg TCEP×HCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)。將該反應(yīng)混合物在室溫輕輕搖動1小時。SH-單體AP38通過凝膠層析純化，使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)進(jìn)行。經(jīng)SDS-PAGE分析分離的產(chǎn)物檢驗(yàn)S-S-二聚體-AP38向SH-單體AP38的定量轉(zhuǎn)化。
產(chǎn)量79.4μg/220μl PBS(33.1％)。
實(shí)施例2b合成Tc-99m-AP3 8[Tc-99m-L19-(Gly)3-Cys-OH]將2.37mg的L-酒石酸二鈉置于一個小瓶中，隨后加入于220μlPBS中的79.4μg還原的AP38，并將該溶液用100μl的Na2HPO4-緩沖液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入50μl Tc-99m發(fā)生器洗脫物(24小時)和10μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。將該反應(yīng)混合物在37℃搖動0.5小時。Tc-99m標(biāo)記的AP38使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量39.7％。
放射化學(xué)純度92.5％(SDS-PAGE)。
比活性17.7 MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性88.7％。
實(shí)施例3a合成還原的AP39[還原的L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH]向240μg(4.29nmol)S-S-二聚體AP39于135μl PBS的/10％甘油中的溶液中加入50μl TCEP-溶液(14.34mg TCEP×HCl/5mlNa2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)。將該反應(yīng)混合物在室溫輕輕搖動1小時。SH-單體AP39通過凝膠層析純化，使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)進(jìn)行。經(jīng)SDS-PAGE分析分離的產(chǎn)物檢驗(yàn)S-S-二聚體AP39向SH-單體AP39的定量轉(zhuǎn)化。
產(chǎn)量135.9μg/180μl PBS(56.2％)。
實(shí)施例3b合成Tc-99m-AP39[Tc-99m-L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH]將4.2mg L-酒石酸二鈉置于一個小瓶中，隨后加入于180μl PBS中的135.9μg還原的AP39，并將該溶液用100μl Na2HPO4-緩沖液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入100μl Tc-99m發(fā)生器洗脫物(24小時)和10μlSnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。將該反應(yīng)混合物在37℃搖動0.5小時。Tc-99m標(biāo)記的AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量50.1％。
放射化學(xué)純度91.5％(SDS-PAGE)。
比活性21.4MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性96.4％。
實(shí)施例4合成Re-188-AP38[Re-188-L19-(Gly)3-Cys-OH]將2.37mg L-酒石酸二鈉置于一個小瓶中，隨后加入于310μlPBS中的112μg還原的AP38，并將該溶液用100μl Na2HPO4緩沖液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入100μl Re-188發(fā)生器洗脫物和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。將該反應(yīng)混合物在37℃搖動1.5小時。Re-188標(biāo)記的AP38使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量28.3％。
放射化學(xué)純度91.1％(SDS-PAGE)。
比活性15.3MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性89.9％。
實(shí)施例5合成Re-1 88-AP39[Re-188-L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH]將2.37mg L-酒石酸二鈉置于一個小瓶中，隨后加入于303μlPBS中的112μg還原的AP39，并將該溶液用100μl Na2HPO4緩沖液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入100μl Re-188發(fā)生器洗脫物和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。將該反應(yīng)混合物在37℃搖動1.5小時。Re-188標(biāo)記的AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量33.5％。
放射化學(xué)純度92.3％(SDS-PAGE)。
比活性18.5 MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性92.5％。
實(shí)施例6a合成還原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH向240μg(4.29nmol)S-S-二聚體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH于160μl PBS/10％甘油中的溶液中加入75μl TCEP-溶液(14.34mgTCEP×HCl/5ml Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)。將該反應(yīng)混合物在室溫輕輕搖動1小時。SH-單體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。經(jīng)SDS-PAGE分析分離的產(chǎn)物檢驗(yàn)S-S-二聚體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH向SH-單體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH的定量轉(zhuǎn)化。
產(chǎn)量80.4μg/210μl PBS(33.5％)。
實(shí)施例6b合成Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH將2.37mg L-酒石酸二鈉置于一個小瓶中，隨后加入于210μlPBS中的80.4μg還原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH，并將該溶液用100μl Na2HPO4緩沖液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入50μl Tc-99m發(fā)生器洗脫物(24小時)和10μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。將反應(yīng)混合物在37℃搖動0.5小時。Tc-99m標(biāo)記的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量37.7％。
放射化學(xué)純度91.5％(SDS-PAGE)。
比活性19.7MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性89.7％。
實(shí)施例7a合成還原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH向240μg(4.29nmol)S-S-二聚體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH于155μl PBS/10％甘油中的溶液中加入75μl TCEP-溶液(14.34mgTCEP×HCl/5ml Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)。將該反應(yīng)混合物在室溫輕輕搖動1小時。SH-單體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。經(jīng)SDS-PAGE分析分離的產(chǎn)物檢驗(yàn)S-S-二聚體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH向SH-單體L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH的定量轉(zhuǎn)化。
產(chǎn)量81.2μg/215μl PBS(33.8％)。
實(shí)施例7b合成Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH將2.37mg L-酒石酸二鈉置于一個小瓶中，隨后加入于215μlPBS中的81.2μg還原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH，并將該溶液用100μl Na2HPO4緩沖液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入50μl Tc-99m發(fā)生器洗脫物(24小時)和10μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。將該反應(yīng)混合物在37℃搖動0.5小時。Tc-99m標(biāo)記的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量35.6％。
放射化學(xué)純度93.5％(SDS-PAGE)。
比活性19.1MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性88.7％。
實(shí)施例8a合成還原的AP39以將EDTA，CDTA，TETA，DTPA，TTHA，HBED，DOTA，NOTA和DO3A型螯合劑特異性綴合于半胱氨酸-SH基團(tuán)將50μl TCEP溶液(14.34mg TCEP×HCl/5ml Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)加入于450μl PBS中的400μg(7.1nmol)AP39溶液中。將反應(yīng)混合物在37℃輕輕搖動1小時。還原的AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液乙酸鈉緩沖液，0.1M，pH 5.0)通過凝膠層析純化。經(jīng)SDS-PAGE分析分離的產(chǎn)物檢驗(yàn)AP39完全轉(zhuǎn)化為還原的AP39的情況。
產(chǎn)量140μg/200μl(35％)。
實(shí)施例8b合成MX-DTPA-馬來酰亞胺(1，4，7-三氮雜-2-(N-馬來酰亞氨基亞乙基對氨基)芐基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷)將512mg(1mmol)的{[3-(4-氨基-苯基)-2-(二-羧甲基-氨基)-丙基]-[2-(二-羧甲基-氨基)-丙基]-氨基}-乙酸(Macrocyclics Inc.Dallas，TX，U.S.A.)和707mg(7mmol)三乙胺溶解于3ml無水DMF中。向1ml無水DMF中滴加400mg(1.5mmol)的3-(2，5-二氧-2，5-二氫-吡咯-1-基)-丙酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(Aldrich)。將該溶液在50℃攪動5小時。緩慢加入30ml二乙醚。將反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪動30分鐘。通過過濾收集沉淀(Principate)。粗產(chǎn)物通過RP-HPLC(乙腈∶水∶三氟乙酸/3∶96.9∶0.1→99.9∶0∶0.1)純化。
產(chǎn)量61％(405mg，0.61mmol)。
MS-ESI664＝M++1。
實(shí)施例8c合成In-111-MX-DTPA-馬來酰亞胺-S(Cys)-AP39-R(R＝還原的)將于200μl乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH 5)中的140μg(5nmol)AP39-R與50μl溶解的1，4，7-三氮雜-2-(N-馬來酰亞氨基亞乙基對氨基)芐基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷(于500μl，0.1M pH 5乙酸鈉緩沖液中的0.25mg DTPA-馬來酰亞胺)在37℃反應(yīng)3小時。將該反應(yīng)混合物用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH-6)透析2次，每次1小時，應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)進(jìn)行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)，并將反應(yīng)混合物在37℃加熱30分鐘。In-111標(biāo)記的DTPA-馬來酰亞胺-S(Cys)-AP39-R使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量54％。
放射化學(xué)純度94％(SDS-PAGE)。
比活性6.2MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性86％。
實(shí)施例9合成In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39將于111μl PBS中的200μg(3.6nmol)非還原的AP39用300μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)稀釋，并用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小時，使用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)進(jìn)行。加入50μl的1，4，7-三氮雜-2-(對異硫氰酸根合)芐基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基-6-甲基庚烷(MX-DTPA)溶液(溶解于500μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)中的0.33mg MX-DTPA)，并將反應(yīng)混合物在37℃加熱3小時。將該反應(yīng)混合物用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小時，及1次17小時(過夜)，均使用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)進(jìn)行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40 MBq，Amersham Inc.)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱30分鐘。In-111標(biāo)記的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量70％。
放射化學(xué)純度85％(SDS-PAGE)。
比活性7.6MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性74％。
實(shí)施例10合成In-111-DOTA-C-芐基-對-NCS-ε-HN(Lys)-AP39將于114μl PBS中的200μg(3.6nmol)非還原的AP39用300μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)稀釋，并用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小時，應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)進(jìn)行。將50μl的1，4，7，10-四氮雜-2-(對-異硫氰酸根合)芐基環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(芐基-對-SCN-DOTA，Macrocyclics Inc.，Dallas TX，U.S.A.)溶液(溶解于5ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)中的1.5mg芐基-對-SCN-DOTA)加入所述溶液中，將反應(yīng)混合物在37℃加熱3小時。將反應(yīng)混合物用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小時，及1次17小時(過夜)，均應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)進(jìn)行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40 MBq，Amersham Inc.)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱30分鐘。In-111標(biāo)記的DOTA-C-芐基-對-NCS-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量74％。
放射化學(xué)純度94％(SDS-PAGE)。
比活性12.3MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性73％。
實(shí)施例11合成Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39將于115μl PBS中的200μg(3.6nmol)非還原的AP39用300μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)稀釋，并用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小時，應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)進(jìn)行。加入50μl的MX-DTPA溶液(0.33mg MX-DTPA溶解于500μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)中)，并將反應(yīng)混合物在37℃加熱3小時。應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(PierceInc.，Rockford，IL，U.S.A.)將反應(yīng)混合物用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小時，及1次17小時(過夜)。
加入100μl[Y-88]YCl3溶液(HCl，1N，75 MBq，Oak RidgeNational Lab.)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱30分鐘。Y-88標(biāo)記的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量65％。
放射化學(xué)純度93％(SDS-PAGE)。
比活性10.2MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性72％。
實(shí)施例12合成Lu-177-DOTA-C-芐基-對-NCS-ε-HN(Lys)-AP3將于110μl PBS中的200μg(3.6nmol)非還原的AP39用300μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)稀釋，并應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小時。加入50μl的芐基-對-SCN-DOTA溶液(1.5 mg溶解于5ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH 8.5)中)，將反應(yīng)混合物在37℃加熱3小時。應(yīng)用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)將該反應(yīng)混合物用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH6.0)透析2次，每次1小時，及1次17小時(過夜)。
加入200μl[Lu-177]LuCl3溶液(HCl，1N，80MBq，NRH-Petten，Netherlands)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱30分鐘。Lu-177標(biāo)記的DOTA-C-芐基-對-NCS-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5層析柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠層析純化。
放射化學(xué)產(chǎn)量74％。
放射化學(xué)純度95％(SDS-PAGE)。
比活性19MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性71％。
實(shí)施例13在單次靜脈內(nèi)注射進(jìn)攜帶腫瘤的裸鼠后，在甲醇酵母中表達(dá)的Tc-99m-AP39的器官分布和排泄將本發(fā)明的物質(zhì)以大約74 kBq的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)注射入攜帶F9(畸胎癌)的動物體內(nèi)(體重為大約25g)。所述物質(zhì)在不同器官中的放射活性濃度及在排泄物中的放射活性，使用一種γ計數(shù)器在施用所述物質(zhì)后的不同時間測定。另外，基于本發(fā)明物質(zhì)在腫瘤和血液中的濃度在不同時間確定腫瘤與血液比率。
Tc-99m-AP39在攜帶F9(畸胎癌)的裸鼠中的生物分布示于表2(平均值±SD，n＝3)。
表2

Tc-99m-AP39在攜帶F9(畸胎癌)的裸鼠中的排泄示于表3(平均值±SD，n＝3)。
表3

Tc-99m-AP39在攜帶F9(畸胎癌)的裸鼠中的腫瘤血液比率示于圖2(平均值±SD，n＝3)。
這項(xiàng)研究結(jié)果示出本發(fā)明物質(zhì)在實(shí)體腫瘤中積累的極佳潛力，同時伴有極佳的排泄。
實(shí)施例14在單一靜脈內(nèi)注射入攜帶腫瘤的裸鼠后，In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39器官分布將本發(fā)明的物質(zhì)以大約48kBq劑量經(jīng)靜脈內(nèi)注射入攜帶F9(畸胎癌)的動物中(體重為大約25g)。所述物質(zhì)在不同器官中的放射性濃度及在排泄物中的放射性，使用一種γ計數(shù)器在施用所述物質(zhì)后的不同時間測定。
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39在攜帶F9(畸胎癌)的裸鼠中的生物分布示于表4(平均值±SD，n＝3)。
表4

In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39在攜帶F9(畸胎癌)的裸鼠中的腫瘤血液比率示于表5(平均SD，n＝3)。
表5

這項(xiàng)研究結(jié)果示出本發(fā)明物質(zhì)在實(shí)體腫瘤中積累的極佳潛力，及同時有極佳的生物分布及腫瘤血液比率。
實(shí)施例15在單次靜脈內(nèi)注射入攜帶腫瘤的裸鼠后，在甲醇酵母中表達(dá)的Tc-99m-AP39的成像(imaging)將本發(fā)明的物質(zhì)以大約9.25MBq劑量經(jīng)靜脈內(nèi)注射入攜帶F9(畸胎癌)的動物體內(nèi)(體重為大約25g)。在施用所述物質(zhì)后不同時間進(jìn)行γ相機(jī)成像(Gamma-camera imaging)。
攜帶F9(畸胎癌)的裸鼠中Tc-99m-AP39的平面閃爍掃描結(jié)果示于圖3和圖4。圖3示出在注射所述物質(zhì)后5小時的閃爍掃描圖，圖4在注射所述物質(zhì)24小時后的閃爍掃描圖。
這項(xiàng)研究的結(jié)果示出本發(fā)明的物質(zhì)具有成像實(shí)體腫瘤的極佳潛力。
序列表<110>舍林股份公司<120>包含纖連蛋白ED-B結(jié)構(gòu)域的特異抗體的綴合物和其在檢測和治療腫瘤中的應(yīng)用<130>27041P_WOAS<140>
<141>
<150>EP02 000 315.8<151>2002-01-03<150>US60/358702<151>2002-02-25<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>238<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>SITE<222>(1)..(116)<223>VH<220>
<221>SITE<222>(117)..(130)<223>Linker<220>
<221>SITE<222>(131)..(238)<223>VL<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(238)<223>deletion，insertion and/or substitution of up to30 amino acids<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>1Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser130 135 140Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser145 150 155 160Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg165 170 175Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg180 185 190Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg195 200 205Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg210 215 220Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235<210>2<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(3)<223>xaa each independently represent any naturallyoccuring amino acid<400>2Xaa Xaa Xaa Cys1
<210>3<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(3)<223>Xaa each independently represent any naturallyoccuring amino acid<220>
<221>VARIANT<222>(5)<223>Xaa represents any naturally occuring amino acid<400>3Xaa Xaa Xaa Cys Xaa1 5<210>4<211>1<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<220>
<221>REPEAT<222>(1)<223>His＝(His)n，wherein n stands for an integer from 4to 6<400>4His1<210>5<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>5Gly Gly Gly Cys1
<210>6<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>6Gly Cys Gly Cys1<210>7<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>7Gly Gly Gly Cys Ala1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>8Gly Cys Gly Cys Ala1 5<210>9<211>247<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>9Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Leu225 230 235 240Glu His His His His His His245<210>10<211>240<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>10Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Cys225 230 235 240<210>11<211>241<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>11Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Cys225 230 235 240Ala<210>12<211>240<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>12Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Cys Gly Cys225 230 235 240<210>13<211>241<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>13Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Cys Gly Cys225 230 235 240Ala
權(quán)利要求
1.包含一種肽的化合物，所述肽包含aa)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR3和/或LCDR3或其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR1區(qū)的最多3個氨基酸、HCDR2區(qū)的最多8個氨基酸、HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸、LCDR1區(qū)的最多6個氨基酸、LCDR2區(qū)的最多4個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；或者ac)SEQ ID NO1(L19)的序列或SEQ ID NO1的變體，所述變體缺失，插入和/或取代最多30個氨基酸，其與SEQ IDNO1所示肽具有相同功能；及ba)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均單獨(dú)代表任何天然發(fā)生的氨基酸，或者bb)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均單獨(dú)代表任何天然發(fā)生的氨基酸，或者bc)一個氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之間的一個整數(shù)，其中aa)，ab)或ac)的C末端通過一個肽鍵與SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQ ID NO5)或者Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO6)。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)或者Gly-Cys-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO8)。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)中的n是6。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的化合物，其與一種放射性同位素綴合。
6.權(quán)利要求6的化合物，其所綴合的放射性同位素選自锝的放射性同位素如94mTc，99mTc，錸的放射性同位素如186Re，188Re，或其它同位素如203Pb，67Ga，68Ga，43Sc，44Sc，47Sc，110mIn，111In，97Ru，62Cu，64Cu，67Cu，68Cu，86Y，88Y，90Y，121Sn，161Tb，153Sm，166Ho，105Rh，177Lu，72As及18F。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中所述放射性同位素是99mTc或188Re。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的化合物，其中所述肽是還原形式。
9.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的化合物作為活性劑，及生理學(xué)可接受的佐劑，載體和/或稀釋劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其在小鼠體內(nèi)在24小時內(nèi)通過腎排泄70％或更多。
11.權(quán)利要求9或10的組合物，其在小鼠體內(nèi)施用后5小時的腫瘤血液比率為5∶1或更多。
12.權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的組合物，其用于診斷性應(yīng)用。
13.權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的組合物，其用于治療性應(yīng)用。
14.一種肽在結(jié)合放射性同位素中的應(yīng)用，所述肽包含aa)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR3和/或LCDR3或其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含表1所示互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其變體，所述變體缺失，插入和/或取代HCDR1區(qū)的最多3個氨基酸、HCDR2區(qū)的最多8個氨基酸、HCDR3區(qū)的最多5個氨基酸、LCDR1區(qū)的最多6個氨基酸、LCDR2區(qū)的最多4個氨基酸及LCDR3區(qū)的最多6個氨基酸，其與SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；或者ac)SEQ ID NO1(L19)的序列或SEQ ID NO1的變體，所述變體缺失，插入和/或取代最多30個氨基酸，其與SEQ IDNO1所示肽具有相同功能；及ba)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均單獨(dú)代表任何天然發(fā)生的氨基酸，或者bb)一個氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均單獨(dú)代表天然發(fā)生的氨基酸，或者bc)一個氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之間的一個整數(shù)，其中aa)，ab)或ac)的C末端通過一個肽鍵與SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端結(jié)合。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中所述放射性同位素選自锝的放射性同位素如94mTc，99mTc，錸的放射性同位素如186Re，188Re，或其它同位素如203Pb，67Ga，68Ga，43Sc，44Sc，47Sc，110mIn，111In，97Ru，62Cu，64Cu，67Cu，68Cu，86Y，88Y，90Y，121Sn，161Tb，153Sm，166Ho，105Rh，177Lu，72As及18F。
16.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述放射性同位素是99mTc或188Re。
17.生產(chǎn)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽的生產(chǎn)方法，特征在于所述肽在真核細(xì)胞中尤其在酵母細(xì)胞中表達(dá)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述真核細(xì)胞是甲醇酵母(Pichiapastoris)細(xì)胞。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述肽組成型表達(dá)。
20.權(quán)利要求17-19任一項(xiàng)的方法，其中所述肽的N末端與來自α信號序列的Kex2切割位點(diǎn)直接融合。
21.用于生產(chǎn)放射性藥物的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的肽，任選地包含生理學(xué)可接受的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用結(jié)合放射性核素的肽診斷和治療腫瘤的方法。所述肽包含纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED－B)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
文檔編號A61K9/00GK1612895SQ03801943
公開日2005年5月4日 申請日期2003年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月3日
發(fā)明者克里斯托夫-斯特凡·希爾格, 迪特馬爾·貝恩多夫, 魯?shù)赂駹枴ざ】藸柌└? 迪特爾·英斯邁爾, 喬瓦尼·內(nèi)里 申請人:舍林股份公司