專利名稱：Has化的多肽,特別是has化的促紅細(xì)胞生成素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與羥烷基淀粉(HAS)特別是與羥乙基淀粉偶聯(lián)的多肽，特別是促紅細(xì)胞生成素。
為了獲得一種特定的生理效果而對(duì)循環(huán)系統(tǒng)應(yīng)用多肽特別是酶或細(xì)胞因子，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中一種眾所周知的方法。
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是紅系祖細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞所必需的一種糖蛋白激素。成人在腎臟中產(chǎn)生EPO。EPO是調(diào)節(jié)循環(huán)中紅細(xì)胞水平所必需的。以低組織氧水平為標(biāo)志的疾病引起EPO生物合成增加，隨后刺激紅細(xì)胞生成。例如，在慢性腎衰竭中，腎功能的喪失一般導(dǎo)致EPO的生物合成減少，伴有紅細(xì)胞減少。
促紅細(xì)胞生成素是一種分子量約為34,000Da的酸性糖蛋白激素。人促紅細(xì)胞生成素是一種166個(gè)氨基酸的多肽，其作為一種單體天然存在(Lin等人，1985，PNAS 82，7580-7584，EP 148 605 B2，EP411 678 B2)。例如，美國(guó)專利4,703,008描述了對(duì)編碼促紅細(xì)胞生成素的基因的鑒定、克隆和表達(dá)。例如，美國(guó)專利4,667,016描述了從支持含有重組促紅細(xì)胞生成素質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中純化重組促紅細(xì)胞生成素。
在本技術(shù)領(lǐng)域中公認(rèn)，EPO的體內(nèi)生物活性主要取決于唾液酸與EPO結(jié)合的程度(參見，例如，EP 428 267 B1)。理論上，14個(gè)唾液酸分子能夠與一個(gè)EPO分子在與N-和O-糖基化位點(diǎn)連接的碳水化合物側(cè)鏈末端結(jié)合。獲得高度唾液酸化的EPO制品需要非常復(fù)雜的純化步驟。
關(guān)于促紅細(xì)胞生成素的更詳細(xì)的信息，見Krantz，Erythropoietin，1991，Blood，77(3)419-34(Review)，和Cerami，Beyond erythropoiesisnovel applications forrecombinant human erythropoietin，，2001，Semin Hematol.，(3Supp17)33-9(Review)。
多肽和酶應(yīng)用的一個(gè)眾所周知的問題是這些蛋白質(zhì)通常不能顯示令人滿意的穩(wěn)定性。具體而言，促紅細(xì)胞生成素的血漿半衰期相對(duì)較短(Spivak和Hogans，1989，Blood 73，90；McMahon等人，1990，Blood 76，1718)。這意味著治療性血漿水平快速降低，必須進(jìn)行重復(fù)靜脈內(nèi)施用。此外，在某些情況下，還觀察到針對(duì)這些肽的免疫應(yīng)答。
通常認(rèn)為，當(dāng)多肽與聚合分子偶聯(lián)時(shí)，多肽的穩(wěn)定性能夠提高且針對(duì)這些多肽的免疫應(yīng)答降低。WO 94/28024公開了用聚乙二醇(PEG)修飾的生理活性多肽顯示免疫原性和抗原性降低，在血流中的循環(huán)遠(yuǎn)長(zhǎng)于未偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，即清除所需時(shí)間更長(zhǎng)。
然而，PEG-藥物偶聯(lián)物也有幾個(gè)缺點(diǎn)，例如，它們不具有能夠被體內(nèi)降解途徑組件識(shí)別的天然結(jié)構(gòu)。因此，除了PEG-偶聯(lián)物之外，還制備了其它偶聯(lián)物和蛋白質(zhì)聚合物。交聯(lián)不同蛋白質(zhì)和大分子(如聚合酶)的多種方法在文獻(xiàn)中已有描述(參見，例如，Wong，《蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)的化學(xué)》(Chemistry of protein conjugation andcross-linking)，1993，CRCS，Inc.)。
羥乙基淀粉(HES)是天然存在的支鏈淀粉衍生物，可被體內(nèi)α-淀粉酶降解。本領(lǐng)域已經(jīng)了解HES-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備(參見，例如，DE 26 16 086或DE 26 46 854中的HES-血紅蛋白偶聯(lián)物)。
DE 26 46 854公開了血紅蛋白與HES的偶聯(lián)方法。在這些方法中，HES與高碘酸鈉反應(yīng)，產(chǎn)生與血紅蛋白連接的二醛。與此不同，DE 2616 086公開的血紅蛋白與HES的偶聯(lián)方法中，交聯(lián)劑(例如bromocyane)首先與HES結(jié)合，隨后血紅蛋白與中間產(chǎn)物連接。
HES是碳水化合物聚合物支鏈淀粉的取代衍生物，在玉米淀粉中以濃度高達(dá)95％重量存在。HES顯示有利的生物學(xué)性質(zhì)，可以用作血容量替代劑，在臨床血液稀釋治療中使用(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。
支鏈淀粉由葡萄糖部分(moiety)組成，其中主鏈中存在α-1，4-糖苷鍵，在分支位點(diǎn)處有α-1，6-糖苷鍵。該分子的物理化學(xué)性質(zhì)主要取決于糖苷鍵的類型。由于α-1，4-糖苷鍵具有切口，產(chǎn)生每圈大約有6個(gè)葡萄糖單體的螺旋結(jié)構(gòu)。
該聚合物的物理化學(xué)以及生物化學(xué)性質(zhì)能夠通過取代改變。通過堿羥乙基化作用可以引入羥乙基。通過改變反應(yīng)條件，能夠研究未取代葡萄糖單體中各羥基對(duì)羥乙基化的不同反應(yīng)性。由于這一事實(shí)，技術(shù)人員能夠有限程度地影響取代模式。
因此，HES的特征主要在于分子量分布和取代程度。有兩種方式可以描述取代程度1.以取代葡萄糖單體相對(duì)于所有葡萄糖部分的比例描述取代程度(DS)。
2.以描述每葡萄糖部分的羥乙基數(shù)的“摩爾取代”(MS)來描述取代程度。
HES溶液作以多分散組合物存在，每個(gè)分子在聚合程度、分支位點(diǎn)數(shù)量和型式以及取代型式等方面彼此不同。因此HES是不同分子量化合物的混合物。因此，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，根據(jù)平均分子量確定具體的HES溶液。在本文中，Mn被計(jì)算為取決于分子數(shù)的算術(shù)平均值。此外，重量平均值Mw代表取決于HES質(zhì)量的單位。
本領(lǐng)域中公開的HES-藥物偶聯(lián)物具有HES不能與藥物位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的缺點(diǎn)。因此，這種偶聯(lián)產(chǎn)生含有多種成分的非常不均一的產(chǎn)物，由于在偶聯(lián)步驟中三維結(jié)構(gòu)被破壞，這些成分可能沒有活性。
總之，仍然需要穩(wěn)定性和/或生物活性提高的進(jìn)一步改進(jìn)的多肽。對(duì)于促紅細(xì)胞生成素尤其如此，必須將具有含高度唾液酸因此具有高活性的同種型從唾液酸含量低的同種型中純化(見EP 428 267 B1)。因此，如果可以采用能夠產(chǎn)生高活性多肽而不需要復(fù)雜純化的生產(chǎn)方法，將是非常有利的。遺憾的是，在細(xì)菌或昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)多肽通常較困難，因?yàn)橥ǔ．a(chǎn)生的多肽不具有正確折疊和天然構(gòu)象，并且缺乏適當(dāng)?shù)奶腔?br> 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供體內(nèi)生物活性高、能夠以低成本容易生產(chǎn)的多肽衍生物，特別是促紅細(xì)胞生成素衍生物。此外，本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)多肽衍生物的方法，其易于進(jìn)行，并且產(chǎn)生高生物活性的產(chǎn)物。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供含有高生物活性的多肽衍生物的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，該問題用含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-促紅細(xì)胞生成素(EPO)-偶聯(lián)物(HAS-EPO)來解決，其中每個(gè)HAS與EPO通過a)碳水化合物部分；或b)硫醚偶聯(lián)。
本發(fā)明的HAS-EPO具有以下優(yōu)點(diǎn)與偶聯(lián)前的促紅細(xì)胞生成素相比，生物穩(wěn)定性提高。此外，它也顯示比標(biāo)準(zhǔn)BRP EPO更高的生物活性。這主要是基于以下事實(shí)HAS-EPO很少甚至不被肝臟和腎臟的清除系統(tǒng)識(shí)別，因此在循環(huán)系統(tǒng)中長(zhǎng)時(shí)間存在。此外，由于HAS以位點(diǎn)特異性的方式連接，因此EPO體內(nèi)生物活性因HAS與EPO偶聯(lián)而被破壞的危險(xiǎn)被最小化。
本發(fā)明的HAS-EPO主要含有兩種成分，即促紅細(xì)胞生成素(EPO)多肽和與之連接的羥烷基淀粉(HAS)。
EPO可以是任何人來源的(參見，例如，Inoue，Wada，Takeuchi，1994，An improved method for the purification of humanerythropoietin with high in vivo activity from the urine ofanemic patients，Biol Pharm Bull.17(2)，180-4；Miyake，Kung，Goldwasser，1977，Purification of human erythropoietin，J BiolChem.，252(15)，5558-64)或者另外一種哺乳動(dòng)物來源的，可以從天然存在的來源(如人腎臟、人胚胎肝臟，或動(dòng)物優(yōu)選猴腎)中通過純化獲得。此外，表述“促紅細(xì)胞生成素”或“EPO”也包括具有紅細(xì)胞生成活性的EPO變體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如1-25個(gè)，優(yōu)選1-10個(gè)，更優(yōu)選1-5個(gè)，最優(yōu)選1個(gè)或2個(gè))已經(jīng)被置換為另外的氨基酸(參見，例如EP 640 619 B1)。紅細(xì)胞生成活性的測(cè)量在本領(lǐng)域中有描述(關(guān)于體外活性的測(cè)量參見例如Fibi等人，1991，Blood，77，1203 ff；Kitamura等人，1989，J.Cell Phys.，140，323-334；關(guān)于EPO體內(nèi)活性的測(cè)量參見Ph.Eur.2001，911-917；Ph.Eur.2000，1316Erythropoietini solutio concentrata，780-785；歐洲藥典(1996/2000)；歐洲藥典，1996，Erythropoietin concentratedsolution，Pharmaeuropa.，8，371-377；Fibi，Hermentin，Pauly，Lauffer，Zettlmeissl.，1995，N-and O-glycosylation muteins ofrecombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells，Blood，85(5)，1229-36；(在第1、2、3天向雌性NMRI小鼠注射EPO和修飾的EPO型(等量蛋白質(zhì)50ng/小鼠)，在第4天采集血樣，測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞))。測(cè)量EPO活性試驗(yàn)的其它出版物包括Barbone，Aparicio，Anderson，Natarajan，Ritchie，1994，Reticulocytesmeasurements as a bioassay for erythropoeitin，J.Pharm.Biomed.Anal.，12(4)，515-22；Bowen，Culligan，Beguin，Kendall，Vlllis，1994，Estimation of effective and total erythropoiesis inmyelodysplasia using serum transferring receptor anderythropoietin concentrations，with automated reticulocyteparameters，Leukemi，8(1)，151-5；Delorme，Lorenzini，Giffin，Martin，Jacobsen，Boone，Elliott，1992，Role of glycosylationon the secretion and biological activity of erythropoietin，Biochemistry，31(41)，9871-6；Higuchi，Oh-eda，Kuboniwa，Tomonoh，Shimonaka，Ochi，1992；Role of sugar chains in theexpression of the biological activity of human erythropoietin，J.Biol.Chem.，267(11)，7703-9；Yamaguchi，Akai，Kawanishi，Ueda，Masuda，Sasaki，1991，Effects of site-directed removalof N-glycosylation sites in human erythropoietin on itsproduction and biological properties，J.Biol.Chem.，266(30)，20434-9；Takeuchi，Inoue，Strickland，Kubota，Wada，Shimizu，Hoshi，Kozutsumi，Takasaki，Kobata，1989，Relationship betweensugar chain structure and biological activity of recombinanthuman erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(20)，7819-22；Kurtz，Eckardt，1989，Assay methods for erythropoietin，Nephron.，51(1)，11-4(German)；Zucali，Sulkowski，1985，Purification of humanurinary erythropoietin on controlled-pore glass and silicicacid，Exp.Hematol.，13(3)，833-7；Krystal，1983，Physical andbiological characterization of erythroblast enhancingfactor(EEF)，a late acting erythropoeticstimulator in serumdistinct from erythropoietin，Exp.Hematol.，11(1)，18-31。
優(yōu)選地，EPO通過重組產(chǎn)生。這包括在真核或原核細(xì)胞中產(chǎn)生，優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母、細(xì)菌細(xì)胞中或者在適于重組生產(chǎn)EPO的其它任何細(xì)胞類型中產(chǎn)生。此外，EPO也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉(zhuǎn)基因鳥特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
多肽的重組產(chǎn)生為本領(lǐng)域公知。通常包括用一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在能夠生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以及從宿主細(xì)胞中純化多肽。關(guān)于詳細(xì)信息，參見例如Krystal，Pankratz，F(xiàn)arber，Smart，1986，Purification of human erythropoietin tohomogeneity by a rapid five-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-levelexpression and purification of a recombinant humanerythropoietin produced using a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，EPO具有人EPO的氨基酸序列(見EP 148605 B2)。
EPO可以含有通過N-和/或O-連接的糖基化作用與EPO連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈(優(yōu)選1-4個(gè)，優(yōu)選4個(gè))，即EPO被糖基化。當(dāng)在真核細(xì)胞中生產(chǎn)EPO時(shí)，多肽通常在翻譯后被糖基化。因此，在哺乳動(dòng)物特別是在人、昆蟲或酵母細(xì)胞內(nèi)的生物合成過程中，碳水化合物側(cè)鏈可以與EPO連接。糖基化EPO的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)在本領(lǐng)域中已經(jīng)廣泛研究(參見EP 428 267 B1；EP 640 619 B1；Rush，Derby，Smith，Merry，Rogers，Rohde，Katta，1995，Microheterogeneity oferythropoietin carbohydrate structure，Anal Chem.，67(8)，1442-52；Takeuchi，Kobata，1991，Structures and functionalroles of the sugar chains of human erythropoietins，Glycobiology，1(4)，337-4 6(Review)。
HAS可以與EPO直接偶聯(lián)，或者也可以通過一個(gè)接頭分子偶聯(lián)。接頭分子的性質(zhì)取決于HAS與EPO連接的方式。表1及下文描述了可能的接頭官能團(tuán)。有幾種接頭可以作為商品獲得(例如，來自Pierce，可獲自Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó)))。表2描述了一些合適的接頭。接頭的性質(zhì)及其用途在下文關(guān)于HES-EPO生產(chǎn)方法的部分中詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，HAS通過一個(gè)碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“碳水化合物部分”指羥基醛或羥基酮，以及它們的化學(xué)修飾(見Rmpp Chemielexikon，ThiemeVerlagStuttgart，德國(guó)，第9版1990，第9卷，2281-2285，以及此處引用的文獻(xiàn))。此外它還指天然存在的碳水化合物部分(如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等)的衍生物。該術(shù)語(yǔ)也包括環(huán)結(jié)構(gòu)已經(jīng)打開并被化學(xué)氧化的天然存在碳水化合物部分。
碳水化合物部分可以與EPO多肽骨架直接連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分。在這種情況下，HAS連接的碳水化合物部分與EPO多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的末端部分。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，HAS與碳水化合物側(cè)鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)，優(yōu)選與碳水化合物側(cè)鏈的末端半乳糖殘基偶聯(lián)。通過除去末端唾液酸，隨后氧化，該半乳糖殘基能夠用于偶聯(lián)(見下文)。
在另外一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，HAS與碳水化合物側(cè)鏈的唾液酸殘基偶聯(lián)，優(yōu)選與碳水化合物側(cè)鏈的末端唾液酸殘基偶聯(lián)。
此外，HAS也可以通過硫醚與EPO偶聯(lián)。如下文詳述的，S原子可以來自于附于EPO上的任何天然或非天然存在的SH基團(tuán)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，S原子可以來源于被引入HES氧化碳水化合物部分(優(yōu)選作為EPO碳水化合物側(cè)鏈一部分的氧化碳水化合物部分)中的SH基團(tuán)(見下文)。
優(yōu)選地，硫醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者添加的半胱氨酸。更優(yōu)選EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)，半胱氨酸33被置換為另外一種氨基酸。此外，HAS也可以與半胱氨酸33偶聯(lián)，而半胱氨酸29被置換為另外一種氨基酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“添加的半胱氨酸”是指多肽(優(yōu)選地EPO)含有在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。
在本發(fā)明該方面，半胱氨酸可以是在EPO的N端或C端添加的額外氨基酸。
此外，也可以通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域中公知(見上文)。在本發(fā)明該方面的上下文中，EPO優(yōu)選是人EPO，置換的氨基酸殘基優(yōu)選是絲氨酸126。
HAS-EPO的第二種組分是羥烷基淀粉(HAS)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“羥烷基淀粉”指被羥烷基取代的淀粉衍生物。此處，烷基可以被取代。優(yōu)選地，羥烷基含有2-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子。因此，“羥烷基淀粉”優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。
HAS的羥烷基至少含有一個(gè)OH基團(tuán)。
表述“羥烷基淀粉”也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對(duì)此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基被鹵素特別是氟、或者被芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。
此外，也可以使用線性或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。
對(duì)于本發(fā)明的所有實(shí)施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量(重量平均值)可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量是更優(yōu)選的。羥乙基淀粉可以進(jìn)一步顯示相對(duì)于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2∶C6取代比。
HAS-EPO的每個(gè)EPO分子可以含有1-12個(gè)，優(yōu)選1-9、1-6或1-3個(gè)，最優(yōu)選1-4個(gè)HAS分子?？梢栽诋a(chǎn)物水解及所得單糖衍生化后，利用GC-MS，通過定量碳水化合物組成分析確定每個(gè)EPO分子的HAS分子數(shù)(見Chaplin和Kennedy(編著)，1986，《碳水化合物分析一種實(shí)用方法》(Carbohydrate Analysisapractical approach)，IRL Press Practical approach series(ISBN 0-947946-44-3)，具體見第1章，單糖，第1-36頁(yè)；第2章，寡糖，第37-53頁(yè)，第3章，中性多糖，第55-96頁(yè))。
本發(fā)明的HAS-EPO偶聯(lián)物可以顯示與重組天然EPO基本相同的體外生物活性，因?yàn)轶w外生物活性只取決于EPO受體的結(jié)合親和力。測(cè)定體外生物活性的方法在本領(lǐng)域公知(見上文)。
此外，HAS-EPO也顯示比用作偶聯(lián)初始材料的EPO(未偶聯(lián)的EPO)更高的體內(nèi)活性。測(cè)定體內(nèi)生物活性的方法在本領(lǐng)域公知(見上文)。此外，實(shí)施例9和10也給出了測(cè)定體內(nèi)和體外EPO活性的測(cè)定法。
如果將未偶聯(lián)的EPO的體內(nèi)活性設(shè)為100％，則HAS-EPO偶聯(lián)物可能顯示出110-500％、優(yōu)選300-400％，或者110％-300％、優(yōu)選、110％-200％、更優(yōu)選110％-180％，或者110-150％、最優(yōu)選110％-140％的體內(nèi)活性。
與Amgen的高度唾液酸化EPO相比(見EP 428 267 B1)，如果將高度唾液酸化EPO的體內(nèi)活性設(shè)為100％，則HAS-EPO顯示優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少85％，或者至少95％、至少150％、至少200％或者至少300％的高度唾液酸化EPO的體內(nèi)活性。最優(yōu)選地，它顯示至少95％的高度唾液酸化EPO的體內(nèi)活性。
本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物的高體內(nèi)生物活性主要是基于以下事實(shí)該HAS-EPO偶聯(lián)物在循環(huán)中保持的時(shí)間比未偶聯(lián)的EPO更長(zhǎng)，因?yàn)樗^少被肝臟清除系統(tǒng)識(shí)別，并且由于分子量較高，腎清除減少。測(cè)定EPO在體內(nèi)循環(huán)半衰期的方法在本領(lǐng)域公知(Sytkowski，Lunn，Davis，F(xiàn)eldman，Siekman，1998，Human erythropoietin dimmers withmarkedly enhanced in vivo activity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(3)，1184-8)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是提供可以比目前作為商品獲得的EPO制品以更低頻率施用的HAS-EPO。標(biāo)準(zhǔn)EPO制品必須至少連續(xù)施用3天，而本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物優(yōu)選每周施用兩次，更優(yōu)選每周一次。
下文公開的涉及EPO或HAS特性的關(guān)于本發(fā)明生產(chǎn)HAS-EPO方法的所有實(shí)施方案，也適用于本發(fā)明的HAS-EPO偶聯(lián)物。
羥烷基淀粉是淀粉的一種醚衍生物。除了所述醚衍生物以外，在本發(fā)明中也能夠使用其它淀粉衍生物。例如，可以使用含有酯化羥基的衍生物。這些衍生物可以是，例如，具有2-12個(gè)碳原子的未取代單羧酸或二羧酸的衍生物，或者其取代衍生物的衍生物。特別有用的是具有2-6個(gè)碳原子的未取代單羧酸的衍生物，特別是乙酸的衍生物。對(duì)此，乙?；矸?、丁基淀粉或丙基淀粉是優(yōu)選的。
此外，含有2-6個(gè)碳原子的未取代二羧酸的衍生物也是優(yōu)選的。
對(duì)于二羧酸的衍生物，二羧酸的第二個(gè)羧基也被酯化是有利的。此外，二羧酸的單烷基酯衍生物在本發(fā)明中也是適用的。
對(duì)于取代的單羧酸或二羧酸，取代基優(yōu)選可以與上述用于取代烷基殘基的取代基相同。
淀粉的酯化技術(shù)在本領(lǐng)域公知(參見，例如Klemm D.等人，《綜合纖維素化學(xué)》(Comprehensive Cellulose Chemistry)第二卷，1998，Whiley-VCH，Weinheim，紐約，具體見第4.4章，纖維素的酯化(ISBN 3-527-29489-9)。
另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-促紅細(xì)胞生成素(EPO)偶聯(lián)物(HAS-EPO)的方法，其包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應(yīng)的EPO，b)提供能夠與步驟a)中EPO反應(yīng)的修飾的HAS，和c)使步驟a)的EPO與步驟b)的HAS反應(yīng)，從而產(chǎn)生一種含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-EPO，其中每個(gè)HAS都與EPO通過i)碳水化合物部分；或ii)硫醚偶聯(lián)。
本發(fā)明的方法具有產(chǎn)生顯示高生物活性的HAS-EPO偶聯(lián)物的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明的方法也具有能夠以低成本生產(chǎn)有效的EPO衍生物的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵摲椒ú话▽?dǎo)致低終產(chǎn)率的復(fù)雜且耗時(shí)的純化步驟，例如，不需要純化掉已知顯示低體內(nèi)生物活性或者無(wú)體內(nèi)生物活性的低唾液酸化的EPO型。具體而言，實(shí)施例20證實(shí)，用極少修飾步驟生產(chǎn)的一種HES-EPO顯示3倍于標(biāo)準(zhǔn)BRP-EPO的活性。
因此，在本發(fā)明方法的第一個(gè)步驟中，提供一種能夠與修飾的HAS反應(yīng)的EPO。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“提供”解釋為在各步驟后，可以獲得一種具有所需特性的分子(在步驟a)中為EPO，在步驟b)中為HAS)。
對(duì)于步驟a)，包括從天然來源中純化EPO，以及在宿主細(xì)胞或生物中重組生產(chǎn)，以及必要時(shí)對(duì)這樣獲得的EPO進(jìn)行修飾。
任何關(guān)于作為本發(fā)明初始材料的EPO的情況，同樣適用于作為本發(fā)明HAS-EPO偶聯(lián)物一部分的促紅細(xì)胞生成素。對(duì)此，以上公開的優(yōu)選實(shí)施方案也適用于本發(fā)明方法。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，EPO具有人EPO的氨基酸序列。
優(yōu)選EPO重組產(chǎn)生。包括在真核或原核細(xì)胞中產(chǎn)生，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母、細(xì)菌細(xì)胞中或者在適于重組生產(chǎn)EPO的其它任何細(xì)胞類型中產(chǎn)生。此外，EPO也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉(zhuǎn)基因鳥類特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
多肽的重組產(chǎn)生在本領(lǐng)域中公知。通常包括用一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在能夠生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以及從宿主細(xì)胞中純化多肽(Krystal，Pankratz，F(xiàn)arber，Smart，1986，Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapidfive-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-level expression andpurification of a recombinant human erythropoietin producedusing a baculoviru vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1)。
EPO可以含有通過N-和/或O-連接的糖基化作用與EPO連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈，即EPO被糖基化。當(dāng)在真核細(xì)胞中生產(chǎn)EPO時(shí)，多肽通常在翻譯后糖基化。因此，在哺乳動(dòng)物，特別是在人、昆蟲或酵母細(xì)胞內(nèi)的生物合成過程中，碳水化合物側(cè)鏈可以與EPO連接，這些細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(見上文)，或從動(dòng)物中提取的或者仍然保留在動(dòng)物中的細(xì)胞。
這些碳水化合物側(cè)鏈可以在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)后進(jìn)行化學(xué)或酶修飾，例如通過除去或添加一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分(參見，例如，Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer，Lindenmaier，1989，蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)進(jìn)展(Advances in Protein design)；Bloecker，Collins，Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著(GBF-Monographs)12，231-246，VCHPublishers，Weinheim，New York，Cambridge)。
本發(fā)明方法的目的是提供一種HAS-EPO，其含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子，其中該HAS通過碳水化合物部分(i)或者通過硫醚(ii)與EPO偶聯(lián)。因此，步驟a)提供的EPO應(yīng)當(dāng)具有以下特性能夠通過碳水化合物部分和/或通過硫醚偶聯(lián)。因此，在步驟a)之后，EPO優(yōu)選地可以含有(1)至少一個(gè)直接或者通過一個(gè)接頭分子與巰基團(tuán)或者碳水化合物部分連接的反應(yīng)性基團(tuán)，其能夠與HES或修飾的HES反應(yīng)，(2)至少一個(gè)修飾的HAS能夠與之偶聯(lián)的碳水化合物部分，和/或(3)至少一個(gè)游離SH基。
對(duì)于上述可能性(1)，步驟a)的EPO優(yōu)選地可以通過將適當(dāng)?shù)慕宇^分子與EPO的SH基或碳水化合物部分偶聯(lián)獲得。實(shí)施例4中的2.1提供了這種修飾的EPO的一個(gè)實(shí)例。重要的是確保接頭分子的添加不損害EPO。而這為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
對(duì)于上述可能性(2)，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的HAS通過碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)。
碳水化合物部分可以與EPO多肽骨架直接連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分。在這種情況下，與HAS連接的碳水化合物部分與EPO多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的末端部分。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的HAS與碳水化合物鏈連接(通過一個(gè)接頭，或者不通過接頭，見下文)，后者與EPO的N-和/或O-糖基化位點(diǎn)連接。
然而，本發(fā)明也包括，EPO含有與修飾的HAS偶聯(lián)的其它碳水化合物部分。本領(lǐng)域公知通過酶或者通過遺傳工程連接碳水化合物部分與多肽的技術(shù)，以及隨后在適當(dāng)細(xì)胞中的表達(dá)(Berger，Greber，Mosbach，1986，Galactosyltransferase-dependent sialylation ofcomplex and endo-Nacetylglucosaminidase H-treated coreN-glycans in vitro，F(xiàn)EBS Lett.，203(1)，64-8；Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer，Lindenmaier，1989，《蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)進(jìn)展》；Bloecker，Collins，Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著，12，231-246，VCHPubishers，Weinheim，New York，Cambridge)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為了能夠與修飾的HAS反應(yīng)而氧化碳水化合物部分。這種氧化能夠以化學(xué)或酶學(xué)方法進(jìn)行。
化學(xué)氧化多肽碳水化合物部分的方法在本領(lǐng)域公知，包括用高碘酸鹽處理(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
通過化學(xué)氧化，原則上能夠氧化位于末端或者不位于末端的任何碳水化合物部分。然而，通過選擇溫和的條件(1mM高碘酸鹽，0℃，不同于嚴(yán)格條件10mM高碘酸鹽，室溫1小時(shí))，可以優(yōu)選地氧化碳水化合物側(cè)鏈的末端碳水化合物部分，例如唾液酸或半乳糖。
此外，碳水化合物部分也可以酶氧化。用于氧化各碳水化合物部分的酶為本領(lǐng)域公知，例如，對(duì)于半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。
如果準(zhǔn)備氧化末端半乳糖部分，如果在能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，或者在遺傳修飾后能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細(xì)胞中生產(chǎn)EPO，最終必須(部分或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化學(xué)或酶法在本領(lǐng)域中公知(Chaplin和Kennedy(編著)，1996，《碳水化合物分析一種實(shí)用方法》(Carbohydrate Analysisa practical approach)，具體見第5章Montreuill，糖蛋白，第175-177頁(yè)；IRL Press Practicalapproach series(ISBN0-94794 6-4 4-3))。
本發(fā)明還包括，在步驟a)中將要與修飾的HAS連接的碳水化合物部分與EPO連接。如果希望連接半乳糖，可以利用半乳糖轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)。這些方法在本領(lǐng)域中公知(Berger，Greber，Mosbach，1986，Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex andendo-N-acetylglucoaminidase H-treated core N-glycans in vitro，F(xiàn)EBS Lett.，203(1)，64-8)。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)中，必要時(shí)，優(yōu)選部分或完全除去(酶和/或化學(xué))末端唾液酸之后，通過氧化EPO的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈的至少一個(gè)末端糖單位(優(yōu)選半乳糖)來修飾EPO(見上文)。
因此，優(yōu)選地，修飾的HAS與碳水化合物鏈氧化的末端糖單位偶聯(lián)，優(yōu)選與半乳糖偶聯(lián)。
此外，修飾的HAS優(yōu)選地也可以與末端唾液酸偶聯(lián)，后者優(yōu)選地在本發(fā)明的方法的步驟a)中氧化。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中(見上述第(3)點(diǎn))，EPO含有至少一個(gè)游離SH基。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該SH基可以與一個(gè)優(yōu)選氧化的碳水化合物部分連接，例如通過使用羥胺衍生物，例如2-(氨氧基)乙硫醇鹽酸鹽(Bauer L.等人，1965，J.Org.Chem.，30，949)，或者通過使用酰肼衍生物，例如巰基乙酸酰肼(Whitesides等人，1977，J.Org.Chem.，42，332)。偶聯(lián)這些分子與EPO氧化碳水化合物部分的方法可以與實(shí)施例方案8和9所述類似。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。
哺乳動(dòng)物EPO含有幾個(gè)通常形成二硫鍵的半胱氨酸。然而，通過將至少一個(gè)半胱氨酸置換為另外一種氨基酸(例如通過重組方法)，可以獲得具有至少一個(gè)含游離SH基的天然存在半胱氨酸的EPO。氨基酸置換方法在本領(lǐng)域中公知(Elliott，Lorenzini，Chang，Barzilay，Delorme，1997，Mapping of the active site of recombinant humanerythropoietin，Blood，89(2)，493-502；Boissel，Lee，Presnell，Cohen，Bunn，1993，Erythropoietin structure-functionrelationships.Mutant proteins that test a model of tertiarystructure，J Biol Chem.，268(21)，15983-93))。
優(yōu)選地，EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，半胱氨酸33被置換為另外一種氨基酸，在步驟c)中，修飾的HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，半胱氨酸29被置換為另一種氨基酸，在步驟c)中，修飾的HAS與半胱氨酸33偶聯(lián)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“添加的半胱氨酸”是指多肽(優(yōu)選EPO)含有一個(gè)在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。這能夠如下實(shí)現(xiàn)在多肽的N端或C端添加(例如通過重組方法)一個(gè)半胱氨酸殘基，或者將一個(gè)天然存在的氨基酸置換(例如通過重組方法)為半胱氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知這些方法(見上文)。
優(yōu)選地，通過將一個(gè)天然存在的氨基酸置換為一個(gè)半胱氨酸來添加半胱氨酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，EPO是人EPO，被置換的氨基酸殘基是絲氨酸126。
優(yōu)選地，修飾的HAS在步驟c)中與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。
在本發(fā)明方法的步驟b)中，提供能夠與步驟a)的EPO反應(yīng)的修飾的HAS。
對(duì)此，HAS優(yōu)選地可以在其還原性末端被修飾。這樣有化學(xué)反應(yīng)易于控制且技術(shù)人員能夠確保HAS的哪個(gè)基團(tuán)在反應(yīng)過程中被修飾的優(yōu)點(diǎn)。由于只將一個(gè)基團(tuán)引入HAS中，能夠防止不同EPO分子通過多功能HAS分子交聯(lián)和其它副反應(yīng)。
因此，修飾的HAS能夠與下列成分反應(yīng)(1)至少一個(gè)直接或者通過接頭分子與EPO的巰基團(tuán)或碳水化合物部分連接的基團(tuán)，(2)至少一個(gè)碳水化合物部分，優(yōu)選其被氧化，和/或(3)至少一個(gè)游離SH基。
對(duì)于上述第(1)點(diǎn)，HAS的修飾取決于與EPO連接的基團(tuán)。其機(jī)制在本領(lǐng)域中公知。實(shí)施例4中的2.1給出了一個(gè)實(shí)例。
對(duì)于上述第(2)點(diǎn)和第(3)點(diǎn)，本領(lǐng)域公知幾種修飾HAS的方法。這些方法的基本原理是，為了能夠與碳水化合物部分或SH基反應(yīng)而修飾HAS的反應(yīng)性基團(tuán)，或者一個(gè)接頭分子與HAS偶聯(lián)，后者含有能夠與碳水化合物部分或SH基反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)。
對(duì)于第(2)點(diǎn)，修飾的HAS能夠與氧化的碳水化合物部分反應(yīng)，優(yōu)選與末端糖殘基、更優(yōu)選與半乳糖或者與末端唾液酸反應(yīng)。
已知有幾種方法可以修飾HAS，使其能夠與氧化的優(yōu)選末端糖殘基反應(yīng)。如上所述，可以在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。在這種情況下，在第一步中，醛基被氧化為內(nèi)酯。這些修飾包括但不限于直接或者通過一個(gè)接頭向HAS上添加酰肼、氨基(以及羥氨基)、氨基脲或硫醇功能基團(tuán)。這些技術(shù)在實(shí)施例2-4中進(jìn)一步詳細(xì)描述。此外，機(jī)制本身在本領(lǐng)域中公知(參見，例如DE19628705A1；Hpoe等人，1981，Carbohydrate Res.，91，39；Fissekis等人，1960，Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry，2，47；Frie，1998，畢業(yè)論文，F(xiàn)achhochschule Hamburg，DE)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選添加酰肼或羥氨基官能團(tuán)。在這種情況下，優(yōu)選地通過在pH 5.5下進(jìn)行本發(fā)明方法步驟c)的反應(yīng)，確保修飾的HAS與EPO的氧化的碳水化合物部分選擇性反應(yīng)，而沒有賴氨酸側(cè)鏈與氧化的糖殘基形成亞胺從而引起分子間或分子內(nèi)EPO交聯(lián)。
對(duì)于第(3)點(diǎn)，也公知幾種用于修飾HAS的方法，使其能夠與游離SH基反應(yīng)。優(yōu)選地，在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。這些方法包括但不限于向HAS添加馬來酰亞胺、二硫醚或鹵代乙酰胺官能團(tuán)。這些技術(shù)在實(shí)施例2-4中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
關(guān)于這些技術(shù)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，可見Chamov等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916；Thorpe等人，1984，Eur.J.Biochem.，140，63；Greenfield等人，1990，Cancer Research，50，6600，以及實(shí)施例2中的1.3引用的文獻(xiàn)。
表1列出了其它一些可能的官能團(tuán)，提供了對(duì)可能的接頭分子的系統(tǒng)綜述。此外，機(jī)制本身在本領(lǐng)域公知。
可以在本發(fā)明中使用的幾種接頭分子在本領(lǐng)域中公知，或者可以作為商品獲得(例如來自Pierce，可以獲自Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó))。表2列出了實(shí)例。
在本發(fā)明方法的步驟c)中，步驟a)的EPO與步驟b)的HAS反應(yīng)，從而產(chǎn)生含一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-EPO，其中HAS通過碳水化合物部分或者通過硫醚與EPO偶聯(lián)。
原則上，使EPO與修飾HAS反應(yīng)的詳細(xì)方法取決于EPO和/或HAS各自的修飾，為本領(lǐng)域公知(參見，例如，Rose，1994，J.Am.Chem.Soc.，116，30，O′Shannessay和Wichek，1990，AnalyticalBiochemistry，191，1；Thorpe等人，1984，Eur.J.Biochem.，140，63；Chamov等人，1992，J.Bioh.Chem.267，15916)。
關(guān)于本發(fā)明舉例說明的方法，實(shí)施例2-4，特別是實(shí)施例4給出了詳細(xì)描述。
步驟c)可以在至少含有10％重量H2O的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
在本發(fā)明方法的這一優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)介質(zhì)含有至少10％重量的水，優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少80％，例如90％或者可達(dá)100％。據(jù)此可以計(jì)算有機(jī)溶劑的含量。因此，該反應(yīng)在水相中進(jìn)行。優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)是水。
本發(fā)明方法這一實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，不必使用在毒理學(xué)上危險(xiǎn)的溶劑，因此在生產(chǎn)過程后不必除去這些溶劑來避免溶劑的污染。此外，對(duì)于殘余的毒理學(xué)上危險(xiǎn)的溶劑，不必進(jìn)行額外的質(zhì)量控制。優(yōu)選使用毒理學(xué)上不危險(xiǎn)的溶劑作為有機(jī)溶劑，如乙醇或丙二醇。
本發(fā)明方法的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，避免了有機(jī)溶劑誘導(dǎo)的不可逆的或可逆的結(jié)構(gòu)改變。因此，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的多肽不同于在有機(jī)溶劑(如DMSO)中制備的多肽。
此外，也意外地發(fā)現(xiàn)，HAS與藥物在水溶液中的偶聯(lián)最小化或者避免了副反應(yīng)。因此，本發(fā)明方法的這個(gè)實(shí)施方案產(chǎn)生高純度的改良產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“羥烷基淀粉”指被羥烷基取代的淀粉衍生物。其中，烷基可以被取代。優(yōu)選羥烷基含有2-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子。因此“羥烷基淀粉”優(yōu)選地包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。
HAS的羥烷基含有至少一個(gè)OH基。
對(duì)于本發(fā)明的所有實(shí)施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。
表述“羥烷基淀粉”也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對(duì)此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基可以被鹵素特別是氟、或者芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。
此外，除了烷基，也可以使用線性或分支的取代或未取代的烯基。
在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量是更優(yōu)選的。羥乙基淀粉可以進(jìn)一步顯示相對(duì)于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度，和2-20的C2∶C6取代比。
通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的HAS-EPO能夠被如下純化和表征
HAS-EPO的分離可以用已知的純化天然和重組EPO的方法進(jìn)行(例如大小排阻層析、離子交換層析、RP-HPLC、羥基磷灰石層析、疏水作用層析、實(shí)施例20.8所述的方法或其組合)。
HAS與EPO多肽的共價(jià)連接能夠在修飾蛋白質(zhì)水解后通過碳水化合物組成分析證實(shí)(EPO的三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)上存在的羥乙基葡萄糖與甘露糖之比)。
EPO的N-連接寡糖處的HAS修飾能夠如下證實(shí)除去HAS修飾的N-聚糖，利用SDS-PAGE+/-Western Blotting觀察預(yù)知的向較高遷移率的轉(zhuǎn)變。
EPO在半胱氨酸殘基處的HAS修飾能夠根據(jù)以下情況證實(shí)通過RP-HPLC和MALDI/TOF-MS不能在HAS修飾產(chǎn)物的蛋白水解片段中檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白水解Cys-肽(Zhou等人，1998，Application ofcapillary electrophoresis，liquid chromatogfaphy，electrospray-mass spectrometry and matrix-assistedlaserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometryto the characterization of recombinant human erythropoietin.Electrophoresis，19(13)，2348-55)。在蛋白水解消化Cys-修飾的EPO后，分離含有HAS的級(jí)分能夠通過常規(guī)氨基酸組成分析證實(shí)該級(jí)分中含有相應(yīng)的肽。
以上公開的涉及EPO或HAS特性的關(guān)于本發(fā)明HAS-EPO的所有實(shí)施方案，也適用于本發(fā)明制備HAS-EPO的方法。
本發(fā)明還涉及一種可通過本發(fā)明方法獲得的HAS-EPO。優(yōu)選地，該HAS-EPO具有上述限定本發(fā)明HAS-EPO的特征。
本發(fā)明還涉及在治療人或動(dòng)物體的方法中使用的本發(fā)明HAS-EPO。
此外，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明HAS-EPO的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物還含有至少一種在促紅細(xì)胞生成素治療中使用的藥學(xué)可接受稀釋劑、佐劑和/或載體。
優(yōu)選地，該藥物組合物用于治療貧血性疾病或造血功能障礙疾病或與之有關(guān)的疾病。
如此處所用的“治療有效量”是指對(duì)于指定病癥和施用方案提供治療效果的量。促紅細(xì)胞生成素同種型優(yōu)選地通過腸胃外途徑施用。選擇的具體途徑取決于治療的疾病。促紅細(xì)胞生成素同工型優(yōu)選作為含有適當(dāng)載體(如人血清白蛋白)、適當(dāng)稀釋劑(如緩沖液)和/或適當(dāng)佐劑的制劑的一部分施用。需要的劑量是足以提高患者血細(xì)胞比容的量，根據(jù)治療疾病的嚴(yán)重程度、施用方法等而不同。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物治療的目的是將血液中血紅蛋白值提高至6.8mmol/l以上。為此，可以施用藥物組合物，使得血紅蛋白值每周提高0.6mmol/l-1.6mmol/l。如果血紅蛋白值超過8.7mmol/l，優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)中斷治療，直到血紅蛋白值低于8.1mmol/l。
本發(fā)明組合物優(yōu)選地在適于皮下或靜脈內(nèi)或腸胃外注射的制劑中使用。為此，適當(dāng)?shù)馁x形劑和載體是，例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯酸鈉、聚山梨醇酯80(polysorbate 80)、HAS和注射用水。該組合物可以每周施用三次，優(yōu)選每周兩次，更優(yōu)選每周一次，最優(yōu)選每?jī)芍芤淮巍?br> 優(yōu)選地，該藥物組合物以0.01-10μg/kg患者體重的量施用，更優(yōu)選0.1-5μg/kg，0.1-1μg/kg或0.2-0.9μg/kg，最優(yōu)選0.3-0.7μg/kg，最優(yōu)選0.4-0.6μg/kg體重。
優(yōu)選地，每次劑量通常施用10ug-200μg，優(yōu)選15μg-100μg。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明HAS-EPO在制備治療貧血疾病或造血功能障礙疾病或與之有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，用含有一個(gè)或多個(gè)羥烷基淀粉(HAS)分子的HAS-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)解決了問題，其中每個(gè)HAS與多肽通過a)碳水化合物部分；或b)硫醚偶聯(lián)。
本發(fā)明HAS-多肽具有以下優(yōu)點(diǎn)與偶聯(lián)前的多肽相比，其顯示生物穩(wěn)定性提高。這主要是由于以下事實(shí)HAS-多肽很少或者不被肝臟和腎臟的清除系統(tǒng)識(shí)別，因此在循環(huán)系統(tǒng)中長(zhǎng)時(shí)間存在。此外，由于HAS被位點(diǎn)特異性地連接，因HAS與多肽偶聯(lián)而破壞該多肽體內(nèi)生物活性的危險(xiǎn)被最小化。
本發(fā)明HAS-多肽主要含有兩種成分，即多肽和與之連接的羥烷基淀粉(HAS)。
該多肽可以是任何人或動(dòng)物來源的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該多肽是人來源的。
該多肽可以是細(xì)胞因子特別是促紅細(xì)胞生成素，抗凝血酶(AT)如AT III，白介素特別是白介素-2、IFN-β、IFN-α、G-CSF、CSF、白介素-6和治療抗體。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該多肽是抗凝血酶(AT)，優(yōu)選是ATIII(Levy JH，Weisinger A，Ziomek CA，Echelard Y，RecombinantAntithrombinProduction and Role in Cardiovascular Disorder，Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27，4(2001)405-416；Edmunds T，Van Patten SM，Pollock J，HansonE，Bernasconi R，Higgins E，Manavalan P，Ziomek C，MeadeH，McPherson J，Cole ES，Transgenically Produced Human AntithrombinStructural andFunctional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin，Blood 91，12(1998)4661-4671；Minnema MC，Chang ACK，Jansen PM，Lubbers YTP，Pratt BM，Whittaker BG，Taylor FB，Hack CE，F(xiàn)riedman B，Recombinant human antithrombin III improvessurvival and attenuates inflammatory responses in baboonslethally challenged with Escherichia coli，Blood 95，4(2000)1117-1123；Van Patten SM，Hanson EH，Bernasconi R，Zhang K，Manavaln P，Cole ES，McPherson JM，Edmunds T，Oxidation ofMethionine Residues in An tithrombin，J.Biol.Chemistry 274，15(1999)10268-10276)。
根據(jù)另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該多肽是人IFN-β，特別是IFN-β1a(參見Avonex，REBIF)和IFN-β1b(參見BETASERON)。
另外一種優(yōu)選的多肽是人G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)。參見，例如，Nagata等人，The chromosomal gene structure and two mRNAsfor human granulocyte colony-stimulating fator，EMBO J.5575-581，1986；Souza等人，Recombinant human granulocytecolony-stimulating factoreffects on normal and leukemicmyeloid cells，Science 232(1986)61-65；Herman等人，Characterization，formulation，and stability ofNeupogen(Filgrastim)，a recombinant human granulocyte-colonystimulating factor，見《蛋白質(zhì)藥物的配制、表征和穩(wěn)定性》(Formulalion，characterization，and stability of proteindrugs)，Rodney Pearlman和Y.John Wang編著，Plenum Press，NewYork，1996，303-328。
關(guān)于促紅細(xì)胞生成素，以上公開的所有實(shí)施方案在此也適用。
優(yōu)選地，該多肽通過重組產(chǎn)生。包括在真核或原核細(xì)胞中產(chǎn)生，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母、細(xì)菌細(xì)胞中，或者在適于重組生產(chǎn)多肽的其它任何細(xì)胞類型中產(chǎn)生。此外，多肽也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉(zhuǎn)基因鳥特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
多肽的重組產(chǎn)生在本領(lǐng)域中公知。通常包括用一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在能夠產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以及從宿主細(xì)胞中純化多肽。關(guān)于詳細(xì)信息，參見，例如Krystal，Pankratz，F(xiàn)arber，Smart，1986，Purification of human erythropoietin tohomogeneity by a rapid five-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-levelexpression and purification of a recombinant humanerythropoietin produced using a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1。
多肽可以含有通過N-和/或O-連接的糖基化作用與該多肽連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈，即該多肽被糖基化。當(dāng)在真核細(xì)胞中生產(chǎn)多肽時(shí)，該多肽通常在翻譯后被糖基化。因此，在哺乳動(dòng)物特別是人、昆蟲或酵母細(xì)胞中生物合成過程中，碳水化合物側(cè)鏈可以與該多肽連接。
HAS可以直接與多肽偶聯(lián)，或者可以通過接頭分子偶聯(lián)。接頭分子的性質(zhì)取決于HAS與多肽連接的方式。有幾種接頭可以作為商品獲得(例如，來自Pierce，見上文)。接頭的性質(zhì)及其用途在以下關(guān)于HES-多肽生產(chǎn)方法的部分中詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)。優(yōu)選地，當(dāng)多肽是抗凝血酶優(yōu)選ATIII時(shí)，同樣適用。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“碳水化合物部分”指羥基醛或羥基酮，以及它們的化學(xué)修飾(見Rmpp Chemielexikon，Thieme Verlag Stuttgart，德國(guó)，第9版，9，2281-2285，和此處引用的文獻(xiàn))。此外，它也指天然存在的碳水化合物部分(如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等)的衍生物。該術(shù)語(yǔ)也包括環(huán)結(jié)構(gòu)已經(jīng)打開并被化學(xué)氧化的天然存在碳水化合物部分。
碳水化合物部分可以直接與多肽骨架連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分。在這種情況下，HAS連接的碳水化合物部分與多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，該碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的末端部分。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，HAS與碳水化合物側(cè)鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)，優(yōu)選地與碳水化合物側(cè)鏈的末端半乳糖殘基偶聯(lián)。通過除去末端唾液酸，隨后氧化，該半乳糖殘基可以用于偶聯(lián)(見下文)。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，HAS與碳水化合物側(cè)鏈的唾液酸殘基偶聯(lián)，優(yōu)選與碳水化合物側(cè)鏈的末端唾液酸殘基偶聯(lián)。
此外，HAS也可以通過硫醚與多肽偶聯(lián)。如下文詳述的，S原子可以來自于附于多肽上的任何天然或非天然存在的SH基團(tuán)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，S原子可以來源于被引入HES氧化碳水化合物部分(優(yōu)選作為多肽碳水化合物側(cè)鏈一部分的氧化碳水化合物部分)中的SH基團(tuán)(見下文)。
優(yōu)選地，硫醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者來源于添加的半胱氨酸。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“添加的半胱氨酸”指多肽含有在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。
在本發(fā)明該方面中，半胱氨酸可以是在多肽的N端或C端添加的額外氨基酸。
此外，也可以通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。
HAS-多肽的第二種組分是HAS。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“羥烷基淀粉”指被羥烷基取代的淀粉衍生物。其中，烷基可以被取代。優(yōu)選地，羥烷基含有2-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子。因此，“羥烷基淀粉”優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。
HAS的羥烷基至少含有一個(gè)OH基。
“羥烷基淀粉”也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對(duì)此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基被鹵素特別是氟、或者芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。
此外，也可以使用線性或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。
對(duì)于本發(fā)明的所有實(shí)施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量(重量平均值)可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量更優(yōu)選。羥乙基淀粉可以進(jìn)一步顯示相對(duì)于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2∶C6取代比。
HAS-多肽每個(gè)多肽分子可以含有1-12個(gè)，優(yōu)選1-9、1-6或1-3個(gè)，最優(yōu)選1-4個(gè)HAS分子。每個(gè)多肽分子的HAS分子數(shù)能夠在產(chǎn)物水解及所得單糖衍生化后，利用GC-MS，通過定量碳水化合物組成分析來確定(Chaplin和Kennedy(編著)，1986，《碳水化合物分析一種實(shí)用方法》(Carbohydrate Analysisa practical approach)，第1章，單糖，第1-36頁(yè)；第2章，寡糖，第37-53頁(yè)，第3章，中性多糖，第55-96頁(yè)；IRL Press Practical approach series(ISBN0-947946-44-3))。
以下公開的涉及多肽或HAS性質(zhì)的本發(fā)明生產(chǎn)HAS-多肽的方法的所有實(shí)施方案也適用于本發(fā)明HAS-多肽。此外，以上公開的通常涉及肽或HAS的關(guān)于HAS-EPO或其制備的所有實(shí)施方案也適用于本發(fā)明的HAS-多肽。
羥烷基淀粉是淀粉的一種醚衍生物。除了所述醚衍生物以外，在本發(fā)明中也能夠使用其它淀粉衍生物。例如，可以使用含有酯化羥基的衍生物。這些衍生物可以是，例如，具有2-12個(gè)碳原子的未取代單羧酸或二羧酸的衍生物，或其取代衍生物的衍生物。特別有用的是具有2-6個(gè)碳原子的未取代單羧酸的衍生物，特別是乙酸的衍生物。在上下文中，乙?；矸?、丁基淀粉或丙基淀粉是優(yōu)選的。
此外，具有2-6個(gè)碳原子的未取代二羧酸的衍生物也是優(yōu)選的。
對(duì)于二羧酸的衍生物，二羧酸的第二個(gè)羧基也被酯化是有利的。此外，二羧酸的單烷基酯衍生物在本發(fā)明中也是適用的。
對(duì)于取代的單羧酸或二羧酸，取代基優(yōu)選可以與上述用于取代烷基殘基的取代基相同。
淀粉的酯化技術(shù)在本領(lǐng)域公知(參見，例如，Klemm D.等人，《綜合纖維素化學(xué)》(Comprehensive Cellulose Chemistry)第2卷，1998，Whiley-VCH，Weinheim，紐約，具體見第4.4章，纖維素的酯化(ISBN3-527-29489-9)。
另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)的方法，其包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應(yīng)的多肽，b)提供能夠與步驟a)中多肽反應(yīng)的修飾的HAS，和c)使步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應(yīng)，從而產(chǎn)生一種含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-多肽，其中每個(gè)HAS都與該多肽通過i)碳水化合物部分；或ii)硫醚偶聯(lián)。
本發(fā)明的方法具有生產(chǎn)顯示高生物活性的HAS-多肽偶聯(lián)物的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明的方法也具有能夠以低成本生產(chǎn)有效的多肽衍生物的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵摲椒ú话▽?dǎo)致低終產(chǎn)量的復(fù)雜且耗時(shí)的純化步驟。
因此，在本發(fā)明的方法的第一個(gè)步驟中，提供能夠與修飾的HAS反應(yīng)的一種多肽。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“提供”解釋為在各步驟后，可以獲得一種具有所需特性的分子(在步驟a)中為多肽，在步驟b)中為HAS)。
對(duì)于步驟a)，包括從天然來源中純化多肽，以及在宿主細(xì)胞或生物中重組生產(chǎn)，以及必要時(shí)對(duì)這樣獲得的多肽進(jìn)行修飾。
任何關(guān)于作為本發(fā)明初始材料多肽的情況，同樣適用于作為本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物一部分的促紅細(xì)胞生成素。對(duì)此，以上公開的優(yōu)選實(shí)施方案也適用于本發(fā)明方法。
優(yōu)選多肽是重組產(chǎn)生的。包括在真核或原核細(xì)胞中產(chǎn)生，優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母、細(xì)菌細(xì)胞中或者在適于重組生產(chǎn)多肽的其它任何細(xì)胞類型中產(chǎn)生。此外，多肽也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中(例如在體液中，如奶、血液等)、在轉(zhuǎn)基因鳥特別是家禽優(yōu)選在雞的蛋中，或者在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
多肽的重組產(chǎn)生在本領(lǐng)域中公知。通常包括用一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在能夠生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以及從宿主細(xì)胞中純化多肽(Krystal，Pankratz，F(xiàn)arber，Smart，1986，Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapidfive-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-level expression andpurification of a recombinant human erythropoietin producedusing a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1)。
多肽可以含有通過N-和/或O-連接的糖基化作用與該多肽連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈，即該多肽被糖基化。當(dāng)在真核細(xì)胞中生產(chǎn)多肽時(shí)，多肽通常在翻譯后糖基化。因此，在哺乳動(dòng)物特別是在人、昆蟲或酵母細(xì)胞中生物合成過程中，碳水化合物側(cè)鏈可以與多肽連接，這些細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(見上文)。
這些碳水化合物側(cè)鏈可以在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)后化學(xué)或酶修飾，例如通過除去或添加一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分(參見，例如，Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer，Lindenmaier，1989，蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)進(jìn)展；Bloecker，Collins，Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著，12，231-246，VCH Publishers，Weinheim，New York，Cambridge)。
本發(fā)明的方法的目的是提供一種含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-多肽，其中該HAS通過碳水化合物部分(i)或者通過硫醚(ii)與多肽偶聯(lián)。因此，步驟a)提供的多肽應(yīng)當(dāng)具有以下特性能夠通過碳水化合物部分和/或通過硫醚偶聯(lián)。因此，在步驟a)之后，多肽優(yōu)選地可以含有(1)至少一個(gè)直接或者通過接頭分子與巰基團(tuán)或者碳水化合物部分連接的反應(yīng)性基團(tuán)，能夠與HES或修飾的HES反應(yīng)，(2)至少一個(gè)能夠與修飾的HAS偶聯(lián)的碳水化合物部分，和/或(3)至少一個(gè)游離SH基。
對(duì)于上述可能性(1)，步驟a)的多肽優(yōu)選地可以通過將適當(dāng)?shù)慕宇^分子與多肽的SH基或碳水化合物部分偶聯(lián)獲得。實(shí)施例4中的2.1提供了這種修飾的多肽的一個(gè)實(shí)例。重要的是確保接頭分子的添加不損害多肽。而這為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
對(duì)于上述可能性(2)，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)。
碳水化合物部分可以與多肽骨架直接連接。優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分。在這種情況下，與HAS連接的碳水化合物部分與多肽骨架之間還可能存在其它碳水化合物部分。更優(yōu)選地，碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的末端部分。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的HAS與碳水化合物鏈連接(通過一個(gè)接頭，或者不通過接頭，見下文)，后者與多肽的N-和/或O-糖基化位點(diǎn)連接。
然而，本發(fā)明也包括，多肽含有與修飾的HAS偶聯(lián)的其它碳水化合物部分。本領(lǐng)域公知通過酶或者通過遺傳工程連接碳水化合物部分與多肽的技術(shù)，以及隨后在適當(dāng)細(xì)胞中的表達(dá)(Berger，Greber，Mosbach，1986，Galactosyltransferase-dependent sialylation ofcomplex and endo-Nacetylglucosaminidase H-treated coreN-glycans invitro，F(xiàn)EBS Lett.，203(1)，64-8；Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer，Lindenmaier，1989，《蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)進(jìn)展》；Bloecker，Collins，Schmidt和Schomburg編著，GBF-專著，12，231-246，VCHPub lishers，Weinheim，New York，Cambridge)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為了能夠與修飾的HAS反應(yīng)而氧化碳水化合物部分。這種氧化能夠以化學(xué)或酶學(xué)方法進(jìn)行。
化學(xué)氧化多肽碳水化合物部分的方法在本領(lǐng)域公知，包括用高碘酸鹽處理(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
通過化學(xué)氧化，原則上能夠氧化位于末端或者不位于末端的任何碳水化合物部分。然而，通過選擇溫和的條件(1mM高碘酸鹽，0℃，不同于嚴(yán)格條件10mM高碘酸鹽，室溫1小時(shí))，可以優(yōu)選地氧化碳水化合物側(cè)鏈的末端碳水化合物部分，例如唾液酸或半乳糖。
此外，碳水化合物部分也可以酶氧化。用于氧化各碳水化合物部分的酶在本領(lǐng)域公知，例如，對(duì)于半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。
如果準(zhǔn)備氧化末端半乳糖部分，如果在能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細(xì)胞例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，或者在遺傳修飾后能夠連接唾液酸與碳水化合物鏈的細(xì)胞中生產(chǎn)多肽，最終必須(部分或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化學(xué)或酶法在本領(lǐng)域中公知(Chaplin和Kennedy(編著)，1996，《碳水化合物分析一種實(shí)用方法》，具體見第5章Montreuill，糖蛋白，第175-177頁(yè)；IRL Press Practicalapproach series(ISBN 0-947946-44-3))。
然而，本發(fā)明也包括在步驟a)中將要與修飾的HAS連接的碳水化合物部分與多肽連接。如果希望連接半乳糖，可以利用半乳糖轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)。這些方法在本領(lǐng)域中公知(Berger，Greber，Mosbach，1986，Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex andendo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro，F(xiàn)EBS Lett.，203(1)，64-8)。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)中，必要時(shí)，優(yōu)選在部分或完全(酶和/或化學(xué))除去末端唾液酸之后，通過氧化多肽的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈的至少一個(gè)末端糖單位(優(yōu)選半乳糖)來修飾多肽(見上文)。
因此，優(yōu)選修飾的HAS與碳水化合物鏈被氧化的末端糖單位偶聯(lián)，優(yōu)選與半乳糖偶聯(lián)。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中(見上文第(3)點(diǎn))，多肽含有至少一個(gè)游離SH基。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。
氨基酸置換方法在本領(lǐng)域中公知(Elliott，Lorenzini，Chang，Barzilay，Delorme，1997，Mapping of the active site ofrecombinant human erythropoietin，Blood，89(2)，493-502；Boissel，Lee，Presnell，Cohen，Bunn，1993，Erythropoietinstructure-function relationships.Mutant proteins that test amodel of tertiary structure，J Biol Chem.，268(21)，15983-93))。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“添加的半胱氨酸”是指多肽含有一個(gè)在野生型多肽中不存在的半胱氨酸殘基。這能夠如下實(shí)現(xiàn)在多肽的N端或C端添加(例如通過重組方法)一個(gè)半胱氨酸殘基，或者將一個(gè)天然存在的氨基酸置換(例如通過重組方法)為半胱氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知這些方法(見上文)。
優(yōu)選地，通過將一個(gè)天然存在的氨基酸置換為一個(gè)半胱氨酸來添加半胱氨酸。
優(yōu)選地，修飾的HAS在步驟c)中與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。
在本發(fā)明的方法的步驟b)中，提供能夠與步驟a)的多肽反應(yīng)的修飾的HAS。
對(duì)此，HAS優(yōu)選地可以在其還原性末端被修飾。這樣有化學(xué)反應(yīng)易于控制且技術(shù)人員能夠確保HAS的哪個(gè)基團(tuán)在反應(yīng)過程中被修飾的優(yōu)點(diǎn)。由于只將一個(gè)基團(tuán)引入HAS中，能夠防止不同多肽分子通過多功能HAS分子交聯(lián)和其它副反應(yīng)。
因此，修飾的HAS能夠與下列成分反應(yīng)(1)至少一個(gè)直接或者通過接頭分子與多肽的巰基團(tuán)或碳水化合物部分連接的基團(tuán)，(2)至少一個(gè)碳水化合物部分，優(yōu)選其被氧化，和/或(3)至少一個(gè)游離SH基。
對(duì)于上述第(1)點(diǎn)，HAS的修飾取決于與多肽連接的基團(tuán)。其機(jī)制在本領(lǐng)域中公知。實(shí)施例4中的2.1給出了一個(gè)實(shí)例。
對(duì)于上述第(2)點(diǎn)和第(3)點(diǎn)，本領(lǐng)域公知幾種修飾HAS的方法。這些方法的基本原理是，為了能夠與碳水化合物部分或SH基反應(yīng)而修飾HAS的反應(yīng)性基團(tuán)，或者一個(gè)接頭分子與HAS偶聯(lián)，后者含有能夠與碳水化合物部分或SH基反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)。
對(duì)于第(2)點(diǎn)，修飾的HAS能夠與氧化的碳水化合物部分反應(yīng)，優(yōu)選與末端糖殘基、更優(yōu)選與半乳糖或者與末端唾液酸反應(yīng)。
公知幾種方法可以修飾HAS，使其能夠與氧化的優(yōu)選末端糖殘基反應(yīng)。如上所述，可以在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。在這種情況下，在第一步中，醛基被氧化為內(nèi)酯。這些修飾包括但不限于直接或者通過接頭向HAS上添加酰肼、氨基(以及羥氨基)、氨基脲或硫醇官能基團(tuán)。這些技術(shù)在實(shí)施例2-4中進(jìn)一步詳細(xì)描述。此外，機(jī)制本身在本領(lǐng)域中公知(參見，例如DE 196 28 705 A1；Hpoe等人，1981，Carbohydrate Res.，91，39；Fissekis等人，1960，Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry，2，47；Frie，1998，畢業(yè)論文，F(xiàn)achhochschule Hamburg，DE)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選添加酰肼或羥氨基官能團(tuán)。在這種情況下，優(yōu)選地通過在pH 5.5下進(jìn)行本發(fā)明方法步驟c)的反應(yīng)，確保修飾的HAS與多肽的氧化的碳水化合物部分選擇性反應(yīng)，而沒有賴氨酸側(cè)鏈與氧化的糖殘基形成亞胺從而引起分子間或分子內(nèi)多肽交聯(lián)。
對(duì)于第(3)點(diǎn)，也公知幾種用于修飾HAS的方法，使其能夠與游離SH基反應(yīng)。優(yōu)選地，在HES-鏈的還原性末端區(qū)域選擇性地引入這種修飾。這些方法包括但不限于向HAS添加馬來酰亞胺、二硫醚或鹵代乙酰胺官能團(tuán)。這些技術(shù)在實(shí)施例2-4中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
關(guān)于這些技術(shù)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，可見Chamov等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916；Thorpe等人，1984，Eur.J.Biochem.，140，63；Greenfield等人，1990，Cancer Research，50，6600，以及實(shí)施例2中的1.3引用的文獻(xiàn)。
表1列出了其它一些可能的官能團(tuán)，提供了對(duì)可能的接頭分子的系統(tǒng)綜述。此外，機(jī)制本身在本領(lǐng)域公知。
可以在本發(fā)明中使用的幾種接頭分子在本領(lǐng)域中公知，或者可以作為商品獲得(例如來自Pierce，可以獲自Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó))。
在本發(fā)明的方法的步驟c)中，步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應(yīng)，從而產(chǎn)生含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-多肽，其中HAS通過碳水化合物部分或者通過硫醚與該多肽偶聯(lián)。
原則上，使多肽與修飾HAS反應(yīng)的詳細(xì)方法取決于多肽和/或HAS各自的修飾，為本領(lǐng)域中公知(參見，例如Rose，1994，J.Am.Chem.Soc.，116，30，O′Shannessay 和 Wichek，1990，AnalyticalBiochemistry，191，1；Thorpe等人，1984，Eur.J.Bio-chem.，140，63；Chamov等人，1992，J.Biol.Chem.267，15916)。
對(duì)于本發(fā)明舉例說明的方法，實(shí)施例2-4，特別是實(shí)施例4中給出了詳細(xì)描述。
步驟c)可以在至少含有10％重量H2O的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
在本發(fā)明方法的這一優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)介質(zhì)含有至少10％重量的水，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少80％，例如90％或者可達(dá)100％。據(jù)此可以計(jì)算有機(jī)溶劑的含量。因此，該反應(yīng)在水相中進(jìn)行。優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)是水。
本發(fā)明方法的這一實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，不必使用在毒理學(xué)上危險(xiǎn)的溶劑，因此在生產(chǎn)過程后不必除去這些溶劑來避免溶劑的污染。此外，對(duì)于殘余的毒理學(xué)上危險(xiǎn)的溶劑，不必進(jìn)行額外的質(zhì)量控制。優(yōu)選使用毒理學(xué)上不危險(xiǎn)的溶劑作為有機(jī)溶劑，如乙醇或丙二醇。
本發(fā)明的方法的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，避免了有機(jī)溶劑誘導(dǎo)的不可逆的或可逆的結(jié)構(gòu)改變。因此，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的多肽不同于在有機(jī)溶劑(如DMSO)中制備的多肽。
此外，也意外地發(fā)現(xiàn)，HAS與藥物在水溶液中的偶聯(lián)最小化或者避免了副反應(yīng)。因此，本發(fā)明方法的這個(gè)實(shí)施方案產(chǎn)生高純度的改良產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“羥烷基淀粉”是指被羥烷基取代的淀粉衍生物。其中，烷基可以被取代。優(yōu)選羥烷基含有2-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子。因此“羥烷基淀粉”優(yōu)選地包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是優(yōu)選的。
HAS的羥烷基含有至少一個(gè)OH基。
對(duì)于本發(fā)明的所有實(shí)施方案，羥乙基淀粉(HES)是最優(yōu)選的。
術(shù)語(yǔ)“羥烷基淀粉”也包括以下衍生物，其中烷基是單取代或多取代的。對(duì)此，只要HAS保持水溶性，優(yōu)選烷基可以被鹵素特別是氟、或者芳基取代。此外，羥烷基的末端羥基也可以酯化或者醚化。另外，羥烷基淀粉的烷基也可以是線性的或分支的。
此外，也可以使用線性或分支的取代或未取代的鏈烯基代替烷基。
在本發(fā)明中，羥乙基淀粉的平均分子量可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量是更優(yōu)選的。羥乙基淀粉能夠進(jìn)一步顯示相對(duì)于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2∶C6取代比。
通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的HAS-多肽能夠被如下純化和表征
HAS-多肽的分離可以用已知的純化天然和重組多肽的方法進(jìn)行(例如大小排阻層析、離子交換層析、RP-HPLC、羥基磷灰石層析、疏水相互作用層析、實(shí)施例20.8所述的方法或其組合)。
HAS與多肽的共價(jià)連接能夠在修飾的蛋白質(zhì)水解后通過碳水化合物組成分析證實(shí)。
在多肽的N-連接寡糖處的HAS修飾能夠如下證實(shí)除去HAS修飾的N-聚糖，利用SDS-PAGE+/-Western Blotting觀察預(yù)知的向較高遷移率的轉(zhuǎn)變。
多肽在半胱氨酸殘基處的HAS修飾能夠根據(jù)以下情況證實(shí)在HAS修飾產(chǎn)物的蛋白水解片段中，通過RP-HPLC和MALDI/TOF-MS不能檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白水解Cys-肽(Zhou等人，1998，Application ofcapillary electrophoresis，liquid chromatography，electrospray-mass spectrometry and matrix-assistedlaserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometryto the characterization of recombinant human erythropoietin.Electrophoresis，19(13)，2348-55)。在蛋白水解消化Cys-修飾的多肽后，分離含有HAS的級(jí)分能夠通過常規(guī)氨基酸組成分析證實(shí)該級(jí)分中含有相應(yīng)的肽。
以上公開的涉及多肽或HAS性質(zhì)的關(guān)于本發(fā)明HAS-多肽的所有實(shí)施方案，也適用于本發(fā)明生產(chǎn)HAS-多肽偶聯(lián)物的方法。此外，以上公開的涉及一般性肽或HAS的關(guān)于HAS-EPO或其制備的所有實(shí)施方案，也適用于本發(fā)明生產(chǎn)HAS-多肽偶聯(lián)物的方法。
本發(fā)明還涉及一種可通過本發(fā)明方法獲得的HAS-多肽。優(yōu)選地，該HAS-多肽具有上述用于限定本發(fā)明HAS-EPO的特征。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，使用的HAS具有下列通式(I)
其中，R1、R2和R3分別是氫，或者是直鏈或支鏈羥烷基。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“羥烷基淀粉”不只限于末端碳水化合物部分含有如通式(I)所示的羥烷基R1、R2和/或R3的化合物(為了簡(jiǎn)短起見)，也指如下化合物在末端碳水化合物部分和/或淀粉分子的其余部分HAS’中任何處存在的至少一個(gè)羥基被羥烷基R1、R2或R3取代。其中，烷基可以是直鏈或支鏈烷基，它可以被適當(dāng)?shù)娜〈?yōu)選地，羥烷基含有1-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選1-6個(gè)碳原子，更優(yōu)選1-4個(gè)碳原子，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子。因此，“羥烷基淀粉”優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中羥乙基淀粉和羥丙基淀粉是特別優(yōu)選的，尤其優(yōu)選羥乙基淀粉。
HAS(優(yōu)選HES)可以與交聯(lián)化合物反應(yīng)，該交聯(lián)劑可以與HAS(優(yōu)選HES)反應(yīng)，并且可與多肽(如上述多肽)反應(yīng)。
HAS與交聯(lián)化合物之間的反應(yīng)可以在HAS的還原性末端或在HAS的氧化的還原性末端發(fā)生。因此，具有通式(I)結(jié)構(gòu)的HAS 和/或，如果還原性末端被氧化，則具有通式(IIa)
和/或通式(IIb)結(jié)構(gòu)的HAS 可以反應(yīng)。
如果通式(I)的HAS與交聯(lián)化合物反應(yīng)，則反應(yīng)優(yōu)選在水介質(zhì)中發(fā)生。如果通式(IIa)和/或(IIb)的HAS與交聯(lián)化合物反應(yīng)，則反應(yīng)優(yōu)選在非水介質(zhì)中發(fā)生，例如極性非質(zhì)子溶劑或溶劑混合物如DMSO，和/或DMF。
如果通過含有HAS和交聯(lián)化合物的HAS衍生物與多肽的氧化的碳水化合物部分反應(yīng)產(chǎn)生本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物，則該交聯(lián)化合物優(yōu)選地是下述化合物H2N-NH2或 或
如果通過含有HAS和至少一種交聯(lián)化合物的HAS衍生物與多肽的巰基反應(yīng)產(chǎn)生本發(fā)明HAS-多肽偶聯(lián)物，則優(yōu)選地，HAS在任選氧化的還原性末端與第一種交聯(lián)化合物反應(yīng)，該交聯(lián)化合物優(yōu)選是下述化合物H2N-NH2或 或


并且產(chǎn)生的HAS衍生物與第二種交聯(lián)化合物反應(yīng)，第二種交聯(lián)化合物能夠與該HAS衍生物和多肽的巰基反應(yīng)。例如，如果HAS衍生物含有結(jié)構(gòu)-NH-作為與第二種交聯(lián)化合物反應(yīng)的官能團(tuán)，則如上詳述的，含有官能團(tuán)F1和F2的以下類型的第二種交聯(lián)化合物尤其是優(yōu)選的

第一種交聯(lián)化合物的特別優(yōu)選的例子是


和

化合物
和 是特別優(yōu)選的，下列第二種交聯(lián)化合物是優(yōu)選的， 和 化合物 是特別優(yōu)選的。
根據(jù)各自的反應(yīng)條件、使用的溶劑或溶劑混合物和/或在水介質(zhì)中與HAS反應(yīng)的化合物R′-NH-R″的殘基R′和/或R″，通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物可以具有下列結(jié)構(gòu)(IIIa) 因此，本發(fā)明也涉及如上所述具有通式(IIIa)結(jié)構(gòu)的羥烷基淀粉衍生物。
例如，如果R′是氫，則通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物也可能具有下列結(jié)構(gòu)(IIIa)或(IIIb)，其中(IIIa)和(IIIb)可以在反應(yīng)混合物中同時(shí)存在，并具有一定的平衡分布
因此，本發(fā)明也涉及如上所述具有根據(jù)通式(IIIb)結(jié)構(gòu)的羥烷基淀粉衍生物。
而且，本發(fā)明也涉及以上述通式(IIIa)和(IIIb)結(jié)構(gòu)的混合物存在的羥烷基淀粉衍生物。
根據(jù)反應(yīng)條件和/或用于反應(yīng)的化合物R′-NH-R″的化學(xué)性質(zhì)，通式(IIIa)的化合物可以在平伏位置或直立位置含有N原子，也可能存在具有一定平衡分布的兩種型式的混合物。
根據(jù)反應(yīng)條件和/或用于反應(yīng)的化合物R′-NH-R″的化學(xué)性質(zhì)，通式(IIIb)化合物可能含有E或Z構(gòu)象的C-N雙鍵，也可能存在具有一定平衡分布的兩種型式的混合物。
在某些情況下，可能希望穩(wěn)定通式(IIIa)的化合物，特別是在水溶液中生產(chǎn)并使用通式(IIIa)的化合物時(shí)。作為穩(wěn)定方法，特別優(yōu)選?；ㄊ?IIIa)的化合物，特別是當(dāng)R′是氫時(shí)。可以使用產(chǎn)生通式(IVa)的羥烷基淀粉衍生物的任何適當(dāng)試劑作為?；瘎?。

根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，作為?；瘎┮徊糠值臍埢鵕a是甲基。優(yōu)選使用羧酸酐、羧酸酰鹵和羧酸活化的酯作為?；瘎?br> 因此，本發(fā)明也涉及可以通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物，其中該衍生物具有通式(IVa)的結(jié)構(gòu)。
?；?-30℃下進(jìn)行，優(yōu)選地在2-20℃下進(jìn)行，特別優(yōu)選地在4-10下進(jìn)行。
在其它一些情況下，可能希望穩(wěn)定通式(IIIb)的化合物，特別是當(dāng)在水溶液中生產(chǎn)和/或使用通式(IIIb)的化合物時(shí)。作為穩(wěn)定方法，還原通式(IIIb)的化合物是特別優(yōu)選的，特別是當(dāng)R′是氫時(shí)?？梢允褂卯a(chǎn)生通式(IVb)的羥烷基淀粉衍生物的任何適當(dāng)試劑作為還原劑。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，使用硼氫化物如NaCNBH3或NaBH4，作為還原試劑。
因此，本發(fā)明也涉及可以通過上述方法獲得的羥烷基淀粉衍生物，其中該衍生物具有通式(IVb)的結(jié)構(gòu)。
還原在4-100℃下進(jìn)行，優(yōu)選地在10-90℃下進(jìn)行，特別優(yōu)選地在25-80℃下進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及化合物(IIIa)和(IIIb)、(IVa)和(IVb)、(IIIa)和(VIa)、(IIIa)和(IVb)、(IIIb)和(IVa)、(IIIb)和(IVb)、(IIIa)和(IIIb)和(IVa)、(IIIa)和(IIIb)和(IVb)、(IVa)和(IVb)和(IIIa)，以及(IVa)和(IVb)和(IIIb)的混合物，其中(IIIa)和/或(IVa)可以獨(dú)立地以N原子位于平伏或直立位置的構(gòu)象存在，和/或(IIIb)可以以E或Z構(gòu)象的C-N雙鍵形式存在。
本發(fā)明還涉及在治療人或動(dòng)物體的方法中使用的本發(fā)明的HAS-多肽。
此外，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明HAS-多肽的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物還含有至少一種在促紅細(xì)胞生成素治療中使用的藥學(xué)可接受的稀釋劑、佐劑和/或載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明HAS-多肽在制備治療貧血性疾病或造血功能障礙性疾病或與之相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過下列附圖、表和實(shí)施例進(jìn)一步說明，它們絕非旨在限制本發(fā)明的范圍。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖1顯示兩種HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析mw分子量標(biāo)準(zhǔn)1道根據(jù)實(shí)施例方案8產(chǎn)生的HES-EPOEPO與酰肼基-HES 12KDL偶聯(lián)2道根據(jù)實(shí)施例方案9產(chǎn)生的HES-EPOEPO與羥胺基HES 12KDK偶聯(lián)C對(duì)照(未偶聯(lián)的EPO)；上面的一條帶代表EPO二聚體圖2圖2通過顯示多肽N-糖苷酶對(duì)HAS修飾的EPO型的消化，證明HES與碳水化合物側(cè)鏈的碳水化合物部分偶聯(lián)1道根據(jù)實(shí)施例方案8產(chǎn)生的HES-EPO，N-糖苷酶消化2道根據(jù)實(shí)施例方案9產(chǎn)生的HES-EPO，N-糖苷酶消化3道BRP EPO標(biāo)準(zhǔn)4道BRP EPO標(biāo)準(zhǔn)，N-糖苷酶消化mw分子量標(biāo)準(zhǔn)(Bio-Rad SDS-PAGE Standards Low range，目錄號(hào)161-0305，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)
圖3圖3顯示根據(jù)實(shí)施例17.1產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。
A道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。
B道根據(jù)實(shí)施例17.1偶聯(lián)后的粗制品。
C道EPO初始材料圖4圖4顯示根據(jù)實(shí)施例17.3產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。
A道根據(jù)實(shí)施例17.3偶聯(lián)后的粗制品。
B道EPO初始材料C道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。
圖5圖5顯示根據(jù)實(shí)施例17.4和17.5產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。
A道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。
B道根據(jù)實(shí)施例17.4偶聯(lián)后的粗制品。
C道根據(jù)實(shí)施例17.5偶聯(lián)后的粗制品。
D道EPO初始材料。
圖6
圖6顯示根據(jù)實(shí)施例19.1和19.4產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。
A道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。
B道根據(jù)實(shí)施例19.4偶聯(lián)后的粗制品。
C道根據(jù)實(shí)施例19.1偶聯(lián)后的粗制品。
D道EPO初始材料。
圖7圖7顯示根據(jù)實(shí)施例19.2、19.3、19.5和19.6產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。
A道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。
B道根據(jù)實(shí)施例19.6偶聯(lián)后的粗制品，基于實(shí)施例13.3b)。
C道根據(jù)實(shí)施例19.5偶聯(lián)后的粗制品，基于實(shí)施例13.1b)。
D道根據(jù)實(shí)施例19.6偶聯(lián)后的粗制品，基于實(shí)施例13.3a)。
E道根據(jù)實(shí)施例19.5偶聯(lián)后的粗制品，基于實(shí)施例13.1a)。
F道根據(jù)實(shí)施例19.2偶聯(lián)后的粗制品。
G道根據(jù)實(shí)施例19.3偶聯(lián)后的粗制品。
K道EPO初始材料。
圖8圖8顯示根據(jù)實(shí)施例19.7、19.8、19.9、19.10、19.11和19.12產(chǎn)生的HES-EPO偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析。
A道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量(kD)從上到下依次為245，123，77，42，30，25.4和17。
B道根據(jù)實(shí)施例19.11偶聯(lián)后的粗制品。
C道根據(jù)實(shí)施例19.10偶聯(lián)后的粗制品。
D道根據(jù)實(shí)施例19.7偶聯(lián)后的粗制品。
E道根據(jù)實(shí)施例19.8偶聯(lián)后的粗制品。
F道根據(jù)實(shí)施例19.12偶聯(lián)后的粗制品。
G道EPO初始材料。
K道根據(jù)實(shí)施例19.9偶聯(lián)后的粗制品。
圖9EPO-GT-1的SDS-PAGE分析，其中弱酸處理5分鐘＝2道；10分鐘＝3道；60分鐘＝4道，未處理的EPO＝1道；顯示除去N-聚糖后EPO的遷移率變化(+N-糖苷酶(PNGase))。
圖10從未處理的EPO中以及在弱酸水解條件下溫育5分鐘、10分鐘、60分鐘的EPO中所分離的寡糖的HPAEC-PAD(高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法)圖。羅馬數(shù)字I-V表示洗脫位置，I＝二唾液酸化的二分支結(jié)構(gòu)，II＝三唾液酸化的三分支結(jié)構(gòu)(兩種異構(gòu)體)，III＝四唾液酸化的四分支結(jié)構(gòu)+2個(gè)N-乙?；樘前分貜?fù)，IV＝四唾液酸化的四分支結(jié)構(gòu)+1個(gè)N-乙?；樘前分貜?fù)；V＝四唾液酸化的四分支結(jié)構(gòu)+不含N-乙?；樘前分貜?fù)。不含及含有1-4個(gè)唾液酸的寡糖結(jié)構(gòu)的洗脫區(qū)用括號(hào)表示。
圖11去唾液酸化后N-連接寡糖的HPAEC-PAD；顯示了N-乙酰神經(jīng)氨酸的洗脫位置；數(shù)字1-9表示標(biāo)準(zhǔn)寡糖的洗脫位置；1＝二分支；2＝三分支(2-4種異構(gòu)體)，3＝三分支(2-6種異構(gòu)體)，4＝四分支；5＝三分支+1個(gè)重復(fù)；6＝四分支+1個(gè)重復(fù)；7＝三分支+2個(gè)重復(fù)；8＝四分支+2個(gè)重復(fù)；9＝四分支+3個(gè)重復(fù)。
圖12溫和處理的和未處理的EPO在唾液酸殘基經(jīng)受高碘酸鹽氧化后的SDS-PAGE分析。1＝高碘酸鹽氧化，未酸處理；2＝高碘酸鹽氧化5分鐘，酸處理；3＝高碘酸鹽氧化和酸處理10分鐘；4＝高碘酸鹽氧化，未酸處理；5＝未高碘酸鹽氧化且未酸處理的BRP EPO標(biāo)準(zhǔn)。
圖13從未處理的EPO中以及從在弱酸水解條件下溫育5分鐘和10分鐘隨后高碘酸鹽處理的EPO中分離的天然寡糖的HPAEC-PAD模式。不含及含有1-4個(gè)唾液酸的寡糖結(jié)構(gòu)的洗脫區(qū)用括號(hào)1-5表示。
圖14EPO-GT-1-A的HES修飾時(shí)間過程的SDS-PAGE分析20μg等份EPO-GT-1-A與羥胺修飾的HES衍生物X反應(yīng)30分鐘、2、4、17小時(shí)。1道＝30分鐘反應(yīng)時(shí)間；2道＝2小時(shí)反應(yīng)時(shí)間；3道＝4小時(shí)反應(yīng)時(shí)間；4道＝17小時(shí)反應(yīng)時(shí)間；5道＝?jīng)]有HES修飾的EPO-GT-1-A。左圖顯示在羥胺修飾的HES衍生物(流速1ml.min-1)X存在下，隨著溫育時(shí)間延長(zhǎng)，EPO-GT-1-A的遷移率改變1道＝30分鐘反應(yīng)時(shí)間；2道＝2小時(shí)反應(yīng)時(shí)間；3道＝4小時(shí)反應(yīng)時(shí)間；4道＝17小時(shí)反應(yīng)時(shí)間；5道＝HES修飾的EPO-GT-1-A。右圖顯示相同樣品用N-糖苷酶處理后的分析。
圖15HES-EPO偶聯(lián)物的Q-Sepharose級(jí)分的SDS-PAGE分析。各1％的穿流液(flow-through)以及在高鹽濃度下洗脫的1％級(jí)分用Speed Vac濃縮器濃縮，在樣品緩沖液中加樣到凝膠上。EPO蛋白用考馬斯藍(lán)染色。A＝樣品I；B＝樣品II；C＝樣品III；K＝對(duì)照EPO-GT-1；A1、B1、C1和K1表示穿流液部分；A2、B2、C2和K2表示用高鹽濃度洗脫的級(jí)分。
圖16aHES修飾的EPO樣品A2(見圖15)、對(duì)照EPO樣品K2和EPO-GT-1-A的SDS-PAGE分析。為了除去N-連接的寡糖，在N-糖苷酶存在下消化EPO制品。所有EPO樣品都顯示遷移率向缺乏或含有O-聚糖的低分子量型轉(zhuǎn)變。對(duì)于HES-修飾的EPO樣品A2，在去-N-糖基化后觀察到O-糖基化與非糖基化蛋白帶的比值較低，在30KDa左右檢測(cè)到一條彌散的蛋白帶，這可能代表O-聚糖殘基的唾液酸處的HES-修飾(見星號(hào)標(biāo)記的箭頭)。
圖16b未處理的或者在N-糖苷酶存在下消化除去N-連接寡糖(見圖16a)的HES-修飾EPO樣品A2(見圖15)、對(duì)照EPO樣品K2和EPO-GT-1A在溫和水解后的SDS-PAGE分析。在N-糖苷酶處理之前的高分子量型A2和處理之后的高分子量型A(見有箭頭及無(wú)箭頭的括號(hào))在樣品酸處理后都消失。用于比較的BRP EPO標(biāo)準(zhǔn)沒有進(jìn)行弱酸處理。
圖17從HES修飾的樣品A、EPO-GT-1-A以及與未修飾HES溫育的對(duì)照EPO樣品(K)中釋放的N-連接寡糖物質(zhì)的HPAEC-PAD分析。羅馬數(shù)字I-V表示洗脫位置，I＝二唾液酸化的二分支結(jié)構(gòu)，II＝三唾液酸化的三分支結(jié)構(gòu)(兩種異構(gòu)體)，III＝四唾液酸化的四分支結(jié)構(gòu)+2個(gè)N-乙?；樘前分貜?fù)，IV＝四唾液酸化的四分支結(jié)構(gòu)+1個(gè)N-乙?；樘前分貜?fù)；V＝四唾液酸化的四分支結(jié)構(gòu)+不含N-乙酰基乳糖胺重復(fù)；括號(hào)表示二、三、四唾液酸化的N-聚糖的洗脫區(qū)，如圖10和圖13的圖例所述。
圖18從HES修飾的樣品A、EPO-GT-1-A以及與未修飾HES溫育的對(duì)照EPO樣品(K)中釋放的N-連接寡糖物質(zhì)的HPAEC-PAD分析。顯示了標(biāo)準(zhǔn)寡糖混合物的保留時(shí)間數(shù)字1-9表示標(biāo)準(zhǔn)寡糖的洗脫位置1＝二分支；2＝三分支(2-4種異構(gòu)體)，3＝三分支(2-6種異構(gòu)體)，4＝四分支；5＝三分支+1個(gè)重復(fù)；6＝四分支+1個(gè)重復(fù)；7＝三分支+2個(gè)重復(fù)；8＝四分支+2個(gè)重復(fù)；9＝四分支+3個(gè)重復(fù)。
圖19-25圖19-25表示從HES修飾的EPO和對(duì)照EPO制品中分離的酶釋放的和化學(xué)去唾液酸化的N-聚糖的MALDI/TOF質(zhì)譜。在m/z1809.7、2174.8、2539.9、2905.0和3270.1處的主要信號(hào)([M+Na]+)對(duì)應(yīng)于二到四分支的不含、含有一個(gè)或兩個(gè)N-乙酰基乳糖胺重復(fù)的復(fù)雜型N-聚糖結(jié)構(gòu)，并且伴有由于對(duì)MS分析的樣品去唾液酸化所使用的酸水解條件引起巖藻糖或半乳糖損失所致的弱信號(hào)。
圖19MALDI/TOF譜HES-修飾的EPO A2的去唾液酸化寡糖。
圖20MALDI/TOF譜EPO GT-1-A的去唾液酸化寡糖。
圖21MALDI/TOF譜EPO K2的去唾液酸化寡糖。
圖22MALDI/TOF譜EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
圖23MALDI/TOF譜酸水解5分鐘EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
圖24MALDI/TOF譜酸水解10分鐘EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
圖25MALDI/TOF譜酸水解60分鐘EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
實(shí)施例實(shí)施例1重組EPO的生產(chǎn)A)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生產(chǎn)重組EPO如下在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)將攜帶人EPO cDNA的質(zhì)?？寺〉秸婧吮磉_(dá)載體中(pCR3，在下文中稱為pCREPO)。如述利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Grabenhorst，Nimtz，Costa等人，1998，In vivo specificity of human alpha1，3/4-fucosyltrans ferases III-VII in the biosynthesis ofLewis(x)and sialyl Lewis(x)motifs on complex-type N-glycans-Coexpression studies from BHK-21 cells together with humanbeta-trace protein，J.Biol.Chem.，273(47)，30985-30994)。
穩(wěn)定表達(dá)人EPO或其氨基酸變體(例如Cys-29→Ser/Ala，或Cys-33→Ser/Ala，Ser-126→Ala等)的CHO細(xì)胞用磷酸鈣沉淀法產(chǎn)生，如述(Grabenhorst等人)用硫酸G418篩選。轉(zhuǎn)染三天后，將細(xì)胞1∶5傳代培養(yǎng)，在含有10％FBS和1.5g/l硫酸G418的DMEM中篩選。
采用這種篩選操作，通常有100-500個(gè)克隆存活，在選擇培養(yǎng)基中再繁殖2-3周。然后通過Western blot和IEF/Western Blot分析匯合生長(zhǎng)之單層的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的EPO表達(dá)水平。
EPO由穩(wěn)定的亞克隆在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中或者在21灌注反應(yīng)器(perfusion reactors)中產(chǎn)生。按照發(fā)表的方案，含有不同數(shù)量NeuAc(例如2-8、4-10、8-12個(gè)NeuAc殘基)的EPO的不同糖型(glycoform)用如下所述多種層析法的組合分離。
文獻(xiàn)Grabenhorst，Conradt，1999，The cytoplasmic，transmembrane，and stem regions of glycosyltransferases specify their in vivofunctional sublocalization and stability in the Golgi.J BiolChem.，274(51)，36107-16；Grabenhorst，Schlenke，Pohl，Nimtz，Conradt，1999，Genetic engineering of recombinantglycoproteins and the glycosylationpathway in mammalian hostcells，Glycoconj J.，16(2)，81-97；Mueller，Schlenke，Nimtz，Conradt，Hauser，1999，Recombinant glycoprotein productqualiry in proliferation-controlled BHK-21 cells，Biotechnology and bioengineering，65(5)，529-536；Schlenke，Grabenhorst，Nimtz，Conradt，1999，Construction andcharacterization of stably transfected BHK-21 cells withhuman-type sialylation characteristic，Cytotechnology，30(1-3)，17-25。
B)在昆蟲細(xì)胞中的生產(chǎn)如文獻(xiàn)所述，用含有受多角體蛋白啟動(dòng)子控制的人EPOcDNA的重組桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，由昆蟲細(xì)胞系SF9和SF 21產(chǎn)生重組人EPO。
在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞以2×106或2×107個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染，每天測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的EPO滴度。EPO通過Bluesepharose層析、Q-Sepharose上的離子交換層析、最后通過C4相上的RP-HPLC純化。
產(chǎn)物的純度通過SDS-PAGE和N末端測(cè)序證實(shí)。詳細(xì)的碳水化合物結(jié)構(gòu)分析(N-和O-糖基化)按照發(fā)表的操作進(jìn)行。
文獻(xiàn)Grabenhorst，Hofer，Nimtz，Jager，Conradt，1993，Biosynthesis and secretion of human in terleukin 2 glycoproteinvariants from baculovirus-infecrted Sf21 cells.Charaterization of polypeptides and posttranslationalmodifications，Eur J Biochem.，215(1)，189-97；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-level expression andpurification of a recombinant human erythropoietin producedusing a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7.
實(shí)施例2
反應(yīng)性HES衍生物的形成1.SH-反應(yīng)性HES1.1EMCH與氧代-HES12KD反應(yīng)，形成SH-反應(yīng)性HES 12KD BB 將0.144g(0.012mmol)氧代-HES12KD(Fresenius GermanPatent DE 196 28 705 A1)溶解于0.3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?4mg(0.15mmol)EMCH(Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))在1.5mL DMSO中的混合物中。在60℃下攪拌19小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至16mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀，再溶解于3mL DMSO中，如上所述再次沉淀。通過離心及真空干燥獲得SH-反應(yīng)性HES 12KD B。與巰基-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例3的2.2中描述。
備選方案在該反應(yīng)中可以使用具有被間隔區(qū)隔開的酰肼和馬來酰亞胺官能基的所有交聯(lián)劑。表2列出了可從Perbio Science，DeutschlandGmbH，Bonn，Germany獲得的這類分子的另外一些實(shí)例；用“A”標(biāo)記。此外，也可以使用具有活化的二硫醚功能團(tuán)而不是馬來酰亞胺的另外一類交聯(lián)劑。
1.2HES糖基胺的鹵代乙酰胺衍生物a)糖基胺的形成1將1mg HES12KD樣品溶解于3mL飽和碳酸氫銨中。然后另外加入固體碳酸氫銨，以使溶液在30℃120小時(shí)的溫育過程中保持飽和。氨基-HES12KD C通過直接凍干反應(yīng)混合物脫鹽。
1Manger，Wong，Rademacher，Dwek，1992，Biochemistry，31，10733-10740；Manger，Rademacher，Dwek，1992，Biochemistry，31，10724-10732b)用氯乙酸酐?；腔稢將1mg氨基-HES12KD C樣品溶解于1mL 1M碳酸氫鈉中，在冰上冷卻。加入固體氯乙酸酐晶體(～5mg)，使反應(yīng)混合物升溫至室溫。監(jiān)測(cè)pH，如果pH下降到7.0以下則另外加入堿。在室溫下2小時(shí)后，加入第二份堿和酸酐。6小時(shí)后產(chǎn)物氯乙酰胺-HES D1(X＝Cl)通過混合床Amberlite MB-3(H)(OH)離子交換樹脂脫鹽。
c)用溴乙酸酐?；腔?溴乙酸酐如Thomas所述制備3。將1mg氨基-HES12KD C樣品溶解于0.1mL干DMF中，在冰上冷卻，加入5mg溴乙酸酐。使反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫，攪拌溶液3小時(shí)。在-20℃下將反應(yīng)混合物加至1mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀，再溶解于0.1mLDMF中，如上所述再次沉淀。通過離心及真空干燥獲得溴乙酰胺-HESD2(X＝Br)。與巰基-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例3的1.2中描述。
2Black，Kiss，Tull，Withers，1993，Carbohydr.Res.，250，1953Thomas，1977，Methodes Enymol.，46，362d)相應(yīng)的碘衍生物D3(X＝I)如合成D2所述合成。使用碘乙酸N-琥珀酰亞胺酯代替溴乙酸酐，所有步驟都避光進(jìn)行。
備選方案
對(duì)于氨基的酰化，可以使用鹵素、酸的其它活化形式，例如--溴化物或-氯化物-酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯，與取代酚的酯(對(duì)硝基酚、五氟酚、三氯酚等)此外，也可以使用含有被間隔區(qū)隔開的反應(yīng)性氨基和鹵代乙?；乃薪宦?lián)劑。一個(gè)例子是SBAP。該分子及其它一些分子可獲自Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó)。它們?cè)诒?中用“D”標(biāo)記。關(guān)于不需要分離鹵代乙酰胺-HES衍生物就可以連接氨基-HES與巰基-EPO的交聯(lián)劑，見實(shí)施例3中1.2的解釋。
1.3氨基-HES E的鹵代乙酰胺衍生物1a)1，4-二氨基丁烷與氧代-HES12KD反應(yīng)，產(chǎn)生氨基-HES12KDE44S.Frie，Diplomarbeit，F(xiàn)achhochschule Hamburg，1998將1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.51mL(15mmol)1，4-二氨基丁烷在15mL DMSO中的混合物中。在40℃下攪拌19小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀氨基-HES12KDE，再溶解于40mL水中，對(duì)水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量(cut off)，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
b)氯乙酰胺-HES12KD F1按上述1.3中制備氯乙酰胺-HES12KDD1的所述方法制備。
c)溴乙酰胺-HES12KD F2(X＝Br)按上述1.3中制備溴乙酰胺-HES12KD D2的所述方法制備。與巰基-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例3的1.2中描述。
d)相應(yīng)的碘衍生物F3(X＝I)在與巰基-EPO反應(yīng)之前不分離。實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例3的1.1中描述。
備選方案參見上文1.2。
2.CHO-反應(yīng)性HES2.1酰肼-HESa)肼與氧代-HES12KD的反應(yīng) 將1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.47mL(15mmol)肼在15mLDMSO中的混合物中。在40℃下攪拌19小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物J，再溶解于40mL水中，用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例4的2.2中描述。
b)己二酸二酰肼與氧代-HES12KD的反應(yīng) 在65℃下將1.74g(15mmol)己二酸二酰肼溶解于20mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭尤肴芙庥?mL無(wú)水DMSO中的
1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD。在60℃下攪拌68小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至200mL水中。含有L的溶液用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例4的2.2中描述。
備選方案此外，也可以使用2個(gè)酰肼基被任一間隔區(qū)分隔的衍生物。
3.另外的氨基-HES12KD衍生物I和H1D或F的氨解如下分開進(jìn)行將各1mg鹵代乙酰胺樣品溶解于0.1mL飽和碳酸銨中。然后加入另外的固體碳酸銨，以使溶液在30℃120小時(shí)的溫育過程中保持飽和。在-20℃下將反應(yīng)混合物加至1mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀物，再溶解于0.05mL水中，如上所述再次沉淀。通過離心及真空干燥獲得產(chǎn)物氨基HESH或I。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例4的4.1中描述。
4.羥胺修飾的HES12KD K O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺如Boturyn等人所述用可以購(gòu)得的材料通過兩步合成5。將1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.04g(15mmol)O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺在15mLDMSO中的混合物中。在65℃下攪拌48小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物K，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例4的3.1中描述。
備選方案此外，也可以使用兩個(gè)羥胺基團(tuán)被任何間隔區(qū)隔開的衍生物。
5Boturyn，Boudali，Constant，Defrancq，Lhomme，1997，Tetrahedron，53，54855.巰基-HES12KD5.1向氧代-HES12KD中添加 將1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.16g(15mmol)巰乙胺在15mLDMSO中的混合物中。在40℃下攪拌24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物M，再溶解于40mL水中，用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。與氧化的Glyco-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)在實(shí)施例4的2.1中描述。
備選方案也可以使用氨基和硫功能基被任何分隔區(qū)隔開的衍生物。此外，衍生物中的氨基也可以被置換為肼、酰肼或羥胺基團(tuán)。硫功能基可以以例如二硫醚或三苯甲基衍生物的形式受到保護(hù)。但在這種情況下，在偶聯(lián)之前必須進(jìn)行額外的脫保護(hù)步驟，該步驟將釋放一種類似于M的成分。
5.2氨基HES12KD E、H或I的修飾a)用SATA/SATP修飾將1.44g(0.12mmol)氨基-HES12KD E、H或I溶解于3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?39mg(0.6mmol)SATA在5mL DMSO中的混合物中。在室溫下攪拌24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物N，再溶解于40mL水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
脫保護(hù)在含有25mM EDTA和0.5M羥胺的50mM磷酸鈉緩沖液pH7.5中進(jìn)行，室溫下2小時(shí)，通過用含有1mM EDTA的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5透析來純化產(chǎn)物O。在脫保護(hù)反應(yīng)之后立即進(jìn)行實(shí)施例4的2.1中描述的偶聯(lián)反應(yīng)。

b)用SPDP修飾將1.44g(0.12mmol)氨基-HES12KD E、H或I溶解于3mL無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?87mg(0.6mmol)SPDP在5mL DMSO中的混合物中。在室溫下攪拌24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物P，再溶解于40mL水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
脫保護(hù)在每0.5mL含有12mg二硫蘇糖醇(DTT)的100mM乙酸鈉緩沖液(含100mM氯化鈉)pH4.5中進(jìn)行，室溫下30分鐘，通過用含有1mM EDTA的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5透析來純化產(chǎn)物Q。在脫保護(hù)反應(yīng)之后立即進(jìn)行實(shí)施例4的2.1中描述的偶聯(lián)反應(yīng)。
備選方案對(duì)于氨基向游離形式或受保護(hù)的硫醇基的轉(zhuǎn)化，可以使用幾種試劑。在修飾后，可以分離產(chǎn)物。此外，關(guān)于交聯(lián)劑的使用，它們可以直接用于偶聯(lián)反應(yīng)，優(yōu)選在純化步驟之后使用。受保護(hù)形式的巰基-HES衍生物的合成可以用于分離和貯存巰基-HES衍生物。為此，可以使用類似于SATA的所有衍生物，它們含有被任何間隔區(qū)隔開的活性酯官能團(tuán)和硫酯官能團(tuán)。表2中的SATP(用“H”標(biāo)記)是該類的另外一個(gè)成員。與SPDP類似的衍生物可能含有被任何間隔區(qū)隔開的活性酯官能團(tuán)和二硫醚官能團(tuán)。表2中可見這些類的其它一些成員，用“F”標(biāo)記。其它類似的衍生物可能含有被任何間隔區(qū)隔開的活性酯官能團(tuán)和作為三苯甲基衍生物而受到保護(hù)的硫醇官能團(tuán)。
實(shí)施例3與巰基-EPO的偶聯(lián)反應(yīng)1.巰基-EPO與鹵代乙酰胺修飾的SH-反應(yīng)性HES的反應(yīng)1.1實(shí)施例方案1使用含有NHS-活性酯和碘乙酰胺基團(tuán)的交聯(lián)劑例如SIA偶聯(lián)巰基-EPO與氨基-HES12KD(E、H或I)6
6Cumber，F(xiàn)orrester，F(xiàn)oxwell，Ross，Thorpe，1985，MethodsEnrymol.，112，207材料A.硼酸鹽緩沖液。組成為50 mM硼酸鈉，pH8.3，5mM EDTA。
B.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4。
C.氨基-HES12KD E、H或I。在硼酸鹽緩沖液中以1mg/mL制備。
D.交聯(lián)劑貯存液14mg SIA溶解于1mL DMSO中。
E.D-SaltTM葡聚糖脫鹽柱，2×5mL柱床體積(Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó))F.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))G.巰基EPO溶液硼酸鹽緩沖液中的5mg/mL巰基EPO1H.微量濃縮器Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德國(guó))方法將100μL SIA溶液加至400μL氨基HES12KD E溶液中，在室溫下攪拌使之反應(yīng)0.5小時(shí)。用微量濃縮器以14000×g離心樣品60分鐘除去過量的交聯(lián)劑。離心后，用硼酸鹽緩沖液使樣品達(dá)到其初始體積，該步驟重復(fù)兩次以上。將所得溶液加至1mL巰基EPO溶液中，反應(yīng)混合物在室溫下溫育16小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，通過加入半胱氨酸至終濃度為10mM來終止過量碘乙酰胺的反應(yīng)性。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的脫鹽柱上，用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分中的蛋白質(zhì)含量。合并含蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。
備選方案在該反應(yīng)中，可以使用含有被間隔區(qū)隔開的琥珀酰亞胺或硫代琥珀酰亞胺官能團(tuán)和碘乙酰胺官能團(tuán)的所有交聯(lián)劑。表2中可見其它一些實(shí)例。它們用“C”標(biāo)記，可獲自Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó)。
1.2實(shí)施例方案2巰基EPO 1與SH反應(yīng)性HES12KD溴乙酰胺D2、F2或碘乙酰胺D3的偶聯(lián)7材料A.磷酸鹽緩沖液組成為100mM磷酸鈉，pH6.1，5mM EDTA。
B.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4。
C.SH反應(yīng)性HES12KD溴乙酰胺D2。在磷酸鹽緩沖鹽水中以10mg/mL制備。
D.D-SaltTM葡聚糖脫鹽柱，2×5mL柱床體積(Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó))E.Coomassie蛋白質(zhì)測(cè)定試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))F.巰基EPO溶液磷酸鹽緩沖鹽水中的5mg/mL巰基EPO1方法1mL SH反應(yīng)性HES12KD溴乙酰胺D2溶液與1mL巰基-EPO溶液混合，反應(yīng)混合物在室溫下溫育48小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，通過加入半胱氨酸至終濃度10mM終止過量溴乙酰胺的反應(yīng)性。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的脫鹽柱上。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量，合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，在用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。
7de Valasco，Merkus，Anderton，Verheul，Lizzio，Van der Zee，van Eden，Hoffmann，Verhoef，Snippe，1995，Infect.Immun.，63，961備選方案代替SH反應(yīng)性HES12KD-溴乙酰胺D2的分離，氨基HES12KD(E，H，I)可以通過琥珀酰亞胺官能團(tuán)和溴乙酰胺官能團(tuán)用交聯(lián)劑連接(見上文1.1)。SBAP是這類交聯(lián)劑的一個(gè)成員，在表2中可見，用“D”標(biāo)記。
2.巰基-EPO與馬來酰亞胺修飾的SH反應(yīng)性HES的反應(yīng)2.1實(shí)施例方案3用含有酰肼和馬來酰亞胺官能團(tuán)的交聯(lián)劑例如M2C2H來偶聯(lián)巰基EPO與HES12KD材料A.M2C2H貯存液DMSO中的10mg/mL M2C2H，新鮮制備B.HES12KD0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5中的10mg/mLC.巰基EPO溶液磷酸鹽/NaCl緩沖液中的5mg/mL巰基EPOD.磷酸鹽/NaCl0.1M磷酸鈉，50mM NaCl，pH7.0E.微量濃縮器Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德國(guó))F.凝膠過濾柱例如，SephadexG-200(1.5×45cm)G.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))H.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4。
方法將M2C2H溶液加至400μL HES12KD溶液中至終濃度為1mM，使之在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)2小時(shí)。用微量濃縮器以14000×g離心樣品60分鐘除去過量的交聯(lián)劑。離心后，用磷酸鹽/NaCl緩沖液使樣品達(dá)到其初始體積，該步驟重復(fù)兩次以上。向M2C2H修飾的HES12KD中加入0.5mL巰基EPO溶液，反應(yīng)混合物在室溫下溫育2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，通過加入半胱氨酸至終濃度為10mM終止過量馬來酰亞胺的反應(yīng)性。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的ScphadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL為單位收集級(jí)分。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量。合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，在用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。
操作注意事項(xiàng)腙加合物在極端pH下略不穩(wěn)定。對(duì)于可能涉及低pH下處理的應(yīng)用，我們通過用PBS緩沖液中的30mM氰基硼氫化鈉處理，將腙還原為肼。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，該額外步驟是不必要的。
2.2實(shí)施例方案4巰基EPO與馬來酰亞氨基-HES12KD B的偶聯(lián)材料A.馬來酰亞氨基-HES12KD B0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5中的10mg/mLB.巰基EPO溶液磷酸鹽/NaCl緩沖液中的5mg/mL巰基EPOC.磷酸鹽/NaCl0.1M磷酸鈉，50mM NaCl，pH7.0D.凝膠過濾柱例如，SephadexG-200(1.5×45cm)E.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))F.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4。
方法1mL SH反應(yīng)性HES12KD B溶液與1mL巰基EPO1溶液混合，在室溫下溫育2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，通過加入半胱氨酸至終濃度10mM終止過量馬來酰亞胺的反應(yīng)性。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL為單位收集級(jí)分。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量。合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，在用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。
2.3實(shí)施例方案12使用含有NHS-活性酯和馬來酰亞胺官能團(tuán)的交聯(lián)劑例如SMCC來偶聯(lián)巰基EPO與氨基HES12KD(E，H，I)
材料A.微量濃縮器Microcon YM-10(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德國(guó))B.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4C.氨基HES12KD E、H或I。在PBS緩沖液中以10mg/mL制備。
D.SMCC溶液1mg SMCC溶解于50μLDMSO中E.D-SaltTM葡聚糖脫鹽柱，2×5mL柱床體積(Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó))F.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))G.巰基EPO1溶液PBS緩沖液中的5mg/mL巰基EPO方法向50μL SMCC溶液中加入400μl氨基HES12KD E溶液，使反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)80分鐘，在46℃下反應(yīng)10分鐘。通過使用微量濃縮器以14000×g離心樣品60分鐘除去過量的交聯(lián)劑。用PBS緩沖液使體積達(dá)到450μL，該步驟重復(fù)兩次以上。最后一次離心后，向所得溶液中加入PBS至450μL，加至1mL巰基EPO溶液中，反應(yīng)混合物在室溫下溫育16小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，通過加入半胱氨酸至終濃度10mM終止過量馬來酰亞胺的反應(yīng)性。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的脫鹽柱上。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量，合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。
備選方案在該反應(yīng)中，可以使用含有被間隔區(qū)隔開的琥珀酰亞胺或硫代琥珀酰亞胺官能團(tuán)和馬來酰亞胺官能團(tuán)的所有交聯(lián)劑。表2中可見這類分子的其它一些例子，用“E”標(biāo)記，可以獲自Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德國(guó)。還有另外一類交聯(lián)劑，它們含有活化的二硫醚官能團(tuán)而不是馬來酰亞胺官能團(tuán)。這些交聯(lián)劑也可以用于偶聯(lián)。而該偶聯(lián)物的二硫鍵在還原條件下可以被切割。這一類的成員在表2中用“F”標(biāo)記。第三類交聯(lián)劑利用乙烯砜官能團(tuán)代替馬來酰亞胺官能團(tuán)作為SH反應(yīng)性基團(tuán)。這一類的一個(gè)成員是“SVSB”，在表2中用“G”標(biāo)記。
實(shí)施例4與氧化的EPO的偶聯(lián)反應(yīng)1.Glyco-EPO的氧化1.1用偏高碘酸鈉氧化Glyco-EPO實(shí)施例方案5材料A.Glyco-EPO溶液乙酸鹽緩沖液中的10mg/mL Glyco-EPOB.偏高碘酸鈉溶液乙酸鹽緩沖液中的10mM或100mM高碘酸鈉，新鮮制備。暗處保存。使用這些溶液時(shí)，氧化混合物中高碘酸鈉的終濃度分別為1mM或10mM。
C.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5D.甘油E.微量濃縮器Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德國(guó))方法所有步驟都避光進(jìn)行。
向1mL冷Glyco-EPO溶液中加入0.1mL冷偏高碘酸鈉溶液，氧化反應(yīng)避光進(jìn)行1小時(shí)。如果待氧化的Glyco-EPO含有唾液酸殘基，則氧化條件是1mM高碘酸鈉，0℃。否則，使用室溫下10mM高碘酸鈉的條件。為了終止氧化，加入甘油至終濃度為15mM，并在0℃下溫育5分鐘。用微量濃縮器以14000×g離心產(chǎn)物60分鐘，除去過量的試劑和副產(chǎn)物。離心后，用下一修飾步驟所用的緩沖液例如乙酸鹽緩沖液，使樣品達(dá)到其初始體積。該步驟重復(fù)兩次以上。
1.2Glyco-EPO的酶氧化實(shí)施例方案6EPO的酶氧化在別處已經(jīng)有描述(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
2.與肼/酰肼衍生物的偶聯(lián)2.1實(shí)施例方案7用含有酰肼和馬來酰亞胺官能團(tuán)的交聯(lián)劑例如M2C2H(PerbioScience，Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))來偶聯(lián)氧化的Glyco-EPO與巰基-HES12KD M、O或Q。
材料A.M2C2H貯存液DMSO中的10mg/mL M2C2H，新鮮制備B.來自6.1.1的氧化的Glyco-EPO溶液乙酸鹽緩沖液中的5mg/mL Glyco-EPOC.巰基-HES12KD M、O或Q磷酸鹽/NaCl緩沖液中的10mg/mLD.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5E.磷酸鹽/NaCl0.1M磷酸鈉，50mM NaCl，pH7.0F.微量濃縮器Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德國(guó))G.凝膠過濾柱例如，SephadexG-200(1.5×45cm)H.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))I.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4方法向1mL氧化的Glyco-EPO中加入M2C2H貯存液至終濃度為1mM，使之在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)2小時(shí)。通過使用微量濃縮器以14000×g離心樣品60分鐘，除去過量的交聯(lián)劑。離心后，用磷酸鹽/NaCl緩沖液使樣品達(dá)到其初始體積，該步驟重復(fù)兩次以上。向M2C2H修飾的Glyco-EPO中加入1mL巰基-HES12KD M、O或Q溶液，反應(yīng)混合物在室溫下溫育16小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，通過加入半胱氨酸終止過量馬來酰亞胺的反應(yīng)性。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL為單位收集級(jí)分。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量，合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。
操作注意事項(xiàng)腙加合物在極端pH下略不穩(wěn)定。對(duì)于可能涉及低pH下處理的應(yīng)用，我們用PBS緩沖液中的30mM氰基硼氫化鈉處理，將腙還原為肼。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，該額外步驟是不必要的。
2.2實(shí)施例方案8氧化的Glyco-EPO與酰肼基-HES12KD L或J直接偶聯(lián)材料A.來自6.1.1的氧化的Glyco-EPO溶液乙酸鹽緩沖液中的5mg/mL Glyco-EPOB.酰肼基-HES12KD L或J乙酸鹽緩沖液中10mg/mLC.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5D.凝膠過濾柱例如，SephadexG-200(1.5×45cm)E.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))F.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4方法1mL酰肼基-HES12KD L或J溶液與1mL氧化的Glyco-EPO溶液混合，反應(yīng)混合物在攪拌下室溫溫育16小時(shí)。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL為單位收集級(jí)分。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量，合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。偶聯(lián)結(jié)果在圖24中顯示。觀察到的分子位移證明偶聯(lián)是成功的。拖尾(smear)是由于HES的不均一性引起的。圖25證明HES與碳水化合物側(cè)鏈的碳水化合物部分偶聯(lián)。
操作注意事項(xiàng)腙加合物在極端pH下略不穩(wěn)定。對(duì)于可能涉及低pH下處理的應(yīng)用，我們通過用PBS緩沖液中的30mM氰基硼氫化鈉處理，將腙還原為肼。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，該額外步驟是不必要的。
3.與羥胺衍生物的偶聯(lián)83.1實(shí)施例方案9氧化的Glyco-EPO與羥氨基-HES12KD K的偶聯(lián)材料A.來自6.1.1的氧化的Glyco-EPO溶液乙酸鹽緩沖液中的5mg/mL Glyco-EPOB.羥氨基-HES12KD K乙酸鹽緩沖液中的10mg/mLC.乙酸鹽緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5D.凝膠過濾柱例如，SephadexG-200(1.5×45cm)E.Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德國(guó))F.PBS，磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.48Rose，1994，Am.Chem.Soc.，116，30方法1mL羥氨基-HES12KD K溶液與1mL氧化的Glyco-EPO溶液混合，反應(yīng)混合物在攪拌下室溫溫育16小時(shí)。將反應(yīng)混合物上樣到用PBS緩沖液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL為單位收集級(jí)分。用Coomassie蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑監(jiān)測(cè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量，合并含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的所有級(jí)分，用水透析過夜后通過凍干獲得偶聯(lián)物。偶聯(lián)結(jié)果在圖24中顯示。在2道觀察到的分子位移證明偶聯(lián)是成功的。拖尾(smear)是由于HES的不均一性引起的。圖25證明HES與碳水化合物側(cè)鏈的碳水化合物部分偶聯(lián)。
實(shí)施例5半乳糖氧化酶處理的EPO N-聚糖的鑒定在過氧化氫酶存在下，在0.05M磷酸鈉緩沖液pH7.0中，重組EPO或部分去唾液酸化的EPO型(有限弱酸水解產(chǎn)生的)與半乳糖氧化酶在37℃溫育30分鐘-4小時(shí)。通過取出50μg等份EPO，隨后用多肽N-聚糖酶處理蛋白質(zhì)，監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展。
在除去唾液酸之前及之后，如(Grabenhorst等人，1999，Nimtz等人，1993/1994；Schlenke等人，1999)所述，對(duì)釋放的N-連接寡糖(通過SDS-PAGE檢測(cè)去-N-糖基化多肽進(jìn)行監(jiān)測(cè))進(jìn)行HPAEC-PAD作圖。根據(jù)HPAEC-PAD中觀察到的典型位移，定量各EPO寡糖中氧化的半乳糖殘基，也通過寡糖混合物的MALDI/TOF MS證實(shí)定量。
實(shí)施例6HAS修飾的EPO的鑒定使用例如Ultrogel AcA 44/54或類似的凝膠過濾介質(zhì)，通過凝膠過濾實(shí)現(xiàn)HAS修飾的EPO型與未反應(yīng)的EPO和HAS前體分子的分離。此外也可以如下除去未反應(yīng)的HAS在含有與Affigel(BioRad)偶聯(lián)的單克隆抗體的4mL柱上免疫親和分離EPO，隨后通過凝膠過濾分離未修飾的EPO(例如使用能夠分離分子量在20kDa-200kDa之間的球蛋白的介質(zhì))。
通過SDS-PAGE分析(使用12.5％或10％丙稀酰胺凝膠)，通過考馬斯亮藍(lán)染色凝膠后檢測(cè)高于未修飾EPO的分子量，鑒定HAS修飾的EPO。使用抗重組人EPO的多克隆抗體對(duì)樣品進(jìn)行Western Blot分析，也能鑒定HAS修飾的EPO多肽的較高分子量。
EPO型的N-聚糖修飾通過用多肽N-聚糖酶(重組N-糖苷酶，來自德國(guó)Roche，使用25單位/mg EPO蛋白，37℃16小時(shí))從EPO蛋白上成功去除來證明；SDS-PAGE分析可見EPO蛋白向N-糖苷酶處理的未修飾EPO之遷移位置典型位移約20KDa。
通過SDS-PAGE檢測(cè)與未反應(yīng)的去-N-糖基化EPO相比去-N-糖基化產(chǎn)物的遷移位置，證實(shí)單去唾液酸化并經(jīng)半乳糖氧化酶處理的EPOO-聚糖在Ser 126處的修飾。必要時(shí)，在SDS-PAGE分析之前通過在C8-相上的RP-HPLC分級(jí)修飾的EPO。通過O-聚糖的β-去除以及使用抗重組人EPO多克隆抗體的Western blot檢測(cè)EPO的去-O-糖基化形式，來分析EPO的HAS O-聚糖修飾。
實(shí)施例7EPO和修飾EPO型的定量用如歐洲藥典(2000，Erythropoietini solutio concentrata，1316，780-785)所述的UV測(cè)量對(duì)EPO定量，并且與國(guó)際BRP參照EPO標(biāo)準(zhǔn)比較。此外，也可以根據(jù)使用RP-C4-柱的RP-HPLC分析以及在254nm處的吸光度(用20、40、80、120μg BRP標(biāo)準(zhǔn)EPO參照制品進(jìn)行校準(zhǔn))，測(cè)定EPO濃度。
實(shí)施例8HES修飾的重組人EPO的體外生物活性使用如Krystal[Krystal，1984，Exp.Heamatol.，11，649-660]描述的促紅細(xì)胞生成素生物活性分析來檢測(cè)純化的HES修飾的EPO的活性。
通過鹽酸苯肼處理在NMRI小鼠中誘導(dǎo)貧血，如[Fibi等人，1991，Blood，77，1203ff.]所述收集并使用脾細(xì)胞。EPO的稀釋液在96孔微量滴定板中與3×105細(xì)胞/孔溫育。在潮濕空氣(5％CO2)下37℃溫育24小時(shí)后，細(xì)胞用每孔1μCi3H-胸苷標(biāo)記4小時(shí)。通過液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量摻入的放射性。國(guó)際參照EPO標(biāo)準(zhǔn)(BRP-標(biāo)準(zhǔn))用于比較。
此外，也可以使用EPO敏感細(xì)胞系TF-1(Kitamura等人，[J.cellPhys.，140.323-334])，通過體外檢測(cè)來測(cè)量EPO的生物活性。洗去指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中的生長(zhǎng)因子，在連續(xù)稀釋的EPO存在下再溫育48小時(shí)。使用Mosmann[Mosman，1983，J.Immunol.Methods，65，55-63]所述的MTT還原檢測(cè)來估計(jì)細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例9EPO和HAS-修飾的EPO型的體內(nèi)活性測(cè)定在紅細(xì)胞正常的小鼠中進(jìn)行體內(nèi)活性測(cè)定，方法是在動(dòng)物接受預(yù)定劑量的EPO或修飾EPO型4天后測(cè)量網(wǎng)織紅細(xì)胞的增加。使用BRPEPO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，該標(biāo)準(zhǔn)在紅細(xì)胞增多小鼠測(cè)定中用WHO EPO標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)。EPO樣品用含有1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋。
每只動(dòng)物皮下注射0.5ml EPO在Dulbecco′s緩沖鹽溶液中的檢測(cè)溶液(相當(dāng)于100、80、40或20IU/ml BRP標(biāo)準(zhǔn)EPO的EPO蛋白量)。注射4天后采集血樣，網(wǎng)織紅細(xì)胞用吖啶橙染色；在采集血樣后5小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)總共30,000個(gè)血細(xì)胞，對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞定量(參見歐洲藥典，2000，Erythropoietini solutio concentrata，1316，780-785和歐洲藥典(1996/2000，附件2002))。
實(shí)施例10體內(nèi)半衰期測(cè)定給兔靜脈內(nèi)注射指定量的未修飾或HAS-修飾的EPO型。在指定時(shí)間采集血樣，制備血清。血清促紅細(xì)胞生成素水平通過體外生物測(cè)定或者通過EPO-特異性商品化ELISA測(cè)定。
實(shí)施例11體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)小鼠每只動(dòng)物皮下接受300IU EPO/kg。處理7天后測(cè)量每只動(dòng)物的血細(xì)胞比容。在修飾EPO處理的所有動(dòng)物中有9只觀察到血細(xì)胞比容顯著增加，由于未處理的EPO的半衰期相對(duì)較短，這是一個(gè)預(yù)料之中的結(jié)果。修飾EPO處理組的血細(xì)胞比容的平均變化與未處理EPO組和對(duì)照組顯著不同。
兔兔用相當(dāng)于200或者多達(dá)800ng/kg體重的單次劑量未修飾或HAS-修飾的EPO處理。2、6、16、24、48小時(shí)后用測(cè)定血漿濃度的商品化EPO-特異性ELISA分析血樣。測(cè)定平均血漿EPO濃度，如(Zettlmissl等人，1989，J.Biol.Chem.，264，21153-21159)所述，根據(jù)ELISA值計(jì)算平均初始半衰期(α-相)和終末半衰期(β-相)。
文獻(xiàn)Sytkowski，Lunn，Risinger和Davis，1999，An ErythropoietinFusion Protein Comprised of Identical Repeating DomainsExhititis Enhanced Biological Properites，J.Biol.Chem.，274，24773-24778。
實(shí)施例12HES-修飾的重組人IL-2的體外生物活性評(píng)估通過在Ultrogel AcA 54上凝膠過濾來回收修飾的IL2。無(wú)菌過濾相應(yīng)級(jí)分的等份，使用依賴IL2的鼠CTLL-2細(xì)胞系測(cè)定IL2的生物活性[Gillis，F(xiàn)erm，On和Smith，1978，J.Immunol.，120，2027-2032]。活性與國(guó)際參照IL2標(biāo)準(zhǔn)制品相關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例13通過未氧化的還原性末端的還原胺化形成羥乙基淀粉衍生物實(shí)施例13.1羥乙基淀粉與1，3-二氨基-2-羥基丙烷的反應(yīng) a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，3-二氨基-2-羥基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在80℃下溫育17小時(shí)。將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，3-二氨基-2-羥基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25℃下溫育3天。
實(shí)施例13.2羥乙基淀粉與1，2-二羥基-3-氨基丙烷的反應(yīng) a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，2-二羥基-3-氨基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在80℃下溫育17小時(shí)。將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScience Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
如G.Avigad，Anal.Biochem.134(1983)449-504所述，用高碘酸鹽氧化切割反應(yīng)產(chǎn)物中的1，2-二醇產(chǎn)生醛，通過對(duì)醛定量間接證實(shí)1，2-二羥基-3-氨基丙烷與HES的反應(yīng)。
b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，2-二羥基-3-氨基丙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25℃下溫育3天。
實(shí)施例13.3羥乙基淀粉與1，4-二氨基丁烷的反應(yīng) a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，4-二氨基丁烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在80℃下溫育17小時(shí)。將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，4-二氨基丁烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25℃下溫育3天。
實(shí)施例13.4羥乙基淀粉與1-巰基-2-氨基乙烷的反應(yīng) a)向200mg羥乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1-巰基-2-氨基乙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3。獲得的混合物在80℃下溫育17小時(shí)。將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(snakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScience Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
b)向200mg羥乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1-巰基-2-氨基乙烷和50mg氰基硼氫化鈉NaCNBH3產(chǎn)生的混合物，也可以在25℃下溫育3天。
實(shí)施例14通過與未氧化的還原性末端偶聯(lián)形成羥乙基淀粉衍生物實(shí)施例14.1羥乙基淀粉與碳酰肼的反應(yīng) 將0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol碳酰肼(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)。在25℃下攪拌18小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5 KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
實(shí)施例14.2羥乙基淀粉與己二酸二酰肼的反應(yīng)
將0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol己二酸二酰肼(LancasterSynthesis，F(xiàn)rankfurt/Main，D)。在25℃下攪拌18小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
實(shí)施例14.3羥乙基淀粉與1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲的反應(yīng) 將0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol 1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲(Lancaster Synthesis，F(xiàn)rankfurt/Main，D)。在25℃下攪拌18小時(shí)后，向反應(yīng)混合物中加入8ml水，懸液以4,500rpm離心15分鐘。將澄清的上清液傾析并隨后加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，以4,500rpm離心15分鐘。澄清的上清液用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
實(shí)施例14.4羥乙基淀粉與O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺的反應(yīng) O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺如Boturyn等人Tetrahedron 53(1997)5485-5492所述用可購(gòu)得的材料通過兩步合成。
將0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml0.1M乙酸鈉水性緩沖液pH5.2中，加入8mmol O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺。在25℃下攪拌18小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
實(shí)施例15通過與氧化的還原性末端反應(yīng)形成羥乙基淀粉衍生物實(shí)施例15.1羥乙基淀粉與碳酰肼的反應(yīng) 將0.12mmol氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根據(jù)DE196 28 705 A1制備)溶解于3ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?5mmol碳酰肼(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在15mlDMSO中的混合物中。在65℃下攪拌88小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioscienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
實(shí)施例15.2羥乙基淀粉與1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲的反應(yīng) 將0.12mmol氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000 D，DS＝0.4，根據(jù)DE196 28 705 A1制備)溶解于3ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?5mmol 1，4-亞苯基-二-3-氨基硫脲(Lancaster Synthesis，F(xiàn)rankfurt/Main，D)在15ml DMSO中的混合物中。在65℃下攪拌88小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL丙酮與乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。離心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，凍干。
實(shí)施例15.3羥乙基淀粉與肼的反應(yīng)H2N-NH2將1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根據(jù)DE 196 287 05 A1制備)溶解于3ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.47ml(15mmol)肼在15ml DMSO中的混合物中。在40℃下攪拌19小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1(v/v)混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40mL水中，用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
實(shí)施例15.4羥乙基淀粉與羥胺的反應(yīng) O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺如Boturyn等人所述用可購(gòu)得的材料通過兩步合成(Boturyn，Boudali，Constant，Defrancq，Lhomme，1997，Tetrahedron，53，5485)。
將1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根據(jù)DE 196 287 05 A1制備)溶解于3ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.04g(15mmol)O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羥胺在15ml DMSO中的混合物中。在65℃下攪拌48小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1(v/v)混合物中。離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
實(shí)施例15.5羥乙基淀粉與己二酸二酰肼的反應(yīng)
在65℃下將1.74g(15mmol)己二酸二酰肼溶解于20ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭尤肴芙庥?ml無(wú)水二甲亞砜中的1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根據(jù)DE 196 28 705 A1制備)。在60℃下攪拌68小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至200mL水中。含有反應(yīng)產(chǎn)物的溶液用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
實(shí)施例15.6羥乙基淀粉與1，4-二氨基丁烷的反應(yīng) 將1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根據(jù)DE 196 287 05 A1制備)溶解于3ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.51ml(15mmol)1，4-二氨基丁烷在15ml DMSO中的混合物中。在40℃下攪拌19小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加至160mL乙醇與丙酮的1∶1(v/v)混合物中。離心收集沉淀氨基-HES10KD/0.4，再溶解于40ml水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德國(guó))，凍干。
實(shí)施例16促紅細(xì)胞生成素的氧化氧化的促紅細(xì)胞生成素如實(shí)施例20所述生產(chǎn)。使用實(shí)施例20.11(c)所述的EPO-GT-1-A作為氧化的促紅細(xì)胞生成素(未進(jìn)行酸水解，用溫和的高碘酸鹽氧化處理的EPO-GT-1)。
實(shí)施例17羥乙基淀粉衍生物與實(shí)施例4氧化的促紅細(xì)胞生成素的偶聯(lián)實(shí)施例17.1氧化的促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.1反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS緩沖液調(diào)節(jié)為pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根據(jù)實(shí)施例14.1產(chǎn)生的18μl HES衍生物溶液(MW18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖3中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例17.2氧化的促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.3反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS緩沖液調(diào)節(jié)為pH5.3。向19μlEPO溶液中加入根據(jù)實(shí)施例14.3產(chǎn)生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。
實(shí)施例17.3氧化的促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.4反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS緩沖液調(diào)節(jié)為pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根據(jù)實(shí)施例14.4產(chǎn)生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖4中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例17.4氧化的促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.1反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS緩沖液調(diào)節(jié)為pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根據(jù)實(shí)施例15.1產(chǎn)生的18μl HES衍生物溶液(MW 10kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖5中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例17.5氧化的促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.2反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)用5M乙酸鈉緩沖液pH5.2將含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS緩沖液調(diào)節(jié)為pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根據(jù)實(shí)施例15.1產(chǎn)生的18μl HES衍生物溶液(MW 10kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％ Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品 。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖5中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例18通過還原促紅細(xì)胞生成素形成巰基-EPO241.5μg促紅細(xì)胞生成素(EPO-GT-1，見實(shí)施例20)在500μl 0.1M硼酸鈉緩沖液，5mM EDTA，10mM DTT(Lancaster，Morcambe，UK)，pH8.3中37℃溫育1小時(shí)。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，10KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾除去DTT，隨后用硼酸鹽緩沖液洗滌3次，用磷酸鹽緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)洗滌2次。
實(shí)施例19用交聯(lián)化合物偶聯(lián)羥乙基淀粉衍生物與巰基促紅細(xì)胞生成素在下列每個(gè)實(shí)施例中，都使用N-(α-馬來酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯(AMAS)作為交聯(lián)化合物。
實(shí)施例19.1巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.1的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例14.1產(chǎn)生并且溶解于200μl 0.1 M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖6中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.2巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.2的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例14.2產(chǎn)生并且溶解于200μl 0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.3巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.3的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例14.3產(chǎn)生并且溶解于200μl 0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.4巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例14.4的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例14.4產(chǎn)生并且溶解于200μl 0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖6中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.5巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例13.1的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向在80℃溫育17小時(shí)以及25℃溫育3天的根據(jù)實(shí)施例13.1產(chǎn)生并且溶解于200μl 0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.6巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例13.3的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向在80℃溫育17小時(shí)以及25℃溫育3天的根據(jù)實(shí)施例13.3產(chǎn)生并且溶解于200μl 0.1M磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去剩余的AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖7中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.7巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.1的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例15.1產(chǎn)生并且溶解于200μl磷酸鈉緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.8巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.2的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例15.2產(chǎn)生并且溶解于200μl磷酸鹽緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.9巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.3的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例15.3產(chǎn)生并且溶解于200μl磷酸鹽緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufklrchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用的HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.10巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.4的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例15.4產(chǎn)生并且溶解于200μl磷酸鹽緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.11巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.5的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例15.5產(chǎn)生并且溶解于200μl磷酸鹽緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例19.12巰基促紅細(xì)胞生成素與實(shí)施例15.6的反應(yīng)產(chǎn)物和交聯(lián)化合物的反應(yīng)向根據(jù)實(shí)施例15.6產(chǎn)生并且溶解于200μl磷酸鹽緩沖液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。將澄清溶液在25℃下溫育80分鐘，在40℃下溫育20分鐘。使用VIVASPIN 0.5ml濃縮器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德國(guó))，以13,000rpm離心過濾，并用磷酸鹽緩沖液洗滌4次各30分鐘，除去AMAS。
向剩余溶液中加入15μg根據(jù)實(shí)施例18產(chǎn)生的巰基EPO(1μg/μl，在磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下溫育16小時(shí)。凍干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen說明書所述，通過SDS-PAGE分析粗制品。凝膠用Roti-考馬斯藍(lán)染色試劑(Roth，Karlsruhe，D)染色過夜。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖8中顯示。蛋白帶向較高分子量的遷移表明偶聯(lián)成功。帶寬增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和與該蛋白質(zhì)連接的HES衍生物的數(shù)量。
實(shí)施例20HES-EPO偶聯(lián)物的制備性生產(chǎn)概述
HES-EPO偶聯(lián)物如下合成將HES衍生物(平均分子量為18,000道爾頓；羥乙基取代程度為0.4)與重組人EPO的寡糖鏈上部分(溫和的高碘酸鹽)氧化的唾液酸殘基偶聯(lián)。根據(jù)碳水化合物結(jié)構(gòu)分析，引入的修飾不影響核心寡糖鏈的結(jié)構(gòu)完整性，因?yàn)榻?jīng)弱酸處理的HES-修飾聚糖的MALDI/TOF-MS顯示完整的中性N-乙?；樘前沸玩?，它與未修飾EPO產(chǎn)物中所見的鏈沒有差別。獲得的結(jié)果表明，對(duì)于預(yù)先沒有部分去除唾液酸而進(jìn)行修飾的EPO制品，每個(gè)EPO分子至少連接3個(gè)修飾的HES殘基。缺少前述蛋白質(zhì)中約50％唾液酸殘基的EPO變體在SDS-PAGE中顯示類似的高表觀分子量遷移率(60-110 KDa比BRPEPO標(biāo)準(zhǔn)的40KDa)。在室溫和pH 3-10下的標(biāo)準(zhǔn)離子交換層析條件下，HES修飾的EPO穩(wěn)定。
在紅細(xì)胞正常的小鼠系中進(jìn)行EPO生物檢測(cè)，根據(jù)歐洲藥典用紫外線吸收值測(cè)定蛋白質(zhì)，RP-HPLC測(cè)定EPO蛋白質(zhì)并經(jīng)BRP EPO標(biāo)準(zhǔn)制品校準(zhǔn)，在該檢測(cè)中，HES修飾的EPO具有比國(guó)際BRP EPO參照標(biāo)準(zhǔn)高2.5-3.0倍的比活性(IU/mg)。
實(shí)施例20.1材料與方法(a)通過N-糖苷酶消化釋放N-連接的寡糖樣品與25單位(根據(jù)德國(guó)Roche Diagnostics的廠商說明書)重組PNGase F在37℃下溫育過夜。根據(jù)蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的比遷移率位移來監(jiān)測(cè)完全消化。通過加入3倍體積的冷100％乙醇，并在-20℃下放置至少2小時(shí)，從多肽中分離釋放的N-聚糖(Schroeter S等人，1999)。在4℃下以13000rpm離心10分鐘除去沉淀的蛋白質(zhì)。然后用500μl冰冷的75％乙醇再洗滌沉淀兩次。合并上清液中的寡糖在真空離心機(jī)(Speed Vac濃縮器，Savant Instruments Inc.，USA)中干燥。聚糖樣品在使用前用Hypercarb柱(25mg或100mg HyperCarb)如下脫鹽柱用500μl溶于0.1％TFA中的80％乙腈(v/v)洗滌3次，隨后用500μl水洗滌3次。樣品用水稀釋至終體積300μl-600μl，之后上柱，然后用水充分洗滌柱子。寡糖用1.2ml(25mg柱；對(duì)于100mg柱為1.8ml)含有0.1％三氟乙酸(v/v)的25％乙腈水溶液洗脫。洗脫的寡糖用2M NH4OH中和，在Speed Vac濃縮器中干燥。在某些情況下，通過將總(糖)蛋白樣品＜100μg的消化混合物吸附到100mgHypercarb柱上，對(duì)N-糖苷酶釋放的寡糖進(jìn)行脫鹽。
(b)通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI/TOF/TOF-MS)對(duì)寡糖的分析使用Bruker ULTRAFLEX飛行時(shí)間(TOF/TOF)儀器在陽(yáng)離子及陰離子模式中使用2，5-二羥基苯甲酸作為紫外線吸收材料，在兩種模式中均使用反射器(reflectron)，分析天然去唾液酸化的寡糖。對(duì)于MS-MS分析，選擇母離子進(jìn)行激光誘導(dǎo)的解離(LID)，獲得的碎片離子用儀器的第二TOF階段(LIFT)分離。濃度約為1-10pmol·μl-1的1μl樣品溶液與等量的各自的基質(zhì)混合。將該混合物點(diǎn)樣到不銹鋼靶上，分析前在室溫下干燥。
實(shí)施例20.2重組人EPO(EPO-GT-1)的制備和鑒定如(Mueller PP等人，1999，Dorner AJ等人，1984)所述由重組CHO細(xì)胞表達(dá)EPO，根據(jù)歐洲藥典所述的方法鑒定這些制品(Ph.Eur.4，Monography 01/20021316Erythropoietin concentratedsolution)。終產(chǎn)物的唾液酸含量為每nMol蛋白質(zhì)12nMol(+/-1.5nMol)。N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)如(Nimtz等人，1999，Grabenhorst，1999)所述通過HPAEC-PAD和MALDI/TOF-MS測(cè)定。獲得的EPO制品含有二、三、四唾液酸化的寡糖(分別為2-12％、15-28％和60-80％，少量存在硫酸化和五唾液酸化鏈)。EPO制品的總糖基化特征類似于國(guó)際BRPEPO標(biāo)準(zhǔn)制品。
重組EPO的等電聚焦模型與國(guó)際BRP參照EPO標(biāo)準(zhǔn)制品相當(dāng)，表明是相應(yīng)的同種型。25％的EPO蛋白在多肽鏈的Ser126處缺乏O-糖基化。
實(shí)施例20.3部分去唾液酸化的EPO形式的制備
EPO GT-1蛋白(2.84mg/ml)在20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0中加熱到80℃，然后每1ml EPO溶液加入100μl 1N H2SO4；分別繼續(xù)溫育5分鐘、10分鐘、60分鐘，產(chǎn)生不同唾液酸化程度的EPO制品。用多肽N-糖苷酶釋放寡糖后對(duì)含有0-4個(gè)唾液酸的寡糖進(jìn)行定量，通過用Hypercarb柱(25mg HyperSep Hypercarb；Thermo-Hypersil-Keystone，UK)脫鹽進(jìn)行N-連接鏈的分離。加入1N NaOH中和EPO制品，在液氮中冷凍，貯存于-20℃，直到下一步使用。
實(shí)施例20.4唾液酸化EPO形式的高碘酸鹽氧化向溶解于3.5ml 20mM磷酸鈉緩沖液pH7.0中的10mg未處理或弱酸處理的EPO中加入1.5ml 0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5，將混合物在冰浴中冷卻到0℃；加入500μl10mM高碘酸鈉，反應(yīng)混合物在0℃下避光保持60分鐘。加入10μl甘油，繼續(xù)避光溫育10分鐘。使用VIVASPIN濃縮器(10,000 MWCO，PES Vivasciernce AG，Hannover，德國(guó))，根據(jù)廠商推薦，在配備固定角轉(zhuǎn)子的實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)中以3000rpm脫鹽，從試劑中分離部分氧化的EPO形式。在液氮中冷凍后，EPO制品以4ml的終體積貯存于-20℃。
對(duì)100μg等份的部分氧化EPO制品進(jìn)行N-糖苷酶處理，寡糖如上所述用Hypercarb柱分離。寡糖通過弱酸處理去唾液酸化，用HPAEC-PAD分析，它們的保留時(shí)間與如(Nimtz等人，1990和1993)所述的可信標(biāo)準(zhǔn)寡糖相當(dāng)。
實(shí)施例20.5用二硫赤蘚糖醇還原EPO二硫醚在30mM二硫赤蘚糖醇(DTT)存在下，將5mg EPO-GT-1在5ml 0.1M Tris/HCl緩沖液pH 8.1中，37℃溫育60分鐘；使用Vivaspin濃縮器在4℃下除去DTT，更換緩沖液4個(gè)循環(huán)。最終的還原EPO制品冷凍于液氮中，在50mM乙酸鈉緩沖液pH5.5中貯存于-20℃。
實(shí)施例20.6 EPO蛋白測(cè)定
EPO蛋白的定量測(cè)定如下進(jìn)行根據(jù)歐洲藥典(歐洲藥典4，專題01/20021316促紅細(xì)胞生成素濃縮溶液)，在1cm徑長(zhǎng)的比色杯中測(cè)定280nm處的紫外線吸光度。另外，也可以使用RP-C4柱(VydacProtein C4，目錄號(hào)214TP5410，Grace Vydac，Ca，US)，通過RP-HPLC方法對(duì)EPO定量；HPLC方法用促紅細(xì)胞生成素BRP1參照標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)(歐洲藥典，Conseil de l′Europe B.P.907-F67029，Strasbourg Cedex1)。
實(shí)施例20.7用半乳糖氧化酶氧化去唾液酸化的EPO在16μl過氧化氫酶(6214單位/200ml)和80μl半乳糖氧化酶(2250單位/ml，來自Dactylium dendroides(Sigma-Aldrich，Steinheim，德國(guó))存在下，將4.485mg完全去唾液酸化的EPO在20mM磷酸鈉緩沖液pH6.8中，37℃溫育過夜；在溫育開始4小時(shí)和8小時(shí)后分兩次加入20μl半乳糖氧化酶。
實(shí)施例20.8用于生物檢測(cè)的EPO樣品的制備從高碘酸鹽或半乳糖氧化酶氧化的EPO蛋白制品與活化的HES溫育反應(yīng)中純化EPOEPO樣品的純化(除去未反應(yīng)的HES衍生物)在室溫下進(jìn)行。EPO溫育混合物(約5mg EPO蛋白)用緩沖液A(20mM N-嗎啉丙磺酸[MOPS/NaOH]，在雙蒸水中，pH8.0)1∶10稀釋，以0.5ml/min的流速上樣到用10倍柱體積(CV)緩沖液A平衡的含有3ml Q-SepharoseHP(Pharmacia編號(hào)17-1014-03，批號(hào)220211)的柱上。用6-8倍柱體積的緩沖液A洗柱(流速＝0.8ml/min)，使用緩沖液B(20mM嗎啉乙磺酸[MES/NaOH，0.5M NaCl，在雙蒸水中，pH6.5)以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫。根據(jù)280nm處的紫外線吸光度檢測(cè)EPO，洗脫到約6ml中。柱用3倍柱體積的緩沖液C(20mM MES，1.5M NaCl，在H2O中，調(diào)節(jié)為pH6.5)再生，用10倍柱體積的緩沖液A再平衡(流速＝0.7ml/min)。
用Vivaspin濃縮器和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對(duì)Q-Sepharose步驟獲得的EPO洗脫物進(jìn)行緩沖液更換，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)離心循環(huán)；樣品用PBS調(diào)節(jié)為2ml，貯存于-20℃。
因?yàn)樵谒捎脳l件下基礎(chǔ)EPO型不結(jié)合Q-Sepharose并發(fā)現(xiàn)與未反應(yīng)的HES衍生物一起出現(xiàn)在穿流液中，因此從Q-Sepharose洗脫物中只獲得＜25％的部分唾液酸化、隨后溫和高碘酸鹽氧化的經(jīng)HES修飾的EPO型。
實(shí)施例20.9脈沖安培檢測(cè)的高pH陰離子交換層析(HPAEC-PAD)使用配有CarboPac PA1柱(0.4×25cm)的Dionex BioLC系統(tǒng)(Dionex，USA)，通過高pH陰離子交換(HPAE)層析以及脈沖安培檢測(cè)器(PAD)，分析純化的天然及去唾液酸化的寡糖(Schroter等人，1999；Nimtz等人，1999)。檢測(cè)器電勢(shì)(E)和脈沖持續(xù)時(shí)間(T)為E1+50mV，T1480ms；E2+500mV，T2120ms；E3-500mV，T360ms，輸出范圍為500-1500nA。然后將寡糖注射到用100％溶劑A平衡的CarboPac PAl柱上。對(duì)于去唾液酸化的寡糖，在40分鐘內(nèi)使用溶劑B的線性梯度(0-20％)，隨后在5分鐘內(nèi)將溶劑B從20％線性提高到100％，進(jìn)行洗脫(流速1ml·min-1)。溶劑A是溶于雙蒸水的0.2MNaOH，溶劑B由溶于溶劑A的0.6M NaOAc組成。對(duì)于天然寡糖，柱子用100％溶劑C(0.1M NaOH，溶于雙蒸水)平衡，在48分鐘內(nèi)使用線性梯度(0-35％)溶劑D，隨后在10分鐘內(nèi)將溶劑D從35％線性提高到100％，進(jìn)行洗脫(流速1ml·min-1)。溶劑D由溶于溶劑C的0.6M NaAc組成。
實(shí)施例20.10通過GC-MS進(jìn)行N-聚糖、HES-修飾的N-聚糖和EPO蛋白的單糖組成分析在甲醇分解、N-再乙?；腿谆柰榛?，通過GC/MS分析相應(yīng)的甲基糖苷[Chaplin，M.F.(1982)一種快速、靈敏的碳水化合物分析方法.Anal.Biochem.123，336-341]來分析單糖。這些分析用Finnigan GCQ離子阱質(zhì)譜儀(Finnigan MAT corp.，San Jose，CA)進(jìn)行，其以配備一個(gè)30m DB5毛細(xì)管柱的陽(yáng)離子EI模式運(yùn)行。溫度程序80℃恒溫2min，然后每分鐘升高10度，至300℃。
根據(jù)保留時(shí)間和特有的斷裂模式鑒定單糖。未校正的電子峰積分的結(jié)果用于定量。由于正位異構(gòu)化和/或存在呋喃型和吡喃型而產(chǎn)生一個(gè)以上峰的單糖，通過加和所有主峰來定量。0.5μg肌醇用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化合物。
實(shí)施例20.11結(jié)果實(shí)施例20.11(a)弱酸處理的(部分去唾液酸化的)EPO-GT-1的N-聚糖的鑒定如圖9所示，在與N-糖苷酶溫育釋放N-連接寡糖之前及之后，通過SDS-PAGE分析經(jīng)弱酸處理5、10或60分鐘的EPO-GT-1制品。對(duì)N-連接寡糖進(jìn)行HPAEC-PAD寡糖作圖(圖10)。未處理的EPO-GT-1含有＞90％的具有3或4個(gè)唾液酸殘基的N-連接寡糖，而在弱酸存在下溫育5分鐘后，＜40％的碳水化合物鏈含有3或4個(gè)唾液酸殘基。去唾液酸化N-聚糖的HPAEC-PAD顯示，檢測(cè)的未處理EPO-GT-1的中性寡糖比例在酸處理5、10或60分鐘的制品中保持穩(wěn)定。去唾液酸化聚糖的MALDI/TOF-MS顯示，在弱酸處理蛋白質(zhì)后存在＜90％的近端巖藻糖。
實(shí)施例20.11(b)高碘酸鹽處理的EPO-GT-1的鑒定對(duì)于預(yù)先酸處理5分鐘和10分鐘或者不予處理的溫和高碘酸鹽處理的EPO型，在圖12中比較它們的SDS-PAGE遷移率。用于高碘酸鹽氧化唾液酸的條件不改變EPO制品的SDS-PAGE圖(比較圖9)。唾液酸的氧化在HPAEC-PAD分析中導(dǎo)致寡糖向較早洗脫時(shí)間遷移(比較圖10和13)。
實(shí)施例20.11(c)HES-修飾的EPO衍生物的鑒定
(aa)用根據(jù)實(shí)施例14.4產(chǎn)生的羥胺修飾的HES衍生物X對(duì)EPO-GT-1-A進(jìn)行HES修飾的時(shí)程(time course)將400μg羥胺修飾的HES衍生物X加入溶于20μl 0.5M NaOAc緩沖液pH5.5中的20μg EPO-GT-1-A(溫和高碘酸鹽氧化的EPO，在溫和高碘酸鹽氧化之前未經(jīng)酸水解)中，分別在30分鐘、2、4、17小時(shí)后，通過將樣品冷凍于液氮中，終止反應(yīng)。隨后將樣品貯存于-20℃，直到進(jìn)一步分析。
加入SDS-PAGE樣品緩沖液，將樣品加熱到90℃，加樣到SDS-凝膠上。如圖14所示，溫育時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致向較高分子量蛋白質(zhì)的遷移增加。在羥胺修飾的HES衍生物X存在下溫育17小時(shí)后，檢測(cè)到一條彌散的考馬斯藍(lán)染色的蛋白帶，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置，它在60-11KDa之間的區(qū)域遷移(見圖14的左部分)。用N-糖苷酶處理后，大多數(shù)蛋白質(zhì)向去-N-糖基化EPO的位置遷移(見圖14，右側(cè)凝膠；箭頭A表示N-糖苷酶的遷移位置；箭頭B表示去-N-糖基化EPO的位置；推定在28KDa與36KDa分子量標(biāo)準(zhǔn)之間區(qū)域內(nèi)所見的彌散蛋白帶代表HES在分子的O-糖基化位點(diǎn)修飾的EPO型。關(guān)于N-糖苷酶的特異性，我們由該結(jié)果得出結(jié)論，實(shí)際上HES-修飾發(fā)生在EPO蛋白的聚糖之高碘酸鹽氧化的唾液酸殘基處。
(bb)HES-EPO偶聯(lián)物的鑒定HES-EPO偶聯(lián)物I(來源于溫和高碘酸鹽氧化后的EPO-GT-1，即來源于EPO-GT-1-A)、II(來源于酸水解5分鐘且溫和高碘酸鹽氧化的EPO-GT-1)、III(來源于酸水解10分鐘且溫和高碘酸鹽氧化的EPO-GT-1)如前所述合成。包括在相同緩沖液條件下的對(duì)照溫育(K)，其中包括未修飾的EPO-GT-1并加入等量的未修飾HES。為了隨后進(jìn)行的HES-EPO衍生物的生物化學(xué)分析，進(jìn)一步純化這些溫育混合物。
HES-EPO偶聯(lián)物I、II和III以及對(duì)照溫育K的溫育物如“材料與方法”(實(shí)施例20.8)所述進(jìn)行Q-Sepharose純化步驟，以除去過量未反應(yīng)HES試劑，后者預(yù)計(jì)出現(xiàn)在離子交換柱的穿流液中。由于在預(yù)先酸處理的樣品II和III中含有大量的基礎(chǔ)EPO型，我們預(yù)計(jì)在穿流液中會(huì)含有來自這些溫育物的相當(dāng)量的修飾的EPO產(chǎn)物。如圖15所示，幾乎所有來源于樣品I的EPO都被Q-Sepharose柱保留，而樣品III和II中只有約20-30％被回收到用高鹽濃度洗脫的級(jí)分中。在SDS-PAGE中，與對(duì)照EPO相比，在穿流液和用高鹽洗脫的級(jí)分中，與HES衍生物X溫育產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)物質(zhì)都具有更高的表觀分子量。
為了更詳細(xì)地鑒定HES-修飾的EPO樣品A和K(見圖13)，我們與高碘酸鹽氧化形式EPO-GT-1-A進(jìn)行比較。樣品進(jìn)行N-糖苷酶處理，如圖16a和16b所示，N-聚糖的釋放在標(biāo)準(zhǔn)EPO制品的O-糖基化和非糖基化EPO型位置處產(chǎn)生兩條低分子量帶。對(duì)于樣品A，檢測(cè)到另一條在28KDa分子量標(biāo)準(zhǔn)位置處遷移的帶，提示在該EPO變體的O-聚糖處發(fā)生HES-修飾(參見實(shí)施例20.11(c)(aa))。在溫和水解樣品后，這條帶(以及高度HES-修飾的高分子量形式的N-糖基化EPO，見圖16a和16b)消失，這與在促紅細(xì)胞生成素的高碘酸鹽氧化的唾液酸殘基處發(fā)生HES修飾的看法一致。
使用能夠從寡糖上完全除去唾液酸殘基(以及唾液酸連接的HES衍生物)的條件，水解N-糖苷酶溫育的混合物等份；中和后，將混合物吸附到小Hypercarb柱上進(jìn)行脫鹽。用水充分洗滌該柱，隨后用含有0.1％三氟乙酸的40％乙腈水溶液洗脫結(jié)合的中性寡糖。對(duì)產(chǎn)生的寡糖進(jìn)行MALDI/TOF-MS。來自樣品A、EPO-GT-1-A和樣品K的去唾液酸化寡糖級(jí)分的波譜顯示復(fù)雜型寡糖的相同質(zhì)量數(shù)m/z＝1810Da(二分支)、2175＝三分支、2540＝四分支、2906＝四分支+1個(gè)N-乙酰基乳糖胺重復(fù)、3271＝四分支+2個(gè)N-乙酰基乳糖胺重復(fù)；檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于缺乏巖藻糖(-146)和半乳糖(-162)的弱信號(hào)，這可歸因于去除唾液酸所使用的酸水解條件(見MALDI-圖19、20、21)。
在一個(gè)平行實(shí)驗(yàn)中，將N-糖苷酶消化混合物吸附到1ml RP-C18柱上(寡糖預(yù)先沒有用酸水解)，用含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫；在這些條件下，EPO蛋白完全保留在RP-材料上，用含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液從柱上洗下寡糖。用含有0.1％TFA的70％乙腈水溶液洗脫去-N-糖基化的EPO蛋白。中和N-糖苷酶處理的樣品A、EPOGT-1-A和樣品K經(jīng)過RP-C18步驟后獲得的寡糖級(jí)分，如前所述用Hypercarb柱脫鹽。在能夠從聚糖上定量除去唾液酸的條件下進(jìn)行弱酸處理之前(見圖17)及之后(見圖18)，對(duì)分離的寡糖進(jìn)行HPAEC-PAD作圖。
從HES修飾的樣品A中所得天然物質(zhì)的HPAEC-PAD圖只顯示可以忽略的寡糖信號(hào)，而EPOGT-1-A-衍生的寡糖顯示與圖13所示樣品(稱為溫和高碘酸鹽處理后的EPO-GT-1樣品)相同的聚糖HPAEC-PAD圖。由對(duì)照EPO樣品(K)獲得的寡糖洗脫圖產(chǎn)生預(yù)期的圖案(圖10中的比較圖)。為了比較，包括了用于比較和參照標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際BRP-EPO標(biāo)準(zhǔn)的天然寡糖譜。
在弱酸水解后，所有寡糖制品都顯示相同的中性寡糖結(jié)構(gòu)的洗脫圖(見圖18)，該結(jié)構(gòu)具有二、三、四分支復(fù)雜型碳水化合物鏈的定性和定量組成，如在作為本研究初始材料的EPO制品的方法部分所述。該結(jié)果證實(shí)，EPO樣品的HES-修飾導(dǎo)致HES衍生物的共價(jià)連接，該衍生物可以用N-糖苷酶從EPO-蛋白質(zhì)上分離下來，使用碳水化合物去唾液酸化的弱酸處理?xiàng)l件可以將其從N-聚糖上去除(見圖16a+b)，因此該衍生物是酸不穩(wěn)定的。
(cc)通過GC-MS對(duì)HES-EPO和HES-EPO N-聚糖的單糖組成分析為了進(jìn)一步證實(shí)EPO在分子N-聚糖處的HES-修飾，用N-糖苷酶消化EPO樣品，EPO蛋白被吸附到RP-C18柱上，而寡糖物質(zhì)如上所述洗掉。如表3所示，只在半胱氨酸殘基處進(jìn)行了HES修飾的EPO蛋白中和EPO樣品A2之寡糖級(jí)分中檢測(cè)到了葡萄糖和羥乙基化葡萄糖衍生物。
實(shí)施例20.11(d)HES-修飾的EPO的體內(nèi)生物活性檢測(cè)按照歐洲藥典所述方法在紅細(xì)胞正常的小鼠系中進(jìn)行EPO生物檢測(cè)；進(jìn)行EPO檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室使用國(guó)際BRP EPO參照標(biāo)準(zhǔn)制品。對(duì)于HES-修飾的EPO A2制品，測(cè)得比活性平均值為每mg EPO蛋白294600單位，表明與同樣進(jìn)行活性測(cè)定的國(guó)際BRP EPO參照標(biāo)準(zhǔn)制品相比，比活性約高3倍。
研究結(jié)果總結(jié)于表4中。
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Male specific modification of human CD52.
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表2





表3來自HES修飾的EPO和對(duì)照樣品之聚糖的單糖組成分析

權(quán)利要求
1.一種含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-促紅細(xì)胞生成素(EPO)偶聯(lián)物(HAS-EPO)，其中每個(gè)HAS都與EPO通過a)碳水化合物部分；或b)硫醚偶聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的HAS-EPO，其中EPO具有人EPO的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的HAS-EPO，其中EPO含有通過N-和/或O-連接糖基化作用與EPO連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈。
4.權(quán)利要求3的HAS-EPO，其中在哺乳動(dòng)物特別是人、昆蟲或酵母細(xì)胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側(cè)鏈已與EPO連接。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的HAS-EPO，其中HAS通過接頭分子與EPO偶聯(lián)。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的HAS-EPO，其中HAS通過碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分并優(yōu)選是被氧化的。
7.權(quán)利要求6的HAS-EPO，其中HAS與碳水化合物側(cè)鏈的半乳糖或唾液酸殘基偶聯(lián)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的HAS-EPO，其中硫醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者添加的半胱氨酸。
9.權(quán)利要求8的HAS-EPO，其中EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。
10.權(quán)利要求9的HAS-EPO，其中HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)，半胱氨酸33被置換為另一種氨基酸。
11.權(quán)利要求9的HAS-EPO，其中HAS與半胱氨酸33偶聯(lián)，半胱氨酸29被置換為另一種氨基酸。
12.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的HAS-EPO，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。
13.權(quán)利要求12的HAS-EPO，其中EPO是人EPO，被置換的氨基酸殘基是絲氨酸126。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的HAS-EPO，其中每個(gè)EPO分子具有1-12個(gè)、優(yōu)選、1-6個(gè)或1-3個(gè)、最優(yōu)選1-4個(gè)HAS分子。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的HAS-EPO，其中HAS選自羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉。
16.權(quán)利要求15的HAS-EPO，其中HAS是羥乙基淀粉(HES)。
17.權(quán)利要求16的HAS-EPO，其中HES的分子量為1-300kDa，優(yōu)選5-100kDa。
18.權(quán)利要求16或17的HAS-EPO，其中HES顯示相對(duì)于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代度和2-20的C2∶C6取代比。
19.一種生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-促紅細(xì)胞生成素(EPO)偶聯(lián)物(HAS-EPO)的方法，包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應(yīng)的EPO，b)提供能夠與步驟a)中EPO反應(yīng)的修飾的HAS，和c)使步驟a)的EPO與步驟b)的HAS反應(yīng)，從而產(chǎn)生含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-EPO，其中每個(gè)HAS都與EPO通過i)碳水化合物部分；或ii)硫醚偶聯(lián)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中EPO具有人EPO的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中EPO是重組產(chǎn)生的。
22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的方法，其中EPO含有通過N-和/或O-連接糖基化作用與EPO連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈。
23.權(quán)利要求22的方法，其中在哺乳動(dòng)物特別是人、昆蟲或酵母細(xì)胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側(cè)鏈已與EPO連接。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中HAS通過碳水化合物部分與EPO偶聯(lián)，并且該碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分。
25.權(quán)利要求24的方法，其中在步驟a)中，通過氧化EPO的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈的至少一個(gè)碳水化合物部分、優(yōu)選至少一個(gè)末端糖單元、更優(yōu)選半乳糖來修飾EPO。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在部分或完全(酶和/或化學(xué))除去末端唾液酸后氧化末端糖單元。
27.權(quán)利要求25或26的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與氧化的末端糖單元偶聯(lián)。
28.權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)的方法，其中EPO含有至少一個(gè)游離SH基。
29.權(quán)利要求28的方法，其中游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。
30.權(quán)利要求29的方法，其中EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。
31.權(quán)利要求30的方法，其中半胱氨酸33被置換為另一種氨基酸，在步驟c)中修飾的HAS與半胱氨酸29偶聯(lián)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中半胱氨酸29被置換為另一種氨基酸，在步驟c)中修飾的HAS與半胱氨酸33偶聯(lián)。
33.權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的方法，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中EPO是人EPO，被置換的氨基酸殘基是絲氨酸126。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。
36.權(quán)利要求19-35中任一項(xiàng)的方法，其中修飾HAS，使得如果HAS與氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)，則其含有游離的酰肼、羥胺、硫醇或氨基脲官能團(tuán)，或者如果HAS與SH基偶聯(lián)，則其含有游離的馬來酰亞胺、二硫醚或鹵代乙酰胺官能團(tuán)。
37.權(quán)利要求19-36中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)在至少含有10％重量H2O的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
38.權(quán)利要求19-37中任一項(xiàng)的方法，其中HAS通過接頭分子與EPO偶聯(lián)。
39.權(quán)利要求19-38中任一項(xiàng)的方法，其中HAS是羥乙基淀粉、羥丙基淀粉或羥丁基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉(HES)。
40.權(quán)利要求39的方法，其中HES具有如權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所限定的性質(zhì)。
41.通過權(quán)利要求19-40中任一項(xiàng)的方法獲得的HAS-EPO。
42.權(quán)利要求41的HAS-EPO，其具有權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所限定的特征。
43.用于人或動(dòng)物體治療方法的根據(jù)權(quán)利要求1-18、41或42中任一項(xiàng)的HAS-EPO在。
44.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-18、41或42中任一項(xiàng)的HAS-EPO。
45.權(quán)利要求44的藥物組合物，進(jìn)一步含有至少一種藥學(xué)可接受的載體。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-18、41或42中任一項(xiàng)的HAS-EPO在制備治療貧血性疾病或造血功能障礙性疾病的藥物中的應(yīng)用。
47.含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)，其中每個(gè)HAS都與多肽通過a)碳水化合物部分；或b)硫醚偶聯(lián)。
48.權(quán)利要求47的HAS-多肽，其中多肽是人源性的。
49.權(quán)利要求47或48的HAS-多肽，其中多肽選自促紅細(xì)胞生成素、白介素特別是白介素-2、IFN-β、IFN-α、CSF、白介素6和治療性抗體。
50.權(quán)利要求47-49中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中多肽含有通過N-和/或O-連接糖基化作用與多肽連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈。
51.權(quán)利要求50的HAS-多肽，其中在哺乳動(dòng)物特別是人、昆蟲或酵母細(xì)胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中，所述碳水化合物側(cè)鏈已與多肽連接。
52.權(quán)利要求47-51中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中HAS通過接頭分子與多肽偶聯(lián)。
53.權(quán)利要求49-52中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分，并優(yōu)選是被氧化的。
54.權(quán)利要求53的HAS-多肽，其中HAS與碳水化合物側(cè)鏈的半乳糖殘基偶聯(lián)。
55.權(quán)利要求47-54中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中硫醚中的S原子來源于天然存在的半胱氨酸或者添加的半胱氨酸。
56.權(quán)利要求55的HAS-多肽，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。
57.權(quán)利要求47-56中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中每個(gè)多肽分子具有1-12個(gè)、優(yōu)選1-6或1-3個(gè)、最優(yōu)選1-4個(gè)HAS分子。
58.權(quán)利要求47-57中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中HAS選自羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉。
59.權(quán)利要求58的HAS-多肽，其中HAS是羥乙基淀粉(HES)。
60.權(quán)利要求59的HAS-多肽，其中HES的分子量為1-300kDa，優(yōu)選5-100kDa。
61.權(quán)利要求59或60中任一項(xiàng)的HAS-多肽，其中HES顯示相對(duì)于羥乙基的0.1-0.8的摩爾取代程度和2-20的C2∶C6取代比。
62.一種生產(chǎn)羥烷基淀粉(HAS)-多肽偶聯(lián)物(HAS-多肽)的方法，包括下列步驟a)提供能夠與修飾的HAS反應(yīng)的多肽，b)提供能夠與步驟a)中多肽反應(yīng)的修飾的HAS，和c)使步驟a)的多肽與步驟b)的HAS反應(yīng)，從而產(chǎn)生含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的HAS-多肽，其中每個(gè)HAS都與多肽通過i)碳水化合物部分；或ii)硫醚偶聯(lián)。
63.權(quán)利要求62的方法，其中多肽是人源性的。
64.權(quán)利要求62或63的方法，其中多肽選自促紅細(xì)胞生成素、白介素特別是白介素-2、IFN-β、IFN-α、CSF、白介素6和治療性抗體。
65.權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)的方法，其中多肽是重組產(chǎn)生的。
66.權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)的方法，其中多肽含有通過N-和/或O-連接糖基化作用與多肽連接的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈。
67.權(quán)利要求66的方法，其中在哺乳動(dòng)物特別是人、昆蟲或酵母細(xì)胞內(nèi)的生產(chǎn)過程中所述碳水化合物側(cè)鏈已與多肽連接。
68.權(quán)利要求66或67的方法，其中HAS通過碳水化合物部分與多肽偶聯(lián)，該碳水化合物部分是碳水化合物側(cè)鏈的一部分。
69.權(quán)利要求68的方法，其中在步驟a)中，通過氧化多肽的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物側(cè)鏈的至少一個(gè)碳水化合物部分、優(yōu)選至少一個(gè)末端糖單元、更優(yōu)選半乳糖來修飾該多肽。
70.權(quán)利要求69的方法，其中在部分或完全(酶和/或化學(xué))除去末端唾液酸后氧化末端糖單元。
71.權(quán)利要求69或70的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與氧化的末端糖單元偶聯(lián)。
72.權(quán)利要求62-71中任一項(xiàng)的方法，其中多肽含有至少一個(gè)游離SH基。
73.權(quán)利要求72的方法，其中游離SH基是天然存在的半胱氨酸或添加的半胱氨酸的一部分。
74.權(quán)利要求62-73中任一項(xiàng)的方法，其中通過將天然存在的氨基酸置換為半胱氨酸來添加半胱氨酸。
75.權(quán)利要求73或74中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟c)中，修飾的HAS與添加的半胱氨酸偶聯(lián)。
76.權(quán)利要求62-75中任一項(xiàng)的方法，其中修飾HAS，使得如果HAS與氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)則含有游離的酰肼、羥胺、硫醇或氨基脲官能團(tuán)，或者如果HAS與SH基偶聯(lián)則含有游離的馬來酰亞胺、二硫醚或鹵代乙酰胺官能團(tuán)。
77.權(quán)利要求62-76中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)在至少含有10％重量H2O的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
78.權(quán)利要求62-78中任一項(xiàng)的方法，其中HAS通過接頭分子與多肽偶聯(lián)。
79.權(quán)利要求62-78中任一項(xiàng)的方法，其中HAS是羥乙基淀粉、羥丙基淀粉或羥丁基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉(HES)。
80.權(quán)利要求79的方法，其中HES具有如權(quán)利要求60或61中任一項(xiàng)所限定的性質(zhì)。
81.可通過權(quán)利要求62-80中任一項(xiàng)的方法獲得的HAS-多肽。
82.權(quán)利要求41的HAS-多肽，其具有權(quán)利要求47-61中任一項(xiàng)所限定的特征。
83.在人或動(dòng)物體治療方法中使用的根據(jù)權(quán)利要求47-61、81或82中任一項(xiàng)的HAS-多肽。
84.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求47-61、81或82中任一項(xiàng)的HAS-多肽。
85.權(quán)利要求84的藥物組合物，進(jìn)一步含有至少一種藥學(xué)可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有一個(gè)或多個(gè)HAS分子的羥烷基淀粉(HAS)－多肽偶聯(lián)物(HAS－多肽)，其中每個(gè)HAS通過碳水化合物部分或硫醚與多肽偶聯(lián)，本發(fā)明還涉及該偶聯(lián)物的生產(chǎn)方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多肽是促紅細(xì)胞生成素(EPO)。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1681844SQ03821464
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月11日
發(fā)明者阿拉爾德·S·康拉德特, ?？柼亍じ窭竞账固? 曼弗雷德·尼姆茲, 諾貝特·扎恩特爾, 羅納德·弗蘭克, 沃爾夫拉姆·艾希納 申請(qǐng)人:弗雷澤紐斯卡比德國(guó)有限公司