專利名稱：：核糖核酸酶與毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于DNA重組技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及核糖核酸酶與細(xì)菌毒蛋白(毒素)膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，利用基因工程技術(shù)制備該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在腫瘤治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：核糖核酸酶(Onconase又稱P30蛋白，Ranpirnase，簡(jiǎn)稱Onc)是從北方豹蛙(Ranapipiens)的卵母細(xì)胞和早期胚胎中分離得到的一種核酸酶，屬于RNaseA超家族。研究表明Onc通過(guò)胞吞作用進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在胞漿內(nèi)選擇性地降解tRNA，抑制蛋白質(zhì)生物合成進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和引起細(xì)胞凋亡。體外實(shí)驗(yàn)表明，Onc對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒性作用，如人的惡性間皮細(xì)胞瘤，非小細(xì)胞肺癌，前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞等。小鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，Onc可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，增強(qiáng)多種抗腫瘤藥物的效果。目前，One作為一種抗惡性間皮細(xì)胞瘤的藥物已經(jīng)進(jìn)入三期臨床，是一種具有良好前景的抗腫瘤藥物。最近，美國(guó)和澳大利亞已批準(zhǔn)Onconase作為非常見(jiàn)病藥物(OrphanDrug)投放市場(chǎng)。然而，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤細(xì)胞對(duì)One的敏感性不同(UlrichArnold&RenateUlbrich陽(yáng)Hofmann.Naturalandengineeredribonucleasesaspotentialcancertherapeutics.BiotechnolLett(2006)28:1615-1622)。這大大限制了Onc在腫瘤治療中的適用范圍。因此，本領(lǐng)域需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有更好的抑制腫瘤效果且廣譜性更強(qiáng)的抗腫瘤藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供核糖核酸酶與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，利用基因工程制備該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在腫瘤治療方面的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種融合蛋白，所述的融合蛋白包括-(1)核糖核酸酶(Onc);(2)細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；(3)位于(1)和(2)之間的由0-50個(gè)(較佳地為5-30個(gè)，更佳的為10-20個(gè))氨基酸構(gòu)成的連接肽。在另一優(yōu)選例中，所述的核糖核酸酶位于融合蛋白的氨基端；所述的細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域位于融合蛋白的羧基端。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域位于融合蛋白的氨基端，所述的核糖核酸酶位于融合蛋白的羧基端。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白基本上由(l)、(3)、(2)相連接而構(gòu)成。更佳地，所述的融合蛋白由(l)、(3)、(2)相連接而構(gòu)成。在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽的序列中包括至少一個(gè)胞內(nèi)蛋白酶的酶切位點(diǎn)序列，從而在進(jìn)入胞內(nèi)后將(1)和(2)分離。在另一優(yōu)選例中，所述的酶切位點(diǎn)序列不存在于核糖核酸酶序列或細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域序列上。在另一優(yōu)選例中，所述的胞內(nèi)蛋白酶是特異性位于細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶。在另一優(yōu)選例中，所述的胞內(nèi)酶選自(但不限于)Furin、基質(zhì)金屬蛋白酶、前列腺特有抗原和組織蛋白酶。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白在進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)酶酶切。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞毒蛋白選自(但不限于)白喉毒素(DT)或綠膿桿菌外毒素A(PE)。在另一優(yōu)選例中，所述的白喉毒素的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域是(a)如SEQIDNO:2中第121-308位的氨基酸序列的蛋白；或(b)將(a)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的蛋白功能的由(a)衍生的多肽；和/或所述的核糖核酸酶是(al)如SEQIDNO:2中第1-104位所示的氨基酸序列(較佳地由SEQIDNO:2中第l-104位的氨基酸序列構(gòu)成)；或(bl)將(al)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(al)所限定的蛋白功能的由(al)衍生的多肽；禾口/或所述的連接肽具有SEQIDNO:2中第105-120位所示的氨基酸序列(較佳地由SEQIDNO:2中第105-120位的氨基酸序列構(gòu)成)。較佳地，所述的融合蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種核酸分子，所述的核酸分子編碼所述的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的核酸分子。在本發(fā)明的第四方面，提供一種基因工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的載體；或所述的細(xì)胞基因組中整合有所述的核酸分子。在本發(fā)明的第五方面，提供一種產(chǎn)生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括(A)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述的融合蛋白；(B)分離出所述的融合蛋白。在本發(fā)明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或治療腫瘤的組合物。所述的腫瘤選自(但不限于)惡性間皮細(xì)胞瘤；肺癌；白血?。粣盒粤馨土?；骨髓瘤；惡性黑色素瘤；乳腺癌；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤；肝癌；鼻咽癌；食管癌；胃癌；結(jié)腸癌；前列腺癌；宮頸癌；口腔癌；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；軟組織腫瘤；骨腫瘤；或皮膚及附件腫瘤。在本發(fā)明的第七方面，提供一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或治療腫瘤的組合物，所述的組合物含有(i)有效量的所述的融合蛋白；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。另一方面，還提供一種抑制(如體外抑制)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述的方法包括利用所述的融合蛋白處理腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖1顯示了含ONC-DT融合蛋白基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET22b-ONC-DT加.39o的示意圖。圖2顯示了本發(fā)明Onc-DT203-39o的表達(dá)純化效果蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中，泳道l.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2.誘導(dǎo)前菌體總蛋白；泳道3.誘導(dǎo)3h后菌體總蛋白；泳道4.誘導(dǎo)后菌體包涵體；泳道5.復(fù)性并純化后Onc-DT2Q3-390。圖3顯示了MTT法測(cè)Onc-DT203.39o對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和人類白血病細(xì)胞K562的細(xì)胞毒性效果圖。其中，A:Onc-DT203.柳和One對(duì)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的細(xì)胞毒性作用比較。B:Onc-DT203.39o和Onc對(duì)人白血病細(xì)胞K562的細(xì)胞毒性作用比較。C:Onc-DT2Q3-39o和Onc對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y的細(xì)胞毒性作用比較。D:Onc-DT2。3.39o和Onc對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞株HL60的細(xì)胞毒性作用比較。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究和試驗(yàn)，首次將核糖核酸酶(Onc)基因和細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域基因融合在一起，并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，經(jīng)純化獲得了核糖核酸酶-細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。所述融合蛋白良好地保留了One的核酸酶活性，又提高了Onc進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)的能力和抗腫瘤的廣譜性，具有比One更優(yōu)異的殺腫瘤效果，對(duì)腫瘤細(xì)胞(包括一些原來(lái)對(duì)One不敏感的腫瘤細(xì)胞)的毒性大為增強(qiáng)(對(duì)不同細(xì)胞的毒性可分別提高10-1000倍)，從而可作為一種新的更有效更廣譜的抗腫瘤藥物。含有核糖核酸酶和細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核糖核酸酶和白喉毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白"、"ONC-DT融合蛋白"等可互換使用，都指由核糖核酸酶氨基酸序列和白喉毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒(méi)有連接肽序列。本發(fā)明提供一種融合蛋白，該蛋白包括Onc蛋白或其生物活性片段，和細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其生物活性片段，該分子能用于抑制腫瘤。更優(yōu)選的，所述的融合蛋白是一種分離的蛋白，與其它蛋白、多肽或分子無(wú)聯(lián)系，是重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)的純化產(chǎn)物或作為一種純化的提取物。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。核糖核酸酶任何適合的Onc均可用于制備本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明中的Onc是指一種多肽，能通過(guò)胞吞作用進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(特別是腫瘤細(xì)胞)，在胞漿內(nèi)選擇性降解tRNA，或其它RNA,從而抑制蛋白質(zhì)合成，并進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和引起細(xì)胞凋亡。Onc對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒性作用。Qnc或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使人們認(rèn)識(shí)到，一般來(lái)說(shuō)，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。見(jiàn)Watson等MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。表l是這種替換的一些示例。表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>可能還有其它的類似的可替換性，這種可替換性往往可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定或者根據(jù)已知的保守序列進(jìn)行確定。任何一種Onc的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，Onc的生物活性片段的含義是指作為一種多肽片段，在與毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域連接并形成融合蛋白后，其仍然能保持全長(zhǎng)的Onc的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50。/。的全長(zhǎng)Onc的抑制腫瘤活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的抑制腫瘤活性。經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如l-30個(gè)，較佳地l-20個(gè)，更佳的1-10個(gè)，進(jìn)一步的l-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Onc的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。所述的經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Onc也具有抑制腫瘤的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的Onc，比如，可采用為了延長(zhǎng)其半衰期、改善其穩(wěn)定性或增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞能力而加以修飾或改良的Onc。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的Onc或者基因可以是與天然存在的Onc或基因雖然具有一定的不同點(diǎn)，但也能殺傷腫瘤細(xì)胞，且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響或毒性。也就是說(shuō)，任何不影響Onc的生物活性或者說(shuō)是基因的生物功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的Onc的氨基酸序列可以與SEQIDNO:2中第1-104位所示的序列基本上相同。優(yōu)選的，所述的Onc具有SEQIDNO:2中第l-104位所示的序列；更優(yōu)選的，所述的Onc由SEQIDNO:2中第1-104位所示的序列構(gòu)成。細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域本發(fā)明的細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域是一類對(duì)毒素的的內(nèi)吞有作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。所述的細(xì)菌毒蛋白包括(但不限于)DT或PE。盡管已知DT與PE的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域有助于增強(qiáng)多種分子的內(nèi)吞，然而以往并不知道它們對(duì)于Onc的內(nèi)吞是否有作用。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)菌毒蛋白是DT，DT是白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素，其由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端為催化結(jié)構(gòu)域，中間為膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，C端為受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的作用為幫助催化結(jié)構(gòu)域穿過(guò)胞內(nèi)體質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)，發(fā)揮催化結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞毒性作用。DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列可能并不影響其活性。可采用的一部分氨基酸替換的示例見(jiàn)表l。可能還有其它的類似的可替換性，這種可替換性往往可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定或者根據(jù)已知的保守序列進(jìn)行確定。任何一種DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的生物活性片段的含義是指作為一種多肽片段，在與Onc連接并形成融合蛋白后，其仍然能保持完整的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的全部或部分功能。正常情況下，所述的生物活性片段至少保持5(T/。的完整DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。所述的經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域也具有幫助Onc穿透腫瘤細(xì)胞膜的功能。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，比如，可采用為了延長(zhǎng)其半衰期、改善其穩(wěn)定性、增強(qiáng)其穿透細(xì)胞的能力或增強(qiáng)其穿透細(xì)胞的特異性而改良的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或者基因可以是與天然存在的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或基因雖然具有一定的不同點(diǎn)，但也能幫助Onc穿透細(xì)胞膜，且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響或毒性。也就是說(shuō)，任何不影響DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的生物活性或者說(shuō)是基因的生物功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可以與SEQIDNO:2中第121-308位所示的序列基本上相同。優(yōu)選的，所述的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域具有SEQIDNO:2中第121-308位所示的序列；更優(yōu)選的，所述的DT膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域由SEQIDNO:2中第121-308位所示的序列構(gòu)成。連接所述的One或其活性片段和細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其活性片段之間可以直接相連接，或者通過(guò)多肽連接子(連接肽)連接。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方式，所述的Onc或其活性片段和細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其活性片段通過(guò)多肽連接子(連接肽)連接，從而形成融合蛋白。所述的連接子包括0-50個(gè)氨基酸；較佳地為5-30個(gè)氨基酸，更佳地為10-20個(gè)氨基酸。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的連接肽的序列中包括至少一個(gè)胞內(nèi)酶的酶切位點(diǎn)序列，且該酶切位點(diǎn)序列不存在于Onc序列或細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域序列上。因而，融合蛋白在細(xì)胞外不被酶切而高效地進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)后，在胞內(nèi)酶的作用下One與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域分離。作為本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的方式，所述的連接肽是含有Furin酶切位點(diǎn)的連接肽。細(xì)胞外環(huán)境通常為中性或微堿性的，而Furin只有在酸性條件下才發(fā)揮作用，當(dāng)融合蛋白進(jìn)入胞內(nèi)后，可在酸性小泡中被Furin酶切，從而使得One與毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域更易于被釋放到胞質(zhì)中。更優(yōu)選的，所述的連接肽具有SEQIDNO:2中第105-120位所示的氨基酸序列。作為一種優(yōu)選的方式，所述的Onc或其活性片段位于融合蛋白的氨基端(N端)；所述的毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其活性片段位于融合蛋白的羧基端(C端)?？蛇x擇地，也可互換兩種蛋白所處的位置，也即所述的Onc或其活性片段位于融合蛋白的羧基端；所述的毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其活性片段位于融合蛋白的氨基端。作為另一種方式，將所述的Onc和細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或它們的活性片段直接連接，比如把細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域與One的編碼基因直接連接，融合表達(dá)，二者之間不加氨基酸連接子。本發(fā)明人的結(jié)果顯示，Onc與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域之間加上本發(fā)明優(yōu)選的連接子比不加連接子所獲得的蛋白的抗腫瘤活性更佳。此外，可選擇地，所述的融合蛋白的氨基端(或羧基端)還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。這些標(biāo)簽可用于對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所構(gòu)建的Onc-DT融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞(包括一些原來(lái)對(duì)One不敏感的細(xì)胞)的毒性大為增強(qiáng)。Onc-DT融合蛋白不僅可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的毒蛋白構(gòu)建免疫毒素，因?yàn)镺nc本身有識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力，其本身也能成為一個(gè)獨(dú)立的抗癌藥物。較之單獨(dú)應(yīng)用Onc，Onc-DT融合蛋白對(duì)腫瘤的殺傷力更強(qiáng)，適用范圍更廣。核酸分子另一方面，本發(fā)明還提供了編碼所述的融合蛋白的分離的核酸，也可以是其互補(bǔ)鏈。任何編碼Onc或其活性片段的合適的DNA結(jié)構(gòu)都適用于本發(fā)明。任何編碼細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其活性片段的合適的DNA結(jié)構(gòu)也適用于本發(fā)明。下文實(shí)例中提及的序列都適用于本發(fā)明的方法。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，編碼融合蛋白的核酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法獲得編碼One和細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域氨基酸的DNA序列，然后將其拼接起來(lái)，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。表達(dá)載體在獲得了編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到本發(fā)明的融合蛋白。因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。如本文所用，"操作性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般"可操作地連于"意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Elsevier最新版)中所描述的?？蛇x用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成蛋白表達(dá)載體。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的載體為原核載體，如pET載體。表達(dá)載體包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的融合蛋白DNA序列，如來(lái)源于哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲的基因。調(diào)控序列可包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。在融合蛋白序列需要調(diào)節(jié)序列功能的時(shí)候，則連接合適的調(diào)控序列。這樣，啟動(dòng)子序列被連接在編碼融合蛋白DNA序列前端。在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的能力通常由復(fù)制起始點(diǎn)控制。用于轉(zhuǎn)化株識(shí)別的篩選基因也可加入表達(dá)載體。另外，非天然的Onc或細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的信號(hào)肽的編碼序列可以引入表達(dá)載體。例如信號(hào)肽(分泌引導(dǎo)物)序列可以和與融合蛋白編碼序列融合，從而使翻譯的融合蛋白可分泌到細(xì)胞外。信號(hào)肽可增強(qiáng)宿主細(xì)胞向胞外分泌嵌合多肽。信號(hào)肽在多肽從細(xì)胞內(nèi)分泌出來(lái)的過(guò)程中可被切去。宿主細(xì)胞此外，含有編碼所述融合蛋白的核酸序列的重組細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細(xì)胞(E.COli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，采用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)、復(fù)性、純化后獲得保留了良好的Onc抗腫瘤活性且細(xì)胞膜穿透性良好的融合蛋白。生產(chǎn)融合蛋白的方法生產(chǎn)融合蛋白的方法也已包括在本發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有融合蛋白編碼核酸的重組細(xì)胞。所述的融合蛋白包括Onc或其有活性的片段以及細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或其活性片段。所述方法可包括讓細(xì)胞表達(dá)編碼的融合蛋白，以及使表達(dá)的融合蛋白的復(fù)性。在一個(gè)實(shí)例中，所述方法還可包括復(fù)性的融合蛋白的分離和/或純化?？蓪⑸鲜鲋苽浍@得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來(lái)分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽(yáng)離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對(duì)上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一?？衫煤蠴nc或細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對(duì)表達(dá)的融合性多肽進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。重組蛋白以及編碼該重組蛋白的核酸可利用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?，例如，化學(xué)合成、重組表達(dá)，或其合并應(yīng)用。參見(jiàn)JohnWiley&Sons,Inc2000年出版的《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，以及ColdSpringHarborLaboratoryPressl989年出版的《MolecularConing:ALaboratoryManual》。在一個(gè)實(shí)例中，編碼融合蛋白的核酸序列是利用PCR技術(shù)制備的，方法參見(jiàn)Prodromou等(ProteinEng.5(8):827-29;1992)論著。融合蛋白的用途本發(fā)明的Onc與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可用于制備抑制腫瘤的組合物。本發(fā)明的融合蛋白不僅具有良好的殺腫瘤生物活性，而且進(jìn)入腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)的能力比單純的Onc更強(qiáng)，因而具有比Onc更優(yōu)異的殺腫瘤效果，從而可用于開(kāi)發(fā)一種更有效的抗腫瘤藥物。本發(fā)明的融合蛋白比單純的Onc具有更為廣譜的抑制腫瘤細(xì)胞的功能。由本發(fā)明的具體實(shí)例可見(jiàn)，所述的融合蛋白對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、急性髓系白血病細(xì)胞均具有優(yōu)異的抑制效果。因此，本發(fā)明的"腫瘤"可以是多種類型的，例如可包括(但不限于)惡性間皮細(xì)胞瘤；肺癌；白血?。粣盒粤馨土?；骨髓瘤；惡性黑色素瘤；乳腺癌；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤；肝癌；鼻咽癌；食管癌；胃癌；結(jié)腸癌；前列腺癌；宮頸癌；口腔癌；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；軟組織腫瘤；骨腫瘤；或皮膚及附件腫瘤。在用于抑制哺乳動(dòng)物腫瘤時(shí)，所述的融合蛋白可全身性給藥，或者局部給藥，具體可視腫瘤的種類、生長(zhǎng)部位、進(jìn)展程度等因素決定。組合物本發(fā)明還提供一種組合物，所述的組合物含有(i)有效量(如0.0001-1000uM)的本發(fā)明所述的Onc與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物通常是藥物組合物，用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或治療腫瘤。如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N,J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說(shuō)明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動(dòng)物給藥的劑型，所述劑型包括但不限于注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑和噴霧劑。在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的具有融合蛋白施用于哺乳動(dòng)物(如人)，其中該安全有效量通常至少約l微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約l微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的組合物可直接用于殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，還可同時(shí)與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次提供且制備出Onc與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，經(jīng)證實(shí)細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域與Onc的融合良好地保留了Onc的核酸酶活性，又顯著提高了Onc進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)的能力和抗腫瘤的廣譜性，具有比Onc更優(yōu)異的殺腫瘤效果，對(duì)腫瘤細(xì)胞(包括一些原來(lái)對(duì)Onc不敏感的腫瘤細(xì)胞)的毒性大為增強(qiáng)。(2)本發(fā)明的融合蛋白可巳知多種腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)于治療許多腫瘤均可用，廣譜性更佳。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，所列舉實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第三版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例10110012()3.39()融合基因的合成以及大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了便于Onc-DT2。3—39。從胞內(nèi)體釋放到胞質(zhì)，以一段16個(gè)氨基酸的含furin酶切位點(diǎn)的連接肽將One和DT連接起來(lái)，furin-DT的DNA序列為全基因合成，為了便于PCR將Onc與furin-DT序列連接起來(lái)，全基因合成時(shí)在furin5'端添加了25個(gè)One末端堿基序列。全基因合成序列見(jiàn)SEQIDNO:3。根據(jù)One和DT的基因序列設(shè)計(jì)并合成了下列一對(duì)引物Onc-DT-U(SEQIDNO:4):5，CCCAGGACTGGCTGACTTTCCA3，；Onc-DT-L(SEQIDNO:5):5，GGGTCGACTTATTCCGGACCACCAGAAGC3，。其中，Onc-DT-U為One成熟蛋白N端的編碼序列；Onc-DT-L為DTC端編碼序列加終止密碼子和Sall酶切位點(diǎn)的反向互補(bǔ)序列。以O(shè)nc-DT-U和Onc-DT-L為引物，含One基因片斷和furin-DT基因片斷的混合物為模板，用高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增Onc-DT基因序列，產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后用Sall酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收得到Onc-DT的插入片斷。將質(zhì)粒pET22b(+)(Novagen)分別用Ball禾QSail酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收得到pET22b的載體片斷，將插入片斷和載體片斷用T4DNA連接酶連接得到pET22b-Onc-DT203.39。質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒的示意圖見(jiàn)圖1。實(shí)施例2Onc-DT網(wǎng)-39o融合蛋白的表達(dá)將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，隔夜挑單克隆于50mlLB培養(yǎng)基中，于37。C培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1:20轉(zhuǎn)接1LTB培養(yǎng)基，于37卩培養(yǎng)至^600=2.0，力BIPTG濃度至0.5mM誘導(dǎo)3.5小時(shí)，4°C、6000rpmX1Omin離心收集菌體，菌體用于下一步的包涵體收集和純化。實(shí)施例3包涵體收集和洗滌將收集到的菌體懸浮在緩沖液SSB_A(20mMTris-HCl，10mMEDTA，pH8.0)中，用超聲波破碎儀破碎菌體；4°C，12000rpmX10min離心，收集包涵體；WIBB(20mMTris-HCl，1M鹽酸胍，65mMDTT，2mMEDTA，pH8.0)懸浮包涵體，攪拌過(guò)夜，4°C，12000卬mX10min收集包涵體。實(shí)施例4蛋白變復(fù)性將1L菌液得到的包涵體溶解于6mlDIBB(20mMTris-HCl，7M鹽酸胍，65mMDTT，2mMEDTA，pH8.0)中，充氮?dú)夂?，攪拌過(guò)夜；4°C，12000rpmX15min，離心收集上清，將蛋白定量至濃度為10mg/ml;將lml包涵體溶液緩慢稀釋到200mlRB(0.5MArginine-HCl，20mMTris-HCl，0.9mM氧化型谷胱甘肽，lmMEDTA，pH9.0)，4°C，12000rpmX30min離心棄沉淀；在復(fù)性緩沖液RB中4°C復(fù)性3648小時(shí)后，用透析液(0.5M尿素，20mMTris-HCl，lmMEDTA，pH9.0)透析去鹽。蛋白溶液存于4'C備用。實(shí)施例5蛋白純化將復(fù)性好的蛋白溶液定量后上強(qiáng)陰離子交換柱。(1)層析柱為Q-Sepharose(2X2cm，；/mfvna"a)，用20mMTris-HCl，1mMEDTA,pH9.0平衡，流速1ml/min。用1MNaCl洗脫30個(gè)柱體積并棄用，將上樣流出液pH調(diào)至IO.O備用。(2)層析柱為Q-Sepharose(2X2cm，；/armac/a)，用20mMTris陽(yáng)HCl，1mMEDTA，pH10.0平衡，然后用0.4MNacl，流速1ml/min洗脫20個(gè)柱體積，1MNaCl洗脫20個(gè)柱體積并分步收集，考馬斯亮蘭G250檢測(cè)含有目的蛋白的樣品。收集含有蛋白的樣品并用透析液20mMTris-HCl，lmMEDTA,pH10.0去鹽后>備用o(3)將去鹽后的樣品溶液定量過(guò)強(qiáng)陰離子交換柱。層析柱為預(yù)裝柱MonoQ(HR5/5，1ml，盧函c&)，流動(dòng)相為L(zhǎng)B2(20mMTris-HCl，1mMEDTA,pHIO.O)禾口WB2(1MNaC1,20mMTris-HCl，1mMEDTA,pH10.0)，流速1ml/min。洗脫方法0-100%WB洗脫30個(gè)柱體積并分步收集，收集處相當(dāng)于30%左右處的蛋白峰。本發(fā)明Onc-DT203.39。蛋白的表達(dá)純化效果蛋白凝膠圖譜見(jiàn)圖2。實(shí)施例6Onc-DT203-390蛋白的細(xì)胞毒性測(cè)定1.0110012()3.39。對(duì)骨髄瘤細(xì)胞SP2/0的細(xì)胞毒性測(cè)定骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于含10%小牛血清，青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100[ig/ml)的RPMI1640(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加卯^培養(yǎng)液(5X104細(xì)胞/ml)，C02(5。/。)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)后，按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(分別是One(制備方法參見(jiàn)onconase對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制作用；沈如凌，孫瑞林，王慶誠(chéng)，歐伶，費(fèi)儉；細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007年29巻6期901-904)和前述制備的Onc-DT2。3.39o(溶于PBS中)10對(duì)照組加PBS，培養(yǎng)72小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。Onc-DT2。3.39o禾卩Onc對(duì)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的細(xì)胞毒性作用比較結(jié)果如圖3A所示?？梢?jiàn)Onc-DT2G3-39Q的ICsQ約為2Xl(r8mol/L;One的IC5q大于8X10—6mol/L，說(shuō)明Onc-DT203.39o對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性顯然比One增強(qiáng)約400倍。2.One-DT2。3—3卯對(duì)人白血病細(xì)胞K562的細(xì)胞毒性測(cè)定人白血病細(xì)胞K562(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于含10%小牛血清，青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100pg/ml)的畫EM(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加90pl培養(yǎng)液(5Xl()4細(xì)胞/ml)，C02(5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后，按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(分別是One蛋白和Onc-DT2。3.39q蛋白)10pl，對(duì)照組加PBS，培養(yǎng)72小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。Onc-DT2。3.39q和Onc對(duì)人白血病細(xì)胞K562的細(xì)胞毒性作用比較如圖3B所示。可見(jiàn)Onc-PT2Q3-39Q的IC5o約為2.5Xl(T8mol/L;One的IC5Q約為1X1(T6mol/L;說(shuō)明Onc-DT肌3卯對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性比One增強(qiáng)約40倍。3.One-DT2。3_39。對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y的細(xì)胞毒性測(cè)定神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于含10%胎牛血清，青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100叫/ml)的DMEM(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加90pl培養(yǎng)液(5Xl(^細(xì)胞/ml)，C02(5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后，按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(分別是One和Onc-DT2Q3.39Q)10pl，對(duì)照組加PBS，培養(yǎng)72小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。Onc-DT2。3-39。和One對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y的細(xì)胞毒性作用比較如圖3C所示。Onc-DT2()3-39()的IC5()約為3Xl(T7mol/L;One的IC5()大于8X10—6mol/L;說(shuō)明Onc-DT203.39o對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性比One增強(qiáng)約27倍。4.Onc-DT203-3卯對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞株HL60的細(xì)胞毒性測(cè)定人急性髓系白血病細(xì)胞株HL60(獲自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞所)培養(yǎng)于含10%小牛血清，青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100pg/ml)的RPMI1640(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加90pl培養(yǎng)液(5X104細(xì)胞/ml),C02(5。/。)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后，按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(分別是ONC和Onc-DT203-390)10nl，對(duì)照組加PBS，培養(yǎng)72小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。Onc-DT加.39o和One對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞株HL60的細(xì)胞毒性作用比較如圖3D所示?？梢?jiàn)Onc-DT2M-39{)的1(250約為3Xl(T7mol/L;One的1。50大于1Xl(T5mol/L;Onc-DT203.39Q對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性比One增強(qiáng)約33倍。實(shí)施例70nc-DT跨膜結(jié)構(gòu)域融合蛋白變體為了便于純化，本發(fā)明人還制備了N端含有6His-tag的融合蛋白。重組載體的轉(zhuǎn)化、表達(dá)同實(shí)施例2-4。采用實(shí)施例6的方法對(duì)純化后獲得的融合蛋白進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有His-tag的融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性接近于前述Onc-DT2Q3.39()。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，上海南方模式生物研究中心<120〉核糖核酸酶與白喉毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域融合蛋白及其制備方法和用途<130>080999<160〉5<170〉PatentInversion3.3<210>1〈211〉924<212〉隨<213>人工序列<220〉<221〉<223〉misc—feature融合基因<400〉1caggactggcccgg犯ccggtctgaattctgttggttcttatcaacctgggagcscggcca^gcta^cg犯ctgaa肌gC3gt犯3CggctgctctgtCELccataacacaggctattcgagagcattaccgggtcacatgactttccactactaaccttt犯agctatacctgtctgeiacaaattctggctgcgctggattgggatgtcgatc犯aaaagtacctggaccgttactggttgctcaggtctatcctgccctga^g3g3tcgctggtaggtcaacctgttaaactcagccgttccattgcctgcaaaggtctgc犯cgttcgttacttgct33CCgtgtttatccgtgatcaa犯tg3gc3gaMttcactaccaacccgtatcgat3gcgggtatcggtcgtggcacagtgagctggtttcaggtagttgtttatcactaacaatcatcgcttacttctcgtcg^犯CC3ggcgtcgttctgaaaact犯gagaaagcccgacagactgcacgtattcgctggaaactgctgagcgtaatggtctatcgctcgataUggttcacaactcttctcgtgacgtacactttcatct犯犯acgtctccggttcattggttcttcccaagatcgatggagcacccgtgctaactaataacctggagcattgcagatgtcctctcttcgctgcataacaaccgtcctgactgcgacctactctcgttctgactacttttcgttggttctgtcttgcgtctctgaaaatctgaggaagg犯ctgtctcgcggcgtggcggtgccgttgatggttgctcaactttgtaggcgUctct60120180240300360420480540600660720780840900924<210〉2<211〉308<212〉PRT<213>人工序列〈220〉<221〉MISC_FEATURE<223〉融合蛋白<400〉2GinAspTrpLeuThrPheGinLysLysHislieThrAsnThrArgAsp151015ValAspCysAspAsnlieMetSerThrAsnLeuPheHisCysLysAsp202530LysAsnThrPhelieTyrSerArgProGluProValLysAlalieCys354045LysGlylielieAlaSerLysAsnValLeuThrThrSerGluPheTyr505560LeuSerAspCysAsnValThrSerArgProCysLysTyrLysLeuLys65707580LysSerThrAsnLysPheCysValThrCysGluAsnGinAlaProVal859095HisPheValGlyValGlySerCysCysAlaGlyAsnArgValArgArg100105110SerValGlySerSerLeuSerCyslieAsnLeuAspTrpAspVallie115120125ArgAspLysThrLysThrLyslieGluSerLeuLysGluHisGlyPro130135140lieLysAsnLysMetSerGluSerProAsnLysThrValSerGluGlu145150155160LysAlaLysGinTyrLeuGluGluPheHisGinThrAlaLeuGluHis165170175ProGluLeuSerGluLeuLysThrValThrGlyThrAsnProValPhe180185190AlaGlyAlaAsnTyrAlaAlaTrpAlaValAsnValAlaGinVallie195200205AspSerGluThrAlaAspAsnLeuGluLysThrThrAlaAlaLeuSer210215220lieLeuProGlylieGlySerValMetGlylieAlaAspGlyAlaVal225230235240HisHisAsnThrGluGlulieValAlaGinSerlieAlaLeuSerSer245250255LeuMetValAlaGinAlalieProLeuValGlyGluLeuValAsplie260265270GlyPheAlaAlaTyrAsnPheValGluSerlielieAsnLeuPheGin275280285ValValHisAsnSerTyrAsnArgProAlaTyrSerProGlyHisLys290295300ThrGinProPhe305<210〉3<211>589<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature〈223〉融合基因〈400〉3ttctgttggttcttctctgtcttgcstc犯taagaccaagatcgagtctctga犯g3gc3actgtatctgtgcactggagcacccggaactgtctgaactcgctggtgctaactacgcggcgtgggcagttgctgataacctggaaaagactactgctgcgc卿cggtgccgttcaccacgctctgtcctctctgatggttgctcaggctggtttcgctgcaitaca^ctttgt卿geigctcttac犯ccgtccggcgtactctccgggcctggsttggg3tgtt3tCCgtg3t3犯3C60cggcccgatc120Ctgg犯g犯tttC3CC3g3C180gaaa^ccgttaCtggtaCCaELCCCggtatt240a犯cgttgctcaggttatcgateigcgaaeic300tctgtctatcctgccgggtatcggtagcgt360taa^cactgaagagatcgtggcacagtctat420tattccgctggt鄉(xiāng)tgagctggttgeitat■cattatcaacctgtttcaggtagttcacaa540tcacaaaactcagccgttt589<210>4〈211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>4cccaggactggctgactttcca<210〉5<211〉29<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉5gggtcgacttattccggaccacc卿agc權(quán)利要求1.一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括(1)核糖核酸酶；(2)細(xì)菌毒蛋白的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；(3)位于(1)和(2)之間的由0-50個(gè)氨基酸構(gòu)成的連接肽。2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的連接肽的序列中包括至少一個(gè)胞內(nèi)蛋白酶的酶切位點(diǎn)序列，從而在進(jìn)入胞內(nèi)后將(1)和(2)分離。較佳地，所述的胞內(nèi)酶選自Furin、基質(zhì)金屬蛋白酶、前列腺特有抗原和組織蛋白酶。3.如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其特征在于，所述的細(xì)胞毒蛋白選自-白喉毒素或綠膿桿菌外毒素A。4.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的白喉毒素的膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域是(a)如SEQIDNO:2中第121-308位的氨基酸序列的蛋白；或(b)將(a)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的蛋白功能的由(a)衍生的多肽；和/或所述的核糖核酸酶是(al)如SEQIDNO:2中第l-104位所示的氨基酸序列；或(bl)將(al)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(al)所限定的蛋白功能的由(al)衍生的多肽；和/或所述的連接肽具有SEQIDNO:2中第105-120位所示的氨基酸序列。5.—種核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子編碼權(quán)利要求l-4中任一所述的融合蛋白。較佳地，所述的核酸分子具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。6.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的核酸分子。7.—種基因工程化的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體；或所述的細(xì)胞基因組中整合有權(quán)利要求5所述的核酸分子。8.—種產(chǎn)生權(quán)利要求l所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(A)培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)權(quán)利要求1所述的融合蛋白；(B)分離出所述的融合蛋白。9.權(quán)利要求l-4中任一所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或治療腫瘤的組合物。10.—種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或治療腫瘤的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(i)權(quán)利要求l-4中任一所述的融合蛋白；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明提供了核糖核酸酶(Onc)與細(xì)菌毒蛋白膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用基因工程制備該融合蛋白的方法。本發(fā)明的融合蛋白既保有原來(lái)的Onc的活性，又具有更強(qiáng)的殺死腫瘤細(xì)胞的能力，可以更廣譜地用于抗腫瘤治療。文檔編號(hào)C07K19/00GK101613410SQ200810039518公開(kāi)日2009年12月30日申請(qǐng)日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者孫瑞林,俊李,沈如凌,王慶誠(chéng),儉費(fèi)申請(qǐng)人:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司;上海南方模式生物研究中心