專利名稱：預防或治療心血管疾病的醛甾酮拮抗劑和非－甾族抗炎劑的組合療法的制作方法
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及預防或治療心血管疾病的領域。更具體而言，本發(fā)明涉及醛甾酮拮抗劑和非-甾族抗炎藥物(NSAID)的組合療法用于預防或治療心血管疾病(包括動脈粥樣硬化)的用途。
背景技術：
前列腺素在炎癥過程和前列腺素產生(特別是PGG2、PGH2和PGE2產生)的抑制方面起重要作用，已經成為抗炎藥物開發(fā)的普遍目標。然而，在減輕前列腺素-誘導的疼痛和與炎癥相關腫脹方面起作用的普通非-甾族抗炎藥物(NSAID)也影響其它與炎癥過程無關的前列腺素-調節(jié)過程。因此，最普通NSAID的高劑量使用會產生嚴重的副作用，包括限制其治療效能的、危及生命的潰瘍。NSAID的替代療法是皮質甾類的使用，它也會產生嚴重的副作用，特別是當涉及長期治療時。
人們已經發(fā)現(xiàn)NSAID通過抑制人花生四烯酸/前列腺素途徑中的酶，包括環(huán)加氧酶(COX)而防止前列腺素產生。近來，發(fā)現(xiàn)了一種與炎癥有關的可誘導酶(被稱作″環(huán)加氧酶-2(COX-2)″或″前列腺素G/H合酶II″)。
一些研究已經暗示炎癥在心血管疾病中起作用。例如，Ridker等人(New Eng.J.Med.，336，973-9(1997))描述了炎癥在心血管疾病中的可能作用。(J.Path.，181，93-9(1997))J.Boyle描述了斑破裂與動脈粥樣硬化炎癥的關聯(lián)性。
在心血管疾病的治療或預防中，現(xiàn)有的藥物療法不總有效或被進行治療的受試者很好地耐受。因此，需要新的藥物療法來填補這種需要。因而本發(fā)明涉及一種采用醛甾酮拮抗劑和NSAID的組合以治療或預防心血管疾病的新的藥物療法。更具體而言，本發(fā)明涉及醛甾酮拮抗劑和NSAID的組合療法用于預防或治療心血管疾病的用途。
附圖簡述
圖1表示在血管緊張肽II輸注的大鼠的研究中，收縮壓的變化。
圖2表示依普利酮(eplerenone)(epoxymexrenone)防止血管緊張肽II輸注的大鼠心臟中的血管炎癥。
圖3表示在載體輸注的大鼠的心臟中缺少環(huán)加氧酶-2(COX-2)的表達。
圖4表示在Ang II輸注的大鼠的心臟中COX-2表達的誘導。
圖5表示在Ang II輸注的大鼠的心臟中，依普利酮阻礙COX-2表達誘導。
圖6表示在載體輸注的大鼠的心臟中缺少骨橋蛋白的表達。
圖7表示在醛甾酮輸注的大鼠的心臟中，依普利酮阻礙骨橋蛋白表達誘導。
圖8表示在醛甾酮輸注的大鼠的心肌層中，依普利酮阻礙骨橋蛋白上調。
圖9表示在醛甾酮輸注的大鼠的心肌層中，依普利酮阻礙COX-2上調。
圖10表示依普利酮防止醛甾酮輸注的大鼠的心肌損傷。
圖11表示在醛甾酮輸注的大鼠的冠狀動脈中層COX-2和骨橋蛋白上的共表達。
圖12表示醛甾酮-誘導的血管炎癥和損傷的某些機理。
圖13表示在血管緊張肽II輸注的卡托普利處理的中風傾向性自發(fā)高血壓大鼠中，依普利酮治療抑制尿蛋白排泄的增加。
圖14表示在血管緊張肽II輸注的卡托普利處理的中風傾向性自發(fā)高血壓大鼠中，依普利酮治療降低腎損傷的組織病理分值。
圖15表示在中風傾向性自發(fā)高血壓大鼠中，依普利酮治療提高存活并減少腦損傷。
圖16表示中風傾性向自發(fā)高血壓大鼠中，依普利酮治療減少腦損傷。
圖17表示在用依普利酮治療的醛甾酮輸注的高血壓大鼠中，心肌COX-2早期時程表達的抑制。
圖18表示在用依普利酮治療的醛甾酮輸注的高血壓大鼠中，心肌骨橋蛋白早期時程表達的抑制。
圖19表示在用依普利酮治療的醛甾酮輸注的高血壓大鼠中，心肌MCP-1早期時程表達的抑制。
圖20表示在用依普利酮治療的醛甾酮輸注的高血壓大鼠中，心肌ICAM-1和VCAM-1早期時程表達的抑制。
圖21表示用醛甾酮輸注的收縮壓升高，以及用醛甾酮輸注和依普利酮治療對這種升高的抑制。
圖22表示對照大鼠、用醛甾酮輸注的大鼠、和用醛甾酮輸注并用依普利酮治療的大鼠28天的心肌組織病理分值，以及用醛甾酮輸注的大鼠、和用醛甾酮輸注并用依普利酮治療的大鼠的心臟重量與體重的比值。
圖23表示對照大鼠、用醛甾酮輸注的大鼠、和用醛甾酮輸注并用依普利酮治療的大鼠的28天循環(huán)骨橋蛋白水平。
圖24表示在對照大鼠、用醛甾酮輸注的大鼠、和用醛甾酮輸注并用依普利酮治療的大鼠中，炎性細胞因子28天的相對mRNA表達。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供一種對有需要的受試者預防或治療其心血管疾病的方法。該方法包括用治療有效量的醛甾酮受體拮抗劑(包括，但不限于，其衍生物或藥學上可接受的鹽)聯(lián)合NSAID(包括，但不限于，其衍生物或藥學上可接受的鹽)治療受試者。
上述方法可用于，但不限于，預防或治療受試者的炎癥-相關疾病，包括但不限于心臟、腎和腦的炎癥-相關疾病，特別是血管炎癥-相關疾病。該方法可用于預防或治療高血壓、心力衰竭、心肌梗死之后的心力衰竭、充血性心力衰竭、冠狀動脈疾病、動脈瘤、動脈硬化、動脈粥樣硬化(包括心臟移植動脈粥樣硬化)、心肌梗死、栓塞、中風、血栓形成(包括靜脈血栓形成)、心絞痛(包括不穩(wěn)定的心絞痛)、鈣化(如血管鈣化和瓣膜鈣化)、川崎病和炎癥(如冠狀動脈斑炎癥、細菌-誘導的炎癥，包括衣原體誘導的炎癥和病毒誘導的炎癥)。
該方法通過改變直接或間接調節(jié)炎癥的一或多種表達產物的表達而用于(但不限于)治療或預防炎癥相關疾病。炎癥-相關疾病，特別是炎癥-相關心血管疾病可全部或部分由一或多種表達產物而調節(jié)，該表達產物可提高或降低表達。所述表達產物可包括但不限于有機分子、蛋白、基于DNA或基于RNA的分子、和這些產物的網絡或集合，它們共同或單獨、直接或間接發(fā)揮作用。所述表達產物表達模式的改變可順序或同時發(fā)生，涉及兩或多種表達產物。這些表達產物對受試者的組織或器官具有直接或間接的作用，通過其它分子或表達產物誘導或增強病理作用。這些表達產物可根據(jù)它們分別起促炎還是抗炎表達產物的作用而通過提高表達水平或降低表達水平來產生促炎作用。
該方法通過減少受影響組織中的促炎成分(包括環(huán)加氧酶和骨橋蛋白)的上調而特別用于治療或預防疾病，而且還可抑制腎、特別是致密斑中環(huán)加氧酶的活性，其中醛甾酮的拮抗作用可誘導環(huán)加氧酶表達。而醛甾酮拮抗劑的使用使由炎癥相關疾病誘導的環(huán)加氧酶表達水平降低，它不可能完全阻礙環(huán)加氧酶活性。加入抑制環(huán)加氧酶活性的NSAID共同發(fā)揮作用還使受影響組織或器官的炎癥減輕。醛甾酮拮抗劑的使用在腎漢勒氏袢的致密斑及皮質粗升支(CTAL)中可誘導環(huán)加氧酶上調。在腎中，環(huán)加氧酶的產物前列腺素涉及腎血液動力學和鹽/水體內平衡的調節(jié)。結果，非-炎性醛甾酮拮抗劑在腎致密斑和CTAL區(qū)中誘導環(huán)加氧酶可導致病理結果，如血壓升高和鹽水潴留。因此，抑制環(huán)加氧酶的NSAID與醛甾酮拮抗劑共同給藥可減慢、終止、或逆轉對醛甾酮拮抗劑在腎中誘導的環(huán)加氧酶的病理性腎反應的發(fā)展。
在上述方法中，心血管疾病包括(但不限于)已知具有炎性成分的那些疾病以及可由醛甾酮或環(huán)加氧酶或兩者調節(jié)的那些疾病。上述方法還包括用要求適當上調環(huán)加氧酶或骨橋蛋白表達的醛甾酮拮抗劑和NSAID組合治療患者。在組織，包括但不限于腎、心臟、和腦中，環(huán)加氧酶可被誘導產生這些促炎酶表達的上調，從而引起輕度到重度的組織和器官損害。
在上述方法中，醛甾酮拮抗劑和NSAID的聯(lián)合給藥用于適度上調環(huán)加氧酶的表達。上述方法還可用于預防或治療組織，包括但不限制于腎、心臟和腦中出現(xiàn)的疾病，其中促炎蛋白骨橋蛋白的表達上調可被誘導，從而產生輕度到重度的組織和器官損害。在上述方法中，醛甾酮拮抗劑與NSAID的聯(lián)合給藥用于調節(jié)骨橋蛋白的表達上調。
在另一實施方案中，本發(fā)明用于預防或治療組織和器官，包括但不限制于腎、心臟和腦中的疾病，其中促炎表達產物MCP-1、IL-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1中任何一種表達上調都可發(fā)生，從而導致輕度到重度的組織和器官損害。在上述方法中，醛甾酮拮抗劑與NSAID的聯(lián)合給藥用于適度調節(jié)MCP-1、IL-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1中任何一種的表達上調。
表達產物的非限制性例子在圖24中表示，通過用醛甾酮拮抗劑與NSAID的組合治療，它們的表達可被適度調節(jié)從而減輕炎癥-相關性心血管疾病?？杀簧险{的促炎表達產物的非限制性例子包括下列一或多種
(a)血管緊張肽II和內皮縮血管肽的受體，
(b)激活分子αvβ3(粘著、增殖和遷移)和CD44(遷移)的單核細胞，
(c)血管炎癥干擾素-γ(Inf-γ)、白介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的介質，
(d)產生組織損害性超氧化物自由基的NADH/NADPH氧化酶，和
(e)引起活性組織纖溶酶原激活物(t-PA)降低的血栓形成前(prothrombotic)纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)。
在本發(fā)明另一實施方案中，表達產物的非-限制性例子包括下列一或多種，通過用醛甾酮拮抗劑與NSAID的組合治療，它們的表達可被適度調節(jié)，從而減輕炎癥相關性心血管疾病
急性期反應物，像C-反應性蛋白(CRP)，
多效細胞因子，像白介素-6(IL-6)，
IL-10、IL-12、可溶性胞內粘著分子-1(sICAM-1)，
肌鈣蛋白T或I、熱激蛋白65(HSP65)，
淀粉樣蛋白、磷脂酶A2、血纖蛋白原、CD40/CD40L信號途徑和
粘著介質，像膠原-結合整聯(lián)蛋白α1β1(間質細胞)和α2β1(上皮細胞)。
在本發(fā)明另一實施方案中，由醛甾酮受體拮抗劑和NSAID的聯(lián)合療法通過升高或降低至少10％的表達，可調節(jié)或改變一或多種炎癥-相關表達產物。在另一實施方案中，通過醛甾酮受體拮抗劑和NSAID的聯(lián)合療法以升高或降低至少25％的表達，可調節(jié)或改變一或多種炎癥-相關表達產物。在另一實施方案中，通過醛甾酮受體拮抗劑和NSAID的聯(lián)合療法以升高或降低至少50％的表達，可調節(jié)或改變一或多種炎癥-相關表達產物。在另一實施方案中，通過醛甾酮受體拮抗劑和NSAID的聯(lián)合療法以升高或降低至少100％的表達，可調節(jié)或改變一或多種炎癥-相關表達產物。
用于預防心血管疾病的花生四烯酸代謝中的環(huán)加氧酶途徑的抑制劑可通過多種機理抑制酶活性。例如，用于此處所述方法中的抑制劑可抑制酶活性的表達。使用醛甾酮拮抗劑阻斷環(huán)加氧酶-2在炎癥損害處的表達十分有利，這是因為它可使由非-選擇性NSAID所致的胃部副作用減到最小，特別是在預期使用高劑量NSAID的長時間預防性治療中。
劑量和治療方法
給藥的醛甾酮受體拮抗劑阻斷劑的用量和本發(fā)明方法的劑量給藥法取決于多種因素，包括受試者的年齡、體重、性別和健康狀況，病理作用的嚴重程度，給藥的途徑和頻率，以及所用的特定醛甾酮阻斷劑，并因此可廣泛變化。給予受試者的適宜每日劑量為約0.001-30mg/kg體重，優(yōu)選約0.005-約20mg/kg體重，更優(yōu)選約0.01-約15mg/kg體重，更優(yōu)選約0.05-約10mg/kg體重，最優(yōu)選約0.01-5mg/kg體重。
給予人類受試者的醛甾酮拮抗劑的每日劑量通常為約0.1mg-約2000mg。在本發(fā)明其中一個實施方案中，每日劑量范圍為約0.1mg-約400mg。在本發(fā)明另一實施方案中，每日劑量范圍為約1mg-約200mg。在本發(fā)明另一實施方案中，每日劑量范圍為約1mg-約100mg。在本發(fā)明另一實施方案中，每日劑量范圍為約10mg-約100mg。在本發(fā)明另一實施方案中，每日劑量范圍為約25mg-約100mg。在本發(fā)明另一實施方案中，每日劑量選自5mg、10mg、12.5mg、25mg、50mg、75mg、和100mg。在本發(fā)明另一實施方案中，每日劑量選自25mg、50mg、和100mg。本發(fā)明的方法特別包括不會在受試者中產生實質上利尿和/或抗-高血壓作用的醛甾酮阻斷劑每日劑量。每日劑量可在1天內分1-4次給藥。
醛甾酮阻斷劑的給藥劑量可基于血壓或適宜替代標記(如鈉尿肽，內皮縮血管肽，和下面論述的其它替代標記)的測量值來確定和調節(jié)。將給予醛甾酮阻斷劑后的血壓和/或替代標記水平與給予醛甾酮阻斷劑前的相應基線水平進行比較，從而測定本發(fā)明方法的效率，并根據(jù)需要滴定。用于本方法中的替代標記的非-限制性例子是用于腎和心血管疾病的替代標記。
預防性給藥劑量
在所述炎癥相關性心血管疾病的診斷之前預防性給予醛甾酮阻斷劑，以及在受試者易患炎癥相關性心血管疾病的時期內繼續(xù)給予醛甾酮阻斷劑，很有益處。因此，可對沒有顯著臨床表象但仍然易受病理影響的個體給予預防性劑量的醛甾酮阻斷化合物。醛甾酮阻斷劑的這種預防性劑量可，但無需，低于用于治療特定的目標病理作用的劑量。
心血管病理的給藥劑量
治療心血管功能病理的給藥劑量可基于鈉尿肽的血液濃度測量值來確定和調節(jié)。鈉尿肽是一組結構上相似但遺傳上不同的肽，它們對心血管、腎、和內分泌體內平衡具有不同的作用。心房的鈉尿肽(″ANP″)和腦的鈉尿肽(″BNP″)為心肌細胞來源，而C-型鈉尿肽(″CNP″)為內皮來源。ANP和BNP與鈉尿肽-A受體(″NPR-A″)結合，其經由3′，5′-環(huán)鳥苷單磷酸(cGMP)調節(jié)尿鈉排泄、血管舒張、腎素抑制、抗有絲分裂發(fā)生、和lusitropic性。血液中鈉尿肽水平，特別是血液BNP水平的升高通常在血容量擴大的條件下和血管損傷，如急性心肌梗死之后，在受試者中觀察到的，其水平在梗死之后的一段延長期持續(xù)升高的水平。(Uusimaa等人，Int.J.Cardiol 1999；695-14)。
鈉尿肽水平相對于在給予醛甾酮阻斷劑之前所測量基線水平的降低表明醛甾酮病理作用的降低，并因此提出了與病理作用抑制的關聯(lián)。
因此，將所需鈉尿肽水平的血液水平和給予醛甾酮阻斷劑之前的相應基線水平進行比較，從而測定本方法治療病理作用的功效。以這種鈉尿肽水平的測量值為基礎，可調節(jié)醛甾酮阻斷劑的給藥劑量以減輕心血管病理作用。
同樣，還可以循環(huán)和尿cGMP水平為基礎，鑒定心臟病變并確定適宜的給藥劑量。cGMP血漿水平的升高平行于平均動脈壓降低。cGMP尿排泄的增加與尿鈉排泄有關。
心臟病變還可通過射血分數(shù)降低或心肌梗死或心力衰竭或左心室肥大的存在來鑒定。左心室肥大可通過回波心電圖或核磁共振成像來鑒定，并用于監(jiān)測治療進展和給藥劑量的適宜性。
因此，在本發(fā)明另一實施方案中，本發(fā)明的方法可用于降低鈉尿肽水平，特別是BNP水平，由此治療相關的心血管病變。
腎病變給藥劑量
治療腎功能病變的給藥劑量可基于蛋白尿、微白蛋白尿的測量值，腎小球濾過率(GFR)的降低，或肌酸酐清除率的降低來確定并調節(jié)。蛋白尿通過在24小時尿收集樣品中的尿蛋白是否高于0.3g而鑒定的。微白蛋白尿是通過免疫測定性尿白蛋白的增加而鑒定的。以這些測量值為基礎，可調節(jié)醛甾酮阻斷劑的給藥劑量，從而減少腎病理作用。
神經病病理給藥劑量
神經病，特別是外周神經病，可通過感覺虧缺或感覺運動原能力的神經病學測試來鑒定，并以它們?yōu)榛A調節(jié)給藥劑量。
視網膜病變給藥
視網膜病可通過眼科測試來鑒定，并以它們?yōu)榛A調節(jié)給藥劑量。
炎癥標記
某些標記可指示或為引起炎癥或早期炎癥的原因。這些標記的測量值可用于確定所要給藥的醛甾酮阻斷劑的適宜劑量，或確定給藥后醛甾酮阻斷劑的有效劑量。這種標記的非限制性例子是骨橋蛋白；急性期反應物如C反應性蛋白(CRP)、血纖蛋白原、因子VIII、血清銅(載體蛋白血漿銅藍蛋白)、血清鐵(載體蛋白鐵蛋白)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)和脂蛋白(a)；鈉尿肽；內皮縮血管肽；VCAM-1；ICAM-1；IL-1β；TNF-α；IL-6；COX-2；fractalkine；MCP-1；和甘油三酯。
用于本發(fā)明的NSAID包括表1所列的化合物(包括這些化合物的衍生物)。表1中所列的每篇公開文獻描述了NSAID的被選方面，如這種化合物的化學制備或生物性質。這些文獻中每篇的內容都在此處引用作為參考。
表1NSAID化合物名稱化學名稱/CAS 參考文獻對乙酰氨基酚US 3125598苯噁洛芬US 3912748卡洛芬US 3896145雙氯酚酸鈉15307-86-5US 3778470二氟尼柳FR 1522570依托度酸1，8-二乙基-1，3，4，9-四氫吡喃[3，4-b]吲哚-1-乙酸/41340-25-4GB 1391005非諾洛芬
非諾洛芬31879-05-7US 3649679氟比洛芬(αR)-2-氟-α-甲基-[1，1’-聯(lián)苯基]-4-乙酸/5104-49-4EP 103265布洛芬α-甲基-4-(2-甲基丙基)苯乙酸2-甲氧苯基酯/66332-77-2GB 1538636吲哚美辛53-86-1US 3161654酮基布洛芬(R)-3-苯甲?；?α-甲基苯乙酸/22071-15-4GB 1164585酮洛來克(+，-)-5-苯甲?；?2，3-二氫-1H-pyrrolizine-1-羧酸/74103-06-3GB 1554057甲氯芬那酸鹽甲芬那酸US 3294813萘丁美酮4-(6-甲氧基-2-萘基)-2-丁酮/42924-53-8GB 1476721萘普生22204-53-1US 3637767奧沙普嗪4，5-二苯基-2-噁唑丙酸/21256-18-8GB1 206403羥保松US 3482021保泰松US 3265577吡羅昔康3-苯基-丙烯酸，2-甲基-3-[(2-吡啶氨基)-羰基]-2H-1，2-苯并噻嗪-4-基酯，S，S-二氧化物/36322-90-4EP 79639舒林酸38194-50-2US 3692651舒洛芬US 4035376替尼達普(Z)-5-氯-2，3-二氫-3-(羥基-2-噻吩基亞甲基)-2-氧-1H-吲哚-1-carboxamide/120210-48-2EP 156603托美汀26171-23-3US 3752826苯酰吡酸鈉US 3752826阿司匹林
在其中一個實施方案中，NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
在另一實施方案中，NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、和氟比洛芬。
在另一實施方案中，NSAID選自布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、和奧沙普嗪。
在另一實施方案中，NSAID選自羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
術語″NSAID″包括結構上與NSAID相關并具有基本相等的生物活性的任何化合物(如衍生物和藥學上可接受的鹽)。例如，這種化合物可包括(但不限于)其前體藥物。
術語″醛甾酮受體拮抗劑″或″醛甾酮拮抗劑″是指作為醛甾酮自身在受體位點上作用的競爭性抑制劑，能夠結合醛甾酮受體，從而調節(jié)受體調節(jié)的醛甾酮活性的化合物。
醛甾酮拮抗劑
本發(fā)明方法中所用的醛甾酮拮抗劑通常為螺內酯型甾族化合物。術語″螺內酯型″是指含有與甾核相連的內酯部分的結構，其通常位于甾族″D″環(huán)上，通過螺鍵構型連接。螺內酯型醛甾酮拮抗劑化合物的亞類包括環(huán)氧-甾族醛甾酮拮抗劑化合物，如依普利酮。螺內酯型拮抗劑化合物的另一亞類包括非-環(huán)氧甾族醛甾酮拮抗劑化合物，如螺內酯。
本發(fā)明方法中所用的環(huán)氧-甾族醛甾酮拮抗劑化合物通常具有用環(huán)氧型部分取代的甾核。術語″環(huán)氧型″部分包括兩個碳原子之間具有氧原子作為橋的任何部分，它的例子包括下列部分
環(huán)氧乙基1，3-環(huán)氧丙基 1，2-環(huán)氧丙基
短語″環(huán)氧-甾族″中所用的術語″甾族″表示由環(huán)戊烯菲部分提供的、具有常規(guī)″A″、″B″、″C″和″D″環(huán)的核。環(huán)氧型部分可在任何可連接或可取代的位置上與環(huán)戊烯菲相連，即與甾核的一個環(huán)稠合或該部分可在環(huán)系統(tǒng)的環(huán)成員上被取代。短語″環(huán)氧-甾族″是指有一或多個環(huán)氧型部分與其相連的甾核。
適用于本發(fā)明方法中的環(huán)氧-甾族醛甾酮拮抗劑包括具有與甾核″C″環(huán)稠合的環(huán)氧部分的化合物家族。特別優(yōu)選的是特征在于存在9α，11α-取代的環(huán)氧部分的20-spiroxane化合物。下面表2中的化合物1-11是用于本發(fā)明方法中的舉例性9α，11α-環(huán)氧-甾族化合物。這些環(huán)氧甾類可通過Grob等人在美國專利US4,559,332中描述的過程制備。用于制備9，11-環(huán)氧甾族化合物和它們鹽的其它方法在Ng等人的WO97/21720和Ng等人的WO98/25948中公開。
表2醛甾酮受體拮抗劑
有特定價值的是依普利酮(也被稱作epoxymexrenone和CGP 30083)，它是上面所示的化合物1。依普利酮的化學名稱是孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，甲酯，(7α，11α，17α)-。該化學名稱對應于依普利酮的CAS登記名稱(依普利酮的CAS登記號為107724-20-9)。美國專利US4,559,332利用可另一名稱9α，11α-環(huán)氧-7α-甲氧羰基-20-spirox-4-烯-3，21-二酮鑒定依普利酮。這種″spiroxane″命名法在，例如，美國專利US4,559,332的第2欄第16行-第4欄第48行進一步描述。依普利酮是一種醛甾酮受體拮抗劑，較之螺內酯，對醛甾酮受體具有更高的特異性。選擇依普利酮作為本發(fā)明方法中的醛甾酮拮抗劑對于減輕某些副作用，如使用具有較低特異性的醛甾酮拮抗劑時出現(xiàn)的男子女性型乳房有益。
適用于本發(fā)明方法中的非-環(huán)氧-甾族醛甾酮拮抗劑包括由通式I定義的螺內酯型化合物家族
其中
是
或
其中R是多達5個碳原子的低級烷基，且
其中
是
或
低級烷基殘基包括支鏈和無支鏈的基團，優(yōu)選甲基、乙基和正-丙基。
通式I內具體的目的化合物如下
7α-乙酰硫-3-氧-4，15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；
3-氧-7α-丙酰硫-4，15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；
6β，7β-亞甲基-3-氧-4，15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；
15α，16α-亞甲基-3-氧-4，7α-丙酰硫-4-雄甾烯[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；
6β，7β，15α，16α-二亞甲基-3-氧-4-雄甾烯[17(β-1′)-螺-5′]-全氫化呋喃-2′-酮；
7α-乙酰硫-15β，16β-亞甲基-3-氧-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；
15β，16β-亞甲基-3-氧-7β-丙酰硫-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；和
6β，7β，15β，16β-二亞甲基-3-氧-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮。
制備通式I化合物的方法在1978年12月12日頒發(fā)的、Wiechart等人的美國專利US4,129,564中描述。
目的非-環(huán)氧甾族化合物的另一家族由通式II定義
其中R1是C1-3-烷基或C1-3?；?，且R2是H或C1-3烷基。
通式II內具體的目的化合物如下
1α-乙酰硫-15β，16β-亞甲基-7α-甲基硫-3-氧-17α-孕甾-4-烯-21，17-羰內酯(carbolactone)；和
15β，16β-亞甲基-1α，7α-二甲基硫-3-氧-17α-孕甾-4-烯-21，17-羰內酯。
制備通式II化合物的方法在1988年12月6日頒發(fā)的、Nickisch等人的美國專利US4,789,668中描述。
目的非環(huán)氧甾族化合物的另一家族由通式III的結構定義
其中R是低級烷基，優(yōu)選的低級烷基是甲基、乙基、丙基和丁基。具體的目的化合物包括
3β，21-二羥基-17α-孕甾-5，15-二烯-17-羧酸γ-內酯；
3β，21-二羥基-17α-孕甾-5，15-二烯-17-羧酸γ-內酯3-乙酸鹽；
3β，21-二羥基-17α-孕甾-5-烯-17-羧酸γ-內酯；
3β，21-二羥基-17α-孕甾-5-烯-17-羧酸γ-內酯3-乙酸鹽；
21-羥基-3-氧-17α-孕甾-4-烯-17-羧酸γ-內酯；
21-羥基-3-氧-17α-孕甾-4，6-二烯-17-羧酸γ-內酯；
21-羥基-3-氧-17α-孕甾-1，4-二烯-17-羧酸γ-內酯；
7α-酰硫-21-羥基-3-氧-17α-孕甾-4-烯-17-羧酸γ內酯；和
7α-乙酰硫-21-羥基-3-氧-17α-孕甾-4-烯-17-羧酸γ-內酯。
制備通式III化合物的方法在1966年6月21日頒發(fā)的、Patchett的美國專利US3,257,390中描述。
目的非-環(huán)氧-甾族化合物的另一家族由通式IV表示
其中E′選自亞乙基、亞乙烯基和(低級烷酰基)硫亞乙基，E″選自亞乙基、亞乙烯基和(低級烷酰基)硫亞乙基和(低級烷?；?硫亞丙基；R是甲基，當E′和E″分別是亞乙基和(低級烷?；?硫亞乙基時，R選自氫和甲基；且E′和E″的選擇是存在至少一個(低級烷?；?硫基。
通式IV內非-環(huán)氧-甾族化合物的優(yōu)選家族由通式V表示
通式V更優(yōu)選的化合物是1-乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮內酯。
通式IV內非-環(huán)氧-甾族化合物的另一優(yōu)選家族由通式VI表示
通式VI內更優(yōu)選的化合物包括下列
7α-乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮內酯；
7β-乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮內酯；
1α，7α-二乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-雄甾-4，6-二烯-3-酮內酯；
7α-乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-雄甾-1，4-二烯-3-酮內酯；
7α-乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮內酯；和
7α-乙酰硫-17α-(2-羧乙基)-17β-羥基-6α-甲基雄甾-4-烯-3-酮內酯。
在通式IV-VI中，術語″烷基″包括含有1-約8個碳的線形和支鏈烷基。術語″(低級烷?；?硫″包括通式低級烷基
的基團
特定的目的化合物是具有下列結構和正式名稱的螺內酯
″螺內酯″17-羥基-7α-巰基-3-氧-17α-孕甾-4-烯-21-羧酸γ-內酯乙酸鹽。
制備通式IV-VI化合物的方法在1961年12月12日頒發(fā)的、Cella等人的美國專利US 3,013,012中描述。螺內酯由G.D.Searle和Co.，Skokie，Illinois銷售，商標為″ ALDACTONE″，片劑形式每片的劑量為25mg、50mg和100mg。
甾族醛甾酮拮抗劑的另一家族由屈螺酮(drospirenone)，[6R-(6α，7α，8β，9α，10β，13β，14α，15α，16α，17β)]-1，3′，4′，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，20，21-十六氫-10，13-二甲基螺[17H-二環(huán)丙[6，715，16]環(huán)戊[a]菲-17，2′(5′H)-呋喃]-3，5′(2H)-二酮，CAS登記號67392-87-4舉例說明。制備和使用屈螺酮的方法在1979，優(yōu)先權DE 2652761 1976的專利GB 1550568中描述。
定義
術語″治療″或″治療″包括給予人所需量的醛甾酮拮抗劑與NSAID的組合，從而抑制或逆轉病理性心血管疾病的發(fā)展。
術語″預防″或″預防″包括預防臨床上較明顯的心血管疾病的發(fā)作或預防個體心血管疾病臨床前期明顯階段的發(fā)作。這包括那些有發(fā)展為心血管疾病可能的預防性治療。
短語″治療有效″是指限定聯(lián)合給藥的兩種藥劑的用量，達到改善疾病嚴重程度和發(fā)病頻率，同時避免不利副作用的目的。
用于治療目的的術語″受試者″包括易患或患有心血管疾病的任何人或動物受試者(優(yōu)選哺乳動物且包括，但不限制于，馴養(yǎng)的動物，如牛、豬、羊或馬科的那些，和陪伴動物，如犬和貓科的那些)，且優(yōu)選人類受試者。所述受試者，例如，由于飲食、與細菌或病毒感染接觸而可能處于危險之中，具有共同的標記存在，在遺傳方面有容易患心血管疾病等的傾向。
術語″醛甾酮拮抗劑″和″醛甾酮受體拮抗劑″包括抑制醛甾酮與鹽皮質激素受體結合，由此阻斷醛甾酮生物作用的化合物。
術語″非-甾族抗炎藥物″或″NSAID″包括結構缺少甾環(huán)，并可阻礙、減少或抑制組織或器官炎癥反應的化合物。
術語″促炎″描述在體內產生的、誘導、激活或提高組織或器官炎癥反應的分子。
術語″hydrido″表示單一的氫原子(H)。例如，該hydrido基團與氧原子連接形成羥基或兩個hydrido基團與碳原子連接形成亞甲基(-CH2-)。單獨或在其它術語如″鹵代烷基″、″烷基磺?；濉ⅰ逋檠跬榛搴汀辶u烷基″內使用時，術語″烷基″包括具有1-約20個碳原子或、優(yōu)選1-約12個碳原子的線形或支鏈基團。更優(yōu)選的烷基是具有1-約10個碳原子的″低級烷基″。最優(yōu)選的是具有1-約6個碳原子的低級烷基。這種基團的例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。術語″烯基″包括具有至少一個碳-碳雙鍵的2-約20個碳原子或，優(yōu)選，2-約12個碳原子的線形或支鏈基團。更優(yōu)選的烷基是具有2-約6個碳原子的″低級烯基″。烯基的例子包括乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基和4-甲基丁烯基。術語″炔基″表示具有2-約20個碳原子或，優(yōu)選，2-約12個碳原子的線形或支鏈基團。更優(yōu)選的炔基是具有2-約10個碳原子的″低級炔基″。最優(yōu)選的是具有2-約6個碳原子的低級炔基。這種基團的例子包括炔丙基、炔丁基等。術語″烯基″、″低級烯基″包括具有″順式″和″反式″方向，或者″E″和″Z″方向。術語″環(huán)烷基″包括具有3-12個碳原子的飽和碳環(huán)基團。更優(yōu)選的環(huán)烷基是具有3-約8個碳原子的″低級環(huán)烷基″。這種基團的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。術語″環(huán)烯基″包括具有3-12個碳原子的部分不飽和碳環(huán)基團。更優(yōu)選的環(huán)烯基是具有4-約8個碳原子的″低級環(huán)烯基″。這種基團的例子包括環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、和環(huán)己烯基。術語″鹵″是指鹵素，如氟、氯、溴或碘。術語″鹵代烷基″包括其中任意一或多種烷基碳原子被上面限定的鹵素取代的基團。特別包含的是一鹵代烷基、二代鹵代烷基和多鹵代烷基。一鹵代烷基，例如，可在基團內具有碘、溴、氯或氟原子。二代鹵和多代鹵代烷基可具有兩個或多個相同的鹵原子或不同鹵素基團的組合?！宓图夳u代烷基″包括具有1-6個碳原子的基團。鹵代烷基的例子包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。術語″羥烷基″包括具有1-約10個碳原子的線形或支鏈烷基，其中任意一個碳原子都可被一或多種羥基取代。更優(yōu)選的羥烷基是具有1-6個碳原子和1個或多個羥基的″低級羥烷基″。這種基團的例子包括羥甲基、羥乙基、羥丙基、羥丁基、和羥己基。術語″烷氧基″和″烷基氧基″包括線形或支鏈的含氧基團，其中每個都具有1-約10個碳原子的烷基部分。更優(yōu)選的烷氧基是具有1-6個碳原子的″低級烷氧基″。這種基團的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和叔-丁氧基。術語″烷氧烷基″包括具有與烷基相連的一或多種烷氧基的烷基，即，形成一烷氧烷基和二烷氧烷基?！逋檠趸蹇蛇M一步被一或多種鹵素原子，如氟、氯或溴取代，產生鹵代烷氧基。更優(yōu)選的鹵代烷氧基是具有1-6個碳原子和一或多種鹵素基團的″低級鹵代烷氧基″。這種基團的例子包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基和氟丙氧基。術語″芳基″，單獨或組合使用時，是指含有1個、2個或3個環(huán)的碳環(huán)芳香系統(tǒng)，其中這種環(huán)可以懸垂的方式連接在一起或稠合。術語″芳基″包括芳香基團，如苯基、萘基、四氫萘基、茚基和聯(lián)苯基。芳基部分在可取代的位置還可被一或多種選自烷基、烷氧烷基、烷氨烷基、羧烷基、烷氧羰烷基、氨羰烷基、烷氧基、芳烷氧基、羥基、氨基、鹵素、硝基、烷氨基、?；?、氰基、羧基、氨羰基、烷氧羰基和芳烷氧羰基的取代基取代。術語″雜環(huán)基″包括飽和、部分不飽和及不飽和的含有雜原子的環(huán)狀基團，其中所述雜原子可選自氮、硫和氧。飽和雜環(huán)基團的例子包括含有1-4個氮原子的飽和3-6元雜單環(huán)基團(例如，吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶子基、哌嗪基等)；含有1-2個氧原子和1-3個氮原子的飽和3-6元雜單環(huán)基團(例如，嗎啉基等)；含有1-2個硫原子和1-3個氮原子的飽和3-6元雜單環(huán)基團(例如，噻唑烷基等)。部分不飽和雜環(huán)基團的例子包括二氫噻吩、二氫吡喃、二氫呋喃和二氫噻唑。術語″雜芳基″包括不飽和的雜環(huán)基團。不飽和雜環(huán)基團，也被稱作″雜芳基″的例子包括含有1-4個氮原子的3-6元雜單環(huán)基團，例如，吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三唑基(例如，4H-1，2，4-三唑基、1H-1，2，3-三唑基、2H-1，2，3-三唑基等)、四唑基(例如，1H-四唑基、2H-四唑基等)等；含有1-5個氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基團，例如，吲哚基、異氮茚基、中氮茚基、苯并咪唑基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并噠嗪基(例如，四唑并[1，5-b]噠嗪基等)等；含有氧原子的不飽和3-6元雜單環(huán)基團，例如，吡喃基、呋喃基等；含有硫原子的不飽和3-6元雜單環(huán)基團，例如，噻吩基等；含有1-2個氧原子和1-3個氮原子的不飽和3-6元雜單環(huán)基團，例如，噁唑基、異噁唑基、噁二唑基(例如，1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基等)等；含有1-2個氧原子和1-3個氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基團(例如，苯并噁唑基、苯并噁二唑基等)；含有1-2個硫原子和1-3個氮原子的不飽和3-6元雜單環(huán)基團，例如，噻唑基、噻二唑基(例如，1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基等)等；含有1-2個硫原子和1-3個氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基團(例如，苯并噻唑基、苯并噻二唑基等)等。該術語還包括其中的雜環(huán)基團與芳基稠合的基團。這種稠合雙環(huán)基團的例子包括苯并呋喃、苯并噻吩等。所述″雜環(huán)基團″可具有1-3個取代基，如烷基、羥基、鹵素、烷氧基、氧、氨基、和烷氨基。術語″烷基硫″包括含有與二價硫原子連接的1-約10個碳原子的線形或支鏈烷基的基團。更優(yōu)選的烷基硫基團是具有1-6個碳原子烷基的″低級烷基硫″基團。這種低級烷基硫基團的例子是甲基硫、乙基硫、丙基硫、丁基硫和己基硫。術語″烷基硫烷基″包括含有通過二價硫原子與1-約10個碳原子烷基連接的烷基硫基團的基團。更優(yōu)選的烷基硫烷基是具有1-6個碳原子烷基的″低級烷基硫烷基″基團。這種低級烷基硫烷基的例子包括甲基硫甲基。術語″烷基亞硫酰基″包括含有與二價-S(＝O)連接的1-10個碳原子的線形或支鏈烷基的基團。更優(yōu)選的烷基亞硫?；蔷哂?-6個碳原子烷基的″低級烷基亞硫?；?。這種低級烷基亞硫?；睦影谆鶃喠蝓；⒁一鶃喠蝓；?、丁基亞硫?；图夯鶃喠蝓；?。術語″磺?；澹瑹o論是單獨使用還是與其它術語，如烷磺?；M合使用，分別表示二價基團-SO2-?！逋榛酋；灏ㄅc磺酰基連接的烷基，其中的烷基如上面所定義。更優(yōu)選的烷磺?；蔷哂?-6個碳原子的″低級烷磺酰基″。這種低級烷磺?；睦影谆酋；?、乙磺?；捅酋；！逋榛酋；暹€可被一或多種鹵素原子，如氟、氯或溴取代，產生鹵代烷磺?；?。術語″氨磺?！濉ⅰ灏被酋；搴汀灏被酋；灞硎綨H2O2S-。術語″?；灞硎居沙ビ袡C酸上羥基的殘基提供的基團。這種?；睦影ㄍ轷；头减；?。這種低級烷?；睦影柞；?、乙酰基、丙?；?、丁酰基、異丁?；?、戊?；愇祯；?、新戊?；?、己?；⑷阴；?。術語″羰基″，無論是單獨使用還是與其它術語組合使用，如″烷氧羰基″，都是指-(C＝O)-。術語″芳?；灏ň哂猩鲜鲷驶姆蓟?。芳?；睦影ū郊柞；?、萘甲?；?，且所述芳?；械姆蓟杀涣硗馊〈Ｐg語″羧基″或″羧基″，無論單獨使用還是與其它術語組合使用，如″羧烷基″，都表示-CO2H。術語″羧烷基″包括用羧基取代的烷基。更優(yōu)選″低級羧烷基″，它包含上面所定義的低級烷基，且在烷基上可被鹵素另外取代。這種低級羧烷基的例子包括羧甲基、羧乙基和羧丙基。術語″烷氧羰基″是指含有經由氧原子與羰基連接的上述烷氧基的基團。更優(yōu)選具有1-6個碳烷基部分的″低級烷氧羰基″。這種低級烷氧羰基(酯)的例子包括取代或未取代的甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、丁氧羰基和己氧羰基。術語″烷羰基″、″芳羰基″和″芳烷羰基″包括具有與羰基相連的上述烷基、芳基和芳烷基的基團。這種基團的例子包括取代或未取代的甲羰基、乙羰基、苯羰基和芐羰基。術語″芳烷基″包括芳基取代的烷基，如芐基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基、和二苯乙基。所述芳烷基中的芳基可另外被鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基和鹵代烷氧基取代。術語芐基與苯甲基可互換。術語″雜環(huán)烷基″包括飽和及部分不飽和的雜環(huán)取代烷基，如吡咯烷甲基、和雜芳基-取代的烷基，如吡啶甲基、喹啉甲基、噻吩甲基、呋喃乙基、和喹啉乙基。所述雜芳烷基中的雜芳基可另外被鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基和鹵代烷氧基取代。術語″芳烷氧基″包括通過氧原子與其它基團連接的芳烷基。術語″芳烷氧烷基″包括通過氧原子與烷基連接的芳烷氧基。術語″芳烷基硫″包括與硫原子連接的芳烷基。術語″芳烷基硫烷基″包括通過硫原子與烷基連接的芳烷基硫。術語″氨烷基″包括被一或多種氨基取代的烷基。更優(yōu)選″低級氨烷基″。這種基團的例子包括氨甲基、氨乙基等。術語″烷氨基″是指已經被一個或兩個烷基取代的氨基。優(yōu)選具有1-6個碳原子烷基部分的″低級N-烷氨基″。適宜的低級烷氨基可以是一或二烷氨基，如N-甲氨基、N-乙氨基、N，N-二甲氨基、N，N-二乙氨基等。術語″芳氨基″表示已經被一個或兩個芳基取代的氨基，如N-苯氨基?！宸及被逶诨鶊F的芳環(huán)部分上可被進一步取代。術語″芳烷氨基″包括通過氨基氮原子與其它基團連接的芳烷基。術語″N-芳氨烷基″和″N-芳基-N-烷基-氨烷基″表示已經分別被一個芳基或一個芳基和一個烷基取代，并具有與烷基連接的氨基的基團。這種基團的例子包括N-苯氨甲基和N-苯基-N-甲氨甲基。術語″氨羰基″表示通式-C(＝O)NH2的酰胺基團。術語″烷氨羰基″表示在氮原子上已經被一個或兩個烷基取代的氨羰基。優(yōu)選″N-烷氨羰基″″N，N-二烷氨羰基″。更優(yōu)選具有上述低級烷基部分的″低級N-烷氨羰基″″低級N，N-二烷氨羰基″。術語″烷氨烷基″包括具有與氨烷基連接的一或多種烷基的基團。術語″芳氧烷基″包括具有通過二價氧原子與烷基連接的芳基的基團。術語″芳硫烷基″包括具有通過二價硫原子與烷基連接的芳基的基團。
本發(fā)明方法中所用的化合物可以游離堿或其藥學上可接受的酸加成鹽的形式存在。術語″藥學上可接受的鹽″包括通常用于形成堿金屬鹽和形成游離酸或游離堿的加成鹽的鹽。鹽的性質并不重要，只要它是藥學上可接受的。本發(fā)明化合物適宜的藥學上可接受的酸加成鹽可從無機酸或有機酸制備。這種無機酸的例子是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。適宜的有機酸可選自脂肪酸、環(huán)脂肪酸、芳香族酸、芳脂肪酸、雜環(huán)酸、羧酸和磺酸類的有機酸，它們的例子是甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、羥基乙酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖醛酸、馬來酸、富馬酸、丙酮酸、天門冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、鄰氨基苯甲酸、甲磺酸、4-羥苯甲酸、苯乙酸、苦杏仁酸、撲酸(雙氫萘酸)、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羥乙磺酸、甲苯磺酸、對氨基苯磺酸、環(huán)己氨磺酸、硬脂酸、algenic、b-羥丁酸、水楊酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。適宜的藥學上可接受的堿加成鹽包括從鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制備的金屬鹽或從N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、meglumine (N-甲葡糖胺)和普魯卡因制備的有機鹽。所有這些鹽都可通過使適宜的酸或堿與化合物反應，利用常規(guī)方法從相應的化合物制備。
組合
本發(fā)明還涉及含有醛甾酮拮抗劑和NSAID的組合。在其中一個實施方案中，該組合是含有醛甾酮拮抗劑和NSAID的藥物組合物。其中一個說明性、非限制性例子是含有依普利酮和雙氯酚酸鈉的藥物組合物。
藥物組合物
本發(fā)明包括一種用于預防或治療心血管疾病的藥物組合物，它含有治療有效量的醛甾酮拮抗劑與NSAID的組合以及至少一種藥學上可接受的載體、助劑或稀釋劑(此處共同稱為″載體″物質)和，如果需要，其它活性成分。本發(fā)明的活性化合物可通過本領域技術人員已知的任何適宜途徑給藥，優(yōu)選以適合這種途徑的藥物組合物形式以治療有效量給藥。該活性化合物和組合物可，例如，口服、血管內、腹膜內、鼻內、支氣管內、皮下、肌內或局部(包括氣霧劑)給藥。
醛甾酮拮抗劑與NSAID組合的給藥可以獨立制劑的形式順序進行，或通過以單一制劑或獨立制劑的形式同時給藥而完成。給藥可通過口服途徑，或通過靜脈內、肌內或皮下注射來完成。該制劑可以是大丸劑的形式，或含水或非水性等滲無菌注射溶液或混懸液的形式。這些溶液和混懸液可從具有一種或多種藥學上可接受載體或稀釋劑的無菌粉末或顆粒，或粘結劑如明膠或羥丙基-甲基纖維素，連同一種或多種潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑制備。
口服給藥時，所述藥物組合物可以是，例如，片劑、膠囊劑、混懸液或液體的形式。所述藥物組合物優(yōu)選被制備成含有特定量活性成分的劑量單位形式。這種劑量單位的例子是片劑或膠囊劑。這些可含有，例如，約1mg-約1000mg、或約5mg-約500mg、或約10mg-約250mg、或約25mg-約150mg用量的各種活性成分。哺乳動物的適宜每日劑量可根據(jù)患者的情況和其它因素廣泛變化。然而，約0.01-30mg/kg體重、特別是約1-15mg/kg體重的劑量是適宜的。
所述活性成分還可作為組合物注射給藥，其中，例如，可使用生理鹽水、葡萄糖或水作為適宜的載體。每種活性成分的適宜每日劑量根據(jù)所治療疾病的不同，每天多次給藥注射約0.01-15mg/kg體重。優(yōu)選的每日劑量為約1-10mg/kg體重。進行預防性治療所需的化合物通常優(yōu)選以約0.1mg-約15mg/kg體重/天的每日劑量給藥。更優(yōu)選的劑量約為1mg-約15mg/千克體重。最優(yōu)選的劑量是約1-約10mg/千克體重/天。適宜劑量可以每天多個分劑量的形式給藥。這些分劑量可以單位劑量的形式施用。
在其中一個實施方案中，醛甾酮受體拮抗劑可以約1mg-約200mg的用量存在，NSAID可以約1mg-約800mg的用量存在，表示醛甾酮拮抗劑與NSAID的比例為約200∶1-約1∶800。
在另一實施方案中，醛甾酮受體拮抗劑可以約5mg-約400mg的用量存在，NSAID可以約1mg-約200mg的用量存在，表示醛甾酮拮抗劑與NSAID的比例為約400∶1-約1∶40。
在另一實施方案中，醛甾酮受體拮抗劑可以約10mg-約200mg的用量存在，NSAID可以約5mg-約100mg的用量存在，表示醛甾酮拮抗劑與NSAID的比例為約40∶1-約1∶10。
在另一實施方案中，醛甾酮受體拮抗劑可以約20mg-約100mg的用量存在，NSAID可以約10mg-約80mg的用量存在，表示醛甾酮拮抗劑與NSAID的比例為約10∶1-約1∶4。
給予受試者或包含在藥物組合物中的NSAID劑量可改變且通常取決于所用的特定NSAID、固有的效能、生物可利用率和組合物的代謝不穩(wěn)定性以及它是否已經被配制用于立即釋放或延時釋放。具體NSAID的劑量范圍的非限制性例子在下面列出
成分號化合物舉例性給藥形式 舉例性給藥劑量 N-1對乙酰氨基酚膠囊劑/口服2.5mg-650mg N-2苯噁洛芬 N-3卡洛芬 N-4雙氯酚酸鈉片劑/口服；凝膠溶液0.2mg-75mg3％0.1％
N-5二氟尼柳片劑/口服250mg-500mg N-6依托度酸膠囊劑/口服400mg-600mg N-7非諾洛芬膠囊劑/口服200mg-400mg N-8氟比洛芬膠囊劑/口服；溶液50mg-100mg0.03％ N-9布洛芬片劑/口服；混懸液7.5mg-800mg40mg/ml-100mg/5ml N-10吲哚美辛膠囊劑/口服；栓劑；可注射的/注射25mg-75mg25mg-50mg1mg N-11酮基布洛芬膠囊劑/口服25mg-200mg N-12酮洛來克 N-13甲氯芬那酸鹽 N-14甲芬那酸膠囊劑/口服250mg N-15萘丁美酮片劑/口服500mg-750mg N-16萘普生混懸液；片劑/口服25mg250mg-500mg N-17奧沙普嗪片劑/口服600mg N-18羥保松 N-19保泰松 N-20吡羅昔康膠囊劑/口服10mg-20mg N-21舒林酸片劑/口服150mg-200mg N-22舒洛芬溶液1％ N-23替尼達普 N-24托美汀片劑/口服200mg-600mg N-25苯酰吡酸鈉 N-26阿司匹林片劑/口服0.19mg-770mg
本領域普通技術人員應當能夠使用這些劑量范圍作為適宜的起始點而給予這種治療，之后可根據(jù)所治療受試者的反應向上或向下滴定該劑量。
使用本發(fā)明的組合療法治療疾病的給藥方法是根據(jù)多種因素選擇的，包括患者的類型、年齡、體重、性別和健康狀況，疾病的嚴重程度，給藥途徑，和所用的特定化合物，并因此而廣泛變化。
下面，列出本發(fā)明組合的非限制性例子，其中該組合包含第一用量的醛甾酮拮抗劑和第二用量的NSAID，其中第一用量和第二用量一起包含治療有效量的醛甾酮受體拮抗劑和NSAID
實施例組分1組分21依普利酮N-12依普利酮N-23依普利酮N-34依普利酮N-45依普利酮N-56依普利酮N-67依普利酮N-78依普利酮N-89依普利酮N-910依普利酮N-1011依普利酮N-1112依普利酮N-1213依普利酮N-1314依普利酮N-1415依普利酮N-1516依普利酮N-1617依普利酮N-1718依普利酮N-1819依普利酮N-19
20依普利酮N-2021依普利酮N-2122依普利酮N-2223依普利酮N-2324依普利酮N-2425依普利酮N-2526依普利酮N-2627螺內酯N-128螺內酯N-229螺內酯N-330螺內酯N-431螺內酯N-532螺內酯N-633螺內酯N-734螺內酯N-835螺內酯N-936螺內酯N-1037螺內酯N-1138螺內酯N-1239螺內酯N-1340螺內酯N-1441螺內酯N-1542螺內酯N-1643螺內酯N-1744螺內酯N-1845螺內酯N-1946螺內酯N-2047螺內酯N-2148螺內酯N-22
49螺內酯N-2350螺內酯N-2451螺內酯N-2552螺內酯N-26
對于治療目的而言，本發(fā)明組合療法中的活性成分通常與一種或多種適于所需給藥途徑的助劑組合。如果口服給藥，所述成分可與乳糖、蔗糖、淀粉、鏈烷酸的纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、明膠、阿拉伯樹膠、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇混合，然后壓成片或裝入膠囊以方便給藥。這種膠囊或片劑可包括控釋制劑，其可以活性化合物在羥丙基甲基纖維素中的分散液形式提供。用于非腸道給藥的制劑可以是含水或非水性等滲無菌注射溶液或混懸液的形式。這些溶液和混懸液可從具有上述口服給藥制劑所用的一種或多種載體或稀釋劑的無菌粉末或顆粒制備。所述成分可溶于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化鈉、和/或各種緩沖液中。其它助劑和給藥形式也是藥學領域廣泛熟知的。
本發(fā)明還包括適用于進行上述治療和/或預防方法的試劑盒。在其中一個實施方案中，所述試劑盒包括含有一種或多種先前鑒定過的環(huán)氧-甾族醛甾酮拮抗劑的第一劑量形式以及含有表1中鑒定的NSAID的第二劑量形式，它們的用量足以進行本發(fā)明的方法。優(yōu)選，第一劑量形式和第二劑量形式同時含有治療有效量的化合物。在另一實施方案中，所述試劑盒還包含說明受試者如何使用試劑盒內含物的書面說明。該書面說明可用于，例如，使受試者獲得治療效果，而不會誘導不利的副作用。在另一實施方案中，所述書面說明包含由藥物管理機構對該試劑盒批準的產品標簽的全部或一部分。
活性化合物的晶形
選擇每種活性化合物的易處理、形式可再現(xiàn)、容易制備、穩(wěn)定而且非-吸濕的形式特別有益。作為舉例說明而不是限制，已經鑒定了醛甾酮拮抗劑依普利酮的多種晶形。這些包括H形式、L形式、多種結晶溶劑化物和無定形依普利酮。這些形式、制備這些形式的方法以及這些形式在制備組合物和藥劑中的用途在下列公開出版物中公開，它們在此處引入作為參考WO 01/41535和WO 01/42272。
受試者群體
某些群體更容易患有調節(jié)醛甾酮作用的疾病。對醛甾酮敏感的這些群體的成員通常也對鹽敏感，其中個體的血壓通常隨著鈉消耗量的增加和降低而分別上升和下降。而在實踐中，本發(fā)明雖不限于這些群體，卻預期某些受試者群體特別適于使用本發(fā)明抗炎劑量的醛甾酮阻斷劑進行治療。因此，可用本發(fā)明方法從治療或預防受益的受試者是通常具有一或多種下列特征的人類受試者
(a)受試者的氯化鈉平均日攝入量為至少約4克，特別是在已知年周期中的至少一或多個月間隔的任意一個月間隔內滿足這種情況。受試者的鈉平均日攝入量優(yōu)選至少約6克、更優(yōu)選至少約8克，且更優(yōu)選至少約12克。
(b)當受試者的日氯化鈉攝入量從少于約3g/天增加到至少約10g/天時，受試者的收縮壓和/或舒張壓升高至少約5％，優(yōu)選至少約7％，更優(yōu)選至少約10％。
(c)受試者血漿醛甾酮(ng/dL)與血漿腎素(ng/ml/hr)的活性比高于約30，優(yōu)選高于約40，更優(yōu)選高于約50；更優(yōu)選高于約60。
(d)受試者具有較低的血漿腎素水平；例如，受試者早晨的血漿腎素活性低于約1.0ng/dL/hr，和/或受試者的活性腎素值低于約15pg/mL。
(e)受試者患有或易患收縮壓和/或舒張壓升高。通常，受試者的收縮壓(例如，利用座式束臂水銀血壓計測量)為至少約130mmHg，優(yōu)選至少約140mmHg，更優(yōu)選至少約150mmHg，受試者的舒張壓(例如，利用座式束臂水銀血壓計測量)為至少約85mmHg，優(yōu)選至少約90mmHg，更優(yōu)選至少約100mmHg。
(f)受試者的尿鈉與尿鉀比(mmol/mmol)小于約6，優(yōu)選小于約5.5，更優(yōu)選小于約5，且更優(yōu)選小于約4.5。
(g)受試者的尿鈉水平為至少60mmol/天，特別是在已知年周期中的至少一或多個月間隔的任意一個月間隔內滿足這種情況。受試者的尿鈉水平優(yōu)選為至少約100mmol/天，更優(yōu)選至少約150mmol/天，更優(yōu)選200mmol/天。
(h)受試者中的一種或多種內皮縮血管肽，特別是血漿免疫反應性ET-1的血漿濃度升高。ET-1的血漿濃度優(yōu)選高于約2.0pmol/L，更優(yōu)選高于約4.0pmol/L，更優(yōu)選高于約8.0pmol/L。
(i)受試者的血壓對使用ACE抑制劑治療基本沒有反應，特別是受試者對10mg/天的依那普利反應與沒有接受抗高血壓療法的受試者血壓相比血壓降低小于約8mmHg，優(yōu)選小于5mmHg，更優(yōu)選小于3mmHg。
(j)受試者具有血容量擴充性高血壓或血容量擴充性臨界高血壓，即由于鈉潴留增加所致的血容量增加導致血壓升高的高血壓。
(k)受試者為非-調節(jié)個體，即，該個體表現(xiàn)在腎血流速度和/或醛甾酮的腎上腺產生中，對鈉攝入量升高或血管緊張肽II給藥具有遲鈍的陽性反應，特別是當反應小于從一般性地域群體采樣(例如，從受試者的來源國家或受試者的常駐國家采樣的個體)的個體的反應時，優(yōu)選當該反應小于群體平均值的40％，更優(yōu)選小于30％，更優(yōu)選小于20％時。
(l)受試者患有或易患腎機能障礙，特別是腎選自腎小球濾過率降低、微白蛋白尿、和蛋白尿中的一或多種的機能障礙。
(m)受試者患有或易患心血管疾病，特別是選自心力衰竭、左心室舒張機能障礙、肥大性心肌病、和舒張性心力衰竭的一或多種的心血管病。
(n)受試者患有或易患肝病，特別是肝硬化。
(o)受試者患有或易患水腫，特別是選自外周組織水腫、肝或脾充血、肝腹水、和呼吸道或肺充血的一種或多種的水腫。
(p)受試者患有或易患胰島素抗性、特別是I型或II型糖尿病、和/或葡萄糖敏感。
(q)受試者的年齡至少為55歲，優(yōu)選至少約60歲，更優(yōu)選至少約65歲。
(r)受試者是，全部或部分，選自亞洲(特別是日本)人種、美洲印第安人種、和黑人人種的至少一種人種的成員。
(s)受試者具有與鹽敏感性相關的一或多種遺傳標記。
(t)受試者肥胖，優(yōu)選具有超過25％的體脂肪，更優(yōu)選具有超過30％的體脂肪，甚至更優(yōu)選具有超過35％的體脂肪。
(u)受試者具有一或多種第一、第二、或第三支系鹽敏感的親屬，其中第一支系親屬是指父母或共有一個或更多相同父母的親屬，第二支系親屬是指祖父母或共有一個或更多相同祖父母的親屬，第三支系親屬是指曾祖父母和共有一個或更多曾祖父母的親屬。優(yōu)選，這種個體具有4個或更多鹽敏感的第一、第二或第三支系親屬；更優(yōu)選，8個或更多這種親屬；甚至更優(yōu)選，16個或更多這種親屬；甚至更優(yōu)選32個或更多這種親屬。
除非另有說明，上面所列的值優(yōu)選表示平均值，更優(yōu)選基于至少2個測量值的日平均值。
優(yōu)選，需要治療的受試者滿足至少兩個或多個上述特征，或至少3個或多個上述特征，或至少4個或多個上述特征。
生物學評價
人心血管疾病是復雜的病癥，常常由高血壓或心肌梗死(MI)引發(fā)。為了確定心血管疾病療法的可能有效性，重要的是確定成分在若干測定法中的功效。因此，在測定法″A″中，醛甾酮拮抗劑依普利酮(epoxymexrenone)的功效是在使用血管緊張肽II輸注的患有血管炎癥的高血壓大鼠模型中測定的。在測定法″B″中，研究描述了評價醛甾酮拮抗劑依普利酮(epoxymexrenone)在用醛甾酮輸注產生有血管炎癥的高血壓大鼠模型中的功效。在測定法″C″中，描述了更進一步的研究，評價了醛甾酮拮抗劑依普利酮(epoxymexrenone)在用醛甾酮輸注產生血管炎癥的高血壓大鼠模型中的功效。
此外，臨床試驗可用于評價在人類中進行的醛甾酮拮抗劑療法。這種治療性試驗的很多實施例都已經公開，包括在American Journal ofCardiology 78，902-907(1996)中描述的RALES 003研究的那些，或在New England Journal of Medicine 341，709-717(1999)中描述的RALES004研究。
測定法A體內血管緊張肽II輸注模型
方案
方法
●雄性Wistar大鼠(n＝50，10只/組；BW＝200g)
●飲用1％NaCl
●實驗組
1.對照組
2.血管緊張肽II(25ng/分，經由alzet微型泵sc)
3.血管緊張肽II(25ng/分，sc)+依普利酮100mpk
4.血管緊張肽II(25ng/分，sc)+腎上腺切除術+地塞米松(12μg/kg/d，sc)
5.血管緊張肽II(25ng/分，sc)+腎上腺切除術+地塞米松(12μg/kg/d，sc)+醛甾酮(40mg/kg/d，經由alzet微型泵sc)
●通過尾部-束裹每周測量SBP
●每天測量24-小時的食物和流體攝入及尿液排出量
●每天收集尿液樣品用于測定尿電解質
●4周后通過放血法處死。將血液收集在干燥的試管中，用于測定血清電解質，將血液收集在含有EDTA的試管中用于測量醛甾酮和皮質甾酮的水平
●用蘇木精和曙紅將心臟染色，并分析測定形態(tài)學異常(即，壞死、血管損傷)。
結果
血壓.接受血管緊張肽II輸注的所有動物的收縮壓都升高了。與接受載體的動物相比，依普利酮或腎上腺切除術都不能降低血壓。醛甾酮輸注可升高血管緊張肽II/鹽、切除腎上腺大鼠的血壓。圖1證實收縮壓升高。
電解質排泄.日尿Na+排泄和尿鉀+排泄之間的比值(U Na+/K+比值)可用作尿鈉排泄的指數(shù)。在開始治療之前，所有組中的尿Na+/K+比值均相似，且在開始高鹽飲食之后，所有動物都同樣升高。接受血管緊張肽II輸注動物的尿Na+/K+比值都沒有改變，直到第17天，與輸注載體的大鼠相比，這些動物的這一比值顯著升高。類似的作用出現(xiàn)在接受依普利酮的血管緊張肽II-輸注的動物中，證實了從輸注開始的第14天，尿Na+/K+比值升高。然而，較之用載體治療的血管緊張肽II-輸注大鼠，用依普利酮-治療的大鼠沒有哪個時間點出現(xiàn)更高的尿Na+/K+比值。事實上，顯著性差異僅在第21天觀察到，當血管緊張肽II-輸注、載體治療的大鼠現(xiàn)示較依普利酮-治療的動物具有更高的尿Na+/K+比值，表明在這些實驗條件下，依普利酮不能產生顯著的利尿或促尿鈉排泄的作用。無論進行或沒進行醛甾酮輸注，切除腎上腺的動物較之腎上腺完整的動物具有更高的尿Na+/K+比值。
心肌損傷.10只血管緊張肽II/鹽處理過的動物中有7只發(fā)展成冠狀動脈血管炎性改變。這些改變的特征在于血管周隙的白細胞滲透，主要是巨嗜細胞。還可在某些動脈中觀察到血管中層的類纖維蛋白壞死。在某些情況下，當損害擴大時，在周圍心肌中存在著相關的心肌細胞壞死。在這些情況下觀察到了實質出血，與心肌壞死的發(fā)現(xiàn)一致。這些血管炎性損害僅在10只接受依普利酮的血管緊張肽II-輸注動物的1只中觀察到，盡管事實上這些動物同用載體處理的血管緊張肽II-輸注的大鼠一樣患有高血壓。(見圖2)。同樣，腎上腺切除術可防止心臟的血管炎性損害。然而，醛甾酮替代療法可恢復在血管緊張肽-II輸注、腎上腺完整、載體處理的大鼠中觀察到的嚴重冠狀動脈和心肌炎癥及損傷。
用環(huán)加氧酶-2特異性抗體將血管緊張肽II-輸注大鼠的心臟進行免疫染色，可鑒定動脈周圍的炎癥區(qū)域，主要是單核細胞/巨嗜細胞中是否存在該酶。環(huán)加氧酶-2染色還可在冠狀動脈中層的血管平滑肌細胞中觀察到，甚至是在血管周隙中沒有顯現(xiàn)形態(tài)學改變或炎性聚集體時(圖4)。依普利酮治療及腎上腺切除術均可顯著降低且在絕大多數(shù)情況下完全防止環(huán)加氧酶-2在血管緊張肽II-輸注大鼠的心臟中表達(見圖3和5)。血管緊張肽-II、切除腎上腺的大鼠中醛甾酮的置換可恢復冠狀動脈中環(huán)加氧酶-2的存在。
骨橋蛋白(也被稱作早期T-細胞活化-1、Eta-1)是一種具有促炎特性的分泌型糖蛋白，調節(jié)單核細胞的趨化、活化和遷移。用骨橋蛋白特異性抗體將血管緊張肽II輸注、飲用鹽水的大鼠心臟免疫染色，可鑒定冠狀動脈的中層是否存在骨橋蛋白。依普利酮治療和腎上腺切除術均可防止骨橋蛋白在血管緊張肽II-輸注、飲用鹽水的大鼠心臟中表達(圖6和7)。醛甾酮的替換可恢復骨橋蛋白在切除腎上腺的動物中表達。
測定法B體內醛甾酮輸注模型
方案2
方法
●雄性Sprague Dawley大鼠(n＝39；BW＝250g)
●飲用1％ NaCl
●在微型泵的植入過程中進行單側腎切除術
●實驗組
1.對照組
2.醛甾酮(0.75mg/hr，經由alzet微型泵sc)
2.醛甾酮(0.75mg/hr，經由alzet微型泵sc)+依普利酮100mpk，p.o
1.醛甾酮(0.75mg/hr，經由alzet微型泵sc)+溶于飲用流體中的0.6％KCl
●1、2和3組僅接受溶于飲用溶液中的0.3％KCl
●通過插入到腹主動脈中的無線遙測探針測量SBP
●4周后處死
→采集心臟并通過中室的橫截面分成兩半上半部貯存在福爾馬林中。下半部在液氮中急速冷凍用于進行生化分析。
●用蘇木精和曙紅及膠原特異性染料picro-sirius紅將心臟染色，并分析測定間質膠原的體積分數(shù)和形態(tài)學異常(即壞死、血管損傷)。
●測量冷凍心臟中的羥脯氨酸濃度。
●骨橋蛋白和COX-2的測定是通過定量RT-PCR(Taqman)進行的。骨橋蛋白還可通過免疫組織化學在心臟中鑒定。
結果
血壓.接受醛甾酮輸注的所有動物的收縮壓都升高。依普利酮治療可顯著降低血壓，但不能使血壓正常化。圖21以圖表示這些結果。
心肌損傷.飲用鹽水、單側腎切除的大鼠沒有心肌損傷。通過間質膠原體積分數(shù)的組織學測定或通過羥脯氨酸濃度的生化測定得到的間質膠原測定值可證實在接受醛甾酮/鹽處理的動物中沒有心肌纖維化。然而，對醛甾酮/鹽處理大鼠的蘇木紫-曙紅染色心臟的檢查證實了嚴重的血管炎性損害。這些損害與方案1中描述的那些相同。依普利酮的給藥可完全防止醛甾酮輸注、飲用鹽水、單側腎切除大鼠的血管炎性改變(圖10)，即使它不能使血壓正?；Ｉ攀斥浀纳邔θ╃尥T導的損傷的發(fā)展沒有顯著影響，因為這些動物顯示與接受載體的醛甾酮/鹽處理的大鼠相似的損傷水平。
在第28天時，測定每組(飲用1％NaCl的大鼠，飲用1％NaCl加醛甾酮的大鼠，和飲用1％NaCl加醛甾酮和依普利酮的大鼠)的血清骨橋蛋白水平。圖23表示在依普利酮治療過的大鼠中，循環(huán)骨橋蛋白的水平顯著降低。
骨橋蛋白免疫染色還可在這些動物的心臟中進行。在沒有接受醛甾酮的、飲用鹽水的單側腎切除動物中沒有檢測到骨橋蛋白。然而，在接受醛甾酮輸注動物的冠狀動脈中層可清楚地鑒定骨橋蛋白。依普利酮治療可防止骨橋蛋白在醛甾酮輸注大鼠的心臟中表達(圖8和18)。膳食鉀的升高不能降低骨橋蛋白的表達。通過定量RT-PCR測定骨橋蛋白mRNA，證實了這種細胞因子在接受載體的醛甾酮/鹽處理大鼠心臟中的顯著(7倍)上調(相對mRNA表達1.7±.2vs 12.25±1.7，P＜.0001)。這種作用可由依普利酮阻礙(相對mRNA表達2.5±.6，P＜.0001vs醛甾酮/鹽+載體組)。與環(huán)加氧酶-2對心臟中醛甾酮-誘導的血管炎癥發(fā)展的作用一致，COX-2mRNA表達在進行醛甾酮/鹽+載體處理的大鼠中增加了3倍(相對mRNA表達1.2±.12vs 3.7±.46，P＜.0001)。與對骨橋蛋白表達的作用相似，依普利酮可防止COX-2在醛甾酮/鹽處理大鼠中的表達水平升高(相對mRNA表達1.8±.36，P＜.01vs醛甾酮/鹽+載體組，見圖9和17)。以同樣的方式，通過依普利酮治療可減弱MCP-1表達和IL-6表達(圖24)。
上述數(shù)據(jù)表明醛甾酮可在高血壓大鼠的心臟中調節(jié)血管炎性表型。這種表型與動脈中層血管平滑肌細胞中的環(huán)加氧酶-2和細胞因子骨橋蛋白的上調有關，這可調節(jié)所觀察到的血管周圍炎癥以及隨后冠狀動脈和心肌層的局部出血/壞死性損傷。不希望受到任何理論的限制，據(jù)信這就是調節(jié)在疾病，如心力衰竭、冠狀動脈疾病、自身免疫性疾病或病毒性心肌炎、結節(jié)性動脈周圍炎(periateritis nodosa)、中風和腎硬化中觀察到的血管改變的機理。圖11揭示骨橋蛋白和環(huán)加氧酶-2在冠狀動脈壁的類似區(qū)中表達。而理論在本發(fā)明中不起作用，圖12表示這種模型的建議機理。在這些實施例中，依普利酮治療可防止心臟中的血管炎癥達到與腎上腺切除術類似的程度，如方案#1所示。依普利酮的作用很大程度上與收縮壓的顯著降低無關，如方案#1所示。依普利酮在血管緊張肽II/鹽高血壓大鼠中缺少利尿或促尿鈉排泄的作用說明選擇性醛甾酮拮抗劑的保護性作用也與其對上皮組織的可能作用無關。此外，膳食鉀升高不能模擬依普利酮作用的事實與依普利酮通過其節(jié)省鉀的性質提供益處的可能性相反。因此，我們提出醛甾酮可能在冠狀血管系統(tǒng)中具有直接的有害作用，與這種激素在上皮組織電解質體內平衡中的作用或其對血壓的作用無關。將依普利酮給予人類可通過其在血管化器官，包括但不限制于心臟、腎、和腦中的抗炎作用而提供益處，這是由本實驗加以證實的。
測定法C進一步的體內醛甾酮輸注研究
測定法B的過程在進一步的研究中詳述。使單側腎切除的Sprague-Dawley大鼠飲用1％NaCl-0.3％KCl，并接受下列其中一種治療載體；醛甾酮輸注；或醛甾酮輸注聯(lián)合依普利酮(100mg/kg/日)。通過醛甾酮/鹽處理30天后在大鼠中誘導的嚴重高血壓可由依普利酮顯著降低。在治療7、14、或30天后，檢查每個治療組動物的心肌組織。病理組織學分析揭示血管炎性損害在第14天開始，并擴展至周圍心肌層，導致病灶的局部出血/壞死性改變。損害發(fā)生在促炎分子表達和進行性上調之后。促炎分子的上調節(jié)和相關的血管心肌損害可通過依普利酮治療顯著減弱。這些數(shù)據(jù)證實了依普利酮可有效降低血壓，并對心臟中醛甾酮誘導的血管炎性損害提供終端-器官保護。
動物
雄性Sprague-Dawley大鼠，重230-250g(Harlan Sprague-DawleyIndustries，Indianapolis，IN)在22±1℃室溫、12小時光亮/12小時黑暗的每日循環(huán)的房間內飼養(yǎng)(n＝96)。到達后，使動物調整1周，并自由接觸TEKLAD 22/5嚙齒動物食物(Harlan TEKLAD，Madison，WI)和自來水，直到開始實驗。
實驗方案
手術前，將動物單獨稱重，并安排在下列其中一組(I)高鹽對照組(載體/正常食物/1％NaCl和0.3％KCl飲用水，n＝31，共3個時間點組)，(II)醛甾酮對照組(醛甾酮/正常食物/1％NaCl和0.3％KCl飲用水，n＝28，共3個時間點組)，(III)100mg/kg/天依普利酮(醛甾酮/依普利酮食物/1％NaCl和0.3％KCl飲用水，n＝30，共3個時間點)。將氯化鉀補充加入到生理鹽水溶液中，從而防止與醛甾酮過量有關的可能低鉀血癥。
治療
手術時，將含有載體(9％乙醇/87％丙二醇/4％dH2O)或1.0mg/mL d-醛甾酮(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的Alzet 2002滲透微型泵(AlzaCorp.，Palo Alto，CA)皮下植入到頸背。醛甾酮是以0.75μg/小時的劑量給藥的。將依普利酮以1mg/g食物的濃度(經計算，給予100mg/kg/天)摻入到TEKLAD 22/5嚙齒動物食物(Harlan TEKLAD，Madison，WI)中。先前的分析工作已經證實了依普利酮在該食物中的穩(wěn)定性，以及制備后得到的均勻性。在治療7、14、或30天后處死每組的動物(n＝8-13)。
手術過程
按照下列過程，將在治療7或14天后處死的動物進行單側腎切除，并植入Alzet微型泵。將治療30天的動物進行單側腎切除，安裝微型泵，并植入無線遙測設備(型號TA11PA-C40，Data Sciences Inc.，St.Paul，MN)。用5％異氟烷(SOLVAY Animal Health Inc.，Mendota Heights，MN)麻醉動物，異氟烷是用VMS麻醉儀(Matrix Medical，Inc.，OrchardPark，NY)在O2中送遞的。在手術過程中用1-2％異氟烷維持麻醉。夾住手術位置，用氯己定擦拭，并噴上聚維酮碘。用#11解剖刀片，穿過皮膚，從胸腔基底向公共區(qū)進行頭尾切開。第二次切開是穿過腹壁肌肉進行的，從而使腹腔暴露。分離左側腎的尿管、腎動脈和靜脈，用4-0絲線結扎，切除并棄去腎。用組織牽開器小心地取出器官，從而使腹主動脈暴露。從剩余結締組織分離出一個1.5cm腹主動脈分支進入髂動脈的嘴側的節(jié)段，并用4-0絲線使中與主動脈錨接。然后將微血管夾放在清潔區(qū)的兩端，以終止過量的血液流出。使用排架，21號針，穿透腹主動脈。植入無線遙測設備的套管，并用4-0絲線錨狀物固定在主動脈中。使器官復位，并將遙測設備放在器官上。使用4-0絲線的不間斷縫合模式縫合腹壁，隨后用4-0絲線以間斷縫合方式縫合皮膚。在縫合處周圍給動物注射100μL麻醉用鹽酸布比卡因(Sanofi WinthropPharmaceuticals，New York，NY)并(i.m.)注射抗生素頭孢孟多(EliLilly和Co.，Indianapolis，IN)。手術后的注意事項包括在從麻醉恢復的過程中，監(jiān)測加熱墊上的動物，直到重建胸骨橫臥。每天監(jiān)測動物的痛苦癥狀和手術位置的感染。用0.1-0.5mg/kg，s.c.Buphrenorphine(Rickett和Colman Pharmaceuticals，Inc.Richmond，VA)處理手術后持續(xù)不適的動物。把動物放置在自來水和TEKLAD 22/5嚙齒類動物食物上(Harlan TEKLAD，Madison，WI)。
血壓分析
無線遙測的動脈血壓是用DATAQUEST A.R.T 1.1版-Gold軟件(DataSciences International，St.Paul，MN)計算的。收集24小時內的數(shù)據(jù)點，將收集速度設置為每只動物每隔5分鐘閱讀10秒。24小時周期為6:00a.m.-6:00a.m.。
處死
在每個實驗時間點停止時，用戊巴比妥(65mg/kg i.p.，SigmaChemical，St.Louis MO)麻醉動物，并用Mettler PM6000天平(Mettler-Toledo，Inc.，Hightstown，NJ)稱重。打開腹腔使腹主動脈暴露。將16號針插入到腹主動脈中，并將動物放血到12cc注射器中。將血液樣品立即轉移到玻璃血清收集試管(Terumo Medical Corp.，Elkton，MD)中進行藥物水平分析。將樣品放在水冰上，直到樣品收集完全，4℃下，3000rev/分鐘離心15分鐘。
放血后，分離心臟和腎，取出，在冷的磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌，吸干。立即用剃刀片沿長軸將腎分開，并放在10％中性緩沖福爾馬林(NBF，Richard-Allen Scientific，Kalamazoo，MI)中。就心臟而言，將右心室(RV)從左心室(LV)上切下來，兩個心室都用Mettler AE163天平(Mettler-Toledo，Inc.，Hightstown，NJ)稱重，并將RV放在10％NBF中。從LV尖上切除2mm的冠狀片，用干冰/異戊烷冷凍，用于分析基因表達，并將LV的剩余部分放在10％NBF中固定。最后的水分微調是在固定3-4天后完成的，其中除去第二個2mm的冠狀片用于進行羥脯氨酸分析，并從近赤道區(qū)除去第3個2mm的冠狀片用于組織學。
組織處理和染色
使用自動化組織處理器(Hypercenter XP，Shandon/Lipshaw Inc.，Pittsburgh，PA)在石蠟中常規(guī)處理心臟的近赤道區(qū)并將其包埋到新鮮的石蠟頂面(Shandon Embedding Center，Shandon/Lipshaw Inc.)。使用Leica RM2035輪轉切片機(Leica Inc.，Houston，Texas)從組織的每個區(qū)切下5和10μm的切片，并固定在Superfrost/Plus顯微鏡載玻片(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上。用膠原特異性染料，Picrosirius Red F3BA(飽和的苦味酸(Sigma Chemical，St.Louis，MO)和0.1％(w/v)Sirius Red F3BA(C.I.#35780，Pfaltz和Bauer，Inc.Waterbury，CN)(6)將10μm切片染色。用水使固定的組織水合。隨后，在加有0.2％(w/v)磷鉬酸(Sigma Chemical，St.Louis MO)的蒸餾水中培養(yǎng)載玻片15分鐘，然后轉移到0.1％Picrosirius Red F3BA中染色110分鐘，在95％乙醇w/1％乙酸(v/v)中放置1分鐘，接著是2分鐘，在100％乙醇中培養(yǎng)1分鐘，并在二甲苯中澄清1分鐘。使用PermountHistological Mounting Media(Fisher Scientific)，用#1蓋玻片覆蓋載玻片。切下每只動物的5μm切片，固定在兩個載玻片上。一個載玻片進行蘇木精和曙紅染色處理，一個載玻片進行高碘酸Schiff(PAS)染色處理。蘇木精和曙紅和PAS用于心臟的病理學評分。
組織病理分析
心肌損傷的半-定量分析是按照先前所述，進行微小改進后實施的(7)。簡單地說，0-4的得分用于評價心肌損傷水平。0分表示沒有損害。1分表示存在血管和血管周圍的炎性損害，但沒有心肌細胞損傷。當觀察到一個很清晰的心肌壞死區(qū)域時，得2分。心肌壞死被定義為心肌細胞存在壞死性改變，如核固縮或核溶解、非收縮的邊緣波狀纖維和胞質的嗜曙紅細胞過多，或心肌細胞膜破壞的明顯證據(jù)。當發(fā)現(xiàn)兩個或多個獨立的壞死區(qū)域時(暗示兩個不同受損區(qū)的存在)，心臟得3分。經證實危害超過左心室50％的廣泛壞死區(qū)域的心臟得4分。
影像分析
使用Videometric 150影像分析系統(tǒng)(Oncor Inc.，Gaitherburg，MD)，Picrosirius Red F3BA染色的載玻片用于量化間質膠原。簡單地說，使用Nikon E Plan 10/0.25；與Nikon Optiphot顯微鏡(Nikon Inc.)連接的160/-物鏡(Nikon Inc.Garden City，NY)捕獲影像。Toshiba 3CCD Color Video Camera(型號IK-T30T，Toshiba Corp.Japan)可將RGB格式的影像從顯微鏡轉播給具有V150視頻板的386計算機。V150視頻板/V150軟件的應用(Oncor Inc.)可將RGB像轉化成HIS(Hue，Intensity，Saturation)格式用于顯示，并以305x的放大率在SonyTrinitron Color Video Monitor(型號PVM-1342Q，Sony Corp，Tokyo，Japan)上分析。一旦影像在像監(jiān)測器上顯示；通過被稱作閾限的過程限定要測量的像素色調、強度、和色飽和度。然后，V150應用僅測量落在閾限內的像素。該系統(tǒng)使用微米量度校準(EM Sciences，F(xiàn)T.Washington，PA 19034)，數(shù)據(jù)以mm2或□m2表示。每次測量后，數(shù)據(jù)自動保存為ASCII文件格式，并轉化成Microsoft Excel 7.0版用于最后的合計。
免疫組織化學
在甲苯中將5μm切片脫石蠟(兩次，5-10分鐘孵育)并通過在乙醇中孵育3分鐘而再水合100％乙醇中孵育2次，接著在95％乙醇中孵育2次，并在70％乙醇中孵育1次。一旦水合，將切片在自來水中洗滌1分鐘，并在蒸餾水中洗滌1分鐘。通過將載玻片放置在3.0％H2O2中15分鐘，接著在蒸餾水中洗滌5分鐘而阻斷內源性過氧化物的活性。使用pH6.0的檸檬酸處理載玻片用于抗原回收。將載玻片加熱至沸騰，25℃冷卻20分鐘，并在蒸餾水中洗滌。使用DAKO自動染色儀(DAKOCorporation，Carpinteria，CA)將載玻片染色。染色前，洗滌并在阻斷緩沖液中孵育該載玻片20分鐘。阻斷緩沖劑在Vectastain ABC試劑盒(Vector Labs，Burlingame，CA)中描述，并含有10mL TNB(NEN TSABiotin System試劑盒，Cat#NEL700A，NEN Life Science Products，Boston，MA)和3滴標準(相當于次級抗體)血清。
用于染色的初級抗體包括1∶100稀釋的骨橋蛋白(小鼠單克隆，Cat#MPIIIb10，Developmental Studies Hybridoma Bank，The Universityof Iowa，Iowa City，IA)；1∶500稀釋的ED-1(抗-巨嗜細胞糖蛋白，小鼠單克隆，MAB1435，Chemicon International Inc.，Temecula，CA)；1∶300稀釋的CD-3(抗-T-細胞，兔多克隆-親和純化抗體，A0452，DAKOCorporation，Carpineria，CA)；1∶100稀釋的ICAM-1(山羊多克隆-親和純化，M-19sc-1511，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；1∶100稀釋的VCAM-1(山羊多克隆-親和純化，C-19sc-1504，SantaCruz Biotechnology)。載玻片先與初級抗體孵育60分鐘，接著與終濃度5μL/mL的生物素化抗體孵育30分鐘，溫度為25℃。染色可用Vectastain ABC-AP試劑盒(Vector Laboratories)及二氨基聯(lián)苯胺染料(DAKO Corporation，Carpinteria，CA)顯現(xiàn)。在水中洗滌載玻片，并用蘇木精復染色30秒。同型匹配的IgG(Sigma Chemical，St.LouisMO)被用作初級抗體的陰性對照。
骨橋蛋白mRNA的原位雜交
RNA探針是以大鼠骨橋蛋白的序列為基礎產生的(GenBank登記號#NM 008608-1)。簡單地說，大鼠骨橋蛋白的cDNA片段是通過使用下列引物進行RT-PCR而產生的正向引物5′-TGG CAC ATT TGT CTT；反向引物3′AGC CCA TCC AGTC。使用TA克隆試劑盒(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)將該cDNA片段插入到PCR II質粒中。探針是在100μL體外轉錄反應物中標記的，該反應物含有rRNA酶抑制劑(2U)、DNA酶(0.5U)、TE緩沖液(1X)、rGTP(10mM)、rCTP(10mM)、rATP(10mM)、rUTP(10mM)、(PROMEGA，Madison，WI)、5/μL(50μCi)33P-UTP(Elkin Pelmer，Boston，MA)和適宜的RNA聚合酶(Sp6 RNA聚合酶(20U/μL)；T7 RNA聚合酶(15U～μL)、PROMEGA)，37℃，60分鐘。使用Microcon YM-50微型濃縮器(Amicon，Bedford，MA)除去反應物中的游離標記。在二甲苯中使切片脫石蠟，并在上述梯度乙醇溶液中再水合，4℃下，在4％低聚甲醛(EMS，F(xiàn)t.Washington，PA)中固定10分鐘。然后用蛋白激酶K(5mg/mL；10分鐘，37℃，Roche，Indianapolis，IN)消化組織，并在0.5XSSC緩沖液(鹽水-檸檬酸鈉緩沖液)中洗滌(10分鐘)。在一系列梯度乙醇中順序脫水，即上述再水合的相反過程后，進行預雜交，42℃下在雜交緩沖液(50％福爾馬林，2XSSC，10％葡聚糖硫酸鹽，v/v)中培養(yǎng)2小時。雜交是55℃下，使用含有tRNA(50pg/mL，Sigma，St.Louis，MO)的雜交緩沖液和適宜的標記探針過夜進行的。然后在2XSSC緩沖液、0.1XSSC-EDTA緩沖液(0.1XSSC、1mM EDTA)、和2XSSC緩沖液中連續(xù)洗滌雜交組織1小時40分鐘。最后，在含有NH4OAc的一系列梯度乙醇中將載玻片脫水(每次2分鐘)，室溫下在真空干燥器中干燥1.5小時。使組織暴露于磷屏過夜。用照相乳膠(Kodak，Rochester，NY)涂覆載玻片，顯影前，4℃下曝光3-5周。用蘇木精和曙紅將顯影的載玻片復染色。
TagMan分析的原理
使用Applied Biosystems′7700序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)進行的熒光5′-核酸酶測定(TaqMan PCR)通過監(jiān)測基因特異性、染料標記的寡核苷酸探針的熒光的增加而實時檢測/量化特定基因。目標和參考基因的探針在5′-末端用6-羧基熒光素(6FAM)報道染料標記，在3′-末端用6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明(TAMRA)猝滅染料標記。當探針被退火到靶基因時，6FAM的熒光由TAMRA的接近而受阻。Taq聚合酶的外切核酸酶活性從寡核苷酸探針釋放染料，這是通過替換導致熒光激發(fā)的靶序列探針而實現(xiàn)的，熒光激發(fā)與存在的靶信息的量成正比。數(shù)據(jù)分析使用Applied Biosystems的序列檢測系統(tǒng)軟件進行。
TagMan引物和探針TGFβ1、ANP、I型膠原、III型膠原
引物和探針是用Oligo Primer Analysis Software，5.0版本(National Biosciences Inc.(NBI)-Wojciech Rychlik，Cascade，CO)設計的。引物由Life Technologies(Grand Island，NY)合成，探針由Applied Biosystems合成。引物/探針組是從所要分析的大鼠基因的已知序列設計的。相對于構成型表達的親環(huán)蛋白這一參考基因使所有靶基因的值標準化。引物/探針組序列可在表8中找到。
表8 TaqMan RT-PCR基因標記引物/探針組基因正向引物反向引物探針轉化生長因子β1(TGFβ1)CACCATCCATGACATGAACC ACCTTGCTGTACT GTGTGTCC TCAGCTCCACAG AGAAGAACTGC心房鈉尿因子(ANP)TGGGCTCCTTCTCCATCAC AGCAGAGCCCTCA GTTTG CCATATTGGAGC AAATCCCGTATA CI型膠原ACCAAGGCTGCAACCTGGA GCAGGAAGGTCAG CTGGAT CCATACTCGAAC TGGAATCCATCGIII型膠原GGCTTTCAGTTCAGCTATGG GACTGTCTTGCTC CATTCAC CCTGATCTTCCT GAAGATGTCCTT G
親環(huán)蛋白CTTGTCCATGGCAAATGCTG GTGATCTTCTTGC TGGTCTTGC CCACAATGCTCA TGCCTTCTTTCA CC 環(huán)加氧酶-2 (COX-2)TCAAAGACACTCAGGTAGACATGATCT CGGCACCAGACCA AAGACTT CACGTCCCTGAG CACCTGCGG 骨橋蛋白CCAGCACACAAGCAGACGTT TCAGTCCATAAGC CAAGCTATCAC CAGTCGATGTCC CTGACGGCCG 單核細胞趨化 蛋白-1 (MCP-1)GCAGGTCTCTGTCACGCTTCT GGCTGAGACAGCA CGTGGAT CCTGTTGTTCAC AGTTGCTGCCTG TAGC 胞間粘著分子 (ICAM-1)ACCTGCAGCCGGAAAGC CCCGTTTGACAGA CTTCACCAT CCGATAGGCAGC GGGACACCA 血管細胞粘著 分子-1 (VCAM-1)GAAGCCGGTCATGGTCAAGT GGTCACCCTTGAA CAGTTCTATCTC TGGCTCCTGATG TTTACCCAATTG ACAGA 親環(huán)蛋白AGAGAAATTTGAGGATGAGAACTTCAT TTGTGTTTGGTCC AGCATTTG AAGCATACAGGT CCTGGCATCTTG TCCAT
所有寡核苷酸都按照5′-3′書寫。引物是未標記的，且所有探針在5′末端用6-羧基熒光素(6FAM)報道染料標記，在3′末端用6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明(TAMRA)猝滅染料標記。
RNA分離TGFβ1、ANP、I型膠原、III型膠原
按照制造商的說明(Leedo Medical Laboratories，Inc.，Houston，Texas)，使用1.5mL RNA-STAT 60將RNA從冷凍的(-70℃)左心室(LV)組織(大約10-20mg)中提取出來。簡單地說，使用裝有5mm探針(Ultra-Turrax T8 Homogenizer，IKA Works，Inc.Wilmington，NC)的組織勻漿器將組織勻化。勻化后，室溫下，定期與等體積的分子梯度氯仿(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)混合孵育10分鐘。12,000g離心樣品10分鐘，通過加入等體積分子梯度異丙醇(Sigma ChemicalCo.)使RNA從上層沉淀出來，接著在-80℃下過夜培養(yǎng)。12,000g離心使RNA沉淀，用75％乙醇洗滌，并溶解在沒有核酸酶的水中(Promega，Madison，WI)。將RNA稀釋，并利用分光光度法分析濃度和純度(A260/A280＝1.9-2.0，平均產率為2-5μg RNA)。
逆轉錄TGFβ1、ANP、I型膠原、III型膠原
雙鏈cDNA是通過向20μL終體積中加入400ng RNA(4μL)而合成的，該終體積含有15％沒有核酸酶的水(Promega，Madison，WI)、1XRT緩沖液(Life Technologies，Grand Island，NY)、10mM DTT(LifeTechnologies)、分別為0.5mM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)、2.5μM Oligod(T)15(Oligo Therapeutics，Inc.，Wilsonville，OR)、40個單位的RNA酶抑制劑(Promega)、和200個單位的SuperScript II逆轉錄酶(Life Technologies)。反應是在帶蓋的薄壁反應試管(Applied Biosystems)中進行的，以確保精確的反應溫度。反應是按照下列方案，使用GeneAmp 9600熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)進行的37℃1小時，95℃5分鐘，和4℃10分鐘。
TaqMan分析TGFβ1、ANP、I型膠原、III型膠原
每個PCR反應物都含有下列加入到22.5μL PCR混合物中的2.5μL(50ng)各cDNA，所述PCR混合物含有38.5％沒有核酸酶的水(Promega)、1X PCR緩沖液II、2mM MgCl2、0.05U/μL AmpliTaq Gold(PCR Core Reagent Kit，N808-0228，Applied Biosystems)、300nM各正向和反向引物(Life Technologies)、200nM探針(AppliedBiosystems)和200μM各dATP、dTTP、dGTP、和dCTP(AppliedBiosystems)。單次反應是在帶有MicroAmp光學蓋(Applied Biosystems)的MicroAmp光學試管中進行的，并將該試管裝到7700 SequenceDetector中。下列方案用于所有反應95℃10分鐘(聚合酶活化)、95℃10秒(變性)和57℃1分鐘(退火)循環(huán)40次。
TagMan引物和探針COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1
所有引物和探針都是用帶有7700序列監(jiān)測系統(tǒng)的引物表達軟件設計并由Applied Biosystems合成的。使用5-倍稀釋的總RNA(200ng-320pg)繪制標準曲線，以在分析實驗樣品前，測定TaqMan反應中各引物/探針組的效率。引物/探針組是從所要分析的大鼠基因已知序列設計的。所有靶基因值都相對于組成型表達的親環(huán)蛋白參考基因標準化。引物/探針組序列可在表8中找到。
RNA分離COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1
RNA是用總RNA分離試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)從冷凍(-80℃)的大鼠心臟組織中提取出來的。使用不銹鋼研缽和研棒將組織碾碎，將其于-80℃冷凍并轉移到含有3-10mL冷變性緩沖液的杜恩斯勻漿器(Kontes，Vineland，NJ)中。將組織勻化并轉移到無菌的15mL聚丙烯離心試管中。加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，用力振搖樣品1分鐘，在冰上孵育至少15分鐘。10,000g離心樣品30分鐘。除去水相，加入1/10體積的醋酸鈉溶液(3.0M NaOAc pH4.5)，將樣品振搖或翻轉10秒，加入與起始樣品體積等體積的酸-苯酚(與異戊醇預混合)∶氯仿(5∶1，Ambion，Inc.)。用力振搖樣品1分鐘，接著在冰上孵育15分鐘，10,000g離心30分鐘。除去水相，并將其放在干凈的聚丙烯試管中。加入等體積的異丙醇(Sigma，St.Louis，MO)，將樣品混合，-20℃培養(yǎng)過夜。10,000g離心樣品30分鐘，除去上清液，并將RNA沉淀重懸浮在沒有DNA酶/RNA酶的水中。-80℃下冷凍樣品至少2小時，在水冰上融化，并稀釋用于定量。
通過DNA酶消化除去基因組DNA和LiCl沉淀除去碳水化合物而進一步純化所有的RNA。37℃下，將各RNA(100μg)與1個單位的DNA酶(Roche Diagnostics，Indidianapolis，IN)和10個單位的RNA酶抑制劑(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)在含有40mM Tris pH7.8、6mM MgCl2、10mM CaCl2的緩沖液中孵育45分鐘。利用RNA清除所用的RNeasy Mini方案(Qiagen，Valencia，CA)除去DNA酶和緩沖液。用體積等于樣品體積一半的7.5M LiCl/50mM EDTA(Ambion，Inc.，Austin，TX)沉淀RNA，-20℃培養(yǎng)過夜，4℃下，13-16,000g離心30分鐘。-80℃下，冷凍所有RNA至少2小時，融化，稀釋，并利用分光光度法分析濃度和純度。
TaqMan分析COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1
TaqMan反應是如下進行的。將10μL(200ng)總RNA(DNA酶處理過和LiCl沉淀的)加入到15μL RT-PCR反應混合物中，該反應混合物含有沒有尿嘧啶-N-糖基化酶的12.5μL 2X One-Step PCR Master Mix(含有AmpliTaq Gold DNA聚合酶，dNTPs，有dUTP，被動參考，和優(yōu)化的緩沖液組分)，0.625μL的40X Multi Scribe和RNAse抑制劑混合物，0.625μL的20μM正向引物，0.625μL的20μM反向引物，0.5μL 5μM TaqMan探針，和0.125μL沒有DNA酶/RNA酶的水。反應是在帶有MicroAmp光學蓋或粘著蓋的MicroAmp光學96-孔反應平板(AppliedBiosystems)中一式兩份進行的，并將其裝到7700序列檢測器中。下列方案用于所有反應48℃30分鐘(逆轉錄)、95℃10分鐘(逆轉錄酶的滅活和聚合酶活化)、95℃15秒(變性)和60℃1分鐘(退火)循環(huán)40次。
羥脯氨酸測定法
心肌羥脯氨酸濃度是通過比色測法測量的，該測定法可量化氧化的羥脯氨酸與對-二甲氨基苯甲醛之間的反應(4)。簡單地說，用Reacti-Therm熱阻(Pierce，Rockford，IL)在60℃下干燥組織(180-250mg)18小時，并稱重。150℃下，在Reacti-Therm熱阻中，用2mL 6NHCl水解干燥組織和陽性膠原對照(Bovine Collagen Type I，Sigma，St.Louis，MO)。在氮氣下將酸蒸發(fā)，并在有4mL異丙醇存在時，在1mL檸檬酸鹽-乙酸鹽緩沖液(0.7M NaOAc、0.2M檸檬酸鹽、45mM檸檬酸、pH6.0)中將樣品再水合，并通過0.45μm Millex LCR濾器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)過濾。
羥脯氨酸含量是通過25℃下，將60μL水解樣品或膠原標準品與350μl檸檬酸鹽-乙酸鹽-異丙醇緩沖液(具有40％異丙醇的檸檬酸鹽-乙酸鹽緩沖液，v/v)和100μL 300mM氯胺T(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)孵育5分鐘而測量的。加入Erlich′s試劑(1.25mL，溶于70％高氯酸和80％異丙醇中的3.5M對-二甲氨基苯甲醛，v/v)顯現(xiàn)和量化羥脯氨酸。60℃孵育樣品30分鐘，冷卻至室溫，檢測558nm處的吸光度。羥脯氨酸含量根據(jù)新制備的反式-4-羥基-L-脯氨酸(Sigma，St.Louis，MO)標準曲線量化。所有樣品和標準品都是一式兩份進行的。統(tǒng)計學分析
數(shù)據(jù)是用變量的單向分析(ANOVA)進行分析的。因為組內正態(tài)假設和組間變量的相等不一致，因此分析是根據(jù)原始數(shù)據(jù)的排列轉化值進行的(非參數(shù)分析)。α＝0.05的顯著性水平用于平均值間的計劃比較。最小顯著性差異(LSD)方法用于組間的計劃比較。使用SAS統(tǒng)計學軟件包(SAS PC，6.12版，SAS Institute，Cary，NC)中的PROC TTEST分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)都以平均值±平均值的標準偏差(SEM)報道。
動物排除
在實驗過程中，有3只動物死亡#17大鼠(醛甾酮+鹽組，在輸注24天后發(fā)現(xiàn)死亡)，#64大鼠(醛甾酮+鹽組，手術后死亡)，和#5大鼠(載體組，手術后死亡)。如果發(fā)現(xiàn)多個參數(shù)都不能代表它們被分配的治療組，則排除這些動物(例如，超過該治療組平均值3個標準偏差)。有3只這樣的動物被從研究中排除#57大鼠(來自7-天方案，醛甾酮+鹽組)，#97大鼠(來自14-天方案，醛甾酮+鹽組)，和#24大鼠(來自30-天方案，100mg/kg/天依普利酮組)。這3只動物表現(xiàn)了炎性標記基因(COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、和VCAM-1)的表達，超過治療組平均值3個標準偏差。#24大鼠也被排除，是因為遙測設備功能失常。這些動物所產生的值在表9.10-表9.19中表示，與數(shù)據(jù)表中其它動物的數(shù)據(jù)分開。
表9.10表10所用的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大鼠#124678910天 心收縮壓(mmHg)3118130121-- ---- --1184120122125-- ---- --1235126123125-- ---- --1276132129130-- ---- --1317133132134-- ---- --1318135133133-- ---- --1299131131133-- ---- --12810130132128124 --116 13512711130130129125 --118 13812812130128126124 --124 14312813131127128121 --123 14312614142122126125 --128 14812815144128127128 --125 13412716132133127128 --125 13412317133133127123 --124 14012818134133129121 --126 14312819125129120125 --124 14012820119131121125 --122 13912621123131125126 --120 13612822127128128126 --125 13312923129133131125 --128 13813124132134130125 --132 14013025133131125125 --128 13612926132131127126 --132 141130
--＝由于技術困難沒有采集到數(shù)據(jù)。
表9.10(接續(xù))
醛甾酮+鹽 大鼠 #111213141516181920 天 心收縮壓(mmHg) 3 116 152 115 127 143 122 -- 124 159 4 120 149 122 134 129 135 -- 125 152 5 126 158 124 142 129 137 -- 128 151 6 132 170 136 157 144 149 -- 135 158 7 140 179 139 165 153 154 -- 145 165 8 145 182 143 160 158 154 -- 146 163 9 150 191 148 172 172 159 -- 151 169 10 156 196 149 175 175 165 -- 151 172 11 154 201 155 178 181 163 -- 155 175 12 159 207 161 190 186 170 -- 163 190 13 161 210 166 196 191 172 -- 166 194 14 164 208 170 204 192 181 159 172 192 15 171 200 164 205 183 173 160 175 194 16 179 218 165 200 194 176 166 187 198 17 174 222 178 209 220 185 170 192 202 18 181 226 174 212 213 186 175 198 203 19 189 219 185 208 231 188 177 201 203 20 192 225 190 220 212 198 180 207 204 21 197 227 197 218 220 201 186 213 211 22 198 227 204 213 223 204 190 221 204 23 200 221 203 223 214 204 187 220 199 24 204 218 199 222 219 207 194 212 212 25 215 209 205 231 219 210 198 196 210 26 219 211 215 224 207 202 192 212 205
--＝由于技術困難沒有采集到數(shù)據(jù)。
表9.10(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大鼠#212223252627 28 29 30 24*天心收縮壓(mmHg)3 123 126 130 128 119 125 126 125 130 --4 130 128 131 139 122 126 128 130 134 --5 132 134 132 143 123 127 127 133 142 --6 133 142 136 152 126 133 137 140 150 --7 140 142 143 156 132 140 140 141 156 --8 142 146 141 156 131 138 138 139 152 --9 142 146 139 154 130 133 137 141 151 -- 10 143 143 138 158 134 136 139 142 149 -- 11 145 139 138 160 136 137 140 145 152 -- 12 147 140 139 165 137 139 140 148 154 -- 13 148 144 137 170 140 140 140 149 153 -- 14 146 142 138 178 143 144 143 152 161 -- 15 145 143 137 173 143 144 141 149 156 -- 16 148 137 137 179 145 145 143 150 164 -- 17 148 141 143 182 149 148 143 160 174 -- 18 151 146 144 187 152 149 148 162 177 -- 19 156 147 145 192 153 154 150 166 177 -- 20 159 147 146 192 155 151 151 168 176 -- 21 162 148 152 200 159 154 155 175 182 -- 22 162 149 153 203 160 158 155 176 185 -- 23 169 157 157 209 163 160 159 180 191 -- 24 168 164 159 211 163 162 161 180 195 -- 25 174 165 161 215 165 161 161 182 198 -- 26 178 168 163 223 167 166 162 192 202 --
--＝由于技術困難沒有采集到數(shù)據(jù)。
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.11用于表11的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大 鼠 # 終體重(g) 左心室 重(mg) 右心室重(mg) 脛骨 長 (cm) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm) 右心室重 (mg)/脛骨 長(cm) AN P(A U) 472917711943.919850 0. 90 482836991553.818441 0. 70 492846961663.818344 3. 59 502675621753.814846 3. 96 512686361783.816747 1. 11 522737091853.719250 0. 94 532696991973.818452 0. 64 542456121893.816150 1. 06 552866671903.817650 0. 93 562456161493.816239 1. 10 Mean2716671783.817547 1. 49 SEM51950.0151 0. 38
表9.11(接續(xù))
醛甾酮+鹽 大 鼠 # 終體重(g)左心室重(mg)右心室重(mg)脛骨長(cm) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm)右心室重(mg)/脛骨長(cm)ANP(AU) 58266784183 3.820648 11. 92 59271719178 3.620049 3.9 9 60299719223 3.918457 13. 41 61286779185 3.920047 3.6
4 62274746168 3.819644 9.0 9 63276620154 3.816341 13. 13 65--849197 3.921851 6.1 3 66266674174 3.718247 3.8 8 Mean277736183 3.819448 8.1 5 SEM5257 0.0 362 1.5 1
--＝由于技術困難沒有采集到數(shù)據(jù)。 57*267778208 3.820555 13.32
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.11(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大 鼠 # 終體重(g) 左心室 重(mg) 右心室重(mg) 脛骨 長 (cm )左心室重(mg)/脛骨長(cm) 右心室重 (mg)/脛骨 長(cm) ANP (AU) 67306859216 3.922055 1. 26 68295712181 3.818748 1. 81 69286618154 3.716742 0. 59 70277658174 3.817346 2. 58 71295754192 3.819851 4. 48 72281733171 3.819345 4. 98 73273726181 3.819148 3. 82 74286696190 3.818350 3. 59 75--700170 3.818445 0. 95 76276688187 3.818149 3. 67
Mean286714182 3.818848 2. 77 SEM4205 0.0 151 0. 49
--＝由于技術困難沒有采集到數(shù)據(jù)。
表9.12用于表12的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大 鼠 # 終體重(g)左心室重(mg) 右心室重(mg) 脛骨 長 (cm)左心室重(mg)/脛骨長(cm) 右心室重 (mg) /脛骨 長(cm) ANP (AU) 873197601883.919548 0.16 883377822383.920161 0.92 893226651793.917146 0.36 903228022083.821155 0.89 91--7421743.819546 7.04 923277902003.820853 1.89 933247473033.819780 3.33 943018261843.8021748 1.80 953037451783.819647 1.08 962957562063.919453 0.17 1273137771743.919945 nd 1282956771783.817847 nd 1292786571653.817343 nd Mean3117481983.819552 1.76 SEM515100.0143 0.66
--＝由于技術困難沒有采集到數(shù)據(jù)。
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.12(接續(xù))
醛甾酮+鹽 大 鼠 #終體重 (g)左心室重(mg)右心室重(mg)脛骨長(cm) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm)右心室重(mg)/脛骨長(cm) ANP (AU) 98298846194 3.822351 4.5 8 99261784189 3.820650 7.7
5 100307912208 3.923453 7.3 4 101242720174 3.818946 4.1 8 102307923217 3.923756 1.5 9 103279854186 3.8 022549 17. 81 104308894216 3.922955 6.4 8 105290859171 3.922044 8.0 8 106264750153 3.819740 2.5 1 130275818202 3.821553 nd 131193746195 3.720253 nd 132215700172 3.619448 nd Mean270817189 3.821450 6.7 0 SEM11225 0.0 251 1.5 9
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。97*235809178 3.920746 5.96
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于
統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.12(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大 鼠 # 終體重(g) 左心室 重(mg) 右心室重(mg) 脛骨 長 (cm ) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm) 右心室重 (mg)/脛骨 長(cm) ANP (AU) 133281804182 3.821248 nd 134304898188 3.823649 2.8 4 135293789176 3.820846 3.2 2 136268851189 3.922149 6.3 9 137267668139 3.817637 4.0 4
138247833371 3.7225100 25.9 0 139296886193 3.823351 5.5 2 140291756188 3.819949 3.5 7 141297751158 3.819842 2.2 9 142264795155 3.721542 8.3 7 143302915225 3.923558 4.2 4 Mean283813197 3.821452 6.6 4 SEM62219 0.0 265 2.2 2
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.13用于表13的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大 鼠 # 終體重(g) 左心室 重(mg) 右心室重(mg) 脛骨 長 (cm ) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm) 右心室重 (mg)/脛骨 長(cm) ANP (AU)1308686160 4.017240 0.9 52337763194 4.118647 0.3 04316728162 4.018241 0.1 26343721162 4.117640 1.0 67291664153 4.016638 1.9 38294612180 4.114944 0.2 49291613141 4.015335 1.1 710332812184 4.219344 0.1 1Mean314700167 4.117241 0.7 4SEM8256 0.0 351 0.2 3
醛甾酮+鹽 大 鼠 # 終體重 (g)左心室重(mg) 右心室重(mg) 脛骨 長 (cm ) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm) 右心室重 (mg)/脛骨 長(cm) ANP (AU)11289934196 4.023449 23. 5912219726148 3.819139 43. 1113289963215 3.924755 14. 8314282942176 3.924245 18. 90152901030224 3.926457 14. 8316267837173 3.921544 23. 4318319962220 3.924756 15. 1419263873187 4.021847 6.7 720234919185 3.824249 20. 97Mean272910192 3.923349 20. 17SEM10298 0.0 272 3.3 6
表9.13(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽大鼠#終體重 (g)左心室重(mg)右心室重(mg)脛骨長(cm)左心室重(mg)/脛骨長(cm)右心室重(mg)/脛骨長(cm)ANP(AU) 21310873177 3.922445 1.9 3 22343908202 4.123352 1.1 5 23334899200 3.923151 4.8 9 252991063209 3.927354 21. 26 26361958187 3.924648 10. 63 273511129242 3.928962 20. 25
28316929189 3.923848 10. 20 29352805181 4.020646 4.8 2 30317861195 3.922150 7.6 7 Mean331936198 3.924051 9.2 0 SEM7346 0.0 092 2.4 4
24*273822178 3.921146 13.45
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.14用于表14的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大 鼠 # 心肌壞死 (0-4) 間隙膠原體積 分數(shù)(％) 羥脯氨酸 (μg/mg)膠原ImRNA(AU)膠原IIImRNA(AU) 470.02.95.111.721.39 480.07.15.720.630.80 490.03.13.151.972.00 500.04.12.371.081.19 510.03.42.231.401.09 520.04.52.480.730.92 530.02.32.351.221.27 540.06.62.420.780.91 550.04.14.680.540.70 560.06.35.210.930.61 Mean0.04.43.571.101.09 SEM0.00.50.450.150.13
表9.14(接續(xù))
醛甾酮+鹽大鼠#心肌壞死 (0-4)間隙膠原體積分數(shù)(％)羥脯氨酸 (μg/mg) 膠原I mRNA (AU)膠原IIImRNA(AU) 580.0nd4.480.840.65 590.03.24.061.401.29 600.06.52.321.971.67 610.0nd2.141.891.67 620.06.12.181.361.59
630.06.92.311.051.59 650.06.52.101.331.58 660.04.42.221.071.30 Mean0.05.62.731.361.42 SEM0.00.60.340.140.12
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。 57*0.03.13.861.711.15
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.14(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大 鼠 # 心肌壞死 (0-4) 間隙膠原體積 分數(shù)(％) 羥脯氨酸 (μg/mg) 膠原ImRNA(AU) 膠原III mRNA (AU) 670.04.32.020.620.93 680.07.24.180.920.95 690.02.94.080.290.43 700.03.33.961.791.25 710.04.24.260.781.03 720.06.64.170.851.14 730.04.41.900.290.45 740.04.91.530.420.64 750.08.82.081.281.33 760.06.92.411.212.71 Mean0.05.43.060.851.09 SEM0.00.60.360.150.21
表9.15用于表15的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大 鼠 #心肌壞死 (0-4) 間隙膠原 體積分數(shù)(％)羥脯氨酸(μg/mg)膠原ImRNA(AU)膠原IIImRNA(AU) 870.04.62.030.900.96 880.03.92.201.601.60 890.06.54.510.920.80 900.04.44.070.580.65 910.06.34.931.281.42 920.03.14.000.941.05
930.04.92.891.141.00 940.03.93.241.071.02 950.03.23.211.561.00 960.03.73.160.800.56 1270.04.92.66ndnd 1280.06.02.70ndnd 1290.06.12.84ndnd Mean0.04.73.261.081.01 SEM0.00.40.240.100.10
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.15(接續(xù))
醛甾酮+鹽 大 鼠 # 心肌壞死 (0-4) 間隙膠原體積 分數(shù)(％) 羥脯氨酸 (μg/mg) 膠原I mRNA (AU) 膠原III mRNA (AU) 980.04.42.891.150.76 991.05.42.912.311.80 1000.03.26.280.250.44 1010.05.95.631.891.39 1020.04.64.832.031.17 1031.03.95.641.001.24 1040.04.85.291.201.06 1050.04.62.761.701.31 1061.05.92.680.430.59 1300.03.42.60ndnd 1313.06.43.00ndnd 1323.09.03.99ndnd Mean0.85.14.041.331.08 SEM0.30.50.400.240.14
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
97*3.03.22.732.691.22
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.15(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大 鼠 #心肌壞死 (0-4) 間隙膠原 體積分數(shù)(％)羥脯氨酸(μg/mg)膠原ImRNA(AU)膠原IIImRNA(AU)
1331.04.12.950.860.60 1340.06.25.970.861.19 1351.03.96.520.901.16 1360.03.75.351.651.24 1370.04.26.801.141.70 1380.03.55.321.441.81 1391.03.32.720.500.60 1400.03.73.131.241.61 1410.05.22.411.692.21 1422.05.62.812.031.80 1430.06.05.033.023.77 Mean0.54.54.461.391.61 SEM0.20.30.500.210.26
表9.16用于表16的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大 鼠 #心肌壞死 (0-4) 間隙膠原體積 分數(shù)(％) 羥脯氨酸 (μg/mg) 膠原I mRNA (AU)膠原IIImRNA(AU)10.04.32.001.691.4320.04.12.710.900.9840.06.42.951.651.0260.07.93.020.901.2870.05.82.810.970.6280.07.75.841.030.5490.06.05.450.690.94 100.07.17.030.920.48 Mean0.06.23.981.090.91 SEM0.00.50.650.130.12
醛甾酮+鹽 大 鼠 #心肌壞死 (0-4)間隙膠原體積分數(shù)(％)羥脯氨酸(μg/mg)膠原ImRNA(AU)膠原IIImRNA(AU) 111.56.67.242.200.75 122.58.88.012.020.58 133.07.23.625.881.99 142.07.13.691.050.72 153.09.34.001.322.04 160.56.83.542.021.43 182.04.03.071.981.82 190.37.23.251.631.89 203.514.53.092.541.28
Mean2.07.94.392.291.39SEM0.41.00.620.470.20
表9.16(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大 鼠 #心肌壞死 (0-4)間隙膠原體積分數(shù)(％)羥脯氨酸(μg/mg)膠原I mRNA (AU)膠原IIImRNA(AU) 210.03.45.181.890.95 220.05.06.111.540.72 230.06.55.172.651.37 250.07.96.401.970.89 260.07.12.732.981.26 270.06.32.842.651.87 280.06.12.972.901.66 290.05.42.822.882.89 300.07.82.723.352.16 Mean0.06.24.102.531.53 SEM0.00.50.530.200.23
24*0.04.45.752.010.73
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.17用于表17的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大鼠#COX-2(AU) 骨橋蛋白 (AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU) VCAM (AU) 47ndndnd1.32ndnd 48ndndnd0.66ndnd 49ndndnd1.46ndnd 500.571.281.130.721.151.19 511.040.941.001.170.94nd 520.990.730.710.801.171.17 530.871.000.841.110.820.60 541.88ndnd0.90ndnd 551.01ndnd0.52ndnd 56nd1.661.671.501.000.86 Mean1.061.121.070.981.020.96 SEM0.180.160.170.120.070.14
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.17(接續(xù))
醛甾酮+鹽 大鼠#COX-2(AU) 骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU) VCAM (AU)582.101.842.051.231.393.49590.700.841.780.980.800.85602.010.953.061.311.092.06612.951.052.361.891.612.51622.051.081.951.221.111.65631.944.922.331.451.150.61653.543.293.141.471.560.94662.451.322.401.211.060.27 Mean2.221.912.381.351.221.55 SEM0.290.510.170.090.100.39
57*0.8228.645.171.351.685.23
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.17(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大鼠 #COX-2(AU)骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU) VCAM (AU) 671.190.542.350.800.910.67 682.851.241.600.810.890.58 690.600.520.850.510.890.22 70ndndnd1.31ndnd 711.160.270.830.800.400.57 720.820.601.741.021.23nd 731.861.132.380.61ndnd 74ndndnd0.84ndnd 750.600.960.671.510.580.53 760.910.752.031.641.001.00 Mean1.250.751.560.990.830.56 SEM0.290.120.250.120.100.08
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.18用于表18的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大鼠#COX-2(AU)骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β (AU) ICAM (AU) VCAM (AU)871.691.281.281.211.450.92880.741.130.941.191.110.6489ndndnd1.00ndnd901.000.940.730.841.14nd911.431.001.381.321.230.93920.611.280.911.260.981.00930.841.401.000.860.941.35941.180.871.050.821.00nd95ndndnd1.00ndnd96ndndnd0.74ndnd127ndndndndndnd128ndndndndndnd129ndndndndndndMean1.071.131.041.021.120.97SEM0.150.080.080.070.070.11
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.18(接續(xù))
醛甾酮+鹽 大鼠 #COX-2(AU)骨橋蛋白 (AU) MCP1 (AU) TGF-β (AU) ICAM (AU) VCAM (AU) 98ndndnd1.26ndnd 997.398.142.421.851.160.89 1001.831.021.870.551.180.69 1015.806.194.591.911.750.84 1022.594.063.191.491.150.72 1036.6312.043.341.181.912.23 1044.182.351.911.321.191.03 1053.718.252.501.271.821.65 1062.6210.412.220.561.571.24 130ndndndndndnd 131ndndndndndnd 132ndndndndndnd Mean4.346.562.761.271.471.16 SEM0.721.370.320.160.120.19
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。 97*23.3481.295.881.291.84 1.75
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
表9.18(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大鼠 #COX-2(AU)骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU)VCAM(AU) 1331.564.031.780.581.200.54 1341.041.001.370.621.360.66 1350.700.771.271.040.950.61 1361.418.431.751.421.260.61 1373.781.591.601.291.560.67 1381.863.971.241.490.980.86 1396.193.931.920.711.511.21 1401.872.131.241.210.791.00 1410.990.721.891.440.980.68 1421.924.762.211.691.721.60 1430.860.991.202.410.830.68 Mean2.022.941.591.261.190.83 SEM0.490.720.100.160.090.10
表2.19用于表19的個體數(shù)據(jù)
對照組載體+鹽 大鼠 #COX-2(AU)骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU) VCAM (AU)11.150.812.390.531.010.9621.751.461.790.522.291.9340.960.571.001.000.99nd60.950.820.811.191.601.3870.861.130.521.00ndnd81.071.160.531.680.550.4591.001.001.520.900.961.0010ndndnd1.24ndndMean1.110.991.221.011.231.14SEM0.110.110.270.130.250.25
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
醛甾酮+鹽 大鼠 #COX-2(AU)骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU) VCAM (AU) 11ndndnd1.41ndnd
124.2613.133.941.27ndnd 134.8111.437.192.112.673.48 14ndndnd1.20ndnd 151.5413.781.611.951.631.87 16ndndnd1.49ndnd 183.107.979.350.831.692.99 195.2818.442.300.541.501.64 208.2014.882.861.211.540.72 Mean4.5313.274.541.331.812.14 SEM0.921.431.250.160.220.49
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。
表9.19(接續(xù))
依普利酮+醛甾酮+鹽 大鼠#COX-2(AU)骨橋蛋白(AU) MCP1 (AU) TGF-β(AU)ICAM(AU) VCAM (AU)212.441.532.111.001.541.42220.553.281.701.492.061.29231.971.982.211.401.011.49253.418.911.381.311.211.27263.711.882.100.961.260.79273.041.972.021.931.060.52282.111.281.431.540.600.57291.341.435.581.320.990.61301.921.012.110.89nd1.42Mean2.282.592.291.321.221.04SEM0.330.820.420.110.150.14
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報告數(shù)據(jù)。 24*12.2154.578.141.352.92 4.01
*這只動物的數(shù)據(jù)不被考慮用于統(tǒng)計學分析且不包括在最終的結果中。
結果
血壓
在實驗過程中，載體+鹽的對照組的血壓保持正常(表10)。醛甾酮+鹽誘導血壓隨時間進行性升高。在接受依普利酮+醛甾酮+鹽的動物中，收縮壓在第8-30天顯著降低。然而，與載體+鹽的對照組相比，血壓仍然保持升高的水平。
表10.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合隨時間對血壓的作用心收縮壓(mmHg)天載體+鹽 n醛甾酮+鹽n依普利酮+醛甾酮+鹽n 3122±3 4132±68126±19 4123±1 4133±4*8130±2*9 5125±1 4137±4*8132±2*9 6130±1 4148±5*8139±3*9 7132±1 4155±5*8143±3*9 8132±1 4156±4*8142±3*#9 9131±1 4164±5*8142±3*#9 10127±2 7168±6*8142±2*#9 11128±2 7171±6*8143±3*#9 12129±2 7178±6*8145±3*#9 13128±3 7182±6*8147±3*#9 14131±4 7182±6*9150±4*#9 15130±2 7181±5*9148±4*#9 16129±2 7187±6*9150±4*#9 17130±2 7195±7*9154±5*#9 18131±3 7196±6*9157±5*#9 19127±2 7200±6*9160±5*#9 20126±3 7203±5*9160±5*#9 21127±2 7208±4*9165±6*#9 22128±1 7209±4*9167±6*#9 23131±2 7208±4*9172±6*#9 24132±2 7210±3*9174±6*#9 25130±2 7210±4*9176±6*#9 26131±2 7210±3*9180±7*#9
這些數(shù)據(jù)在圖1中以圖形表示。
值是在24小時周期內，每隔5分鐘所獲得值的平均值±SEM。
*明顯不同于載體+鹽，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
體重，心肌肥大和ANP
與載體+鹽的正常血壓對照組相比，在第7、14和30天時，接受醛甾酮+鹽處理的動物體重明顯降低(表11-13)。由醛甾酮+鹽處理誘導的體重降低可通過在第30天時給予依普利酮而顯著減弱(表11)。在醛甾酮+鹽處理中，出現(xiàn)明顯的左心室和右心室肥大。左心室肥大在進行醛甾酮+鹽處理7天后較明顯，而右心室肥大僅在醛甾酮+鹽處理30天后較明顯(表13)。依普利酮不能影響由醛甾酮+鹽處理誘導的絕對心室重量或心室重量與脛骨長度的比值(表11-13)。心房鈉尿肽(ANP)mRNA水平的顯著升高也可在用醛甾酮+鹽處理的動物中觀察到(表11-13)。ANP mRNA的上調可在治療30天后，而不是治療14天后，通過依普利酮顯著降低(表13)。
表11.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療7天后對大鼠的作用組#終體重(g)左心室重(mg)右心室重(mg) 脛 骨 長 (c m)左心室重(mg)/脛骨長(cm)右心室重(mg)/脛骨長(cm)ANP(AU)載體+鹽271±5(n＝10)667±19(n＝10)178±5(n＝10)3.8±0.01(n＝10) 175±5 (n＝10)47±1(n＝10)1.49±0.38(n＝10)醛甾酮+鹽277±5(n＝7)736±25*(n＝8)183±7(n＝8)3.8±0.03(n＝8) 194±6* (n＝8)48±2(n＝8)8.72±1.51*(n＝8)依普利酮+醛甾酮+鹽287±4*(n＝9)714±20(n＝10)182±5(n＝10)3.8±0.01(n＝10) 188±5 (n＝10)48±1(n＝10)2.77±0.49*#(n＝10)
值是治療7天后測量的平均值±SEM
*明顯不同于載體+鹽對照組，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
ANP＝心房鈉尿肽。
AU＝相對于親環(huán)蛋白表達測量的任意單位。
表12.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療14天后對大鼠的作用組#終體重(g)左心室重(mg)右心室重(mg)脛骨長(cm) 左心室 重(mg) /脛骨長 (cm)右心室重(mg)/ 脛骨長(cm)ANP(AU)載體+鹽311±5(n＝12)748±25(n＝13)198±10(n＝13)3.8±0.01(n＝13) 195±4 (n＝13)52±3(n＝13)1.76±0.66(n＝10)醛甾酮+鹽270±11*(n＝12)817±22*(n＝12)189±5(n＝12)3.8±0.02(n＝12) 214±5* (n＝12)50±1(n＝12)6.70±1.59*(n＝9)依普利酮+醛甾酮+鹽283±6*(n＝11)813±22*(n＝11)197±19(n＝11)3.8±0.02(n＝11) 214±6* (n＝11)52±5(n＝11)6.64±2.22*(n＝10)
值是治療14天后測量的平均值±SEM
*明顯不同于載體+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
ANP＝心房鈉尿肽。
AU＝相對于親環(huán)蛋白表達測量的任意單位。
表13.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療30天后對大鼠的作用組# 終 體 重 (g)左心室重(mg)右心室重(mg)脛骨長(cm)左心室重(mg)/脛骨長 (cm)右心室重(mg)/脛骨長(cm)ANP(AU)載體+鹽(n＝8)314±8 700±2 5 167±6 4.1±0. 03172±541±10.74±0.23醛甾酮+鹽(n＝9)272±10* 910±2 9* 192±8* 3.9±0. 02*233±7*49±2*20.17±3.36*依普利酮+醛甾酮+鹽(n＝9)331±7# 936±3 4* 198±6* 3.9±0. 00*240±9*51±2*9.20±2.44*#
值是治療30天后測量的平均值±SEM
*明顯不同于載體+鹽，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
ANP＝心房鈉尿肽。
AU＝相對于親環(huán)蛋白表達測量的任意單位。
心肌壞死
在實驗組之間，間質膠原體積分數(shù)和羥脯氨酸水平在任一時間點都沒有統(tǒng)計學上的差異(表14-16)。與載體+鹽的對照組相比，在第30天時，I型膠原信息的適度增加可在醛甾酮+鹽和醛甾酮+依普利酮+鹽的治療組檢測到(表16)。III型膠原mRNA水平在任一時間點都沒有顯著增加(表14-16)。
表14.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療7天后對大鼠心肌損傷和纖維化的作用組心肌壞死(0-4)ICVF(％)羥脯氨酸(μg/mg) 膠原I mRNA (AU) 膠原III mRNA (AU)載體+鹽 0.0±0.0 (n＝10) 4.4±0 .5 (n＝10 ) 3.57±0.4 5 (n＝10)1.10±0.15(n＝10)1.09±0.13(n＝10)醛甾酮+鹽 0.0±0.0 (n＝8) 5.6±0 .6 (n＝6) 2.73±0.3 4 (n＝8)1.36±0.14(n＝8)1.42±0.12(n＝8)依普利酮+醛甾酮+鹽 0.0±0.0 (n＝10) 5.4±0 .6 (n＝10 ) 3.06±0.3 6 (n＝10)0.85±0.15(n＝10)1.09±0.21(n＝10)
值是治療7天后測量的平均值±SEM
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
ICVF＝間質膠原體積分數(shù)
I型膠原＝I型膠原mRNA.
III型膠原＝III型膠原mRNA.
AU＝相對于親環(huán)蛋白表達測量的任意單位。
表15.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療14天后對大鼠心肌損傷和纖維化的作用組心肌壞死(0-4) ICVF (％) 羥脯氨酸 (μg/mg) 膠原I mRNA (AU)膠原IIImRNA(AU)載體+鹽0.0±0.0(n＝13) 4.7±0 .4 (n＝13 )3.26±0.24(n＝13) 1.08±0. 10 (n＝10)1.01±0.10(n＝10)醛甾酮+鹽0.8±0.3(n＝12) 5.1±0 .5 (n＝12 )4.04±0.40(n＝12) 1.33±0. 24 (n＝9)1.08±0.14(n＝9)依普利酮+醛甾酮+鹽0.5±0.2(n＝11) 4.5±0 .3 (n＝11 )4.46±0.50(n＝11) 1.39±0. 21 (n＝11)1.61±0.26(n＝11)
值是治療14天后測量的平均值±SEM
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
ICVF＝間質膠原體積分數(shù)
I型膠原＝I型膠原mRNA.
III型膠原＝III型膠原mRNA.
AU＝相對于親環(huán)蛋白表達測量的任意單位。
表16.醛甾酮+鹽處理單獨或與
依普利酮聯(lián)合治療30天后對大鼠心
肌損傷和纖維化的作用
組心肌壞死(0-4) ICVF (％) 羥脯氨酸 (μg/mg) 膠原I mRNA (AU)膠原IIImRNA(AU)載體+鹽(n＝8)0.0±0.0 6.2±0 .5 3.98±0.6 5 1.09±0. 130.91±0.12醛甾酮+鹽(n＝9)2.0±0.4* 7.9±1 .0 4.39±0.6 2 2.29±0. 47*1.39±0.20依普利酮+醛甾酮+鹽(n＝9)0.0±0.0# 6.2±0 .5 4.10±0.5 3 2.53±0. 20*1.53±0.23
數(shù)據(jù)是治療30天后測量的平均值±SEM
*明顯不同于載體組，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
ICVF＝間質膠原體積分數(shù)
I型膠原＝I型膠原mRNA.
III型膠原＝III型膠原mRNA.
AU＝相對于親環(huán)蛋白表達測量的任意單位。
心肌組織病理學
心肌組織損害是在治療7、14和30天后，使用半-定量評分系統(tǒng)評價的。載體+鹽對照組的心臟在所有時間點都是組織學正常的。在接受醛甾酮+鹽處理7天后的大鼠心臟中沒有鑒定出血管或心肌損害(表14)。相反，在開始處理的第14天，觀察到了病灶動脈和心肌改變(表15和16)。醛甾酮+鹽處理14天和30天后的動脈和心肌定性改變相似，但頻率和嚴重程度隨時間而增加。依普利酮的給藥可顯著減弱所有時間點的心肌損傷(表14-16；圖44)。
炎性介質的基因表達
多種促炎分子的表達水平是用定量Taqman PCR分析評估的(表17-19)。環(huán)加氧酶-2(COX-2)及單核趨化蛋白-1(MCP-1)的表達水平在所有時間點由醛甾酮+鹽處理都類似且顯著地升高。骨橋蛋白的表達也可在醛甾酮+鹽處理14(6倍)和30天(13倍)后被顯著上調(表18-19)。轉化生長因子β1(TGF-β1)的mRNA水平在所檢測的任一時間點都未上調。胞內粘著分子-1(ICAM-1)的mRNA表達在醛甾酮+鹽處理的第14和30天上調，雖然增加是適度的(表9-10)。血管細胞粘著分子-1(VCAM-1)的基因表達在醛甾酮+鹽處理的第30天增加了2倍，然而這種增加沒有達到統(tǒng)計學顯著(表19)。與用醛甾酮+鹽處理的動物中的基因表達相比，所有標記基因的表達由依普利酮顯著降低。
表17.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療7天后對大鼠炎性標記相對mRNA表達的作用組 COX-2 mRNA (AU) 骨橋蛋白 mRNA (AU)MCP-1mRNA(AU) TGF-β1 mRNA (AU) ICAM mRNA (AU) VCAM mRNA (AU)載體+鹽 1.06±0 .18 (n＝6) 1.12±0 .16 (n＝5)1.07±0.17(n＝5) 0.98±0 .12 (n＝10 ) 1.02±0 .12 (n＝5) 0.96±0 .14 (n＝5)醛甾酮+鹽 2.22±0 .29* (n＝8) 1.91±0 .51 (n＝8)2.38±0.17*(n＝8) 1.35±0 .09 (n＝8) 1.22±0 .10 (n＝8) 1.55±0 .39 (n＝8)依普利酮+醛甾酮+鹽 1.25±0 .27# (n＝8) 0.75±0 .12 (n＝8)1.56±0.25#(n＝8) 0.99±0 .12 (n＝10 ) 0.83±0 .10 (n＝7) 0.56±0 .08 (n＝6)
值是治療7天后，以任意單位平均值±SEM表示的mRNA表達值(相對于親環(huán)蛋白表達)。
*明顯不同于載體+鹽，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
COX-2＝環(huán)加氧酶-2。
MCP-1＝單核細胞趨化蛋白-1。
TGF-β1＝轉化生長因子β1。
ICAM＝胞內粘著分子-1。
VCAM＝血管細胞粘著分子-1。
表18.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療14天后對大鼠炎性標記相對mRNA表達的作用組 COX-2 mRNA (AU)骨橋蛋白mRNA(AU) MCP-1 mRNA (AU) TGF-β1 mRNA (AU) ICAM mRNA (AU) VCAM mRNA (AU)載體+鹽1.07±0.15(n＝7)1.13±0.08(n＝7) 1.04±0 .08 (n＝7) 1.02±0 .07 (n＝10 ) 1.12±0 .07 (n＝7) 0.97±0 .11 (n＝5)醛甾酮+鹽4.34±0.72*(n＝8)6.56±1.37*(n＝8) 2.76±0. 32* (n＝8) 1.27±0 .16 (n＝9) 1.47±0 .12* (n＝8) 1.16±0 .19 (n＝8)依普利酮+醛甾酮+鹽12.02±0.49*#(n＝11)2.94±0.72#*(n＝11) 1.59±0. 10*# (n＝11) 1.26±0 .16 (n＝11 ) 1.19±0 .09# (n＝11) 0.83±0 .10 (n＝11 )
值是治療14天后，以平均值±SEM表示的mRNA表達值(相對于親環(huán)蛋白表達)。
*明顯不同于載體+鹽，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
COX-2＝環(huán)加氧酶-2。
MCP-1＝單核細胞趨化蛋白-1。
TGF-β1＝轉化生長因子β1。
ICAM＝胞內粘著分子-1。
VCAM＝血管細胞粘著分子-1。
表19.醛甾酮+鹽處理單獨或與依普利酮聯(lián)合治療30天后對大鼠炎性標記相對mRNA表達的作用組 COX-2 mRNA (AU) 骨橋蛋白 mRNA (AU) MCP-1 mRNA (AU)TGF-β1mRNA(AU)ICAMmRNA(AU) VCAM mRNA (AU)載體+鹽1.11±0.11(n＝7)0.99±0.11(n＝7)1.22±0.27(n＝7) 1.01±0 .13 (n＝8)1.23±0.25(n＝6) 1.14±0. 25 (n＝5)醛甾酮+鹽4.53±0.92*(n＝6)13.27±1.43*(n＝6)4.54±1.25*(n＝6) 1.33±0 .16 (n＝9)1.81±0.22*(n＝5) 2.14±0. 49 (n＝5)依普利酮+醛甾酮+鹽2.28±0.33*#(n＝9)2.59±0.82*#(n＝9)2.29±0.42*#(n＝9) 1.32±0 .11 (n＝9)1.22±0.15#(n＝8) 1.04±0. 14# (n＝9)
值是治療30天后，以平均值±SEM表示的mRNA表達值(相對于親環(huán)蛋白表達)。
*明顯不同于載體+鹽，p＜0.05。
#明顯不同于醛甾酮+鹽，p＜0.05。
依普利酮劑量為100mg/kg/天。
COX-2＝環(huán)加氧酶-2。
MCP-1＝單核細胞趨化蛋白-1。
TGF-β1＝轉化生長因子β1。
ICAM＝胞內粘著分子-1。
VCAM＝血管細胞粘著分子-1。
免疫組織化學
醛甾酮+鹽誘導的促炎反應的分子分析是利用免疫組織化學分析進一步描述的。與內皮粘著并滲透到血管周隙的絕大多數(shù)細胞對于單核細胞/巨噬細胞抗體(ED-1)是正染色的，對于T-細胞抗體(CD-3)是負染色的。與載體+鹽對照組的心臟中沒有骨橋蛋白染色相比，醛甾酮+鹽處理大鼠的心臟中，骨橋蛋白表達很明顯。骨橋蛋白表達主要位于受影響的和某些未受影響的冠狀動脈的中層細胞，但也可存在于血管周隙和心肌壞死區(qū)域中的某些巨噬細胞中。在心肌細胞中沒發(fā)現(xiàn)顯著的骨橋蛋白表達。ICAM-1染色是在內皮細胞和血管周隙中鑒定的；然而，VCAM-1主要在內皮細胞中表達。對于評價的所有標記蛋白而言，依普利酮的給藥可顯著弱化醛甾酮+鹽處理在心肌組織中誘導的染色。
骨橋蛋白mRNA的原位雜交
進行原位雜交將使骨橋蛋白表達限于心肌組織中。絕大多數(shù)骨橋蛋白mRNA在冠狀動脈中層細胞中發(fā)現(xiàn)(圖3)；然而，骨橋蛋白信息也可在周圍血管細胞和滲透到局部出血和壞死區(qū)域中的細胞中鑒定。骨橋蛋白mRNA在心肌細胞或未受影響的間質區(qū)域中并不顯現(xiàn)。
結論
用醛甾酮加鹽處理大鼠可誘導血管炎癥和心臟組織損害。由醛甾酮+鹽處理誘導的這種損害出現(xiàn)在炎性反應之后，炎性反應的特征在于促炎分子的正調節(jié)。依普利酮可顯著減弱這種最初的血管炎性反應和隨后的心肌損傷。
腎性高血壓大鼠模型
在腎動脈結扎高血壓大鼠，一種高腎素高血壓模型中，評價醛甾酮抑制劑與環(huán)加氧酶-2選擇性抑制劑的聯(lián)合療法用于降低血壓的活性。在該模型中，左腎動脈結扎6天后，血漿腎素活性及血壓都顯著升高(J.L.Cangiano等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，206，310-313(1979))。使用連續(xù)監(jiān)測血壓的無線遙測血壓傳輸器檢測雄性Sprague-Dawley大鼠。用氯胺酮-HCl(100mg/kg)和乙酰丙嗪-馬來酸鹽(2.2mg/kg)的混合物麻醉大鼠。經由中線切開使腹主動脈暴露。將微血管夾放在腎動脈和髂分支遠側的主動脈上。用22號針穿透主動脈，插入導管尖。將通過結扎位于腰肌適當位置處的導管與無線遙測血壓傳輸器連接(Mini-Mitter Co.，Inc.，Sunriver，OR)。把傳輸器放在腹膜腔中，并在切口閉合后與腹肌縫合起來。大鼠是在無線遙測接收器上單獨飼養(yǎng)的，并讓標準大鼠隨意進食及喝水。使大鼠從手術中恢復至少5天。在適宜的數(shù)據(jù)記錄器如微型計算機上測量平均動脈壓和心率。每天24小時內，以2.5-10分鐘的時間間隔和200-500Hz采集數(shù)據(jù)樣本達10秒。采集對照數(shù)據(jù)24小時后，用美索比妥(30mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，并根據(jù)需要補充。進行中線腹部切開，長度大約為2cm，以使左腎暴露。小心將腎動脈與靠近主動脈的靜脈分離，而不要使靜脈受創(chuàng)傷。用無菌4-0絲線完全結扎動脈。通過小心縫合肌肉層和皮膚使切口閉合。6天后，當MAP通常升高50-70mmHg時，每天管飼給予醛甾酮拮抗劑或與一種或多種環(huán)加氧酶-2選擇性抑制劑的組合約8周。單一藥物的給藥劑量是用20和200mg/kg/天的醛甾酮抑制劑(例如，依普利酮)和1、3、10、30、和100mg/kg/天的環(huán)加氧酶-2選擇性抑制劑進行的。藥物混合物是通過給予1、3、10、30、和100mg/kg/天劑量的環(huán)加氧酶-2選擇性抑制劑及20或200mg/kg/天的醛甾酮抑制劑的組合獲得的。血壓降低是通過無線遙測系統(tǒng)監(jiān)測的，并將對化合物的反應與在載體-處理動物中獲得反應進行比較。血漿及尿鈉和尿鉀的水平是作為醛甾酮阻斷劑有效性的測量值監(jiān)測的。使用代謝籠過夜收集尿液樣品，以分離樣品。血漿樣品是通過靜脈導管插入獲得的。鈉和鉀是通過火焰光度法測量的。心臟纖維化是通過輸注固定后，對切開心臟的組織學和化學測量值確定的。將左心室和右心室稱重，包埋，并切片。隨后，用picrosirius紅將切片染色，然后通過用電腦處理的影像分析量化染成紅色的膠原區(qū)域。將心尖用酸消化，比色測量游離的羥脯氨酸。預期在用組合療法治療的試驗動物中，MAP將向著正常血壓顯著降低，且心肌纖維化的情況將被抑制或避免。
還有很多其它動物模型都適于評價心血管疾病的預防，包括動脈粥樣硬化的預防。見Stehbens，Prog.Card.Dis.，XXIX，1007-28(1986)和Zhang等人，Science，258，468-71(1992)。
用于動脈粥樣硬化的APOe小鼠模型已經由Roselear等人(Arterioscle.Thromb.Vasc.Biol.，16，1013-18(1996))描述。醛甾酮阻斷劑在預防動脈粥樣硬化損害方面應當發(fā)揮作用。
這里描述的生物學評價可用于證實包含醛甾酮受體拮抗劑和NSAID的聯(lián)合療法用于治療或預防心血管疾病的功效。
雖然已經相對于具體實施方案描述了本發(fā)明，但是這些實施方案的詳述并不被解釋為對本發(fā)明的限制。
此處提及的所有專利文件都引入這里作為參考。
權利要求
1.用于治療或預防心血管疾病的組合，含有第一用量的醛甾酮受體拮抗劑和第二用量的NSAID，其中所述第一用量和所述第二用量一起含有治療有效量的所述醛甾酮受體拮抗劑和所述NSAID。
2.用于治療或預防心血管疾病的藥物組合物，含有第一用量的醛甾酮受體拮抗劑、第二用量的NSAID、以及一種或多種藥學上可接受的載體物質，其中所述第一用量和所述第二用量一起含有治療有效量的所述醛甾酮受體拮抗劑和所述NSAID。
3.權利要求2的藥物組合物，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是環(huán)氧-甾族醛甾酮受體拮抗劑。
4.權利要求3的藥物組合物，其中所述環(huán)氧-甾族醛甾酮受體拮抗劑具有與20-spiroxane化合物甾核的“C”環(huán)稠合的環(huán)氧部分。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述20-spiroxane化合物的特征在于存在9α，11α-取代的環(huán)氧部分。
6.權利要求2的藥物組合物，其中所述醛甾酮受體拮抗劑選自
依普利酮；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-二甲酯，(7α，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，(6β，7β，11α，17β)-；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧，7-(1-甲基乙基)酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，7-甲酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-1，4，6-三烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，(6β，7β，11α)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，甲酯，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，一鉀鹽，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，(6β，7β，11α，17β)-；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，乙酯，(7α，11α，17β)-；和
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，1-甲基乙基酯，(7α，11α，17β)-。
7.權利要求2的藥物組合物，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是依普利酮。
8.權利要求7的藥物組合物，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
9.權利要求8的藥物組合物，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、和布洛芬。
10.權利要求8的藥物組合物，其中所述NSAID選自吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮，萘普生、奧沙普嗪、羥保松。
11.權利要求8的藥物組合物，其中所述NSAID選自保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
12.權利要求8的藥物組合物，其中所述NSAID和所述醛甾酮受體拮抗劑以從約1∶1到約1∶20范圍的重量比存在于所述組合中。
13.權利要求12的藥物組合物，其中所述重量比范圍為約1∶5到約1∶15。
14.權利要求12的藥物組合物，其中所述重量比為約1∶10。
15.權利要求2的藥物組合物，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是螺內酯。
16.權利要求15的藥物組合物，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
17.權利要求16的藥物組合物，其中所述NSAID和所述醛甾酮受體拮抗劑以從約1∶1到約1∶20范圍的重量比存在于所述組合中。
18.權利要求17的藥物組合物，其中所述重量比范圍為約1∶5到約1∶15。
19.權利要求18的藥物組合物，其中所述重量比為約1∶10。
20.權利要求2的藥物組合物，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉和阿司匹林。
21.一種用于治療或預防有此需要的受試者的心血管疾病的方法，包括給予受試者第一用量的醛甾酮受體拮抗劑和第二用量的NSAID，其中所述第一用量和所述第二用量一起含有治療有效量的所述醛甾酮受體拮抗劑和所述NSAID。
22.權利要求21的方法，其中所述心血管疾病選自高血壓、心力衰竭、冠狀動脈疾病、動脈瘤、動脈硬化、動脈粥樣硬化、心肌梗死、栓塞、中風、血栓形成、絞痛、血管斑炎癥、血管斑破裂、川崎病、鈣化和炎癥。
23.權利要求21的方法，其中所述心血管疾病選自冠狀動脈疾病、動脈瘤、動脈硬化、動脈粥樣硬化、心肌梗死、栓塞、中風、血栓形成、絞痛、血管斑炎癥、血管斑破裂、川崎病、鈣化和炎癥。
24.權利要求21的方法，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是螺內酯型化合物。
25.權利要求21的方法，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是螺內酯。
26.權利要求26的方法，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉和阿司匹林。
27.權利要求26的方法，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、雙氯酚酸鈉、非諾洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽，萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美汀、和阿司匹林。
28.權利要求21的方法，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是環(huán)氧-甾族醛甾酮受體拮抗劑。
29.權利要求28的方法，其中所述環(huán)氧-甾族化合物具有與20-spiroxane化合物甾核的“C”環(huán)稠合的環(huán)氧部分。
30.權利要求29的方法，其中所述20-spiroxane化合物的特征在于存在9α，11β-取代的環(huán)氧部分。
31.權利要求28的方法，其中所述環(huán)氧-甾族化合物選自
依普利酮；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-二甲酯，(7α，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，(6β，7β，11α，17β)-；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧，7-(1-甲基乙基)酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，7-甲酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-1，4，6-三烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，(6β，7β，11α)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，甲酯，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，一鉀鹽，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-環(huán)丙[6，7]孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，(6β，7β，11α，17β)-；
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，乙酯，(7α，11α，17β)-；和
孕甾-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧-，γ-內酯，1-甲基乙基酯，(7α，11α，17β)-。
32.權利要求21的方法，其中所述醛甾酮受體拮抗劑是依普利酮。
33.權利要求32的方法，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
34.權利要求21的方法，其中所述NSAID選自對乙酰氨基酚、苯噁洛芬、卡洛芬、雙氯酚酸鈉、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、酮洛來克、甲氯芬那酸鹽、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普嗪、羥保松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、舒洛芬、替尼達普、托美汀、苯酰吡酸鈉、和阿司匹林。
35.權利要求21的方法，其中所述醛甾酮受體拮抗劑和所述NSAID以順序的方式給藥。
36.權利要求21的方法，其中所述醛甾酮受體拮抗劑和所述NSAID以基本同時的方式給藥。
37.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以約0.1mg-約400mg的每日劑量范圍給藥。
38.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以約1mg-約200mg的每日劑量范圍給藥。
39.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以約1mg-約100mg的每日劑量范圍給藥。
40.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以約10mg-約100mg的每日劑量范圍給藥。
41.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以約25mg-約100mg的每日劑量范圍給藥。
42.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以選自5mg、10mg、12.5mg、25mg、50mg、75mg、和100mg的每日劑量給藥。
43.權利要求32的方法，其中所述依普利酮以選自25mg、50mg和100mg的每日劑量給藥。
44.一種用于治療或預防有此需要的受試者的炎癥-相關疾病的方法，包括給予受試者第一用量的醛甾酮受體拮抗劑和第二用量的NSAID，其中所述第一用量和所述第二用量一起足以改變直接或間接涉及受試者炎癥調節(jié)的一或多種表達產物的表達。
45.權利要求44的方法，其中所述炎癥-相關疾病出現(xiàn)于所述受試者的組織中。
46.權利要求44的方法，其中所述炎癥-相關疾病出現(xiàn)于所述受試者的器官中。
47.權利要求46的方法，其中所述器官是心臟。
48.權利要求46的方法，其中所述器官是腦。
49.權利要求46的方法，其中所述器官是腎。
50.權利要求44的方法，其中一或多種所述表達產物的升高的表達水平直接或間接涉及受試者炎癥的調節(jié)。
51.權利要求44的方法，其中一或多種所述表達產物的降低的表達水平直接或間接涉及受試者炎癥的調節(jié)。
52.權利要求44的方法，其中兩或多種所述表達產物同時共表達。
53.權利要求44的方法，其中兩或多種所述表達產物順序共表達。
54.權利要求44的方法，其中所述表達產物選自環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、ANF、aVβ3、Inf-γ、IL-1、TNF-α、NADH/NADPH氧化酶、超氧化物自由基、TXA2、bFGF、CD44、內皮縮血管肽、血管緊張肽II受體、活性t-PA、非活性t-PA、PAI-1、CRP、IL-6、IL-10、IL-12、肌鈣蛋白T、HSP65、淀粉狀蛋白、磷脂酶A2、血纖蛋白原、CD40/CD40L、膠原蛋白結合整聯(lián)蛋白α1β1和膠原蛋白結合整聯(lián)蛋白α2β1。
55.權利要求4 4的方法，其中所述表達產物選自環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、ANF、αvβ3、Inf-γ、IL-1、TNF-α、NADH/NADPH氧化酶、超氧化物自由基、TXA2、bFGF、CD44、內皮縮血管肽、血管緊張肽II受體、活性t-PA、非活性t-PA和PAI-1。
56.權利要求44的方法，其中所述表達產物是環(huán)加氧酶-2。
57.權利要求56的方法，其中所述環(huán)加氧酶-2與選自骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的一或多種表達產物共表達。
58.權利要求44的方法，其中所述表達產物是骨橋蛋白。
59.權利要求58的方法，其中所述骨橋蛋白與選自環(huán)加氧酶-2、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的一或多種表達產物共表達。
60.權利要求44的方法，其中所述表達產物是MCP-1。
61.權利要求60的方法，其中所述MCP-1與選自環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、ICAM-1和VCAM-1的一或多種表達產物共表達。
62.權利要求44的方法，其中所述表達產物是ICAM-1。
63.權利要求62的方法，其中所述ICAM-1與選自環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、MCP-1和VCAM-1的一或多種表達產物共表達。
64.權利要求44的方法，其中所述表達產物是VCAM-1。
65.權利要求64的方法，其中所述VCAM-1與選自環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、ICAM-1和MCP-1的一或多種表達產物共表達。
66.一種用于治療或預防心血管疾病的試劑盒，它包含醛甾酮受體拮抗劑和NSAID。
67.權利要求66的試劑盒，它還包含說明受試者如何使用所述試劑盒內含物的書面說明。
68.權利要求67的試劑盒，其中該書面說明還說明受試者如何使用所述試劑盒的內含物而獲得治療效果卻不會誘導有害的副作用。
69.權利要求67的試劑盒，其中該書面說明包含由藥物管理機構對所述試劑盒批準的產品標簽的全部或一部分。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療炎癥的醛甾酮阻斷劑與NSAID的組合。
文檔編號A61K31/58GK1625412SQ0380303
公開日2005年6月8日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權日2002年1月30日
發(fā)明者E·G·麥克馬洪, R·羅奇, A·E·魯?shù)婪?申請人:法瑪西雅公司