專利名稱：抗血管生成的主動(dòng)免疫療法的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和制藥工業(yè)領(lǐng)域，特別涉及使用血管發(fā)生相關(guān)分子作為靶標(biāo)的主動(dòng)免疫療法。
從原有的血管形成新的血管的過程叫做血管發(fā)生。促(pro-)血管生成和抗血管生成因子之間的平衡對(duì)這一過程進(jìn)行著廣泛的調(diào)控。其過程與促血管生成因子(pro-angiogenic)的誘導(dǎo)作用和異常形式的新血管形成相關(guān)的疾病包括(a)腫瘤(包括原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶)，(b)急性與慢性炎癥，例如哮喘、呼吸窘迫、子宮內(nèi)膜異位癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及組織水腫，(c)感染引起的疾病，例如肝炎和Kaposi肉瘤(Kaposi sarcoma)(d)自身免疫病例如糖尿病、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎和(e)其他疾病和狀態(tài)，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變或者新生兒視網(wǎng)膜病變、器官移植排斥、黃斑變性、新生血管性青光眼、血管瘤和血管纖維瘤(CarmellietP.y Jain RK.Nature 407249，2000；Kuwano M等人，Intern Med 40565，2001)。許多這些疾病的潛在的治療方法可能基于通過其中和作用抑制刺激血管的異常形成的促血管生成因子的活性或者其受體的活性，或者基于清除促血管生成因子的來源。
血管內(nèi)皮生長因子是能夠直接并特異性地誘導(dǎo)新血管形成的分子家族(Leung Science 2461306，1989；Klagsburn M，Annual Rev Physiol33217，1991)。這個(gè)家族包括血管通透因子，也被稱為血管內(nèi)皮生長因子VPF/VEGF(現(xiàn)在命名為VEGF-A)、胎盤生長因子PIGF、血小板衍生生長因子PDGF-A和PDGF-B、以及其它四種與VEGF-A在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的新分子VEGF-B/VRF、VEGF-C/VRP、VEGD-D/FIGF和VEGF-E(Olofsson B等人，PNAS USA 132576，1996；Joukov V等人，EMBO J15290，1996；Yamada Y等人，Genomics 42483，1997；OgawaS等人，J Biol Chem 27331273，1998)。
VEGF-A是由兩個(gè)23-kDa的亞單位組成的同源二聚體糖蛋白質(zhì)(Ferrara N等人，Biochem Biophys Res Comun 165198，1989)，有5種由同一RNA經(jīng)過不同的拼接形成的單體同種型(isoform)。其中有兩種固定在細(xì)胞膜上(VEGF189和VEGF206)，其余三種是可溶性的(VEGF121、VEGF145和VEGF165)。VEGF165是除了心臟和肺以外哺乳動(dòng)物組織中含量最豐富的同種型，心臟和肺中含量最多的是VEGF189(Neufeld G等人，Canc Met Rev 15153，1995)，而胎盤中則以VEGF121的表達(dá)量占優(yōu)(Shibuya MA等人，Adv Canc Res 67281，1995)。
VEGF-A是家族中研究最多，特征最為人所知的，在多種疾病研究中都描述了它的改變。它的過度表達(dá)與多種疾病都相關(guān)，例如不同來源、不同位置的腫瘤以及腫瘤轉(zhuǎn)移(Grunstein J等人，Cancer Res 591592，1999)、潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏癥(Crohn’s disease)等慢性炎癥(Kanazawa S等人，Am J Gastroentnterol 96822，2001)、牛皮癬(Detmar M等人，J Exp Med 1801441，1994)、呼吸窘迫(Thichett DR等人，Am J Respir Care Med 1641601，2001)、動(dòng)脈粥樣硬化(CellettiFL等人，Nat Med 7425，2001；Couffinhal T等人，Am J Pathol 1501653，1997)、子宮內(nèi)膜異位癥(McLaren J.Human Reprod Update 645，200)、哮喘(Hoshino M等人，J Allergy Clin Immunol 107295，2001)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎(Pufe T等人，J Rheumatol 281482，2001)、甲狀腺炎(Nagura S等人，Hum Pathol 3210，2001)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和新生兒視網(wǎng)膜病變(Murata T等人，Lab Invest 74819，1996；Reynolds JD.Paediatr Drugs 3263，2001)、黃斑變性和青光眼(Wells JA等人，Br J Ophthalmol 80363，1996；Tripathi RC等人，Ophthalmology105232，1998)、組織水腫(Kaner RJ等人，Am J Respir Cell Mol Biol.22640 2000；Ferrara N，Endocrinol Rev 1318，1992)、肥胖(Tonello C等人，F(xiàn)EBS lett 442167，1999)、血管瘤(Wizigmann S y Plate KH HistolHistopathol 111049，1996)，在炎性關(guān)節(jié)病人的滑液中存在(BottomleyMJ等人，Clin Exp Immunol 119182，2000)，并且與移植排斥相關(guān)(Vasir B等人，Transplantation 71924，2001)。特別是在腫瘤中，表達(dá)VEGF-A的3種基本同種型121、165和189的細(xì)胞也是在體內(nèi)生長比較快的細(xì)胞，然而到了末期，大多數(shù)腫瘤限制165同種型的表達(dá)，或者說，在缺乏165同種型的情況下，限制121和189表達(dá)而遠(yuǎn)不能促進(jìn)細(xì)胞生長，從而證明幾種同種型的聯(lián)合作用能夠增強(qiáng)腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)(Grunstein J.MolCell Biol 207282，2000)。
PIGF報(bào)道于1991年，它在同源二聚體狀態(tài)下不能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖(Maglione D等人，Proc Natl Acad Sci USA889267，1991；DiSalvo J等人，J Biol Bhem 2707717，1995)。通過VEGFR-1進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使PIGF得以上調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞放大了其對(duì)于VEGF在向與某些疾病相關(guān)的血管生成的表型轉(zhuǎn)變中的反應(yīng)(Carmeliet P等人，Nat Med 7575，2001)。PIGF的表達(dá)與人腦膜瘤和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的血管形成過程有關(guān)(Numara M等人，J Neurooncol 40123，1998)。這個(gè)分子與VEGF 165形成異源二聚體，具有促進(jìn)血管生成的活性，并描述了在一些在腫瘤細(xì)胞系的條件性培養(yǎng)液中它們的過度表達(dá)(Cao Y等人，J Bio Chem 2713154，1996)，這種過度表達(dá)通常還與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和原發(fā)的炎性關(guān)節(jié)病有關(guān)(Bottomley MJ等人，Clin Exp Immunol 119182，2000)。
VEGF家族其它成員的過度表達(dá)的研究較少，也與一些病變相關(guān)。VEGF-B與乳腺、卵巢和腎臟腫瘤以及黑色素瘤和纖維組織瘤相關(guān)(Sowter HM等人，Lab.Invest.77607，1997；Salven P Am.J.Pathol.153103，1998；Gunningham SP等人，Cancer Res 613206，2001)。報(bào)道了在不同起源的腫瘤細(xì)胞中VEGF-B 167同種型的體外差異表達(dá)(Li X等人，Growth Factors 1949，2001)。VEGF-C和VEGF-D參與了淋巴管形成的調(diào)節(jié)(Joukov V.等人，EMBO J.15290，1996)，VEGF-C的過度表達(dá)與下列疾病有關(guān)組織水腫、乳腺、肺、頭頸部、食道、胃等部位腫瘤、淋巴瘤、前列腺癌、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)(Kajita T等人，Br J Cancer8593，2001；Kitadi Y等人，IntJ Cancer 93662，2001；HashimotoI等人，BrJ Cancer 8593，2001；KinoshitaJ等人，Breast Cancer Res Treat 66159，2001；Ueda M，等人，Gynecol Oncol 82162，2001；Salven P Am.J.Pathol.153103，1998；O-Charoenrat P等人，Cancer 92556，2001)。關(guān)于VEGF-D，它在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)與體內(nèi)腫瘤的淋巴脈管系統(tǒng)增加和淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移的提高有關(guān)(Stacker SA等人，Nat Med 7186，2001；Marconcini L等人，Proc Natl Acad Sci USA969671，1999)。
VEGF家族分子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能變化是通過它們與酪氨酸激酶3型的細(xì)胞受體的結(jié)合所介導(dǎo)的，這類受體目前包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(KDR/Flk1)和VEGFR3(Flt4)(Kaipainen A J.Exp.Med.1782077，1993)。N端的結(jié)構(gòu)域2已經(jīng)確認(rèn)是負(fù)責(zé)與配體結(jié)合，它能促進(jìn)胞漿結(jié)構(gòu)域的磷酸化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Davis-Smyth T等人，EMBO154919，1996)。
VEGFR1配體包括VEGF-A、PIGF和VEGF-B，其親和力依次遞減(Shibuya M Int J Biochem Cell Biol 33409，2001)。在內(nèi)皮細(xì)胞中，這個(gè)受體捕獲循環(huán)中的VEGF(Gille H等人，EMBO J.194064，2000)。表達(dá)于造血細(xì)胞的VEGFR1和VEGF-A的結(jié)合顯著影響B(tài)淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞的前體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NFκB的活化。上面這種相互作用與體內(nèi)一種不利的免疫平衡的建立有關(guān)，其中樹突細(xì)胞的成熟和T細(xì)胞的比例減少，在一些免疫抑制患者尤其是腫瘤患者中，觀察到了這種現(xiàn)象(Dikov MM等人，Canc Res 612015，2001；Gabrilovich D等人，Blood 924150，1998)。VEGFR1的過度表達(dá)與牛皮癬、子宮內(nèi)膜癌和肝細(xì)胞癌相關(guān)(Detmar M等人，J Exp Med 1801141，1994Ng IO Am JClin Patol 116838，2001；Yokoyama Y等人，Gynecol Oncol 77413，2000)。
VEGFR2受體(KDR/Flk1)介導(dǎo)VEGF-A的生物學(xué)功能，也能結(jié)合VEGF-C和VEGF-D。這個(gè)受體分別在活化的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤來源的細(xì)胞系上差異表達(dá)，在此建立VEGF的自分泌通路。除了涉及前面提到的那些與它的配體的過度表達(dá)相關(guān)的疾病以外，VEGFR2的過度表達(dá)與下列疾病的進(jìn)展有關(guān)子宮內(nèi)膜癌(Giatromanolaki A等人，Cancer 922569，2001)、惡性間皮瘤(Strizzi L等人，J Pathol 193468，2001)、星形細(xì)胞瘤(Carroll RS等人，Cancer 861335，1999)、原發(fā)乳腺癌(Kranz A等人，Int J Cancer 84293，1999)、腸型胃癌(Takahashi Y等人，ClinCancer Res 21679，1996)、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、退行性少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、壞死性室管膜瘤(necroticependimoma)(Cban AS等人，Am J Surg Pathol 22816，1998)。KDR的過度表達(dá)與常染色體病VHL和成血管細(xì)胞瘤(Wizigmann-Voos S等人，Cancer Res 551358，1995)以及糖尿病性視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展有關(guān)(Ishibashi T.Jpn J Ophthalmol 44323，2000)，KDR與Flt-1共同過度表達(dá)還與遲發(fā)型超敏反應(yīng)有關(guān)(Brown LF等人，J Immunol 1542801，1995)。
VEGF-C和VEGF-D介導(dǎo)的淋巴血管生成(lymphangiogenesis)是它們與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面的FLT4受體或VEGFR3結(jié)合的結(jié)果。在有些情形中，甚至不出現(xiàn)配體的過度表達(dá)時(shí)，受體的過度表達(dá)同下列疾病過程中的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)，這些疾病包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Smith G.BrJ Ophthalmol 1999 Apr；83(4)486-94)、慢性炎癥與潰瘍(Paavonen K等人，Am J Pathol 1561499，2000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的建立與乳腺癌的發(fā)展(Gunningham SP.Clin Cancer Res 64278，2000；Valtola R等人，Am JPathol 1541381，1999)，并且與鼻咽癌和口腔鱗癌有關(guān)(Saaristo A等人，Am J Pathol 1577，2000；Moriyama M等人，Oral Oncol 33369，1997)。而且，VEGFR3的過度表達(dá)還是Kaposi肉瘤(Kaposi sarcoma)、Dabska型血管內(nèi)皮瘤(type Dabska hemangioendothelioma)、皮膚淋巴管瘤(cutaneous lymphangiomatosis)一個(gè)靈敏的標(biāo)志(Folpe AL等人，Mod Pathol 13180，2000；Lymboussaki A等人，Am J Pathol 153395，1998)。
最近確認(rèn)了兩個(gè)新的VEGF受體命名為NRP1和NRP2。它們屬于neurophilin家族(NRP)，并作為VEGF家族一些特定同種型VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-B167和PIGF蛋白質(zhì)的共同受體(co-receptors)，提高其促有絲分裂能力。NRP1的表達(dá)已經(jīng)成為前列腺癌侵襲力的一個(gè)標(biāo)志，還與黑色素瘤血管生成的增加以及乳腺癌的細(xì)胞凋亡逃逸有關(guān)(LatilA等人，Int J Cancer 89167，2000；Lacal PM J Invest Dermatol 1151000，2000；Bachelder RE Cancer Res 615736，2001)。NRP1、KDR和VEGF-A165的共同過度表達(dá)與糖尿病性視網(wǎng)膜病變中的纖維血管(fibrovascular)增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)(Ishida S.等人，InvestOphthalmol Vis Sci 411649，2000；Ikeda M.等人，J Pathol 191426，2000)。NRP2在骨肉瘤中過度表達(dá)并促進(jìn)血管生成和腫瘤的生長(HandaA等人，Int J Oncol 17291，2000)。
多數(shù)以抑制血管生成為基礎(chǔ)的治療策略，尤其是腫瘤的治療，是建立在阻斷VEGF家族及其受體的基礎(chǔ)上的，臨床試驗(yàn)階段使用(1)阻斷VEGF或者KDR受體的單克隆抗體、(2)金屬蛋白質(zhì)酶抑制劑，如Neovastat和Prinomastat、(3)VEGF抑制劑如Thalidomide、Suramin、Troponin I、IFN-α和Neovastat(4)VEGF受體阻斷劑例如SU5416、FTK787和SU6668、(5)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，如Endostatin和CA4-P、(6)降低VEGF或VEGF受體表達(dá)的核酶(ribozyme)(Angiozyme)。由于人類的VEGF及其受體KDR和Flt-1與小鼠的同源基因之間高度同源(分別為～90％，81％，89％)，常規(guī)使用許多動(dòng)物模型用以針對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的抗血管生成化合物臨床前藥效評(píng)價(jià)(Hicklin DJ等人，DDT 6517，2001)。
被動(dòng)給藥VEGF或VEGFR抗體在人體臨床不同階段的試驗(yàn)獲得了成功(Hicklin DJ等人，DDT 6517，2001)?？筕EGF人源化單克隆抗體A.4.6.1(Genentech，San Francisco，United States)已經(jīng)進(jìn)入治療結(jié)腸、乳腺、腎臟和肺部腫瘤的三期臨床試驗(yàn)(Dim，KJ等人，Nature 362841，1993；Boersig C.R&D Directions Oct 7；44，2001)。尤其是KDR受體，已經(jīng)開發(fā)了識(shí)別這個(gè)受體細(xì)胞外N端結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體(IMC-1C11，ImClone)，這個(gè)單克隆抗體抑制人白血病細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移并提高異種移植小鼠的存活。目前，正在研究它對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移患者的作用(Dias S等人，J.Clin Invest 106511，2000)。在上述試驗(yàn)中，已經(jīng)證明這些抗體的使用中沒有伴隨副作用。
除了前面所述，還有一種尚沒有應(yīng)用于阻斷血管生成的療法，特異性的主動(dòng)免疫療法(SAI)。在腫瘤的SAI中，作為抗原的多肽、蛋白質(zhì)或者DNA與合適的佐劑混合使用。SAI對(duì)體液免疫(B淋巴細(xì)胞活化)和細(xì)胞免疫(T輔助細(xì)胞、細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞活化)兩種免疫反應(yīng)進(jìn)行刺激，并且與MHC I和MHC II類情況下，樹突細(xì)胞作為專門的抗原呈遞細(xì)胞的功能有關(guān)(Bystryn JC，Medscape Hematology-Oncology41，2001；Parker，KC等人，J.Immunol 152163，1994；Nestle FO等人，Nature Medicine 7761，2001；Timmerman JM，Annual Review Medicine50507，1999)。
SAI是試驗(yàn)和臨床研究中一個(gè)迅速增長的領(lǐng)域，它的應(yīng)用前景很有吸引力，尤其是在腫瘤學(xué)中，已經(jīng)報(bào)道了60多種基于SAI方法的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，已經(jīng)超過了目前基于單克隆抗體的臨床試驗(yàn)。特別是對(duì)于癌癥而言，作為SAI免疫原的抗原選擇，是建立在抗原的生理學(xué)特性(relevance)和它們?cè)谀[瘤表型漂變(phenotype drift)中不易被取代的特點(diǎn)(Bodey B等人，Anticancer Research 292665，2000)，以及它們與腫瘤組織生長和演變高度特異的相關(guān)性的基礎(chǔ)上的。
利用SAI治療癌癥的策略還優(yōu)先考慮到表達(dá)于不同類型的腫瘤中的抗原確定，其可提高同一疫苗制劑的指征數(shù)目。例如癌胚抗原(CEA)、HER2-neu、人端粒酶以及神經(jīng)節(jié)苷脂(Greener M.，Mol Med Today 6257200；Rice J等人，J Immunol 1671558，2001；Carr A等人，Melanoma Res11219，2001；Murray JL等人，Semin Oncol 2771，2000)。
在人類腫瘤中，VEGF過度表達(dá)于腫瘤區(qū)室中(Ferrara，N.Curr.Top.Microbiol.Immunol.2371，1999)，已經(jīng)證實(shí)在腫瘤相關(guān)的脈管系統(tǒng)中有高水平的VEGF及其受體(Brekken RA.J Control Release 74173，2001)?；|(zhì)細(xì)胞也能在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(transformed cells)的刺激下產(chǎn)生VEGF，結(jié)果是當(dāng)腫瘤細(xì)胞被清除之后，患者仍保持原有的VEGF水平。在前列腺癌、宮頸癌和乳腺癌中，VEGF及其受體對(duì)于預(yù)后和病程發(fā)展(staging)有實(shí)用價(jià)值(George DJ等人，Clin Cancer Res 71932，2001；Dobbs SP等人，Br J Cancer 761410，1997；Callagy G等人，Appl Immunohistochem MolMorphol 8104，2000)。另一方面，VEGF也是可溶性因子，其與其它細(xì)胞因子例如IL-10、TNF-α、TGF-β(Ohm JE和Carbone DP，ImmunolRes 23263，2001)參與癌癥患者特有的免疫抑制(Staveley K等人，ProcNatl Acad Sci USA 951178，1998；Lee KH等人，J Immunol 1614183，1998)。該免疫抑制效果似乎與其結(jié)合Flt1受體相關(guān)(Gabrilovich D等人Blood 924150，1998)。
本發(fā)明描述了在試驗(yàn)?zāi)[瘤中使用VEGF家族分子及其受體的SAI方法。獲得的抗腫瘤效果至少基于以下四種機(jī)制，不排除其可能的組合(a)通過細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞直接破壞產(chǎn)生VEGF的腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞、(b)通過抗體捕獲或者中和循環(huán)中的VEGF從而破壞腫瘤相關(guān)血管的內(nèi)皮細(xì)胞、(c)通過細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞或者補(bǔ)體結(jié)合抗體直接破壞表達(dá)VEGF受體的內(nèi)皮細(xì)胞、(d)通過捕獲或者中和循環(huán)中的VEGF激活局部免疫反應(yīng)，從而清除其免疫抑制效應(yīng)。
在理想情況下，這些療法可以清除或者避免腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，單獨(dú)或者和其他抗腫瘤藥劑結(jié)合用作一線或者二線療法(first or second linetherapy)來減少或清除原發(fā)腫瘤。
針對(duì)VEGF家族分子及其受體的主動(dòng)免疫，單獨(dú)使用或者與其它療法結(jié)合對(duì)于下列疾病也很有效急性和慢性的炎癥過程(哮喘、呼吸窘迫、子宮內(nèi)膜異位癥、動(dòng)脈粥樣硬化、組織水腫)、傳染病(肝炎，Kaposi肉瘤)、自身免疫病(糖尿病、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、滑膜炎)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變與新生兒視網(wǎng)膜病變、器官移植排斥、黃斑變性、新生血管性青光眼、血管瘤和血管纖維瘤等等。
本發(fā)明的詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明，體內(nèi)給予編碼VEGF家族蛋白質(zhì)及其受體、共同受體或者片段的寡核苷酸序列或者其多肽變體，誘導(dǎo)具有抗血管生成和抗腫瘤作用的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的目的多肽性質(zhì)的免疫原及其片段，可以從其天然來源中分離，或可以利用合成或DNA重組技術(shù)獲得。這些多肽也可以與那些具有已知的佐劑活性的蛋白質(zhì)如p64K(R.Silva等人，US5286484和EP0474313)融合制備，或者單獨(dú)制備以后再與它們共價(jià)結(jié)合。
在這些情況下其它可用的策略就是獲得天然多肽、其突變的或者修飾的變體以及它們的片段，作為突環(huán)(loop)的一部分暴露或不暴露在如OMP1的細(xì)菌蛋白，成為免疫激活制劑的一部分，在這種情況下特別指的是VSSP(R.Perez等人，US5788985和6149921)。而且，還可以獲得暴露在病毒粒子表面的多肽免疫原(HbsAg，細(xì)小病毒的VP2，等等)，結(jié)合到特定的多肽，這些多肽以免疫應(yīng)答誘導(dǎo)過程中特定的細(xì)胞和器官為靶標(biāo)(CTLA4，Ig的Fc段，等等)，也可以結(jié)合到能夠提高生物分布的蛋白質(zhì)如VP22。
本發(fā)明的目的蛋白質(zhì)的最重要的天然來源優(yōu)勢(shì)表達(dá)于胎盤、激活的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。用這些細(xì)胞或組織的mRNA通過已知的方法來獲得互補(bǔ)DNA(cDNA)。所提取的RNA用作多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板來擴(kuò)增所選擇的抗原所對(duì)應(yīng)的cDNA。在每種情況下，所使用的引物都是根據(jù)將要插入cDNA的載體的特征設(shè)計(jì)的，或者根據(jù)以前報(bào)道的目的蛋白質(zhì)的序列設(shè)計(jì)?；蛘?，并且優(yōu)選在PCR擴(kuò)增用于本發(fā)明中最大的抗原的受體的情形中，其編碼區(qū)是以兩個(gè)或多個(gè)的重疊片段的形式擴(kuò)增的。這些片段包含一個(gè)常用的連接位點(diǎn)，用來從片段開始組合成完整的DNA。
一種用來克隆目的抗原的替代方法是從市售的來源于人內(nèi)皮或者同樣來源的腫瘤的DNA庫中選擇。在某些情況下，可能希望突變本發(fā)明的目的抗原，目的是避免由接種疫苗尤其是在VEGF家族產(chǎn)生的血管生成誘導(dǎo)事件。這些突變優(yōu)選在那些文獻(xiàn)報(bào)道的受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行。因此，所設(shè)計(jì)的引物要覆蓋目的分子的兩端，PCR產(chǎn)物用作模板來獲得突變分子。這些突變變體缺乏生物學(xué)功能但是能夠重現(xiàn)所選的抗原的免疫原性。
用前面提到的方法獲得的cDNA分子插入合適的載體中，載體可以是病毒、質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體或者類似的物質(zhì)。載體帶有在靶細(xì)胞中基因適當(dāng)表達(dá)所需的元件，以及根據(jù)其性質(zhì)使其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的元件。本發(fā)明的DNA分子可能含有一個(gè)或者多個(gè)目的基因，這些基因由一個(gè)或者多個(gè)核酸組成(cDNA、gDNA、合成與半合成DNA等)，其經(jīng)過轉(zhuǎn)錄或者在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候翻譯就能在靶細(xì)胞中產(chǎn)生具有治療或者疫苗價(jià)值的產(chǎn)物。
一般地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗治療產(chǎn)品的基因受到啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子能在靶細(xì)胞或者有機(jī)體(哺乳動(dòng)物)中發(fā)揮作用，還受到含有終止信號(hào)和目的基因產(chǎn)物mRNA中的多聚腺苷化的3’端區(qū)域的控制，使它能夠表達(dá)。啟動(dòng)子可以是所述基因的天然的啟動(dòng)子或者異源的在靶細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以來源于真核生物或者病毒。在真核啟動(dòng)子中，可以使用任何啟動(dòng)子或者可以激活或者抑制基因轉(zhuǎn)錄的衍生的序列，可以是特異性的或者非特異的，可以是誘導(dǎo)性的或非誘導(dǎo)性的，可以是強(qiáng)或弱的。另外，啟動(dòng)子區(qū)域可以通過插入激活子(activator)或者誘導(dǎo)子(inductor)序列進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)目的基因的組織特異性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)。
另外，目的基因可以帶有信號(hào)序列用于亞細(xì)胞定位，這樣目的基因一旦合成，它在細(xì)胞內(nèi)的定位或分泌可以在它所表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)得到改變。它還可以帶有編碼特定區(qū)域的基因，這個(gè)區(qū)域能結(jié)合到免疫組織特異的配體上，這樣目的基因就被引導(dǎo)至產(chǎn)生應(yīng)答的部位，從而獲得治療/疫苗效應(yīng)。
此外，目的基因的前面可以帶有編碼mRNA復(fù)制元件(mRNAreplication machinery)的序列，使mRNA能夠在靶細(xì)胞中復(fù)制，提高了所述基因的表達(dá)，從而提高了本發(fā)明的治療/疫苗效果。這里提到的復(fù)制元件(replication machinery)可以來源于甲病毒屬(alphavirus)(Schlesinger S.，Expert Opin Biol Ther.1177，2001)，特別是辛德畢斯病毒(Sinbis)、塞姆利基(Semliki)病毒等。在這種特殊情況下，目的基因在亞基因組啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，使得本發(fā)明的分子一旦被內(nèi)在化，它的mRNA就能夠在靶細(xì)胞中復(fù)制。另外，DNA載體可能帶有一些序列，這些序列能使本發(fā)明的目的分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。這樣就能夠提高表達(dá)水平和/或治療/疫苗效果(Collings A.，Vaccine 184601，1999)。
DNA載體可以用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒DNA純化技術(shù)純化。這些技術(shù)包括含有溴化乙啶的氯化銫密度梯度純化法或者離子交換柱或其它用于分離DNA分子的交換物或方法(Ferreira GN等人，Trends Biotechnol.18380，2000)。
本發(fā)明包括了質(zhì)粒DNA載體的使用，尤其是用于人體基因治療和DNA免疫的PAEC家族的緊湊型載體(compact vector)(Herrera等人，Biochem.Biophys.Res.Commu.279548，2000)。這個(gè)家族包括載體pAEC-K6(登錄號(hào)AJ278712)、pAEC-M7(登錄號(hào)AJ278713)、pAEC-Δ2(登錄號(hào)AJ278714)、pAEC-SPE(登錄號(hào)AJ278715)和pAEC-SPT(登錄號(hào)AJ278716)。這些載體只含有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞中表達(dá)目的產(chǎn)物的最基本的元件，以及大腸桿菌中的復(fù)制單元。轉(zhuǎn)錄單元由人巨細(xì)胞病毒(CMV)的即早期啟動(dòng)子、用于目的產(chǎn)物插入的多克隆位點(diǎn)、以及來自猿猴病毒40(SV40)的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化序列組成。復(fù)制單元中，該載體包括卡那霉素抗性基因(Tn903)、pUC19復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)，目的是保證高拷貝數(shù)和選擇帶有目的質(zhì)粒的細(xì)菌。
另外，本發(fā)明包括了質(zhì)粒DNA載體的使用，優(yōu)選用于人體DNA免疫的PMAE家族的緊湊型載體。其中包括與PAEC系列相同的細(xì)菌中的功能元件、人CMV的即早期啟動(dòng)子以及多克隆位點(diǎn)。此外，它們還帶有合成的內(nèi)含子以及合成的轉(zhuǎn)錄終止序列和來源于兔β-球蛋白的多聚腺苷化序列。據(jù)報(bào)道，利用與后者相似的序列可以獲得所克隆基因的更高的表達(dá)水平(Norman JA等人，Vaccine 15801，1997)。而且，這個(gè)系列的載體還含有連續(xù)的免疫刺激序列重復(fù)(CpG基序)，這個(gè)序列能夠激活人和小鼠的天然免疫系統(tǒng)，從而激活針對(duì)目的分子的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答(Krieg SM，Vaccine 19618，2001)。
用重組病毒(腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒等病毒)進(jìn)行的免疫能在宿主體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞反應(yīng)。將目的基因引入具有整合序列以及每種病毒特異的啟動(dòng)子的重組病毒載體。本發(fā)明也包含了這種策略，并優(yōu)選采用禽痘病毒和pFP67xgpt載體。pFP67xgpt載體用于在合成的強(qiáng)早/晚期啟動(dòng)子的作用下，位于禽痘病毒FP9的11.2kB的BamHI片段開放讀碼框架6和7之間克隆目的基因。這個(gè)質(zhì)粒還含有牛痘病毒啟動(dòng)子p7.5K控制的Ecogpt，用來鑒定重組病毒。本發(fā)明包括的其它替代手段包括用VEGF家族的蛋白質(zhì)及其受體和/或共同受體免疫。如前所描述獲得的cDNA分子克隆到載體中在病毒、酵母、噬菌體、植物或者更高等細(xì)胞中表達(dá)，從而得到抗原的蛋白質(zhì)變體，它們的序列都通過傳統(tǒng)的自動(dòng)測(cè)序法得到了驗(yàn)證。有幾個(gè)表達(dá)載體已經(jīng)報(bào)道并用于獲得重組蛋白質(zhì)。這些載體至少含有可操作性連接到所要表達(dá)的DNA序列或片段上的調(diào)控表達(dá)的序列。用于控制表達(dá)的序列實(shí)例有l(wèi)ac、trp、tac和trc系統(tǒng)、啟動(dòng)子區(qū)域、lambda噬菌體的主要操縱子、表面蛋白fd的調(diào)控子區(qū)域、酵母糖分解啟動(dòng)子(例如3-磷酸甘油酸酯激酶(3-phosphoglicerate kinase))、酵母酸性磷酸酶啟動(dòng)子(例如Pho5)、酵母α交配因子啟動(dòng)子、來源于多瘤病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、猿猴病毒的啟動(dòng)子(例如SV40的早/晚期啟動(dòng)子)、以及其它已知序列，這些序列能夠調(diào)控基因在原核和真核細(xì)胞以及它們的病毒或其組合內(nèi)的表達(dá)。
這些載體復(fù)制以及獲得本發(fā)明的目的重組蛋白質(zhì)所使用的宿主包括原核細(xì)胞與真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括大腸桿菌(E.Coli)(DHI、MRCI、HB101、W3110、SG-936、X1776、X2282、DH5α)、假單胞菌、枯草桿菌、鏈球菌等。真核細(xì)胞包括酵母和真菌、昆蟲、動(dòng)物細(xì)胞(例如COS-7和CHO)、人和植物細(xì)胞、組織培養(yǎng)物等。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中的所選擇的系統(tǒng)中表達(dá)后，可以用已知的方法分離多肽或者肽。
佐劑的使用即使用已經(jīng)在一定的動(dòng)物模型中顯示有效的裸DNA或者蛋白質(zhì)來免疫，本發(fā)明的治療策在治療腫瘤或者自身免疫病的患者的時(shí)候還是遇到了挑戰(zhàn)。為了促進(jìn)免疫應(yīng)答，DNA或蛋白質(zhì)疫苗可以與一些已經(jīng)描述過的免疫增強(qiáng)劑共同使用，如礦物鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣)、免疫刺激劑例如細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL-18)、分子(CD40、CD154、MHC I分子的穩(wěn)定鏈、LFA3)、皂角苷(如QS21)、MDP衍生物、CpG寡聚物、LPS、MPL和聚磷腈、脂類顆粒如乳劑(例如弗氏佐劑、SAF、MF59)、脂質(zhì)體、病毒體、iscom、螯合劑、微粒佐劑如PLG微粒、poloxamer、病毒類(如HBcAg、HCcAg、HBsAg)、細(xì)菌類(如VSSP、OPC)、粘膜佐劑如熱不穩(wěn)定內(nèi)毒素(LT)、霍亂毒素、以及突變毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和多聚脂質(zhì)體。在DNA疫苗免疫中，目的抗原的表達(dá)可以在雙順反子載體上聯(lián)合某些已經(jīng)提到的免疫增強(qiáng)分子。
在實(shí)施例中詳細(xì)列出的試驗(yàn)條件顯示，DNA可以非共價(jià)的結(jié)合到某些提到的顆粒上，而這種混合物的使用降低了抗腫瘤應(yīng)答的最適濃度，與報(bào)道的那些更高劑量的裸DNA相似。
對(duì)哺乳動(dòng)物的用藥對(duì)于治療性的應(yīng)用，本發(fā)明的疫苗制劑以藥物可接受的劑量通過以下途徑給藥哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人粘膜、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔、淋巴內(nèi)、局部和吸入等。它們可以給藥到組織間隙，包括肌肉、皮膚、腦、肺、肝、骨髓、脾、胸腺、心臟、淋巴結(jié)、血液、骨、軟骨、胰臟、腎臟、膀胱、胃、腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、眼、腺體以及結(jié)締組織。對(duì)于轉(zhuǎn)移寡核苷酸的載體，它們優(yōu)選表達(dá)于分化的體細(xì)胞，盡管它們也可定位到未分化或分化程度較低的細(xì)胞例如皮膚成纖維細(xì)胞和血液多能細(xì)胞。
免疫原可以在藥物學(xué)允許的不產(chǎn)生毒性或治療效果的載體中給藥。這些載體的例子包括離子交換劑、氧化鋁、aluminum esthearates、卵磷脂、血清蛋白質(zhì)如白蛋白、緩沖液例如磷酸、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、植物來源的飽和脂肪酸不完全甘油脂混合物、水、鹽或者電解質(zhì)例如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鋅鹽、膠體硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮(polivynil pirrolidone)、基于纖維素和聚乙二醇的物質(zhì)。在本發(fā)明中，優(yōu)選磷酸緩沖液作為疫苗制劑的載體使用。
在使用蛋白質(zhì)和肽的時(shí)候，它們可以共價(jià)或者非共價(jià)地結(jié)合到已知有類似佐劑作用的的載體分子上。這些分子包括KLH、p64K、OPC(Musacchio A等人，Vaccine 19；3692，2001)以及VSSP。本發(fā)明還有一種替代方法聯(lián)合使用裸DNA、病毒載體和蛋白質(zhì)免疫原。質(zhì)粒DNA給藥的優(yōu)勢(shì)在于能夠在疫苗制劑中產(chǎn)生一種到多種目的分子。因此，本發(fā)明涉及的分子可以通過各種類型載體的組合在接種程序中給藥(誘導(dǎo)再刺激的變體，使用DNA、蛋白質(zhì)和病毒載體)。
DNA載體可以直接向患者給藥，或者宿主細(xì)胞可以在體內(nèi)或者體外用載體修飾。后一種策略可以聯(lián)合位點(diǎn)特異重組插入或體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因免疫接種而指導(dǎo)載體至特定的細(xì)胞表達(dá)。而且，DNA載體的細(xì)菌宿主可以用作它們體內(nèi)轉(zhuǎn)化的載體。
這樣，帶有本發(fā)明的基因的分子可以以裸DNA的形式或者聯(lián)合不同的載體使用化學(xué)/生物化學(xué)/生物學(xué)、天然/合成、或者重組的。這些分子可以偶聯(lián)或者結(jié)合到陽離子肽、包裝分子(如PEG、PEI)、核定位肽(NLP)等等。這些也可以與能夠形成DNA沉淀的陽離子一起給藥，作為脂質(zhì)體制劑的一部分，所述分子膜融合前加到該制劑中，并在脂性的合成載體上，也可以由陽離子聚合物組成(例如DOGS或者DOTMA)。對(duì)于DNA載體的給藥，也可以使用嵌合蛋白質(zhì)，它們能包裝DNA分子并且介導(dǎo)復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及其被特異細(xì)胞選擇性內(nèi)吞。帶有本發(fā)明涉及的治療/疫苗基因的DNA分子，可以通過物理轉(zhuǎn)運(yùn)方法例如顆粒轟擊、電穿孔(離體、體內(nèi)、體外)或者通過局部應(yīng)用或者顆粒吸入等方法直接向體內(nèi)給藥而用于向細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)?；钶d體包括腺病毒顆?；蛘弑景l(fā)明的分子所產(chǎn)生的相同宿主。
所使用的多肽和/或者寡核苷酸的劑量可以根據(jù)不同的參數(shù)建立，尤其是要依賴下列參數(shù)作為抗原給藥的基因或者蛋白質(zhì)、給藥的途徑、預(yù)治療的病理學(xué)、治療時(shí)間，在使用寡核苷酸時(shí)的用于免疫的載體。與下面實(shí)施例描述的不同的劑量的改變或者給藥途徑的變化，不背離本發(fā)明的原則或者觀點(diǎn)，可能達(dá)到最佳的免疫效果，獲得更好的應(yīng)答。
治療應(yīng)用本發(fā)明比被動(dòng)免疫療法有很多優(yōu)點(diǎn)，這些被動(dòng)免疫方法已經(jīng)進(jìn)入高級(jí)臨床階段，它們使用相同分子作為靶標(biāo)。相比給藥單克隆抗體(如，Anti-VEGF)的被動(dòng)免疫，使用蛋白質(zhì)或寡核苷酸的免疫的優(yōu)點(diǎn)在于能夠誘導(dǎo)抗體的內(nèi)源性生成并且誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性CD8+淋巴細(xì)胞的增殖與擴(kuò)散。
本發(fā)明比直接阻斷VEGF-VEGFR體系的治療策略有很多優(yōu)點(diǎn)，主要由于這些策略只能清除循環(huán)中的VEGF水平或阻斷KDR。而這里所提出的策略不但具有上述作用，還能破壞VEGF的來源(也就是腫瘤細(xì)胞以及相關(guān)的基質(zhì))和/或表達(dá)它們的受體的細(xì)胞(腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞)。以前這個(gè)領(lǐng)域的工作只描述了體液應(yīng)答作為所觀察到的主要的效果。不想將本發(fā)明局限于一種特定的機(jī)制，實(shí)施例顯示，除了特異性的體液應(yīng)答之外，所述的疫苗制劑還能激發(fā)CD8+細(xì)胞應(yīng)答，其與體液應(yīng)簽共同作用；在腫瘤環(huán)境中，兩者的結(jié)合與獲得抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)(在實(shí)施例9中觀察到)。
細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答可能是通過對(duì)表1和表2中的一些肽的識(shí)別所介導(dǎo)的。其中某些肽段可能與針對(duì)所述擇的VEGF家族及其受體和共同受體的靶標(biāo)的細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)。這一信息是通過分別使用BIMAS和SYFPHEITI軟件的NIH和Heidelberg研究所(http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind和www.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)的公共數(shù)據(jù)庫利用計(jì)算機(jī)分析得到的。標(biāo)記的肽和其它由目的抗原衍生的序列可以用來對(duì)已經(jīng)描述的病理狀態(tài)進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，可以單獨(dú)或聯(lián)合治療，含有或者不含有佐劑作用的分子。這些肽也可以以它們的寡核苷酸變體的形式用作疫苗。
用于抑制血管生成及相關(guān)的病理狀態(tài)的方法，包括給予哺乳動(dòng)物有效劑量的本發(fā)明所描述的DNA或者蛋白質(zhì)分子，通過任何途徑，并使用某些以前描述過的免疫增強(qiáng)劑或者佐劑。哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人。
不可逆轉(zhuǎn)并不受調(diào)控的血管生成的增加與許多疾病有關(guān)。這個(gè)包括VEGF家族及其受體和共同受體的體系在許多病理狀態(tài)中都過度表達(dá)，正如以前所描述的。在這種情況下，本發(fā)明所提出的治療策略有效治療下列疾病(a)癌癥(原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶)，(b)急性與慢性炎癥過程如哮喘、呼吸窘迫、子宮內(nèi)膜異位癥、動(dòng)脈粥樣硬化、以及組織水腫，(c)傳染性疾病如肝炎與Kaposi肉瘤，(d)自身免疫病如糖尿病、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和甲狀腺炎，(e)其它疾病與狀態(tài)如糖尿病性視網(wǎng)膜病變或者新生兒視網(wǎng)膜病變、器官移植排斥、黃斑變性、新生血管性青光眼、血管瘤和血管纖維瘤。
尤其是在腫瘤情況下，用本發(fā)明所提出的免疫原免疫接種可有效治療惡性腫瘤、肉瘤和血管化腫瘤。能夠用所提出的策略治療的一些腫瘤的實(shí)例包括表皮樣腫瘤、鱗狀瘤如頭頸部鱗狀瘤、以及結(jié)直腸、前列腺、乳腺、肺(包括小細(xì)胞和非小細(xì)胞)、胰腺、甲狀腺、卵巢和肝腫瘤。這些方法在治療其它類型的腫瘤中也有效，例如Kaposi肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管瘤、腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤)、黑色素瘤、腎臟和胃腸部癌、橫紋肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤。
特別地，VEGF-A和/或其受體VEGFR-1和VEGFR-2作為免疫原用于治療不同來源和位置的腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶、血管瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、組織水腫、急性與慢性炎癥過程如潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏癥(Crohn’sdisease)、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎性關(guān)節(jié)病、牛皮癬、呼吸窘迫、哮喘、甲狀腺炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變或者新生兒視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、青光眼、常染色體病VHL、肥胖、某些器官移植排斥。另一方面，針對(duì)PIGF的反應(yīng)對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有用，通常用于原發(fā)的炎性關(guān)節(jié)病的治療。
對(duì)于VEGF-B而言，它作為免疫原對(duì)于乳腺、卵巢和腎臟腫瘤以及黑色素瘤和纖維肉瘤有效。VEGF-C和它的受體VEGFR-3對(duì)于治療組織水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、慢性炎癥、潰瘍、乳腺腫瘤、肺部腫瘤、頭頸部腫瘤、食道腫瘤、胃部腫瘤、淋巴瘤、前列腺腫瘤、轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)(metastatic nodule)、Kaposi肉瘤(Kaposi sarcoma)、Dabska型血管內(nèi)皮瘤(Dabska type hemangioendothelioma)、皮膚淋巴管瘤(cutaneouslymphangiomatosis)都有效。VEGF-D的免疫可以特異性的用于治療淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
NRP1和NRP2共同受體用于哺乳動(dòng)物免疫，能有效的治療尤其是前列腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的纖維血管增生。
基于給予抗體的被動(dòng)免疫治療的研究顯示，抗VEGF-A和KDR的抗體聯(lián)合使用對(duì)于同源腫瘤(syngeneic tumors)模型更有效。因此，使用兩種或多種本發(fā)明免疫原對(duì)抑制血管生成和腫瘤生長提供了特別有效的治療。這些免疫原可以單獨(dú)給藥，也可以用雙順反子載體通過前面提過的途徑成對(duì)給藥。另外，本發(fā)明的疫苗組合物可以與藥物或化學(xué)治療劑一起或者先后使用，對(duì)于治療的疾病有利。
下面描述的結(jié)果證明抗血管生成和抗腫瘤反應(yīng)是通過體液和細(xì)胞應(yīng)簽的共同作用介導(dǎo)的。尤其是VEGF及其受體，它們參與了樹突細(xì)胞成熟并且作用于B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞前體。實(shí)施例10表明，本發(fā)明所提出的治療策略除了降低血清中的VEGF水平以外，也能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞比例的正?；?。這一效果能促進(jìn)腫瘤抗原在MHC I的呈遞，提高抗腫瘤免疫應(yīng)答的質(zhì)量和強(qiáng)度，使這種免疫應(yīng)答不但指向免疫原，也能指向腫瘤環(huán)境中其它腫瘤相關(guān)、腫瘤特異和過度表達(dá)的抗原。
表1.HLAA.0201中VEGF家族蛋白質(zhì)MHCI相關(guān)肽的評(píng)估
注意粗體字表示的值對(duì)應(yīng)那些在兩個(gè)預(yù)測(cè)中一致的肽或者其區(qū)域表2.HLAA.0201中VEGF家族受體MHCI相關(guān)肽的評(píng)估
注意粗體字表示的值對(duì)應(yīng)那些在兩個(gè)預(yù)測(cè)中一致的肽或者其區(qū)域?qū)嵤├龑?shí)施例1抗原的克隆與瞬時(shí)表達(dá)人VEGF及其同種型和功能突變體用來自以前分離的CaSki細(xì)胞(ATCC CRL 1550)的mRNA的cDNA作為模板，通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆了VEGF的同種型，使用引物為SEQ ID1和SEQ ID2，操作按照制備商(Perkin-Elmer)的說明進(jìn)行。從2％的瓊脂糖凝膠上提取VEGF同種型121、165和189所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物帶。用核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化電泳帶后，純化VEGF同種型的cDNA并獨(dú)立克隆到PAECΔ2載體(CIGB所有的載體)中。所得到的質(zhì)粒測(cè)序并確定克隆的同種型與EMBL(www.embl-heidelberg.de)所報(bào)道的氨基酸序列沒有發(fā)生突變。與VEGF同種型對(duì)應(yīng)的cDNA隨后克隆到pMAE5Δ5的Kpnl/EcoRV中，這個(gè)載體因?yàn)橛?’免疫刺激CpG位點(diǎn)的存在，而不同于pAECΔ2。
根據(jù)Seimeister G等人(Siemeister等人，J Biol Chem 27311115，1998)所述，將前面克隆的VEGF121同種型直接突變得到與KDR受體結(jié)合能力缺陷的VEGF變體(VEGFKDR(-))的cDNA。
用下列引物通過PCR法得到該突變變體(A)5’端片段(315bp)的擴(kuò)增用引物SEQ ID3和SEQ ID4(B)3’端片段(93bp)的擴(kuò)增用引物SEQ ID5和SEQ ID6擴(kuò)增的片段用文獻(xiàn)中的方法純化，并以等摩爾濃度作為融合PCR的模板，使用相應(yīng)于序列SEQ ID7和SEQ ID8的引物。所得到的含有突變的cDNA用BamHI/EcoRI進(jìn)行消化并純化，再克隆到pAECΔ2載體中。用測(cè)序的方法驗(yàn)證所引入的突變，與VEGFKDR(-)對(duì)應(yīng)的DNA亞克隆到pMAE5Δ5載體BamHI/EcoRI處，得到pMAE5Δ5 VEGFKDR(-)。
用于轉(zhuǎn)染和動(dòng)物接種的質(zhì)粒在不含內(nèi)毒素的條件下純化，如WhalenR.等人所述(Whalen RG和Davis HL，Clin Immunol Immunopathol 751，1995)。簡言之，按照制造商說明使用QIAGEN Endo-free系統(tǒng)純化DNA，然后將該DNA進(jìn)行第二次沉淀。最后，用不含內(nèi)毒素的PBS(Sigma，USA)溶解DNA至終濃度4mg/mL。
1.2人VEGF受體(KDR/Flk1)使用人VEGF(Sigma)和肝素(Sigma)處理的內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC(Clonetic，USA)的mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR得到編碼VEGF受體KDR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(KDR1-3)以及該受體跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(KDRTC)的cDNA。
對(duì)于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域1到3，所使用的引物為序列SEQ ID9和SEQID10。用核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化所得到的擴(kuò)增片段(943bp)后，將該編碼KDR結(jié)構(gòu)域1至3的cDNA純化并克隆到pAECΔ2載體中。限制性酶分析陽性的克隆經(jīng)過對(duì)相應(yīng)的DNA的測(cè)序得到驗(yàn)證。KDR1-3對(duì)應(yīng)的cDNA序列然后亞克隆到前述pMAE5Δ5載體BamHI/EcoRI處(pMAE5Δ5 KDR1-3)。
設(shè)計(jì)一個(gè)兩步法的策略克隆該受體的跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。為插入第一個(gè)片段，使用了相應(yīng)于SEQ ID11和SEQ ID12的引物。經(jīng)過Xbal/BgIII消化這個(gè)747bp的片段后，將該產(chǎn)物克隆到pMAE5載體中，載體事先也用同樣的酶消化，得到了質(zhì)粒pMAE5 KDR747。再用BgIII/NotI消化該質(zhì)粒以便于插入其余的1091bp的羧基端片段，這個(gè)1091bp的片段是用相應(yīng)于序列SEQ ID13和SEQ ID14的引物擴(kuò)增得到的。限制性酶分析陽性的克隆經(jīng)過DNA測(cè)序驗(yàn)證，并命名為pMAE5 KDR C。
1.2.1在病毒載體中克隆KDP的跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)為了在禽痘病毒上克隆VEGF受體(KDR)的跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)，使用對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID15和SEQ ID16的引物。用酶Stul/Smal消化該953bp片段后，將產(chǎn)物克隆到pFP67xgpt載體中，該載體事先也用同樣的酶消化。在同一個(gè)載體上，用Smal/BamHI消化后，插入用對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID15和SEQ ID16的引物從原始cDNA擴(kuò)增得到的919bp的片段。限制性酶分析陽性的克隆經(jīng)過DNA測(cè)序驗(yàn)證，并命名為pFP67xgpt KDRC。
在補(bǔ)充有2％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中培養(yǎng)禽痘病毒(FWPVs)。用Lipofectin(Gibco BRL，GrandIsland，USA)將pFP67xgpt KDR C轉(zhuǎn)染到CEF中，CEF事先用減毒株FP9感染。24小時(shí)后，加入新鮮的培養(yǎng)基，細(xì)胞再培養(yǎng)3至4天。之后，細(xì)胞凍融3次。表達(dá)編碼Ecogpt酶基因的重組病毒用含有霉酚酸(25μg/mL)、黃嘌呤(Xantine)(250μg/mL)和次黃嘌呤(hypoxantine)(15μg/mL)的選擇性培養(yǎng)基(MXH)純化。用PCR檢查基因在重組病毒中的正確插入。重組病毒命名為FPKDRgpt，未重組病毒作為陰性對(duì)照FP。
實(shí)施例2抗原的體內(nèi)表達(dá)為了確認(rèn)所構(gòu)建的載體在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的能力，將它們注射到C57BL/6小鼠(每組3只)的股四頭肌中。
1.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠10和50μg)2.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF165(每只小鼠10和50μg)3.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF189(每只小鼠10和50μg)4.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGFKDR(-)(每只小鼠10和50μg)5.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-KDR1-3(每只小鼠10和50μg)6.于pH7.2的PBS中的pMAE5 KDR C(每只小鼠10和50μg)7.于pH7.2的PBS中的FPKDRgpt(2.5*107cfu)8.pH7.2的PBS(陰性對(duì)照)注射后48小時(shí)處死動(dòng)物，分離一塊所注射的肌肉。部分肌肉組織在蛋白酶抑制劑和去離子去污劑的存在下勻漿。用識(shí)別全部人VEGF同種型的多克隆抗體(sc-152G)通過Dot-Blot和Western-Blot，根據(jù)所描述的步驟分析蛋白質(zhì)提取液中VEGF的存在。從其余的肌肉組織中用TRI-Reagent(SIGMA)提取RNA。每種試驗(yàn)條件的RNA共20μg在含甲醛的1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。將RNA轉(zhuǎn)到尼龍膜上(HYBOND)，然后用ATP32標(biāo)記的VEGF121同種型的cDNA進(jìn)行雜交，所述cDNA識(shí)別所有的VEGF同種型，也可以用類似標(biāo)記的KDR的cDNA雜交。在這兩種情況下，濾膜都與一個(gè)組成型基因(constitutive gene)磷酸甘油醛脫氫酶(gliceraldehyde 3-phosphate deshydrogenase)(GAPDH)的cDNA重新雜交。在所有分析的構(gòu)建體中，對(duì)與人VEGF和所克隆的KDR受體片段對(duì)應(yīng)的電泳帶都進(jìn)行了鑒定。
實(shí)施例3用含有VEGF受體KDR基因片段的質(zhì)粒進(jìn)行接種的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)用或不用下列變體接種各組C57BL/6小鼠(每組10只)1.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-KDR1-3(每只小鼠1、10、50和100μg)2.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5 KDR C(每只小鼠1、10、50和100μg)3.FPKDRgpt(2.5*107cfu)4.pH7.2的PBS(陰性對(duì)照)5.FP(2.5*107cfu)(陰性對(duì)照組3)在每種情況下，小鼠在左后足處通過肌內(nèi)注射免疫50微升總體積。15天后，所有動(dòng)物用初始免疫方案重復(fù)免疫。在最后一次免疫后30天進(jìn)行腫瘤攻擊，在每只動(dòng)物的右腹部皮下注射104個(gè)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞(ATCC，CRL-6475)。每周進(jìn)行三次測(cè)量監(jiān)視腫瘤的生長直到動(dòng)物開始死亡。
在pMAE5Δ5-KDR1-3質(zhì)粒免疫的小鼠中在每只小鼠50和100μgDNA的劑量下觀察到了腫瘤大小的減少，與陰性對(duì)照相比有明顯的降低(見表3)。第33天的生存分析顯示，用上述DNA在每只小鼠50和100μg的劑量下免疫的動(dòng)物與未免疫的小鼠(pH7.2的PBS組)相比，這個(gè)參數(shù)明顯的提高(與陰性對(duì)照組相比)。對(duì)于pMAE5Δ5 KDR C(見表3)，腫瘤體積在四個(gè)使用的劑量都觀察到了明顯的下降，每只動(dòng)物100到10μg的劑量有存活的提高。在使用FPKDRgpt構(gòu)建體的條件下(見表3)病毒載體的使用，與陰性對(duì)照相比(用沒有插入FPgpt的載體免疫的小鼠組)，降低了腫瘤的體積并提高了存活。
表3.用VEGF受體(KDR)基因片段免疫的小鼠的腫瘤體積與存活
注意腫瘤體積用從每組動(dòng)物所測(cè)得得平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用一元ANOVA和Bonferroni post-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。在存活方面，在所顯示的天數(shù)用log-rank檢驗(yàn)比較每組與對(duì)照組獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用ns表示p≤0.5，不明顯；*表示p≤0.05；**表示p≤0.01；***表示p≤0.001。
實(shí)施例4用含有VEGF同種型或突變株的質(zhì)粒進(jìn)行接種的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)用或不用下列各變體接種各組C57BL/6小鼠(每組10只)1.于pH7.2的PBS中的pAECΔ2-VEGF121(每只小鼠1、10、50和100μg)2.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠1、10、50和100μg)
3.于H7.2的PBS中的AE5Δ5-VEGF165(每只小鼠1、10、50和100μg)4.于H7.2的PBS中的AE5Δ5-VEGF189(每只小鼠1、10、50和100μg)5.于H7.2的PBS中的AE5Δ5-VEGFKDR(-)(每只小鼠1、10、50和100μg)6.pH7.2的PBS(陰性對(duì)照)在每一情況下，小鼠都是在左后足處通過肌內(nèi)注射免疫50微升總體積。15天后，所有小鼠用初始免疫方案重復(fù)免疫。在最后一次免疫后30天進(jìn)行腫瘤攻擊，每只動(dòng)物在右腹部皮下注射104個(gè)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞(ATCC，CRL-6475)。每周進(jìn)行三次測(cè)量監(jiān)視腫瘤的生長直到動(dòng)物開始死亡。
PAEC系列的裸DNA在用每只動(dòng)物100μg劑量免疫的小鼠中觀察到了與對(duì)照組相比腫瘤生長的減少(見表4)。在帶有5CpG位點(diǎn)的pMAE5Δ5系列載體中的小鼠組與陰性對(duì)照相比變體中，不論何種VEGF同種型，在免疫10、50和100μg DNA劑量的小鼠組與陰性對(duì)照相比腫瘤大小明顯下降。在使用突變變體pMAE5Δ5-VEGFKDR(-)的情形中，在與pMAE5Δ5-VEGF121類似的劑量下獲得腫瘤大小明顯的減少。
第43天的存活分析表明在每只動(dòng)物免疫50和100μg劑量的變體pMAE5Δ5-VEGF121、pMAE5Δ5-VEGF165、pMAE5Δ5-VEGF189和pMAE5Δ5-VEGFKDR(-)的動(dòng)物(與陰性對(duì)照相比)得到了明顯的提高(見表4)。
表4.用含有VEGF基因不同同種型以及突變變體的裸DNA的不同變體免疫的小鼠的腫瘤體積與存活
注意腫瘤體積用從每組動(dòng)物所測(cè)得得平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，使用一元ANOVA和Bonferroni post-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。在存活方面，在所顯示的天數(shù)使用log-rank test比較每組與對(duì)照組獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用ns表示p≤0.5不明顯；*表示p≤0.05；**表示p≤0.01；***表示p≤0.001。
實(shí)施例5在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中用pMAE5Δ5-VEGF121和pMAE5Δ5-KDR1-3進(jìn)行免疫的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)用或不用下列變體接種各組C57BL/6小鼠(每組20只)1.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠50μgDNA)2.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-KDR1-3(每只小鼠50μgDNA)3.pH7.2的PBS(陰性對(duì)照)每種情況，在第0天在左后足處通過肌內(nèi)注射免疫總體積為50微升。15天后，所有動(dòng)物用初始免疫方案重復(fù)免疫。
在第5天，開始用雞II型膠原(Sigma)誘導(dǎo)自身免疫性關(guān)節(jié)炎，這個(gè)模型以前被Campbell等人(Campbell IK等人，Eur.J.Immunol.301568，2000)報(bào)道過。在第26天重復(fù)這個(gè)免疫?；谌粘?biāo)準(zhǔn)，對(duì)每只小鼠的四肢進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量是根據(jù)對(duì)四肢是否存在以下跡象的檢查而得到的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，它是從0到3打分紅斑跡象(1)、炎癥(2)、關(guān)節(jié)僵硬(3)，最大值為12。誘導(dǎo)后23天小鼠開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，50天時(shí)發(fā)病率較高。表5列出在不同試驗(yàn)組動(dòng)物中關(guān)節(jié)炎發(fā)病率的分析。在第40和55天在接種組(1和2)觀察到了與陰性對(duì)照組相比關(guān)節(jié)炎發(fā)病率的明顯下降。
表5.在所選擇的日期關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率(第40和55天)
實(shí)施例6接種的體內(nèi)抗血管生成效應(yīng)用或不用下列變體接種各組C57BL/6小鼠(每組15只)1.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠50μg/DNA)
2.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-KDR1-3(每只小鼠50μg/DNA)3.于pH7.2的PBS中的pMAE DR C(每只小鼠50μg/DNA)4.pH7.2的PBS(陰性對(duì)照)在每種情況中，C57BL/6小鼠都是在左后足處通過肌內(nèi)注射免疫總體積50微升。15天后，所有小鼠用初始免疫方案重復(fù)免疫。在最后一次免疫后30天用Coughlin MC等人(Coughlin MC等人，J.Clin.Invest.1011441，1998)所描述的magrigel評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)的血管生成.前面免疫過的動(dòng)物分成5組并在腹中線處皮下注射500微升magrigel(BectonDickinson and Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey，USA)，其中含有1. 50ng/mL VEGF，5U/mL肝素2. 105個(gè)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞3.PBS六天后動(dòng)物處死，提取matrigel塞。根據(jù)制造說明(Drabkin’s reagentkit；Sigma Diagnostics Co.，St.Louis，Missouri，USA)分析塞中的血紅蛋白含量。編碼VEGF及其受體KDR的質(zhì)粒接種后能明顯(p＜0.001)抑制VEGF誘導(dǎo)的血管形成，也能抑制更復(fù)雜的體系腫瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的血管形成。
實(shí)施例7通過pMAE5Δ5-VEGF121與不同佐劑的非共價(jià)結(jié)合獲得免疫原以前報(bào)道過的各種不同的免疫刺激劑同pMAE5Δ5-VEGF121構(gòu)建體按照下面描述的方法混合使用。
根據(jù)Musacchio等人(Musacchio A等人Vaccine，67751，1997)報(bào)道的方法純化腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)外膜的Opc蛋白質(zhì)。將50μg/mL的pMAE5Δ5-VEGF121加到10μg/mL的Opc中，在酸性pH下溫和振蕩。將所得到的混合物在不含內(nèi)毒素的pH7.2的PBS(Sigma)中過夜透析。通過1％的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA檢查Opc蛋白質(zhì)-質(zhì)粒DNA的結(jié)合(Opc-pMAE5Δ5-VEGF121)水平。超過50％的質(zhì)粒DNA與Opc蛋白質(zhì)結(jié)合。
使用來自腦膜炎奈瑟球菌外膜的蛋白質(zhì)合體(OMPC)的非常小粒子(VSSP)(由分子免疫學(xué)中心(R.Perez等人United States PatentApplication 5788985，6149921)提供)，與目的質(zhì)粒DNA組合。VSSP(1mg)與5mg pMAE5Δ5-VEGF121孵育過夜并溫和振蕩。所得到的材料在不含內(nèi)毒素的pH7.2的PBS(Sigma)中過夜透析。用1％的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA來檢查VSSP-質(zhì)粒DNA的結(jié)合(VSSP-pMAE5Δ5-VEGF121)水平。超過50％的質(zhì)粒DNA結(jié)合VSSP粒子。
用一種以前報(bào)道的方法(Lorenzo LF等人，Biochem Biophys ResCommun 281962，2001)制備乙型肝炎與丙型肝炎的核心顆?；乖?HCcAg與HBcAg)。每mg抗原與5mg質(zhì)粒混合過夜孵育。用1％的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA來檢查HCcAg或HBcAg-質(zhì)粒DNA的結(jié)合(分別為HCcAg-pMAE5Δ5-VEGF121與HBcAg-pMAE5Δ5-VEGF121)水平。在每種情形中，超過50％的DNA結(jié)合抗原粒子。
實(shí)施例8用pMAE5Δ5-VEGF121構(gòu)建體與免疫應(yīng)答佐劑的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)用或不用下列變體接種各組C57BL/6小鼠(每組10只)1.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠1、10、和50μgDNA)2.Opc-pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠1、10、和50μgDNA)3.VSSP-pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠1、10、和50μgDNA)4.HBcAg-pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠1、10、和50μgDNA)5.HCcAg-pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠1、10、和50μgDNA)6.pH7.2的PBS(第1組的陰性對(duì)照)7.Opc(第2組的陰性對(duì)照)8.VSSP(第3組的陰性對(duì)照)9.HBcAg(第4組的陰性對(duì)照)
10.HCcAg(第5組的陰性對(duì)照)免疫步驟、腫瘤攻擊與腫瘤體積的測(cè)量與前面的實(shí)施例中所描述的類似。與各自陰性對(duì)照組相比各個(gè)疫苗變體在每只小鼠10μg或10μg以上DNA劑量下降低腫瘤生長(見表6)。用結(jié)合或不結(jié)合作為免疫增強(qiáng)劑載體的Opc、VSSP、HBcAg、HCcAg的VEGF基因免疫動(dòng)物觀察到了與各自對(duì)照組相比明顯提高的存活。所有用了載體的變體與各自對(duì)照相比都顯示了明顯提高的存活，從每只小鼠10μg劑量開始，而pMAE5Δ5-VEGF121的裸DNA變體在每只小鼠50μg劑量下與對(duì)照組相比產(chǎn)生了明顯的不同(見表6)。
表6.用不同免疫刺激劑免疫的小鼠的腫瘤體積與存活
注意腫瘤體積用從每組動(dòng)物所測(cè)得得平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用一元ANOVA和Bonferroni post-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。在存活方面，在所顯示的天數(shù)用log-rank test比較每組與對(duì)照組獲得報(bào)告的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用ns表示p≤0.5，不明顯；*表示p≤0.05；**表示p≤0.01；***表示p≤0.001。
實(shí)施例9使用蛋白質(zhì)形式的VEGF的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)用或不用下列變體接種每組10只C57BL/6小鼠加完全和不完全弗氏佐劑的VEGF165(20μg/小鼠)。
完全或不完全弗氏佐劑(陰性對(duì)照)VEGF165抗原來源是商品化的(Sigma)，純度達(dá)到97％以上。用弗氏完全佐劑(Sigma)通過腹腔內(nèi)途徑免疫小鼠，在第15天和第30天用弗氏不完全佐劑通過同樣途徑重復(fù)免疫。腫瘤攻擊與腫瘤體積的測(cè)量與前面的實(shí)施例中所述類似。
觀察到了VEGF免疫組與未免疫的對(duì)照組相比腫瘤體積明顯減小，存活提高。效果與以前用VEGF DNA的試驗(yàn)結(jié)果相似。
實(shí)施例10嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)C57BL/6小鼠體內(nèi)免疫保護(hù)轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)根據(jù)實(shí)施例5描述的方法用或不用每只小鼠50μg的pMAE5Δ5-VEGF121免疫C57BL/6小鼠。初次免疫后45天處死小鼠。根據(jù)制造商的說明用磁珠(Dynabeads，USA)分離所述小鼠的CD8+、CD4+和B淋巴細(xì)胞。
每組10只六周齡的C57BL/6 SCID小鼠用下列前面提取的淋巴細(xì)胞的組合重建。
第1組來自pMAE5Δ5-VEGF121免疫的小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+的T淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞不重建。
第2組來自免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞，來自未免疫小鼠的CD8+的T淋巴細(xì)胞。
第3組來自免疫小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+的T淋巴細(xì)胞，以及B淋巴細(xì)胞，作為試驗(yàn)的陽性對(duì)照。
第4組來自未免疫小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞，作為試驗(yàn)的陰性對(duì)照。
重建的SCID小鼠皮下用104個(gè)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞攻擊。每周進(jìn)行三次測(cè)量監(jiān)視腫瘤的生長直到小鼠開始死亡。用實(shí)驗(yàn)室的ELISA方法分析抗VEGF抗體水平。用0.5μg/mL的VEGF165(Sigma)溶液將96孔板孵育過夜。用PBS-BSA1％(BDH，UK)溶液封閉孔，然后用系列稀釋的動(dòng)物血清孵育。用PBS-吐溫0.05％洗滌后加入商品化的的抗小鼠IgG多克隆抗體(Sigma，A0168)。通過商品化的底物鄰苯二胺(OPD，Sigma)擴(kuò)大信號(hào)。
表7反映了腫瘤攻擊的小鼠腫瘤體積(第24天)和存活率(第40天)的結(jié)果。從重建后的第15天開始，第1到3組的動(dòng)物與第4組用來自未免疫小鼠淋巴細(xì)胞重建的小鼠相比腫瘤大小減少。因此在被免疫的小鼠中激活免疫系統(tǒng)，從而降低腫瘤大小的作用，是與體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的，后一種是細(xì)胞毒性(CTL)，因?yàn)樵诘?組中缺乏抗VEGF抗體。然而，在試驗(yàn)條件下只有第3組(免疫小鼠的B和T淋巴細(xì)胞)的存活提高(見表7)。在部分重建缺乏B或CTL型T應(yīng)答的重建動(dòng)物中(分別為第1組或第2組)，其存活與陽性對(duì)照相比沒有差別。這些結(jié)果表明體液應(yīng)答與細(xì)胞應(yīng)答的組合(第4組)能產(chǎn)生有效應(yīng)答的協(xié)同作用，延長受腫瘤攻擊的小鼠的存活。
表7.用來自pMAE5Δ5-VEGF121免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞重建的SCID小鼠的腫瘤體積與存活
注意供體小鼠用或不用每只小鼠50μgpMAE5Δ5-VEGF DNA免疫。腫瘤體積用從每組動(dòng)物所測(cè)得得平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用一元ANOVA和Bonferroni post-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。在存活方面，在所顯示的天數(shù)用log-rank test比較每組與對(duì)照組獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用ns表示p≤0.5，不明顯；*表示p≤0.05；**表示p≤0.01；***表示p≤0.001。
實(shí)施例11通過免疫反應(yīng)去除循環(huán)中的VEGF顯示免疫恢復(fù)用或不用下列變體肌肉內(nèi)注射每組15只C57BL/6雌性小鼠1.于pH7.2的PBS中的pMAE5Δ5-VEGF121(每只小鼠50μg)2.pH7.2的PBS每種情況中，通過于左后足肌肉內(nèi)注射總體積50微升免疫小鼠。15天后，所有動(dòng)物用初次免疫方案重復(fù)免疫。最后一次免疫三十天后每組隨機(jī)挑選5只處死，用宏觀的和組織學(xué)的評(píng)價(jià)分析免疫與對(duì)照動(dòng)物的免疫狀態(tài)以及接種對(duì)器官和組織的毒性。
每組其余的動(dòng)物在右腹部接受皮下注射104個(gè)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞。在注射腫瘤細(xì)胞后的第15和30天，每組處死5只小鼠，并按照前面描述的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
在所有被評(píng)價(jià)的動(dòng)物中宏觀水平上都沒有出現(xiàn)毒性現(xiàn)象，組織學(xué)分析表明在最后一次免疫后30天檢測(cè)的任何器官?zèng)]有發(fā)現(xiàn)損傷。免疫學(xué)評(píng)價(jià)包括(1)小鼠血清中VEGF水平評(píng)價(jià)；(2)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞構(gòu)成，以及脾臟、腕腋(brachial axillary)和腹股溝淋巴結(jié)中樹突細(xì)胞的成熟度。
未處理的動(dòng)物血清中的鼠VEGF水平分析(用于鼠VEGF的R&D試劑盒)表明，隨著暴露于腫瘤時(shí)間的增長，血清中VEGF水平升高，同腫瘤體積隨時(shí)間的增長一致。在針對(duì)人VEGF免疫的一組，在腫瘤攻擊后持續(xù)的30天內(nèi)檢測(cè)到了鼠VEGF水平的明顯下降(p＜0.001，方差分析，Bonferroni post-test)。
用Gabrilovich等人(Gabrilovich D等人，Blood 924150，1998)報(bào)道的方法研究了淋巴結(jié)和脾臟中細(xì)胞群的比例，從而分析了每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死的動(dòng)物的免疫系統(tǒng)狀況。在這些研究中，使用了商品化的識(shí)別CD3、CD19、CD11c和CD86(B7-2)分子的單克隆抗體(Pharmingen)，這些單克隆抗體用異硫氰酸熒光素(FITC)和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記，通過使用流式細(xì)胞儀(FACS)能夠顯現(xiàn)各個(gè)細(xì)胞群。所獲得的結(jié)果顯示在表8中。
表8.根據(jù)表面標(biāo)記的FACS分析細(xì)胞群體結(jié)果總結(jié)
注意在每種情況中，數(shù)值表示陽性細(xì)胞在總體計(jì)數(shù)細(xì)胞中所占的百分比。
免疫后30天動(dòng)物淋巴細(xì)胞群和樹突細(xì)胞成熟度的分析顯示接種VEGF DNA不能誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫狀態(tài)任何變化。然而腫瘤移植后30天，未接種動(dòng)物出現(xiàn)了T淋巴細(xì)胞/B淋巴細(xì)胞比例(CD3/CD9)的下降，無論在淋巴結(jié)還是在脾臟，與腫瘤攻擊前相比都有下降。而且，尤其是在脾臟中，淋巴樣細(xì)胞數(shù)有了明顯下降。在這些動(dòng)物的淋巴結(jié)和脾臟中也都觀察到了成熟樹突細(xì)胞數(shù)的下降。在接種VEGF DNA的小鼠組中觀察到了各個(gè)參數(shù)的明顯恢復(fù)，這個(gè)現(xiàn)象可能與這組動(dòng)物中觀察到的血清VEGF水平的下降關(guān)。
序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>Antiangiogenic active immunotherapies<130>序列表<140>CU2002/0076<141>2002-04-15<150>EP98001000<151>1998-01-31<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.主動(dòng)接種方法，其特征是給予估劑化或未估劑化的疫苗制劑，所述的疫苗制劑含有與血管生成增加直接相關(guān)的多肽和/或編碼與血管生成增加直接相關(guān)的蛋白質(zhì)的寡核苷酸，和其變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中與血管生成直接相關(guān)的蛋白質(zhì)屬于血管內(nèi)皮生長因子VEGF家族。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFA同種型的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFA121。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFA165。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFA189。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFB同種型的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2和7的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFB167。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFC。
10.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFD。
11.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中的蛋白質(zhì)是PLGF。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中與血管生成增加直接相關(guān)的蛋白質(zhì)屬于VEGF受體和共同受體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1和12的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFR1。
14.根據(jù)權(quán)利要求1和12的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFR2。
15.根據(jù)權(quán)利要求1和12的方法，其中的蛋白質(zhì)是VEGFR3。
16.根據(jù)權(quán)利要求1和12的方法，其中的蛋白質(zhì)是NRP1。
17.根據(jù)權(quán)利要求1和12的方法，其中的蛋白質(zhì)是NRP2。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到17的方法，其中的免疫原是來自VEGF家族或者其受體的變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到18的方法，其中的抗原是自體抗原。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到18的方法，其中的抗原是異體抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到20的方法，其中的免疫原是合成的、重組的、嵌合的或者天然的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到21的方法，其中的免疫原是肽性質(zhì)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的免疫原是上述2到22的權(quán)利要求描述的分子中的至少兩種的混合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療哺乳動(dòng)物腫瘤。
25.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療和預(yù)防人體腫瘤。
26.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療如人體內(nèi)惡性瘤的形成及其轉(zhuǎn)移中發(fā)生的以血管生成的增加為特征的疾病。
27.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療如良性瘤的形成中發(fā)生的以血管生成的增加為特征的疾病。
28.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療如急性和慢性炎癥過程中發(fā)生的以血管生成的增加為特征的疾病。
29.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療如自身免疫過程中發(fā)生的以血管生成的增加為特征的疾病。
30.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療如眼部病變中發(fā)生的以血管生成的增加為特征的疾病。
31.根據(jù)權(quán)利要求1到23的方法，用于治療特別是情感動(dòng)物和牛中以血管生成的增加為特征的疾病。
32.疫苗組合物，其含有與血管生成增加直接相關(guān)的多肽和/或編碼與血管生成增加直接相關(guān)的蛋白質(zhì)的寡核苷酸和其變體，存在或者不存在藥物可接受的佐劑的情況下給藥。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32和33的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFA同種型中的一種。
35.根據(jù)權(quán)利要求32、33和34的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFA121。
36.根據(jù)權(quán)利要求32、33和34的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFA165。
37.根據(jù)權(quán)利要求32、33和34的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFA189。
38.根據(jù)權(quán)利要求32和33的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFB異構(gòu)體。
39.根據(jù)權(quán)利要求32、33和38的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFB167。
40.根據(jù)權(quán)利要求32和33的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFC。
41.根據(jù)權(quán)利要求32和33的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFD。
42.根據(jù)權(quán)利要求32和33的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是PIGF。
43.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)屬于VEGF受體和共同受體。
44.根據(jù)權(quán)利要求32和43的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFR1。
45.根據(jù)權(quán)利要求32和43的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFR2。
46.根據(jù)權(quán)利要求32和43的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是VEGFR3。
47.根據(jù)權(quán)利要求32和43的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是NRP1。
48.根據(jù)權(quán)利要求32和43的疫苗組合物，其中的相關(guān)蛋白質(zhì)是NRP2。
49.根據(jù)權(quán)利要求32到48的疫苗組合物，其特征在于含有來自VEGF家族、其受體和共同受體的突變體作為免疫原。
50.根據(jù)權(quán)利要求32到49的疫苗組合物，其中的抗原是自體抗原。
51.根據(jù)權(quán)利要求32到49的疫苗組合物，其中的抗原是異體抗原。
52.根據(jù)權(quán)利要求32到51的疫苗組合物，其中的免疫原是合成的、重組的、嵌合的或者天然的。
53.根據(jù)權(quán)利要求32到51的疫苗組合物，其中的免疫原是肽性質(zhì)的。
54.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗組合物，其特征是含有是權(quán)利要求33到53中描述的分子中的至少兩種的混合物作為免疫原。
55.根據(jù)權(quán)利要求32到54的疫苗組合物，其中的免疫原以質(zhì)粒載體的一部分給藥。
56.根據(jù)權(quán)利要求32到54的疫苗組合物，其中的免疫原以病毒載體的一部分給藥。
57.根據(jù)權(quán)利要求32到54的疫苗組合物，其中的免疫原以多肽給藥。
58.根據(jù)權(quán)利要求32到57的疫苗組合物，其中的免疫原共價(jià)結(jié)合或者不結(jié)合佐劑給藥。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的疫苗組合物，其中的佐劑是顆粒狀的。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的疫苗組合物，其中的佐劑特別是乙型肝炎核心抗原的重組顆粒。
61.根據(jù)權(quán)利要求59的疫苗組合物，其中的佐劑特別是丙型肝炎核心抗原的重組顆粒。
62.根據(jù)權(quán)利要求59的疫苗組合物，其中的佐劑特別是VSSP。
63.根據(jù)權(quán)利要求58的疫苗組合物，其中的佐劑是蛋白質(zhì)性質(zhì)的。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的疫苗組合物，其中的佐劑是OPC蛋白質(zhì)。
65.根據(jù)權(quán)利要求63的疫苗組合物，其中的佐劑是KLH蛋白質(zhì)。
66.根據(jù)權(quán)利要求58的疫苗組合物，其中的佐劑是乳劑。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的疫苗組合物，其中的佐劑是弗氏佐劑或其衍生物。
68.根據(jù)權(quán)利要求66的疫苗組合物，其中的佐劑是Montanide ISA51。
全文摘要
本發(fā)明涉及血管通透因子(VPF)家族分子、受體與共同受體的寡核苷酸與肽序列及其變體在治療與脈管系統(tǒng)增加有關(guān)的病理組織的主動(dòng)免疫療法中的應(yīng)用。上述方法可以單獨(dú)或者與其它方法聯(lián)合用于治療腫瘤及其轉(zhuǎn)移、急性與慢性炎癥過程、傳染病、自身免疫病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變或者新生兒視網(wǎng)膜病變、器官移植排斥、黃斑變性、新生血管性青光眼、血管瘤和血管纖維瘤。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1646153SQ03808567
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月15日
發(fā)明者M·邦蓋羅梅羅, B·E·阿塞維多卡思特羅, J·V·加維永多考利, L·E·費(fèi)爾德斯莫利納, O·洛佩斯奧克古, R·D·L·C·席爾瓦羅德里格斯, A·穆薩基奧拉薩, E·加爾班羅德里格斯, D·M·瓦茲奎斯布羅姆奎斯特 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心