專利名稱：鑒定物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定能夠影響靶分子活性的物質(zhì)的細(xì)胞方法。
背景技術(shù)：
作用于細(xì)胞靶分子的新藥物的開發(fā)通常利用生化或細(xì)胞功能測定法進(jìn)行，這些測定法能研究許多假定的活性物質(zhì)是否可以影響待研究的靶分子。
細(xì)胞測定法通常以基于生長的測試體系為基礎(chǔ)發(fā)揮作用，在所述系統(tǒng)中待研究的靶分子的活性對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。此外，還已知如下測試體系，其中根據(jù)“報道基因產(chǎn)物”的活性或表達(dá)，可以檢測和定量靶分子的活性。雖然即使在高流通量篩選(HTS)中，所說的兩種類型測定法都能夠鑒定調(diào)控靶分子活性的新活性物質(zhì)，但這些已知測試體系仍存在缺點，即，它們通常相對低的信噪比(signal-to-background ratio)，這使得它們的特異性非常低，尤其當(dāng)它們以HTS格式應(yīng)用時。
鑒于所提及的現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的一個目的是提供能在HTS形式中進(jìn)行高效篩選的測試體系。

發(fā)明內(nèi)容
依照本發(fā)明，這個目的通過用于鑒定能夠影響靶分子活性的物質(zhì)的細(xì)胞方法達(dá)到，其中待分析的細(xì)胞攜帶至少一種報道基因且該靶分子的活性影響細(xì)胞增殖，該方法包括下列步驟a.使至少一種細(xì)胞接觸待測物質(zhì)；b.檢測細(xì)胞增殖，c.檢測報道基因產(chǎn)物的活性。
細(xì)胞增殖的檢測和報道基因活性的檢測不一定要以上述次序進(jìn)行。
報道基因可整合入細(xì)胞基因組或穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)入所說細(xì)胞。術(shù)語報道基因產(chǎn)物包括mRNA和蛋白質(zhì)。適宜的報道基因及其產(chǎn)物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的，且在此特別適宜的是諸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶之類的酶或諸如GFP、BFP、水母發(fā)光蛋白之類的熒光蛋白質(zhì)，等等。用于報道基因的適宜啟動子取決于具體測試體系的類型和靶目標(biāo)以及所用的細(xì)胞類型。報道基因優(yōu)選處于如下啟動子的控制下，所說的啟動子通過靶分子所直接或間接地偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。優(yōu)選產(chǎn)物是酶的報道基因，其中所說的酶的活性可通過外部添加的底物的轉(zhuǎn)化進(jìn)行檢測。
本發(fā)明范圍內(nèi)的靶分子可以直接或間接作用于所用細(xì)胞的增殖。就此而論，靶分子可以對本方法所用細(xì)胞的增殖施加影響(并因此，在活性狀態(tài)下，直接激活或抑制所說的細(xì)胞)。靶分子可以例如具有組成型活性并被待測物質(zhì)抑制，或者可以以非活性狀態(tài)存在并被待測物質(zhì)激活。不過，按照優(yōu)選的實施方案，靶分子僅以活性狀態(tài)通過干擾直接影響本方法所用細(xì)胞的增殖的分子來影響所述細(xì)胞的增殖(如，酵母細(xì)胞中的FUS1-HIS3，見下文)。原則上，所有類型的細(xì)胞外的、膜結(jié)合的或細(xì)胞內(nèi)的生物分子都適于作為靶分子，尤其優(yōu)選人的生物分子，特別是蛋白質(zhì)或核酸，其中特別是細(xì)胞分裂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)的成員，特別是GPCR、蛋白激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶，等。
待分析的物質(zhì)對靶分子的影響可以促進(jìn)或抑制后者的活性，例如通過與靶分子本身相互作用或通過影響能作用于靶分子的活性或表達(dá)的分子來實施促進(jìn)或抑制作用。
可以純粹定性或定量地檢測細(xì)胞增殖和報道基因產(chǎn)物的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種類型的檢測(例如通過測定細(xì)胞懸浮液中液體培養(yǎng)物的混濁度來直接或間接的測定細(xì)胞密度；報道基因產(chǎn)物活性的比色測定或發(fā)光測定(luminometric)，等等)。
按照優(yōu)選的實施方案，靶分子的活性對報道基因產(chǎn)物的活性(優(yōu)選其表達(dá))有影響。所說靶分子可以直接(靶分子本身影響報道基因產(chǎn)物的活性/表達(dá))或間接(靶分子通過激活細(xì)胞代謝或信號級聯(lián)反應(yīng)影響報道基因的活性或表達(dá))影響報道基因產(chǎn)物的活性或表達(dá)。
靶分子優(yōu)選異源分子(即非天然存在或表達(dá)于本發(fā)明方法所用細(xì)胞中的分子)，尤其優(yōu)選寡核苷酸、多核苷酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)、或蛋白質(zhì)片段。異源靶分子可以整合入細(xì)胞基因組中或者通過穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)入所說的細(xì)胞，靶分子的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，異源靶分子通過與嵌合分子的相互作用而作用于本方法所用細(xì)胞的增殖。在此特別優(yōu)選這樣的方法，其中異源靶分子是穩(wěn)定整合入非人細(xì)胞，尤其是酵母細(xì)胞的人分子，其通過能與異源分子相互作用并能參與酵母細(xì)胞固有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)或代謝級聯(lián)反應(yīng)的嵌合分子影響細(xì)胞的增殖。在此尤其優(yōu)選地，所說嵌合分子是氨基酸序列具有來自人的部分和來自酵母的部分的重組蛋白質(zhì)、多肽或蛋白質(zhì)片段。在本發(fā)明范圍內(nèi)特別適宜的是作為異源靶分子的人GPCR與嵌合G蛋白亞基(“移植體”，見下文)的組合，原則上任何以嵌合形式存在的亞基均是可以的。
在使用基于底物轉(zhuǎn)化來測定其活性的報道基因時，在添加待分析物質(zhì)后延遲加入底物是有利的。添加待分析物質(zhì)與添加底物之間的優(yōu)選時間間隔至少是本發(fā)明方法所用細(xì)胞完成一個細(xì)胞周期的時間，尤其優(yōu)選2-24個細(xì)胞周期的時間間隔。在使用酵母細(xì)胞時，時間間隔優(yōu)選為約4-48小時，優(yōu)選20-30小時，尤其是24小時。
報道基因的活性優(yōu)選通過破碎細(xì)胞來檢測，尤其優(yōu)選通過添加透化或破壞細(xì)胞壁的物質(zhì)(方便的是一種去污劑或兩種或多種去污劑的組合；在此特別適宜的是毛地黃皂苷、Triton X-100、Nonidet P-40、Tween 20、CHAPS或SDS)來進(jìn)行細(xì)胞破碎。尤其優(yōu)選濃度為10-600μg/ml，優(yōu)選20-400μg/ml，特別優(yōu)選40-60μg/ml的毛地黃皂苷，以及/或濃度為0.005％-0.4％體積，優(yōu)選0.01％-0.2％體積的Triton X-100，所說的每個濃度指的都是終濃度。優(yōu)選在緩沖溶液中將去污劑加到反應(yīng)混合物中，尤其適宜的緩沖條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的(生理緩沖液、中性pH、等滲鹽濃度，等等)。
各種各樣的細(xì)胞類型都可以用于本發(fā)明的方法中，因此，原則上，原核和真核細(xì)胞、植物或動物細(xì)胞都是適宜的。不過，優(yōu)選真核細(xì)胞，尤其優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞，特別是釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，使用多種細(xì)胞并同時通過一個處理或方法流程進(jìn)行篩選，其中所說細(xì)胞彼此至少由于靶分子的不同類型而不同(“復(fù)式方法”，multiplex method)。
按照一個特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及一種可以用于鑒定作為克隆的G蛋白偶聯(lián)受體之配體的物質(zhì)的廣泛可用的方法。本發(fā)明的方法靈敏而有效，因此可以在高流通量試驗中以復(fù)合形式同時測定多種GPCR。
本發(fā)明通過以下例證性的實施方案和附圖得到了進(jìn)一步的描述。
具體實施例方式
篩選影響G蛋白偶聯(lián)受體活性的物質(zhì)制藥業(yè)上最重要的一類靶分子是G蛋白偶聯(lián)受體。在過去，已有眾多此蛋白家族的代表性蛋白質(zhì)被逐步克隆并進(jìn)行了藥理學(xué)表征。因為目前已對整個人類基因組進(jìn)行了測序，所以最近已在序列水平上鑒定到大量GPCR。目前制藥業(yè)的一個主要目標(biāo)是通過篩選全面的物質(zhì)文庫鑒別這些受體的配體。遺憾的是，利用目前的方法和技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)存在著實質(zhì)性障礙，即在所說文庫中篩選此眾多的靶分子需要的時間和成本。EP 0 708922 B1討論了在細(xì)胞培養(yǎng)物中同時篩選多種GPCR的可能性。其中描述的哺乳動物細(xì)胞過量表達(dá)GPCR，并且在與激活受體的物質(zhì)接觸時有生長增加的反應(yīng)。因為不表達(dá)所說物質(zhì)所激活的受體的細(xì)胞仍然繼續(xù)生長(雖然相比較而言生長更慢)，所以該測試體系的靈敏度不是非常高。此外，因為保溫時間很長，此方法是耗時的，而因為是哺乳動物細(xì)胞體系，所以此方法又是昂貴的。
低成本篩選GPCR的一種可能方案是使用基于酵母的測試體系。因為時間也是制藥學(xué)研究中一個非常重要的因素，所以本發(fā)明的目的是設(shè)計一種可以同時篩選許多GPCR的酵母體系。為了可以用于高流通量篩選中，所說方法應(yīng)非常易于操作并具有非常大的測量窗口。
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)在許多生理學(xué)過程中起著重要的作用。它們是目前已知的最重要的蛋白質(zhì)家族之一且據(jù)推測人類基因組中約1000個基因編碼這種受體。GPCR具有特征性結(jié)構(gòu)它們是以α-螺旋形式7次環(huán)繞排列穿越細(xì)胞膜磷脂雙層的整合膜蛋白。據(jù)估計目前約50％的處方藥物與GPCR結(jié)合。這增強了此類受體對于制藥業(yè)的重要性。由于此蛋白質(zhì)家族的大小和重要性，而且鑒于許多GPCR(孤兒GPCR)的化學(xué)結(jié)合配偶體仍是未知的這一事實，可以認(rèn)為此類受體將是未來尋找新藥用物質(zhì)時用作適宜靶蛋白的最重要儲備之一。
所有的G蛋白偶聯(lián)受體都按照一個共同的基本原則發(fā)揮作用與細(xì)胞外配體的結(jié)合導(dǎo)致受體蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，從而使得受體蛋白可以與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)接觸。位于質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)的G蛋白介導(dǎo)了信號從胞外向細(xì)胞內(nèi)部的傳導(dǎo)。依賴受體的特異性，它們可激發(fā)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，所有這些均導(dǎo)致諸如cAMP、cGMP、Ca2+等第二信使或其它第二信使的形成，而這些第二信使通過激活或失活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)。異源三聚體G蛋白包含α、β和γ三個亞基。在G蛋白異源三聚體中GDP與Gα亞基結(jié)合。與配體活化的受體的相互作用導(dǎo)致GDP被GTP取代。由此產(chǎn)生的構(gòu)象改變導(dǎo)致G蛋白異源三聚體解離成一個α亞基和一個βγ復(fù)合體?；罨摩羴喕挺娄脧?fù)合體都會影響細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)蛋白。α亞基可劃分為四種不同的類型Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。
按信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中所涉及的G蛋白對GPCR進(jìn)行分類，即，Gs家族的GPCR通過Gαs的活化介導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶的刺激作用并因此提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度。Gi家族的GPCR通過Gαi的活化介導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用并因此降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度。Gq家族的GPCR通過Gαq的活化介導(dǎo)各種PLCβ同種型的刺激作用并導(dǎo)致膜結(jié)合磷脂酰肌醇4，5-二磷酸水解成二酰甘油和肌醇三磷酸(IP3)。IP3使Ca2+自胞內(nèi)貯庫釋放。Gα12與rho特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子相互作用。
信號維持到具有GTPase活性的Gα亞基水解結(jié)合的GTP為止。RGS(G蛋白信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)蛋白家族成員通過作為Gα亞基GTPase活性的活化劑來調(diào)控信號的持續(xù)時間。此G蛋白控制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)似乎對于所有真核體系都是共同的。
在這一信號體系中得到充分鑒定的一個例子是面包酵母(釀酒酵母)的“信息素應(yīng)答途徑”。MATa交配型的酵母細(xì)胞表達(dá)STE2基因編碼的受體。此受體通過α因子的結(jié)合被激活，α因子是另一交配型(MATα)酵母細(xì)胞所釋放的肽信息素。酵母的異源三聚體G蛋白由基因GPA1(Gα)、STE4(Gβ)和STE18(Gγ)的產(chǎn)物組成。Gβγ復(fù)合體在Ste2p受體活化后被釋放并將信號轉(zhuǎn)換成促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)。這引起細(xì)胞周期蛋白依賴型激酶抑制劑Far1p的活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期滯止，并引起對交配過程中所涉及的許多基因(如，F(xiàn)US1)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。此途徑通過RGS家族的一個成員-Sst2p脫敏。另一交配型(MATα)的酵母細(xì)胞表達(dá)不同的受體(Ste3p)并因此對MATa細(xì)胞釋放的另一信息素(a-因子)產(chǎn)生反應(yīng)。除此之外，兩種交配類型所用的信號傳導(dǎo)設(shè)備是相同的。
已數(shù)次證實了哺乳動物GPCR可以與酵母的G蛋白信號系統(tǒng)偶聯(lián)。一些受體，包括大鼠促生長素抑制素2受體(Price等，Mol Cell Biol 15，6188-6195(1995))和大鼠腺苷A2a受體(Price等，Molecular Pharmacology50，829-837(1996))可與酵母Gα蛋白質(zhì)Gpa1p直接相互作用，而其它受體，包括生長激素釋放激素受體(GHRHR)(Kajkowski等，J ReceptSignal Transduct Res 17，293-303(1997))則與Gpa1p不相容。不過，為了使這些受體能夠進(jìn)行偶聯(lián)，可以將酵母Gα亞基缺失，并改為表達(dá)異源受體和全長哺乳動物Gα亞基?；蛘?，可以利用雜合的Gα亞基，其中Gpa1p的C末端結(jié)構(gòu)域(約占肽序列的三分之一)已被哺乳動物Gα亞基的相應(yīng)區(qū)域所取代；兩種方法均參閱WO 95/21925。雜合的或其它修飾的或異源的Gα亞基都需要達(dá)到一些標(biāo)準(zhǔn)，以便能夠與酵母信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)偶聯(lián)。最重要的一條是，所說的亞基一方面能有效結(jié)合酵母Gβγ，以便能在缺乏活化的GPCR的情況下阻斷信號，而另一方面，其又能有效結(jié)合激動劑所活化的受體以便隨后能轉(zhuǎn)導(dǎo)該信號。文獻(xiàn)Conklin等，Nature 363，274-276(1993)首次描述了一種雜合體，其中Gαq的5個C末端氨基酸已被相應(yīng)的Gαi序列代替(Gαqi5)，從而使得正常的Gαi偶聯(lián)受體又可以與Gαq信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑偶聯(lián)。WO 99/14344和Brown等，Yeast 16，11-22(2000)證實，此同一方法在酵母內(nèi)也是可行的。這種情況下，Gpa1p的5個C末端氨基酸被人Gα蛋白的相應(yīng)氨基酸所取代。使用這些被稱為“移植體(transplant)”的雜合體，可以允許許多哺乳動物GPCR與酵母的交配途徑偶聯(lián)。
此處所用的酵母菌株在SST2、FAR1中，以及取決于細(xì)胞的交配類型，在STE2或STE3基因中有缺失。缺失SST2(RGS家族的一個成員)，目的在于防止信號的下調(diào)。FAR1的缺失可以使細(xì)胞即使在信號素應(yīng)答途徑被關(guān)閉的情況下仍能繼續(xù)生長。STE2或STE3的關(guān)閉，目的在于防止對異源三聚體G蛋白的不想要的競爭。在酵母基因組中GPA1基因被上述移植體取代。所說移植體在天然基因座位置于GPA1啟動子控制下表達(dá)，從而保證了異源三聚體G蛋白的化學(xué)計量能得以保持。
可以以抑制或刺激方式修飾生物有機體的至少一種GPCR依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用。當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑依賴型可檢測信號在某化合物存在的情況下比在該化合物缺失的情況下弱時，該化合物具有抑制作用。引起這樣作用的化合物也稱為拮抗劑。另一方面，當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑依賴型可檢測信號在化學(xué)化合物存在情況下比在該化合物缺乏的情況下強時，該化學(xué)化合物具有刺激物的作用。這樣的化合物也稱為激動劑。
已有報道將基因FUS1、FUS2(Cismowski等，Nat Biotechnol 17，878-883(1999)；Frederickson，Nat Biotechnol 17，852-853(1999))和YNL279w(WO 02/40660)的啟動子用于釀酒酵母中的功能性試驗。作為對交配因子刺激信息素應(yīng)答途徑的響應(yīng)，所說基因的表達(dá)增加。如果這些基因之一的啟動子元件與結(jié)構(gòu)基因發(fā)生功能性連接，所說結(jié)構(gòu)基因(也稱為報道基因)的表達(dá)就可通過所述的酵母信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)控。這樣的報道基因通常是內(nèi)源性生長標(biāo)記物，諸如HIS3或其它營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因(如，URA3、LEU2、ADE2、LYS1或TRP1)(它們在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到刺激的情況下將允許細(xì)胞在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)基中得以生長)，或者是賦予對特定物質(zhì)(如，CYH2或G418R)的抗性或敏感性的基因。不過，還可以使用編碼諸如β-半乳糖苷酶(LacZ)或“綠色熒光蛋白”(GFP)等胞內(nèi)酶或編碼諸如磷酸酶(PHO5)等分泌型酶的報道基因。如果所用的報道基因是CAN1，則使細(xì)胞生長于含刀豆氨酸的培養(yǎng)基中。當(dāng)存在異源表達(dá)的GPCR的活化劑(激動劑)時，CAN1基因?qū)⒈槐磉_(dá)，從而使細(xì)胞不再能生長于含刀豆氨酸的培養(yǎng)基中。添加抑制劑(拮抗劑)則導(dǎo)致培養(yǎng)物在此選擇性培養(yǎng)基中生長。
文獻(xiàn)中描述的酵母GPCR試驗通常只利用一種報道基因，主要是在FUS1啟動子控制下的HIS3或LacZ(FUS1-HIS3或FUS1-lacZ)(Price等，Mol Cell Biol 15，6188-6195(1995)；Price等，Molecular Pharmacology50，829-837(1996)；Campbell等，Bioorg.Med.Chem.Lett.9，2413-2418(1999)；Pausch，Trends Biotechnol 15，487-494(1997))。如果使用FUS1-HIS3，按照未含組氨酸的液體培養(yǎng)基中酵母培養(yǎng)物的濁度測量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化。本發(fā)明人的實驗證實了液體培養(yǎng)物中單一生長讀出信息給出了約30-50∶1的信噪比(見

圖1a和3)。以氯酚紅β-D-半乳吡喃糖苷(CPRG)作為酶底物進(jìn)行的β-半乳糖苷酶液體試驗顯示，在刺激后，信號相對于背景增加約2-3倍(也參見圖1b)。為了進(jìn)一步增大測量窗口，將兩種報道基因同時用于酵母細(xì)胞中，因為這應(yīng)是兩個測量信號的乘積。圖1c說明了此原理。這種雙報道基因測定法產(chǎn)生的信噪比因此提高到了約100-150∶1。文獻(xiàn)Brown等，Yeast 16，11-22(2000)描述了類似的試驗。FUS1-HIS3和FUS1-lacZ在此也被同時應(yīng)用于以CPRG為底物的β-半乳糖苷酶液體試驗中。在該文獻(xiàn)中在用配體刺激受體的整個期間中均添加有CPRG。相反，在本發(fā)明方法中只在用配體刺激受體后才將CPRG與去污劑在緩沖液中一起添加，從而使β-半乳糖苷酶測量有了明顯的改進(jìn)。另一方面，如果CPRG存在于配體誘導(dǎo)的生長期間，則生長容易被抑制，且再一方面，CPRG通過質(zhì)膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部是困難的。如果只是在生長完成后才將CPRG與能破壞質(zhì)膜的去污劑一起加入，則可以避免上述兩個問題。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法利用了雙報道基因試驗，一個報道基因是生長標(biāo)記，而另一報道基因是酶或GFP。只有可測量的酶或熒光蛋白的或多或或少的線性誘導(dǎo)表達(dá)與生長(對數(shù)事件)的這種組合，才導(dǎo)致所述的信號擴(kuò)大，即，大的測量窗口。EP 0 708 922 B1(AcadiaPharmaceuticals)也描述了一種以應(yīng)答受體刺激出現(xiàn)的生長為基礎(chǔ)的方法。在這種情況下，受配體刺激的表達(dá)受體的細(xì)胞只是比未受刺激的細(xì)胞生長快(參閱EP 0 708 922 B1中的圖2和圖10)。而在本文所述的發(fā)明中，這樣的未受刺激的酵母細(xì)胞根本不生長(參見列舉的實施例(如，圖3B，左圖))。EP 0 708 922 B1也將異源表達(dá)的β-半乳糖苷酶的活性用作可檢測信號。不過，此處LacZ被組成型表達(dá)，即，所測量的酶活性只是作為應(yīng)答配體對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的刺激作用而生長的細(xì)胞數(shù)目的一個量度，而不度量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的刺激強度。相反，在本文所述的本發(fā)明中LacZ表達(dá)是在信息素應(yīng)答途徑所誘導(dǎo)的啟動子(如，F(xiàn)US1或YNL279w)的控制下進(jìn)行的。圖3A說明，即使使用相同數(shù)目的酵母細(xì)胞(左邊的曲線圖)，β-半乳糖苷酶的可檢測活性也取決于所加入配體的量，即，取決于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑刺激作用的強度(右邊的曲線圖)。
按照EP 0 708 922 B1(參閱第10頁)，細(xì)胞的“擴(kuò)增”指“受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長，特別是與未被受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長相比而言”，即，經(jīng)受體轉(zhuǎn)染的和未經(jīng)受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都能生長，只是在用配體刺激后被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長得更快。關(guān)于此，第33頁和第44頁的圖有說明。在此細(xì)胞系中，根本不存在其表達(dá)可以造成細(xì)胞生長的報道基因構(gòu)建體。使細(xì)胞有可能生長的唯一修飾是受配體刺激的過表達(dá)受體。
然而本發(fā)明中，按照優(yōu)選的實施方案，進(jìn)行雙重選擇營養(yǎng)培養(yǎng)基缺乏此處所用酵母菌株生長所必需的物質(zhì)-尿嘧啶和組氨酸。因為我們利用URA3基因作為受體質(zhì)粒上的選擇性標(biāo)記，不含有受體質(zhì)粒的細(xì)胞根本就不生長。
被受體DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞原則上也不能在所說的營養(yǎng)型培養(yǎng)基上生長，除非它們受存在的配體刺激。只有當(dāng)配體結(jié)合時，報道基因HIS3才表達(dá)且細(xì)胞才能夠在所說的營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長。
原則上，已被受體轉(zhuǎn)染但未攜帶任何諸如HIS3等生長標(biāo)記作為報道基因的酵母菌株將不存在生長應(yīng)答。
所說的方法可以以單一受體形式和多重受體形式(復(fù)式)應(yīng)用。此測定法的有利之處在多重受體形式中尤為顯著。圖1C意圖說明這一點。理論上說，表達(dá)特定受體的單酵母細(xì)胞，當(dāng)用適當(dāng)?shù)呐潴w(化學(xué)化合物或天然配體)接觸時，作為對刺激作用的響應(yīng)，應(yīng)足以從其它未響應(yīng)的酵母細(xì)胞背景中“突顯”出來。這就為高流通量篩選帶來了優(yōu)勢，因為這種方法可以同時篩選數(shù)種GPCR。尤其是對于在開始時在制藥業(yè)中的重要性尚不清楚的孤兒GPCR而言，本文所述的方法可以使公司所投入的時間和金錢都縮減到最少。因為GPCR偶聯(lián)的Gα亞基也是未知的，所以本方法還提供了同時在數(shù)個移植體株系中測試一種或多種孤兒GPCR的可能性。
附圖簡述圖1描述了多重受體形式的雙報道基因試驗的原理圖1a描述了激動劑誘導(dǎo)的生長讀出信息。圖1b是激動劑誘導(dǎo)的β-半乳糖苷酶介導(dǎo)的顏色讀出信息。最后，圖1c描述了激動劑誘導(dǎo)的生長和顏色雙重讀出信息。
圖2A-D描述了用于構(gòu)建以YNL279w啟動子為基礎(chǔ)的株系的質(zhì)粒。
圖3說明了與只利用一種報道基因相比，雙報道基因試驗如何提高了酵母液體試驗的性能。
圖4以所用Gα移植體的函數(shù)形式顯示了人緩激肽B2受體與酵母信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的結(jié)合?？蛰d體p426GPD總是用作對照。
圖5說明雙報道基因試驗還可用于篩選拮抗劑。此處顯示的例子是人緩激肽B2受體和空載體對照。
圖6A和B指出，即使在與酶底物保溫29小時后，使用YNL279w啟動子產(chǎn)生的背景信號也明顯低于用FUS1啟動子所產(chǎn)生的背景信號。
圖7解釋了如何以多重受體形式進(jìn)行試驗。圖7A說明了在每種情況下各種GPCR分別表達(dá)于獨立的酵母菌株中，而非它們一起表達(dá)于一個菌株中。圖7B展示了在微量滴定板中多重受體形式與單一受體形式相比的試驗性能。
圖8指出如果僅僅在與配體保溫后才將酶底物CPRG與去污劑一起加入，則可以提高試驗的性能。
實施例實施例1材料和方法質(zhì)粒和酵母遺傳學(xué)按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行所有的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)操作(Ausubel等，分子生物學(xué)通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley&Sons，紐約；Guthrie und Fink，酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南(Guide to YeastGenetics and Molecular Biology)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego)。
受體的表達(dá)構(gòu)建體所有的表達(dá)構(gòu)建體都以附加型2μ酵母-大腸桿菌穿梭載體p426GPD(Mumberg等，Gene 156，119-122(1995))為基礎(chǔ)。為了在酵母細(xì)胞中獲得高的組成型表達(dá)，將編碼人G蛋白偶聯(lián)受體的cDNA序列克隆入此載體的GPD啟動子和CYC終止子之間。以下人GPCR被克隆入此載體中EDG1受體(Genbank NM_001400)、EDG5受體(Genbank NM_004230)、緩激肽B2受體(Genbank NM_000623)、M1毒蠅堿性受體(GenbankNM_000738)、促生長素抑制素SSTR2受體(Genbank NM_001050)、M3毒蠅堿性受體(Genbank NM_000740)。
酵母菌株
所有酵母菌株都以ATCC 208352的釀酒酵母野生型菌株W303-1a為基礎(chǔ)。
基因型MATa，ade2-1，ura3-1，his3-11，trp1-1，leu2-3，leu2-112，can1-100。
使用了兩套不同的酵母菌株。一套來源于YLJ21并利用FUS1基因的啟動子表達(dá)報道基因，而另一套來源于YSG13并利用了YNL279w基因的啟動子。
酵母菌株YLJ21由Ekkehard Leberer提供。
基因型MATa，ste2::KanR sst2::ura3FOAfar1::hisG FUS1::HIS3mfa2::FUS1-lacZ::ura3FOAade2-1，ura3-1，his3-11，trp1-1，leu2-3，leu2-112，can1-100。
通過已分別整合于HIS3基因座和MFA2基因座的兩種報道基因FUS::HIS3和FUS1-lacZ的幫助可檢測信息素應(yīng)答途徑的活化。FAR1基因已被hisG重復(fù)片段取代，從而使細(xì)胞即使在信息素應(yīng)答途徑已被激活的情況下仍能繼續(xù)生長。為了防止由于Sst2p的GTPase功能造成的G蛋白信號的下調(diào)，用URA3基因取代了SST2基因。在所有情況下，通過在含5-氟乳清酸的培養(yǎng)基上選擇，再次回收ura3標(biāo)記物。編碼α因子受體的基因STE2已被KanR基因取代。
酵母菌株YSG13制備如下基因型MATa，ste2::KanR sst2::pYNL279w-HIS3 far1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2 ade2-1，ura3-1，his3-11，trp1-1，leu2-3，leu2-112，can1-100。
菌株構(gòu)建ste2::KanR為了用卡那霉素抗性基因取代酵母STE2基因，用BamHI和EcoRI切割質(zhì)粒pLJ51并轉(zhuǎn)化入野生型酵母菌株W303-1a。在YPD+G418培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。
sst2::pYNL279w-HIS3在另一步驟中，用允許HIS3基因在YNL279w啟動子控制下表達(dá)的盒子取代酵母SST2基因。為此目的，用BamHI和NotI切割質(zhì)粒sst2::279LHIS3/pCR-BluntII并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在SC/Gluc-His+α因子培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。
far1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2然后用允許與β-半乳糖苷酶融合的Fus1p的136個N末端氨基酸在YNL279w啟動子控制下表達(dá)的盒子取代FAR1基因。為此目的，用SacII和XhoI切割質(zhì)粒pBSfar1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2 w/o并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在SC/Gluc-Ade培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。
總是用PCR方法檢查所有片段在基因組中的正確整合。
將移植體引入YLJ21和YSG13從菌株YLJ21和YSG13開始，酵母基因組中酵母G蛋白α-亞基Gpa1的最后5個氨基酸最終被人G蛋白α亞基的最后5個氨基酸取代。為此目的，例如為了構(gòu)建酵母菌株YEW3，用SacI切割GPA1-C5-Galpha q整合型質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入酵母菌株YLJ21。在SC/Gluc-Trp培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。其它的移植體以相同的方式整合。表1列出了各種移植體和來源于此的酵母菌株。
表1G蛋白移植體

雙報道基因試驗將克隆入載體p426GPD的人GPCR轉(zhuǎn)化入適當(dāng)?shù)慕湍妇瓴⒃跓o尿嘧啶且以2％葡萄糖為碳源的SC選擇性平板(SC/Gluc-Ura)上30℃保溫3天。然后用由此獲得的單細(xì)胞集落接種2ml SC/Gluc-Ura，過夜培養(yǎng)。第二天，將細(xì)胞1∶100稀釋于pH6.8的SC/Gluc-Ura-His中。在酵母菌株用FUS1啟動子進(jìn)行報道基因表達(dá)的情況下，將2-10mM 3-氨基三唑(3-AT，Sigma)另外添加入所說培養(yǎng)基中。在所有情況下，將90μl稀釋的細(xì)胞懸浮液吸入96孔微量滴定板的孔中，孔中已有10μl待研究的配體。將平板在30℃振蕩或不振蕩保溫5-24小時。隨后在各孔中加入50μl的檢測混合液。檢測混合液的組成為150μg/ml毛地黃毒苷(Sigma)、300μg/ml氯酚紅β-D-吡喃型半乳糖苷(CPRG，Roche)、pH6.7的300mM磷酸鈉緩沖液。30℃振蕩或不振蕩保溫2小時后，在分光光度計(Spectramax Plus，Molecular Devices)中通過測定574nm處的吸收值檢測β-半乳糖苷酶活性。分析數(shù)據(jù)并用Graphpad Prism3.0計算機軟件繪制劑量應(yīng)答曲線。所有測量值都是三份平行試樣測定值的平均。
實施例2單獨利用一種報道基因和同時使用兩種報道基因之間的比較用空載體p426GPD或已克隆入p426GPD的人GPCR EDG1和EDG5轉(zhuǎn)化酵母菌株YLJ21。然后將轉(zhuǎn)化后的酵母在2ml SC/Gluc-Ura中30℃培養(yǎng)過夜。第二天，將細(xì)胞1∶100稀釋于pH6.8且不含有(圖3A)或含有2mM 3-AT(圖3B)的SC/Gluc-Ura-His中。在所有情況下，將90μl稀釋的細(xì)胞懸浮液吸入96孔微量滴定板的孔中，孔中已含有10μl鞘氨醇1-磷酸(Biomol)的系列稀釋液或作為對照的純水。將平板在30℃振蕩(700rpm)保溫23小時。在光度計中于630nm波長處測定由酵母細(xì)胞生長所導(dǎo)致的濁度(圖3A和B，均為左邊的圖)。隨后在各孔中加入50μl的檢測混合液。30℃振蕩保溫2小時后，在光度計中通過測定574nm處的吸收值檢測β-半乳糖苷酶的活性。
圖3A左邊的圖表明，當(dāng)利用FUS1-HIS作為報道構(gòu)建體時，不添加3-AT就無可見的劑量應(yīng)答曲線。即使在不刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的情況下，F(xiàn)US1啟動子在無組氨酸的培養(yǎng)基上也產(chǎn)生了相當(dāng)高的背景信號，即，該啟動子不受嚴(yán)格調(diào)控。相反，如果加入2mM作為His3p的競爭性抑制劑的3-AT，背景信號則被抑制，且當(dāng)EDG1或EDG5表達(dá)時(圖3B，左邊的圖)所檢測信號的水平取決于培養(yǎng)基中鞘氨醇1-磷酸的量(Ancellin等，J BiolChem 274，18997-19002(1999))。圖3A中右邊的曲線圖顯示LacZ報道基因也導(dǎo)致可接受的劑量應(yīng)答曲線，但測量窗口非常小。按圖3B中右邊的曲線圖指出的，同時使用HIS3和LacZ使信噪比提高數(shù)倍?？傊?，本實驗顯示了人GPCR EDG1和EDG5可通過酵母內(nèi)源Gα亞基Gpa1p與信息素應(yīng)答途徑偶聯(lián)。
實施例3其中人緩激肽B2受體通過Gα移植體與酵母信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑結(jié)合的雙報道基因試驗用空載體p426GPD或克隆入p426GPD的人緩激肽B2受體轉(zhuǎn)化酵母菌株YLJ21(Gpa1)、YEW1(Gpa1/Gαs)、YEW2(Gpa1/Gα16)和YEW3(Gpa1/Gαq)。在如上所述標(biāo)準(zhǔn)條件下于存在2mM 3-AT時進(jìn)行此試驗。所用的配體是天然激動劑緩激肽(Sigma)；保溫20小時。圖4說明，如果只有Gpa1p可用，緩激肽B2受體幾乎根本不能與信息素應(yīng)答途徑結(jié)合。相反，當(dāng)酵母表達(dá)Gα移植體Gpa1/Gα16或Gpa1/Gαq時，受體與所說信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成功結(jié)合。Gpa1/Gαq使偶聯(lián)最有效，這是預(yù)期中的，因為人緩激肽B2受體在其天然細(xì)胞環(huán)境中就與Gαq偶聯(lián)(Hall，Pharmacol.Ther.56，131-190(1992))。
實施例4將雙報道基因測定法用于拮抗劑的檢測用空載體p426GPD或克隆入p426GPD的人緩激肽B2受體轉(zhuǎn)化酵母菌株YEW3(Gpa1/Gαq)。測定以與實施例2相似的方式進(jìn)行。唯一的區(qū)別是在含1nM緩激肽激動劑的測試平板各孔中加入了拮抗劑HOE140的稀釋液(Sigma；Hall，Gen.Pharmacol.28，1-6(1997))。圖5顯示增加HOE140的量可以將緩激肽引起的信號抑制到背景水平。因此雙報道基因測定法也適于拮抗劑檢測。
實施例5FUS1啟動子和YNL279w啟動子之間的比較用空載體p426GPD或克隆入p426GPD的人緩激肽B2受體轉(zhuǎn)化酵母菌株YEW3(Gpa1/Gαq，F(xiàn)US啟動子)和YEW17(Gpa1/Gαq，YNL279w啟動子)。在如上所述標(biāo)準(zhǔn)條件下，對于YEW3的情形而言，在存在2mM3-AT時進(jìn)行測定，對于YEW17的情形而言，在不存在3-AT時進(jìn)行測定。在加入檢測混合物后，于2小時后及29小時后測定β-半乳糖苷酶的活性。
如圖6A所顯示的，以及更明顯地如圖6B所顯示的，在使用FUS1啟動子的情況中，即使培養(yǎng)基中存在3-AT，受體轉(zhuǎn)化的菌株的背景信號或用空對照載體轉(zhuǎn)化的菌株的背景信號也隨著時間顯著增加。而在使用YNL279w啟動子的情況中，背景信號基本上不隨時間改變。3-AT的添加不是必需的。由此可以推斷，YNL279w受到了非常嚴(yán)格的調(diào)控。這在高流通量測定中被證實特別有利，因為該測量不需要準(zhǔn)確的定時，從而有可能更靈活的進(jìn)行操作。
實施例6以多重受體形式(復(fù)式)進(jìn)行試驗用人M1毒蠅堿性受體轉(zhuǎn)化YEW3(Gpa1/Gαq)，用促生長素抑制素受體2和EDG5轉(zhuǎn)化YLJ21(Gpa1)。受體均已被克隆入p426GPD。按上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行操作。受體一個一個地單獨測試或混合測試?；旌蠝y試和單獨測試使用相同的過夜培養(yǎng)物。它們只以1∶100稀釋于pH6.8的SC/Gluc-Ura-His中的形式混合，即，混合物因此總地含有單獨測試時3倍的細(xì)胞數(shù)。圖7A意圖說明，所有這些受體都已被一個一個單獨表達(dá)，即，不是在一個細(xì)胞中一起表達(dá)。與配體氨甲酰膽堿(Sigma；稀釋成10-8M至10-2M)、促生長素抑制素-14(Bachem；10-10M至10-4M)和鞘氨醇1-磷酸(Biomol，10-10M至10-4M)一起保溫24小時。如圖7B所說明的，也可在混合物中檢測到激動劑。
實施例7β-半乳糖苷酶的兩種檢測方法的比較按照慣例，以如下方式進(jìn)行酵母CPRG試驗，即，在受體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞與配體接觸的整個期間內(nèi)CPRG都存在于培養(yǎng)基中(Brown等，Yeast16，11-22(2000)和WO 99/14344)。圖8描述了此方法和本發(fā)明所述方法之間的比較。
用克隆入p426GPD的人M1和M3毒蠅堿性受體轉(zhuǎn)化YEW3(Gpa1/Gαq)。如上所述進(jìn)行過夜培養(yǎng)，然后在兩種不同培養(yǎng)基中1∶100稀釋至OD600為0.02。在一種情況下(圖8A)，細(xì)胞被稀釋于SC/Gluc-Ura-His、2mM 3-AT、0.1mg/ml CPRG、pH7的0.1M磷酸鈉緩沖液。在另一情況中，在2mM 3-AT存在的情況下如上所述進(jìn)行測定(圖8B)。用于毒蠅堿性受體的配體是氨甲酰膽堿。對于圖8A的數(shù)據(jù)，試驗進(jìn)行了28小時，然后在光度計上分析測試平板。對于圖8B，保溫26小時，然后加入檢測混合物。2小時后進(jìn)行測定。如圖8所說明的，只在與配體一起保溫之后加入CPRG和去污劑(在此案例中是毛地黃皂苷)才顯著提高了該試驗的性能。此處所述方法的另一優(yōu)勢是，可以排除CPRG在與化學(xué)化合物長期保溫期間，尤其是篩選期間可能有的相互作用。
權(quán)利要求
1.用于鑒定能夠影響靶分子活性的物質(zhì)的細(xì)胞方法，其中待分析的細(xì)胞攜帶至少一種報道基因且該靶分子的活性影響細(xì)胞增殖，該方法包括下列步驟a)使至少一種細(xì)胞接觸待測物質(zhì)；b)檢測細(xì)胞增殖；c)檢測報道基因產(chǎn)物的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中靶分子的活性影響報道基因產(chǎn)物的活性，優(yōu)選表達(dá)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中靶分子是異源分子，優(yōu)選異源寡核苷酸、多核苷酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
4.權(quán)利要求1的方法，其中報道基因產(chǎn)物是其活性可以根據(jù)底物轉(zhuǎn)化來檢測的酶。
5.權(quán)利要求4的方法，其中在添加待分析物質(zhì)后延遲添加底物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中添加待分析物質(zhì)與添加底物之間的時間間隔相應(yīng)于所用細(xì)胞完成至少一個細(xì)胞周期、優(yōu)選2-24個細(xì)胞周期的時間。
7.權(quán)利要求1的方法，其中報道基因產(chǎn)物的活性是通過破壞細(xì)胞，優(yōu)選通過與底物一起添加透化或破壞細(xì)胞壁的物質(zhì)來檢測的。
8.前述權(quán)利要求任一的方法，其中靶分子自身對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。
9.前述權(quán)利要求任一的方法，其中靶分子通過干擾直接影響細(xì)胞增殖的分子來發(fā)揮對細(xì)胞增殖的影響。
10.權(quán)利要求9的方法，其中靶分子通過與嵌合分子的相互作用來發(fā)揮其對細(xì)胞增殖的作用。
11.前述權(quán)利要求之任一的方法，其中細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選來自釀酒酵母菌株的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求2-11任一項的方法，其中在一個處理中同時篩選具有不同靶分子的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定能夠影響靶分子活性的物質(zhì)的細(xì)胞方法，其中，待分析的細(xì)胞攜帶至少一種報道基因且所述靶分子的活性影響細(xì)胞增殖。所述方法包括使至少一種細(xì)胞接觸待測物質(zhì)，檢測細(xì)胞增殖，并檢測報道基因產(chǎn)物的活性。
文檔編號A61K38/00GK1672046SQ03817493
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日
發(fā)明者S·格雷策, M·德霍佩, B·馬伊 申請人:安萬特醫(yī)藥德國有限公司