專利名稱：針對自體饑餓激素的免疫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性種痘(“活性治療性免疫療法”)。特別是涉及針對自體(“自身”)饑餓激素(ghrelin)蛋白的治療性種痘和治療肥胖與其它以身體脂肪沉積過量為特征的疾病，或者可以是關(guān)注的體重增加的情況。
因而，本發(fā)明不僅也涉及改善以脂肪沉積為特征的肥胖的治療和預(yù)防，而且也涉及改善以體重減少為特征的情況的治療和預(yù)防。更明確地，本發(fā)明提供一種下調(diào)(非期望的)脂肪沉積的方法，該方法是通過針對饑餓激素的抗體的生成、或通過針對試驗材料的組分的抗體的生成實現(xiàn)的，該試驗材料正在經(jīng)受包括脂肪沉積過量的肥胖或處于上述危險中。本發(fā)明進一步提供一種上調(diào)期望的體內(nèi)脂肪的沉積的方法，該方法通過針對饑餓激素的抗體的生成、或通過針對試驗材料的組分的抗體的生成實現(xiàn)，該試驗材料正在經(jīng)受解放或處于解放的危險中。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)有用的多肽的方法，以及修飾上述多肽的方法。本發(fā)明也包括解碼修飾多肽的核酸片斷，以及嵌入這些核酸片斷的載體、宿主細胞(host cells)和由此轉(zhuǎn)化的細胞株(cell lines)。本發(fā)明也提供了一種鑒別多肽沉積物的類似物的方法，該方法在本發(fā)明的組合物中也有用，該組合物包括修飾的多肽或包括解碼修飾多肽的核酸。最后本發(fā)明也可以配對饑餓激素肽免疫原。
背景技術(shù)：
在過去的三十年里，肥胖的流行已經(jīng)上升到流行病的比例；現(xiàn)在，不僅在美國和歐洲，而且在象中國、拉丁美洲、中東和北非等發(fā)展中國家正在報道人口中肥胖的發(fā)生在增加。盡管在努力改善公眾的健康，更加健康的生活方式可能還要十年以上。根據(jù)最近的統(tǒng)計，結(jié)果表明預(yù)計61％的成人超重或肥胖，超重或肥胖是這樣定義的身體重量指數(shù)(BMI＝體重的公斤數(shù)÷[身高的米數(shù)]2)為25或更大(National Health and NutritionExamination Survey(NHANES)1999))。在同樣的人口中，肥胖(BMI大于或等于30.0)從1980年的15％到1999年預(yù)測的27％，幾乎翻番。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估計，全球大約有3億人口肥胖。
超重或個體肥胖(BMI為25和以上)增加了身體患病的風(fēng)險，如高血壓、過度緊張；高血液膽固醇、異常脂蛋白血癥；2型(非胰島素依賴性的)糖尿病；胰島素抵抗，葡萄糖耐受不良；高胰島素癥；冠心??；心絞痛；充血性心力衰竭；中風(fēng)；膽結(jié)石；膀胱炎和膽石?。煌达L(fēng)；關(guān)節(jié)炎；阻塞性睡眠息癥和呼吸問題；某些類型的癌癥(如子宮內(nèi)膜、乳房、前列腺和大腸)；懷孕并發(fā)癥；貧弱女性的生殖健康(如月經(jīng)異常、不能生育、異常排卵)；膀胱控制障礙(如壓力失禁)；尿素腎石?。恍睦硎С?如抑郁、飲食失調(diào)、身體扭曲和自卑)。從未成年死亡風(fēng)險的增加到嚴重的慢性癥狀的健康問題降低了整個生命的質(zhì)量。而且，和瘦的個體相比，25～35歲之間的嚴重肥胖者的死亡率上升12倍。消極的對待肥胖能導(dǎo)致許多生活領(lǐng)域的歧視，包括衛(wèi)生保健和就業(yè)。
目前，全民健康制度中，診斷、治療和服用肥胖的直接成本僅在幾個國家中有預(yù)算。盡管研究方法上的巨大差異導(dǎo)致很難比較不同國家的成本和由一個國家推斷另一個國家的情況，在西方國家中，建議2～8％的疾病治療費用應(yīng)用于肥胖方面。例如，和全部的癌癥治療成本相比，這表示了全民醫(yī)療服務(wù)預(yù)算的主要部分。發(fā)展中國家不發(fā)達的醫(yī)療服務(wù)制度在醫(yī)療服務(wù)資源上的潛在影響可能更加嚴重(WHO)。
過量吸收卡路里和/或很少的體力活動會導(dǎo)致超重或肥胖。對于每個個體，體重是基因、代謝、行為、環(huán)境、文化和社會經(jīng)濟的影響的綜合結(jié)果。對于超重和肥胖來說，行為和環(huán)境因素是有很大作用的，并且行為和環(huán)境因素提供了針對治療和預(yù)防而進行的發(fā)明和創(chuàng)造的最大機會。因此，許多研究表明通過藥物和鍛煉的減肥降低了上述顯著的風(fēng)險因素。不幸的是，這些治療很不成功，失敗率達到95％。失敗可能是因為人體機制的復(fù)雜性，在古代食物供應(yīng)不足的情況下，這種復(fù)雜性有助于人類的生存。這個機制可以有助于增加食欲，特別是高卡路里的食物，有助于降低體力活動和增加，并根據(jù)飲食和活動的情況增加脂肪代謝。
1995年發(fā)現(xiàn)的瘦素(Leptin)是一種抑制食欲的激素。瘦素主要在脂肪組織中生成，通常根據(jù)脂肪存儲的比例循環(huán)。當(dāng)脂肪細胞豐富時，瘦素會暗示人們停止飲食。新發(fā)現(xiàn)的一種稱之為饑餓激素的激素(1999)好像有相反的作用。該激素是一種胃激素，該激素被認為是生長激素(GH)賽可若嗒(secretagouge)受體亞型1a(GHS—Rla)的一種內(nèi)源性配位體，該激素刺激了貓和人類生長激素的分泌(Kojima M et al.，Nature，1999，402656-60；Kojima M et al.，Trends in Endocrinology andMetabolism，2001，12118-22；Takaya K ET AL.，J CLIN ENDOCRINOLMetab，2000，854908-11)。以嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)的食欲基因(orexigenic)和脂肪基因(adipogenic)為基礎(chǔ)(Tschp M et al.，Nature，2000，407908-913；Wren AM et al.，Endocrinology，2000，1414325-28；Nakazato M et al.，Nature，2001，409194-8；Shintani M et al.，Diabetes，2001，50227-232)，假設(shè)了饑餓激素在調(diào)節(jié)能量平衡中的附加作用(Inui A，Nature Reviews Neuroscience，2001，2551-60；HorvathTL et al.，Endocrinology，2001，142(10)4163-9)。研究已經(jīng)表明，嚙齒動物中饑餓激素的注入刺激了攝取食物并產(chǎn)生了肥胖(Tschp M etal.，Nature，2000，908-13)，并不依賴生長激素分泌的變化(Nakazato Met al.，Nature，2001，vol.409194-8)。在研究人類時，饑餓激素的注入增加了短期的饑餓(Wren AM et al.，J Clin Endocrinol，Metab，2001，865992)。卡明斯等人(N Eng J Med，2002，3461623-30)報道在飯前、限制飲食和饑餓時饑餓激素水平上升，而飯后饑餓激素迅速下降。作者假設(shè)觀察到的飯前的增加激起飲食的欲望，而長期飲食限制的水平增加可能有助于饑餓和伴隨的消極能量平衡可能的適應(yīng)。該理論和饑餓激素作用于下丘腦的神經(jīng)細胞的證據(jù)一致，眾所周知，該下丘腦的神經(jīng)細胞調(diào)節(jié)能量平衡(Nakazato M et al.，Nature，2001，vol.409194-8)?？魉沟热?2002)報道一旦飲食導(dǎo)致體重減少，飯前血漿中的饑餓激素水平將增加。體重減得越多，飯后饑餓激素的水平增加的越大。這和饑餓激素在長期調(diào)節(jié)體重中所起的作用是一致的。而且，據(jù)報道，胃繞道外科手術(shù)顯著抑制了饑餓激素水平，這可能有助于替代管病人的體重降低。繞道手術(shù)阻止了胃細胞接觸食物，從而導(dǎo)致了饑餓激素的降低到幾乎不可覺察的水平(＞75％的降低)。有趣的是，大部分替代管病人手術(shù)后完全失去了對食物的興趣，這也可能是饑餓激素的生成大幅度降低的原因。因而，饑餓激素確實在肥胖中起到很大的作用，對于肥胖病人的饑餓激素的生成的減少必須1.減少體重，即減少過多的體內(nèi)脂肪；2.隨后保持能減少體重的飲食。
饑餓激素的結(jié)構(gòu)和絲氨酸-3的殘留物中的正辛?；ピ谝黄鸬酿囸I激素具有獨特的結(jié)構(gòu)。其表明，處理的第一少量殘留物、成熟的饑餓激素、甘氨酸-Ser-Ser(正辛?；?-苯基丙氨酸片段組成了這種肽的活性組分(Bednarek MA etal.，2000)。
饑餓激素和其它蛋白質(zhì)的同族關(guān)系饑餓激素已經(jīng)在人的胃內(nèi)鑒別出來了。除了2個氨基酸外，該饑餓激素和鼠的饑餓激素類似。從cDNA庫里分離出來的人類的前-正饑餓激素(pre-proghrelin)由117種氨基酸組成。鼠和人類的前-正饑餓激素有82.9％是一致的。饑餓激素和目前識別出的任何其它非-饑餓激素肽沒有很高的同族關(guān)系。
饑餓激素的生物活性饑餓激素被認為是通過胃功能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)控制的調(diào)制部分改變了進食(Date Y et al.，2001；Masuda Y et AL.，2000)。特別的，饑餓激素的ICV服用刺激了胃酸億劑量依賴(dose-dependent)和阿托品敏感(atropine-sensitive)的方式分泌。免疫組織化學(xué)說明了鼠迷走神經(jīng)(vagus nerve)中的孤束核(nucleus of the solitary tract)和多絲摩托和(dorsomotor nucleus)的fos表達(fos-expression)。阿瑟卡瓦·A等人在2001年認為饑餓激素具有胃腸道蠕動促進的活性，并與胃動素(motilin)的結(jié)構(gòu)類似；同時通過作用于下丘腦的神經(jīng)肽Y和Y(1)受體而具有有效的食欲基因(orexigenic)(進食)活性，這種作用在迷走神經(jīng)切斷術(shù)后消失。和增加該活性的其它降低食欲的肽(anorexigenic peptides)相比，饑餓激素減少了胃迷走神經(jīng)傳入的流量。上述作者和其他的一些人(Toshinai K et AL.，2001)報道通過禁食、胰島素，增加了先天肥胖鼠(ob/ob mice)的胃中的饑餓激素的基因表達。
饑餓激素作用的體內(nèi)展示在鼠中，外因的饑餓激素在增加生成激素(GH)釋放的同時也增加了食物的攝取，從而引起體重的增加，脂肪利用的降低(Wren AM et al.，2000；Tschp M et al.2000)。同時，饑餓激素的側(cè)腦室(Intracerebroventricular，ICV)內(nèi)的服用在食物攝取和體重的增加中也產(chǎn)生了劑量依賴的增加。鼠血漿的饑餓激素通過禁食增加，通過再進食或口服葡萄糖而減少，而不是通過水?dāng)z取。除了饑餓激素在調(diào)節(jié)GH分泌的作用外，這些作者認為在必要的增加代謝效率時，饑餓激素改變了視丘下部。納卡扎托(Nakazato)·M等人(2001)認為饑餓激素涉及能量平衡的下丘腦平衡。饑餓激素的側(cè)腦室注射強烈刺激了鼠的進食和增加了體重。饑餓激素也增加了鼠的進食，這在生長激素中是遺傳性缺乏的?？?饑餓激素免疫球蛋白G強烈的抑制了進食。在發(fā)現(xiàn)ICV饑餓激素服用、fos蛋白質(zhì)、神經(jīng)元活性遺傳標志在進食調(diào)節(jié)中的主要作用后，也包括神經(jīng)肽Y神經(jīng)元和相關(guān)的刺豚鼠的蛋白質(zhì)神經(jīng)元?？贵w和神經(jīng)肽Y神經(jīng)元和相關(guān)的刺豚鼠的蛋白質(zhì)的對抗劑和抗體廢止了饑餓激素的誘導(dǎo)進食。增加神經(jīng)肽Y基因表達和阻礙瘦素引起的進食減少的饑餓激素表明在進食服用中瘦素和饑餓激素之間存在競爭性的相互作用。因此可以得出饑餓激素是進食中的生理性調(diào)節(jié)。除了動物以外，饑餓激素也進行了許多醫(yī)療研究。在進食前1小時，饑餓激素的水平翻番，而在進食時饑餓激素的水平降低(如插頁)，這表明饑餓激素在進食初期起了很大作用(Cummings DE et al.，2001)。上述結(jié)論被饑餓激素增加了食欲和進食的人類研究證實(Wren AM et al.，2001)。
目前和將來肥胖的治療據(jù)預(yù)測，在美國有3千4百萬至6千1百萬的人肥胖，而且在發(fā)展中國家以每年1％的速度增長。下面取消了早期治療，當(dāng)FDA同意艾波特(Abbott)的西布曲明(sibutramine)(Reductil/Meridia)用于減肥，藥物減肥的市場在1997年11月重新建立了；進一步在1999年4月，F(xiàn)DA也同意了]洛希(Roche)的羅氏鮮(Xenical)(orlistat)。世界肥胖市場預(yù)測到2008年將達到37億，并以21.1％的年增長率增長。該市場潛力將刺激藥物公司開發(fā)新的減肥產(chǎn)品，因此在過去的7年里，這些藥物的數(shù)量翻了3倍，這也導(dǎo)致了在潛在的研究活動的增加。吸引最大注意力的藥物種類包括5-HT調(diào)制的藥物、β-3-腎上腺素受體興奮劑、脂肪酶抑制劑、黑皮質(zhì)素(melanocortin)-4-興奮劑和瘦素興奮劑。自從這種媒質(zhì)可以降低進食，瘦素興奮劑已經(jīng)引起了極大的興趣。然而，最近的研究表明肥胖個體很多，而且抵抗瘦素，這激起了替代物的研究。
饑餓激素是肥胖領(lǐng)域中最有希望達到目的的。盡管科學(xué)家僅僅在1999年才鑒別出饑餓激素，已經(jīng)有200多篇的論文發(fā)表。饑餓激素刺肥胖病人激進食并降低血漿的濃度表明這種媒質(zhì)是進食的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。當(dāng)前，本領(lǐng)域的權(quán)威認為饑餓激素活性的進一步降低可以達到治療效果，因而饑餓激素受體結(jié)合的對抗劑在治療肥胖的藥物中是一個選擇。相應(yīng)的，許多工具可用于篩選饑餓激素受體興奮劑。除了藥物發(fā)現(xiàn)的潛力，盡管公開的許多專利建議這種分子還不成熟，饑餓激素受體興奮劑也出現(xiàn)了?？紤]到支持發(fā)展饑餓激素抗體的證據(jù)、肥胖市場潛在的規(guī)模和臨床醫(yī)生用于相對小量的治療，現(xiàn)在是投資發(fā)展這種令人鼓舞的治療種類的最佳時機。
體內(nèi)有益脂肪增加的情況遭受許多疾病的病人可能從體內(nèi)脂肪的增加受益，這和上述肥胖病人的情況正好相反。確實存在這樣的情況即問題是由缺乏食欲和沒有充足的食物供應(yīng)。這些情況包括惡病體質(zhì)和食欲減退。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供一種治療以體內(nèi)脂肪過量為癥狀的新型方法，脂肪過量是由于吸收的能量超過了能量的消耗，這也是肥胖的特征。本發(fā)明的另一個目的是提供導(dǎo)致體內(nèi)脂肪增加的治療方法。進一步的發(fā)明目的是提供針對饑餓激素的自體菌苗。
本發(fā)明概述此處公開的是利用自體菌苗接種的技術(shù)產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，以對抗其它的非免疫原的自體蛋白質(zhì)、饑餓激素，包括體內(nèi)沉積的過量脂肪。因此，產(chǎn)生的強烈的免疫反應(yīng)對抗饑餓激素。本發(fā)明也公開了這種疫苗的制備，該疫苗不僅用于預(yù)防、一定的治療或緩和與體內(nèi)脂肪沉積過量癥狀相關(guān)的疾病，而且也用于誘導(dǎo)體內(nèi)脂肪的增加。
后者表示的結(jié)果是令人驚異的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中許多免疫原饑餓激素的類似物好像影響了動物免疫變異體中的血清饑餓激素的上升。這種在血清饑餓激素中的上升伴隨著免疫動物體重的重要的增加，即使該動物沒有顯示增加的進食。
而且，饑餓激素水平循環(huán)的增加致使活性免疫對抗自體饑餓激素，一個意外替代饑餓激素直接服用的材料為1)將從饑餓激素引起的生理效應(yīng)受益；以及2)自身能夠產(chǎn)生饑餓激素的能力。
因而，在最廣和最普通的范圍內(nèi)，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)對抗動物(包括人)自體饑餓激素的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括影響動物的免疫系統(tǒng)，以及從下述基團選擇的免疫原的免疫有效量，該基團包括
-至少一種饑餓激素多肽或以及隨后形成物，以使含有饑餓激素多肽或隨后形成物的動物的免疫誘導(dǎo)對抗動物自體饑餓激素的抗體的生成，以及-至少一種結(jié)合在同一分子中的饑餓激素類似物，至少一種饑餓激素的B-細胞的表位，以及至少一種一半不是來自于饑餓激素的的化學(xué)物質(zhì)，以使動物的免疫和類似物一起誘導(dǎo)對抗饑餓激素的抗體的生成。
正如下述對本發(fā)明討論的一樣，該方法用于用于體內(nèi)的下調(diào)饑餓激素活性，或者體內(nèi)的上調(diào)饑餓激素活性。
例如，與其中的饑餓激素的類似物具有鍵親和力的、包括抗-饑餓激素或分子服用的治療方法相比，本發(fā)明最具有吸引力的方面是肥胖可以通過定期的、而不是經(jīng)常的免疫進行控制和/或轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明，1～4年每次注射免疫原的化合物足夠獲得期望的效果，然而其中饑餓激素活性其它的抑制劑的服用要求每天，或至少每周服用。同樣的優(yōu)點存在于指示體內(nèi)需要增加的的情況。
本發(fā)明也涉及饑餓激素的類似物和解碼這些子集的核酸片段。同樣，包括類似物或核酸片段的免疫原的化合物也是本發(fā)明的部分。
本發(fā)明也涉及鑒別饑餓激素類似物的方法，以及制備含有饑餓激素類似物的組合物的方法。
最后，本發(fā)明也提供了被動的免疫治療，其中服用單克隆的抗一饑餓激素抗體是為了獲得和活性接種疫苗類似的效果。
本發(fā)明的詳細公開定義為了闡明本發(fā)明的范圍，下面將對本說明書和權(quán)利要求書中用的許多術(shù)語進行詳細描述。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“免疫原”指的是誘導(dǎo)一免疫反應(yīng)的試劑(物質(zhì)或組合物)?？梢岳斫猓承┓肿?如自體宿主所承受的傳統(tǒng)的小半抗原或自體蛋白)不能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。然而，即使在免疫動物正常的承受范圍內(nèi)，當(dāng)一些自體蛋白在很強的免疫啟動子(immunologic adjuvants)下形成時，其也能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。因此，上下文中的“免疫原”是組合物(自體蛋白和啟動子)，而不僅僅是單一分子。
術(shù)語“T-淋巴細胞”和“T-細胞”可以交替使用用于負責(zé)調(diào)制免疫反應(yīng)的不同的細胞，即胸腺來源的淋巴細胞，以及作為肱骨處的免疫反應(yīng)的活性促進者。同時，術(shù)語“B-淋巴細胞”和“B-細胞”在抗體生成淋巴細胞中交替使用。
此處的“饑餓激素多肽”用于表示這樣的多肽，該多肽不僅具有上述來自于人和其它哺乳動物(或其中和為處理的饑餓激素縮短分享大量的表位)的饑餓激素蛋白的氨基酸序列，而且該多肽的氨基酸序列和這些蛋白質(zhì)的外源的類似物一致，該些蛋白質(zhì)從本術(shù)語包括的其它物種中分離。本術(shù)語包括成熟的饑餓激素肽、饑餓激素前蛋白胨和饑餓激素預(yù)-前蛋白胨。在原核體系中制備的饑餓激素的unglycosylate形態(tài)也包括在該術(shù)語的范圍內(nèi)，這是因為這些形態(tài)在使用酵母或其它的非哺乳動物真核狀態(tài)表達體系時具有不同的糖基化模式。然而值得注意的是，當(dāng)使用術(shù)語“饑餓激素多肽”時，出現(xiàn)的問題是多肽出現(xiàn)在處理的動物中通常是非-免疫原的。換句話說，饑餓激素多肽是一種自體蛋白或這種自體蛋白的外源類似物，該自體蛋白或這種自體蛋白的外源類似物通常不會在所討論的動物中產(chǎn)生對抗饑餓激素的免疫反應(yīng)。
“饑餓激素類似物”是一種饑餓激素多肽，該饑餓激素在一級結(jié)構(gòu)經(jīng)過了改變。例如，這種改變是饑餓激素多肽的融合狀態(tài)到合適的熔體(fusion partner) (即除了涉及C-和/或N-氨基酸殘基的最終添加物的一級結(jié)構(gòu)的變化)和/或以插入的形式和/或饑餓激素多肽氨基酸序列中的取代物。該術(shù)語也包括饑餓激素分子的衍生物，比較下述討論的饑餓激素的修飾。
需要注意的是，例如，犬的和人類饑餓激素的類似物在人體內(nèi)作為疫苗的應(yīng)用可以想象到能夠產(chǎn)生對抗饑餓激素的期望的免疫性。作為免疫的外源類似物(xeno-analogue)的這種使用也在上述討論的“饑餓激素類似物”中考慮到。
當(dāng)使用此處“饑餓激素”縮寫時，一般指的是野生饑餓激素的氨基酸序列(此處也表示“饑餓激素”和“饑餓激素-wt”)。這個術(shù)語包括前蛋白胨和成熟的肽，所以成熟的饑餓激素表示為饑餓激素-m。成人饑餓激素表示為h-饑餓激素、h-饑餓激素-m、或m-饑餓激素-wt，等等。如果其中DNA的結(jié)構(gòu)包括解碼主要序列或其它物質(zhì)的信息，通?？梢郧逦鷱纳舷挛牡目闯?。
上下文中的術(shù)語“多肽”一般用來表示2～10個氨基酸殘基的短肽、11～100個氨基酸殘基的寡肽(oligopeptides)和超過個氨基酸殘基的多肽。而且，該術(shù)語也包括蛋白質(zhì)，即包括至少一種多肽的功能性生物分子；當(dāng)包括至少兩種多肽時，這些通過共價鍵或非共價鍵連接可以形成染色體組(complexes)。蛋白質(zhì)中的多肽可以糖基化和/或脂化(lipidated)和/或包括非朊基基團。術(shù)語“聚氨基酸(polyamonia acid)”等同于術(shù)語“多肽”。
術(shù)語“亞序列(subsequence)”表示的是至少3個氨基酸的連續(xù)部分或相應(yīng)的至少3個核苷，該核苷分別直接來源于天然產(chǎn)生的饑餓激素氨基酸序列或核酸序列。
通常，本發(fā)明上下文中的術(shù)語“動物”表示的是動物種群(優(yōu)選為哺乳動物)，如智人(Homo sapiens)、犬類(Canis domesticus)等，并且不僅僅是單一的動物。然而，該術(shù)語也表示這些動物物種的數(shù)目，由于個體的免疫很重要，根據(jù)本發(fā)明的方法，充分的harbour允許用同一種免疫原對動物進行免疫。例如，如果饑餓激素的遺傳性變型存在不同的人口中，為了能夠打破針對每個個體中的饑餓激素的自體耐藥性，對于這些不同的個體用不同的免疫原是必要的。本發(fā)明上下文中的動物是具有免疫系統(tǒng)的活的動物對于技術(shù)人員來說是清楚的。該動物優(yōu)選為脊椎動物，如哺乳動物。
此處的術(shù)語“體內(nèi)的饑餓激素活性的下調(diào)”表示的是饑餓激素和其受體(或者饑餓激素和這種分子的其它可能的重要的生物結(jié)合配體)之間的相互反應(yīng)的數(shù)目的活體組織中的減少。下調(diào)可以通過幾種機制實現(xiàn)其中通過抗體結(jié)合在饑餓激素的活性位點上的簡單的沖突是最簡單的。然而，抗體結(jié)合通過清除細胞導(dǎo)致饑餓激素消除也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另一種可能是抗-饑餓激素抗體的結(jié)合能夠干擾導(dǎo)致成熟饑餓激素的正常的前饑餓激素的分裂。
表述“影響出現(xiàn)…至免疫系統(tǒng)”想表示的是動物的免疫系統(tǒng)以可控制的方式受到免疫原的挑戰(zhàn)。正如下述公開的一樣，這種免疫系統(tǒng)的挑戰(zhàn)能夠受到許多方式的影響，其中最重要的是含有“藥物疫苗(pharmaccines)”(即用于治療或改進正在發(fā)生的疾病的核酸)的多肽的接種疫苗或核酸““藥物疫苗”的接種疫苗。獲得的最重要的結(jié)果是動物中的免疫活性細胞面臨免疫有效方式的抗原，其中獲得這種結(jié)果的準確方式對于本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是不重要的。
術(shù)語“免疫有效量”在免疫學(xué)中的常用意思即為能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的免疫原的有效量，該免疫反應(yīng)包括共享免疫原的免疫技術(shù)特征的分子。
當(dāng)此處使用表述饑餓激素被“修飾”時，其意思是組成饑餓激素支柱的多肽的化學(xué)修飾。例如，這種修飾可以是饑餓激素序列中某些氨基酸殘基的衍生物(如烷化、?；?、酯化等)，但如下述公開，優(yōu)選的修飾包括饑餓激素氨基酸序列一級結(jié)構(gòu)的改變(或添加)。一個特異的修飾是饑餓激素中天然生成的辛?；膭h除。
當(dāng)討論“針對饑餓激素的自體耐藥性”時，可以理解，由于饑餓激素是人群中需要進行免疫的自體蛋白質(zhì)，正常的個體不需要對抗饑餓激素的免疫反應(yīng)；雖然臨時的動物個體可能生成對抗天然饑餓激素的抗體，如作為自動免疫失常的一部分，但是不能排除在外。無論如何，動物將僅能正常的針對自身的饑餓激素自體耐藥性，但是它不可能排除來源于其它動物物種或具有不同饑餓激素顯型的物種的饑餓激素類似物也對所述動物具有耐藥性。
“外源T-細胞表位”(或“外源T-淋巴細胞表位”)是一種能夠結(jié)合MHC分子和刺激動物物種中的T-細胞的肽。本發(fā)明中優(yōu)選的外源T-細胞表位是“混雜的”表位，即結(jié)合動物物種或種群中MHC分子中特異種類的一大部分的表位。
僅有數(shù)量有限的這種混雜的T-細胞表位是公知的，并將在下面仔細討論。值得注意的是，根據(jù)本發(fā)明，為了使免疫原在盡可能多的動物種群中有效，這是必要的1)在同樣的饑餓激素類似物插入幾種外源T-細胞表位或2)制備幾種饑餓激素類似物，其中每種類似物具有一不同的插入的混雜表位。也需要注意的是，當(dāng)討論中沒有成為自體蛋白存在分離的形式時，外源T-細胞表位也包括隱藏的T-細胞表位的應(yīng)用，即來自自體蛋白的表位僅僅施加免疫原的性能。
“外源T輔助淋巴細胞表位”(外源TH表位)是一種外源T細胞表位，該表位結(jié)合MHC的II型分子，并能夠出現(xiàn)在結(jié)合在MHC的II型分子上的抗原呈遞細胞(APC)上。
本發(fā)明上下文中的(生物)分子“功能部分”表示的是負責(zé)由分子施加的至少一種生化或生理效應(yīng)的分子部分。本領(lǐng)域公知的是，許多酶和其它效應(yīng)器分子具有一個活性位點，該活性位點負責(zé)由討論中的分子施加的效應(yīng)。分子的其它部位可以作為有利于實現(xiàn)目的的穩(wěn)定或溶解性；因此，如果這些目的和本發(fā)明中的某些實施方式不相關(guān)，分子的其它部位可以排除。例如，可以用某種細胞因子(cytokines)作為饑餓激素中的一修飾半(modifying moiety)(和下面詳細的討論比較)，在這種情況下，由于和饑餓激素的耦合提供了必要的穩(wěn)定，穩(wěn)定性的問題可以不相關(guān)。
術(shù)語“佐劑”為在疫苗技術(shù)領(lǐng)域的常用意思，即一種物質(zhì)或一組合物，其中1)本質(zhì)上不能修飾對抗疫苗免疫原的特定的免疫反應(yīng)，但是其不過是2)能夠提高對抗免疫原的免疫反應(yīng)?；蛘?，換句話說，和佐劑一起的接種疫苗不能提供一個對抗免疫原的免疫反應(yīng)，和免疫原一起的接種疫苗可以或不可以產(chǎn)生對抗免疫原的免疫反應(yīng)，但是接種疫苗、免疫原和佐劑的結(jié)合誘導(dǎo)了對抗免疫原的免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)比免疫原單獨誘導(dǎo)的強烈。
本發(fā)明上下文中的分子的“靶向”想要表示的是在某種組織中優(yōu)先出現(xiàn)的狀況(其中分子引入到動物中)，或者是優(yōu)先和特定細胞或細胞類型的情況。效果可以以多種方式實現(xiàn)，這些方式包括組合物中有利于靶子的分子的形成，或在分子中引入基團以有利于靶子。這些問題將在下面詳述。
“免疫系統(tǒng)的刺激”表達的是物質(zhì)或組合物表示的是通常的、非特定的免疫能力的影響。許多佐劑和推定的佐藥(如某種細胞因子)共有刺激免疫系統(tǒng)的能力。用免疫刺激試劑的結(jié)果是免疫系統(tǒng)增加的“警戒性”，和單獨使用免疫原相比，其意味著和免疫原一起的同時或隨后的免疫誘導(dǎo)了重要的更有效的免疫反應(yīng)。
“生產(chǎn)性結(jié)合(productive binding)”表示的是針對MHC分子(I型或II型)的肽的結(jié)合，以便能夠刺激T-細胞，該T-細胞體現(xiàn)的是連接到MHC分子的肽。例如，如果APC刺激一連接到上述肽-MHC的II型聯(lián)合體的TH細胞，連接到APC表面的MHC的II型的分子的肽據(jù)說是有成果的結(jié)合，抗-饑餓激素免疫的優(yōu)選實施例如上簡單敘述，對抗饑餓激素的免疫可以是積極的和消極的。即使本發(fā)明的重點是藥劑的服用是誘導(dǎo)一針對饑餓激素的積極的免疫反應(yīng)，體內(nèi)結(jié)合饑餓激素的藥劑服用也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在本發(fā)明中可以應(yīng)用公知的單分子克隆的技術(shù)。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用人類的或人類全部克隆的抗體，如通過使用基因改造的鼠表示人類免疫球蛋白輕的或重的鏈。技術(shù)人員應(yīng)知道如何注射和服用這種抗體組合物?？蛇x擇的，饑餓激素受體可溶的形式可以注射，從而導(dǎo)致針對饑餓激素血流的有效的結(jié)合。
然而，如上所述，優(yōu)選的實施例包括對抗饑餓激素的活性免疫。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法用作免疫原的饑餓激素多肽是一種修飾的分子，其中至少在饑餓激素多肽氨基酸序列中有一個變化，由于獲得所有重要的針對饑餓激素自體耐藥性的機會大大方便了這種方法。值得注意的是，這并不排除用這種修飾的饑餓激素的形成的可能性，其進一步促進對抗饑餓激素的自體耐藥性的突破，如含有特定佐劑的形成在下面詳細討論。
已經(jīng)公開(Dalum I et al.，1996，.J.Immunol.1574796-4804)，潛在的自身反應(yīng)B-淋巴細胞認識自身蛋白生理性的出現(xiàn)在正常的個體中。然而，為了這些B-淋巴細胞能夠確實和相關(guān)的自體蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，從細胞因子產(chǎn)生T-輔助淋巴細胞需要協(xié)助(TH-細胞或TH-淋巴細胞)。通常不能提供這種協(xié)助，這是因為，當(dāng)通過抗原提呈細胞(ACPs)時，T-淋巴細胞通常不認識來自于自體蛋白的T-細胞表位。然而，通過自體蛋白提供“外源”的元素時(即引入一重要的免疫修飾)，認識外源因素的T-細胞在認識APC(如，初始的，單核細胞)上的外源表位時被激活。能夠認識修飾自體蛋白上的自體表位多細胞株的B-淋巴細胞(特異的ACPs)也使抗原內(nèi)在化，并且隨后出現(xiàn)外源T-細胞表位，隨后激活的T-淋巴細胞向這些自體反應(yīng)多細胞株的B-淋巴細胞提供細胞因子幫助。由于由多細胞株的B-淋巴細胞生成的抗體核修飾的多肽上的表位反應(yīng)，包括那些出現(xiàn)在天然的多肽上的，可和非修飾的自體蛋白進行交叉反應(yīng)的抗體也被誘導(dǎo)。
總之，T-淋巴細胞可以導(dǎo)致反應(yīng)，如果多細胞株的B-淋巴細胞的種群認識全部的外源抗原，事實上，其中只有插入的表位對于宿主來說是外源的。按照這種方法，可和非修飾的自體蛋白進行交叉反應(yīng)的抗體也被誘導(dǎo)。
為了得到自體耐藥性的突破，本領(lǐng)域中幾種修飾肽自體抗原的方法是公知的。因此，根據(jù)本發(fā)明，修飾能夠包括-至少一種外源T-細胞肽被引入，和/或-至少一種第一部分被引入到一抗原提呈細胞(APC)上，并影響修飾分子的靶子，和/或-至少一種第二部分被引入，并刺激免疫系統(tǒng)，和/或
-至少一種第三部分被引入到免疫系統(tǒng)上，并優(yōu)化修飾饑餓激素多肽的出現(xiàn)。
然而，在保持饑餓激素中原始的B-淋巴細胞表位的充分的比例時，所有這些修飾都應(yīng)進行，這是由于天然分子的B-淋巴細胞認識得到了提高。
在一個優(yōu)選的實施例中，支鏈(以外源T-細胞表位或上述的第一、第二和第三部分)以共價或非共價的引入。這表明來自饑餓激素的氨基酸殘基的延伸在沒有改變初始氨基酸序列時衍生，或至少在單獨的鏈中的氨基酸之間的表位鍵沒有引入變化。
可選擇的和優(yōu)選的實施例使用氨基酸取代物和/或缺失和/或插入物和/或加成化合物(可能受到重組細胞或肽合成方式的影響；涉及氨基酸較長的伸展的修飾產(chǎn)生融合多肽)。本實施例特異的優(yōu)選方式是WO 95/05849中公開的技術(shù)，該文獻公開了通過和自體蛋白類似物的免疫針對自體蛋白進行的免疫熱處理(immunizing)，其中許多氨基酸序列被相應(yīng)的許多氨基酸序列取代，而同時保持類似物中自體蛋白所有的3維結(jié)構(gòu)。然而，為了本發(fā)明，如果修飾產(chǎn)生外源T-細胞表位的同時保持饑餓激素中足夠數(shù)量的B-細胞表位，這就足夠了。然而，為了獲得誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的最大效率，饑餓激素的整體三級結(jié)構(gòu)優(yōu)選保持在修飾的分子中。
下述公式描述的是本發(fā)明包括的饑餓激素的通常的結(jié)構(gòu)下述公式描述的是本發(fā)明包括的分子的通常的結(jié)構(gòu)(MOD1)S1(ghre1)n1(MOD2)S2(ghre2)n2…(MODx)Sx(ghrex)nx(I)其中，ghre1～ghre2是含有饑餓激素多肽后續(xù)的x B-細胞，獨立的相同或不相同，并可以含有或不含有外源支鏈，x是一≥3的整數(shù)，n1-nx是x整數(shù)≥0(至少一種個是≥1)，MOD1-MODx是引入保持的B-細胞之間的x修飾，S1-Sx是x整數(shù)≥0(如果在ghrex序列中沒有支鏈引入，至少一種個是≥1)。因而，假定免疫原上通常的功能抑制劑，本發(fā)明允許饑餓激素多肽原始序列的各種蛻變(permutations)和其中的各種修飾。從而，包括在本發(fā)明中的修飾饑餓激素多肽通過饑餓激素多肽序列的部分省略得到，例如，修飾饑餓激素多肽體內(nèi)的展示了反作用，因而產(chǎn)生了非期望的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例利用饑餓激素多肽的B-淋巴細胞表位的多重出現(xiàn)(即公式I，其中至少一種B-細胞表位出現(xiàn)在兩個位置)。這種效果抗原通過不同的方法實現(xiàn)，例如通過簡單的制備包含結(jié)構(gòu)(饑餓激素多肽)m的融合多肽(fusion polypeptides)，其中m是大于或等于2的整數(shù)，然后至少在一個饑餓激素序列中引入上述討論的修飾。優(yōu)選的是，引入的修飾包括至少一種個B-淋巴細胞表位的復(fù)制物和/或半抗原的引入。這些包括可選擇的表位的多重出現(xiàn)的實施例特別適合這些情況即只要饑餓激素多肽的小部分用作疫苗試劑中的成分。
如上所述，外源T-細胞表位的引入通過至少一種個氨基酸的插入、增加、缺失或取代來完成。當(dāng)然，正常的情況是在氨基酸序列中引入一個以上的變化(如通過完全的T-細胞表位插入或取代)，但是要達到的重要目的是，當(dāng)通過抗原提呈細胞(APC)處理類似物時，類似物將產(chǎn)生這樣的外源免疫顯型T-細胞表位，即該決定基出現(xiàn)在APC表面的MCH的II型分子的上下文中。因而，如果在合適位置的饑餓激素多肽的氨基酸序列包括也可以在外源TH表位的許多氨基酸殘基，然后外源TH表位能夠以氨基酸插入、增加、缺失和取代的方式、通過提供剩余外源表位的氨基酸來完成。換句話說，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，通過插入或取代引入完整的TH表位不是必要的。
優(yōu)選的是，氨基酸插入、缺失、取代或增加的數(shù)目至少為2，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和25個插入、缺失、取代或增加。進一步優(yōu)選的是，氨基酸的插入、缺失、取代或增加不超過150，例如最多在100、90、80和70。特別優(yōu)選的是，插入、缺失、取代或增加的數(shù)目不超過60，特別的數(shù)目不應(yīng)超過50甚至40。最優(yōu)選的是數(shù)目不超過30。
關(guān)于氨基酸的增加，值得注意的是，當(dāng)最終的結(jié)構(gòu)是融合多肽的形式時，氨基酸的增加大大超過150。
本發(fā)明優(yōu)選的實施例包括通過引入至少一種個外源免疫顯型T-細胞表位的修飾?？梢岳斫獾氖牵琓-細胞表位免疫的優(yōu)勢取決于討論的動物的物種。正如此處應(yīng)用的，術(shù)語“免疫顯型(immunodominance)”簡單的是指在預(yù)防接種的個體/群體的表位產(chǎn)生一重要的免疫反應(yīng)，但是公知的事實是在個體/群體的顯型免疫的T-細胞表位在同樣物種中的另一個體中不是必要的顯型免疫，即使其可以在后者的個體中粘合MCH-II型分子。因此，為了本發(fā)明的目的，當(dāng)出現(xiàn)在抗原時，免疫顯型T-細胞表位對提供T-細胞幫助是有效的。代表性地，免疫顯型T-細胞表位具有內(nèi)在的特征，無論多肽在哪里出現(xiàn)，該些免疫顯型T-細胞表位將總是充分的出現(xiàn)在連接MHC的II型分子上。
另一個重要點是T-細胞表位的MHC限制的問題。通常，自然生成的T-細胞表位是MHC受限的，即含有一T-細胞表位的某種肽將僅僅有效的連接到MHC的II型分子的子集中。在大多數(shù)的情況下，依次具有這種效果即一種特定T-細胞表位的使用將產(chǎn)生一疫苗的成分，該成分只在一定種群中有效，并取決于比例的大小，很有必要在同一分子中包括根多的T-細胞表位，或者可選擇的制備一多組分疫苗，其中組分是不同的饑餓激素多肽，并通過引入的T-細胞表位彼此間進行區(qū)分。
如果所用的T-細胞的MHC限制完全未知(例如，接種的動物具有很少的所述的MHC成分的情況)，由特定疫苗成分覆蓋的種群的部分通過下述公式計算(II)---fpropedoton=1-Πi=10(1-pi)]]>-其中，pi是應(yīng)答出現(xiàn)在疫苗組分中的外源T-細胞表位的種群中的頻率，n是疫苗組分中的外源T-細胞表位的總數(shù)。因而，種群中的應(yīng)答頻率分別是0.8、0.7和0.6、含有3個外源T-細胞表位的疫苗組分將給出1-0.2×0.3×0.4＝0.976，-即97.6％的種群將統(tǒng)計地鑲嵌調(diào)制的MHC-II應(yīng)答疫苗。
上述的公式不應(yīng)用于這些情況，即其中所用的或多或少的肽的準確的MHC限制模式是公知的情況。例如，如果某種肽僅僅連接由HLA-DR等位基因DR1、DR3、DR5和DR7解碼的人類的MHC-II分子，于是這種肽的應(yīng)用和另外連接由HLA-DR等位基因解碼的剩余的MHC-II分子肽一起由討論中的種群覆蓋100％。同樣地，如果第二肽僅僅連接DR3和DR5，這種肽的添加將根本不增加覆蓋。如果種群應(yīng)答的計算純粹以疫苗中的T-細胞表位的MHC限制位基礎(chǔ)，由特定的疫苗組分覆蓋的種群的分數(shù)可以通過下述公式計算 -其中，φj是解碼MHC分子的等位基因單模標本中種群頻率的總和，其中MHC分子連接疫苗中任一T-細胞表位，并屬于3個公知的HLA位點(locus)(DP、DR和DQ)的jth；實際上，在第一次計算中，MHC分子將認識每個疫苗中的T-細胞表位，因而按類型列出(DP、DR和DQ)-然后，列出的不同等位基因單模標本的個體頻率按照每種類型總計，從而生成φ1、φ2和φ3。
公式II中的pi可能會發(fā)生超過相應(yīng)的理論值ni(IV)---πi=1-Πj=13(1-vj)2]]>
-其中，Uj是解碼MHC分子的等位基因單模標本中種群頻率的總和；其中MHC分子連接疫苗中任一T-細胞表位并屬于3個公知的HLA位點(locus) (DP、DR和DQ)的jth這表明種群的1-πi是fresidual_i=(pi-πi)/(1-πi)的應(yīng)答者的頻率。因此，公式III可以調(diào)整，從而生成公式V。
-其中，如果是消極的，術(shù)語1-fresidual_i設(shè)置為0。需要注意的是，公式V要求所有的表位對抗同套的單模標本已被單模標本的映射。
因此，當(dāng)選擇T-細胞表位引入到類似物里時，包括能夠獲得的表位的所有信息是重要的1)種群中針對每種表位的應(yīng)答者的頻率，2)MHC限制數(shù)據(jù)，和3)種群中相關(guān)單模標本的頻率。
此處存在許多天然生成的“混雜的”T-細胞表位，該表位在很大比例的動物種群或動物種群中是活性的，并優(yōu)選引入到疫苗中，從而降低了在同一疫苗中大量不同類似物的需求。
根據(jù)本發(fā)明，混雜的表位可以是天然生成的人類T-細胞表位，如從破傷風(fēng)菌疫苗中的表位(如P2和P30表位)，以及白喉類毒素、流感病毒hemagluttinin(HA)和P.falciparum CS抗原中的表位。
過去許多年，許多其它的混雜T-細胞表位已經(jīng)被確認。特別是能夠連接大比例的HLA-DR分子的表位已經(jīng)確認，其中HLA-DR分子由HLA-DR等位基因解碼；根據(jù)本發(fā)明，在使用的類似物中引入了所有可能的T-細胞表位。比較下述文獻討論的表位，這些文獻包括WO 98/23635(Frazer IH et al.，assigned to The University of Queensland)；Southwood S et al.，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F et al.，1988，Nature 336778-780；Chicz RM et al.，1993，J.Exp.Med 17827-47；Hammer J etal.，1993，Cell 74197-203；和Falk K et al.，1994，Immunogenetics39230-242。近來的文獻也涉及HLA-DQ和-DP配合基。此處5篇參考文獻列出的所有表位和本發(fā)明中應(yīng)用的天然表位相關(guān)，也和此處的表位共享相同的目的。
可選擇的，表位可以是任何人工的T-細胞表位，該表位能夠連接大比例的MHC的II型分子。根據(jù)本發(fā)明，在WO 95/07707和相應(yīng)的論文AlexanderJ et AL.，1994，Immunity 1751-761(這兩個公開在此處作為參考文獻)公開的pan DR肽(“PADRE”)是本發(fā)明有興趣使用的表位。需要注意的是，為了改善服用時的穩(wěn)定性，這些文獻中公開的最有效的PADRE肽附帶C-和N-終點(termini)的D-氨基酸。然而，本發(fā)明主要是為了將相關(guān)的表位結(jié)合為修飾的饑餓激素多肽的一部分，然后在ACPs的溶菌小室(lysosomal compartment)進行酶分解，以便在隨后的MHC-II分子中出現(xiàn)；因此，本發(fā)明中使用的表位中結(jié)合D-氨基酸不是有利的。
一個特別優(yōu)選的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA或一免疫有效的亞序列(subsequence)。這個和同樣缺失MHC限制的其它表位在T-細胞表位中是優(yōu)選的，應(yīng)在本發(fā)明的方法中使用的類似物中出現(xiàn)。這些超-混雜的表位可以是本發(fā)明中最簡單的實施例，其中僅有一個修飾的饑餓激素多肽出現(xiàn)在接種的動物免疫系統(tǒng)中。
如上所述，饑餓激素的修飾也可以包括第一部分的引入，該第一部分將修飾的饑餓激素多肽變?yōu)锳PC或B-淋巴細胞。例如，第一部分可以是B-淋巴細胞特定的表面抗原或APC特定表面抗原的特定結(jié)合配體。本領(lǐng)域中許多這種特定的表面抗原是公知的。例如，部分可以是糖類，該糖類是B-淋巴細胞或APC(如甘露聚糖或甘露糖)上的受體?？蛇x擇的，第二部分可以是半抗原。明確認識APCs或淋巴細胞上的表面分子的抗體片斷可以用作第一部分(例如，表面分子可以是巨噬細胞和單核細胞的FCY受體，如FCγRI或，可選擇任何其它特定表面標記如CD40或CTLA-4)。需要注意的是，所有舉例的目標分子也可以作為佐劑的一部分，如下所述。
為了獲得增強的免疫反應(yīng)，作為將修飾的饑餓激素多肽變?yōu)槟撤N細胞類型的替代物或補充，通過包括上述刺激免疫系統(tǒng)的第二部分，其可能增加免疫系統(tǒng)的應(yīng)答水平。第二部分的代表性例子是細胞因子和熱休克(heat-shock)蛋白或分子伴侶(molecular chaperones)，以及其中有效的部分。
根據(jù)本發(fā)明，使用的合適的細胞因子是那些通常在疫苗組分中作為佐藥的，例如，干擾素γ(IFN-γ)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和刺激因素(GM-CSF)的粒細胞-巨噬細胞群；可選擇的，細胞因子分子的功能部分可以作為第二部分。關(guān)于這種細胞因子作為佐藥物質(zhì)的應(yīng)用將在下面敘述。
根據(jù)本發(fā)明，用作第二部分的合適的熱休克蛋白質(zhì)或分子伴侶可以是HSP70(熱休克蛋白70、)、HSP90(熱休克蛋白90)、HSC70(熱休克同源蛋白70)、GRP94(和gp96一樣公知，Wearsch PA et al.1998，Biochemistry 375709-19)和鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)。
可選擇的，第二部分可以是毒素、如李氏桿菌(listeriolycin，LLO)、油脂A和可加熱的腸毒素。許多分支桿菌的衍生物也是可選擇的，如MDP(胞壁酸酶)、CFA(完全的弗氏’s佐藥)和海藻糖雙脂基(diesters)TDM和TDE引入增強免疫系統(tǒng)中的修飾饑餓激素多肽出現(xiàn)的可能性是本發(fā)明一個重要的實施例。這個原則也通過幾個實施例顯示了。例如，公知的是，錨定在伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)蛋白質(zhì)OspA的棕櫚酰脂可以使用，以提供自體調(diào)整多肽(cf.如WO 96/40718)-油脂蛋白質(zhì)(lipidatedproteins)和核形成膠束樣的結(jié)構(gòu)，該核包括多肽的油脂錨定部分和分子突出的剩余部分，從而導(dǎo)致抗原定子的多重出現(xiàn)。因此，這種使用和用不同油脂錨(如十四烷基、法呢基、香葉酯-香葉酯基、GPI-錨和N-酰甘油二酯基)的相關(guān)的方法在本發(fā)明中是優(yōu)選的實施例，特別是由于在重組細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的油脂錨的規(guī)定是相當(dāng)易懂的，并且對于修飾的饑餓激素多肽來說，僅僅要求將如天然生成信號序列作為融合部分。
另一種可能就是使用補充因素C3或C3自身的C3d片段(cf.Dempsey ETAL.，1996，Science 271，348-350 and Lou & Kohler，1998，NatureBiotechnology 16，458-462)。
另一種提供表位區(qū)域的有吸引力的方法是WO 00/32227公開的技術(shù)，其中抗原以規(guī)則的重復(fù)圖樣出現(xiàn)，因而產(chǎn)生獨立類似病毒衣殼的免疫原的T-細胞，在本發(fā)明的上下文中，WO 00/32227中的技術(shù)是專業(yè)輔助的應(yīng)用。因而WO 00/32227的公開在此處作為參考。本發(fā)明可選擇的實施例是共價結(jié)合的聚氨基酸，該實施例也使饑餓激素多肽的重要的表位區(qū)域的多重(如至少是2)復(fù)制優(yōu)選的出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中，該聚氨基酸選自饑餓激素多肽、以及其后續(xù)、或某種分子的類似物、當(dāng)有必要時和上述討論的外源TH表位或其中的第一、第二或第三部分一起。例如，可以用高分子材料，如聚羥基聚合物，特別是糖類如右旋糖苷，cf.如Lees A et al.，1994，Vaccine 121160-1166；Lees A et AL.，1990，J Immunol.1453594-3600，但是甘露糖和甘露聚糖也是有用的替代物。例如，E.大腸桿菌和其它的細菌的整合膜蛋白也是有用的結(jié)合模式。傳統(tǒng)的載體分子如鑰孔血藍蛋白(Keyholelimpet hemocyanin，KLH)、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和牛血漿蛋白(BSA)也是優(yōu)選和有用的結(jié)合模式。共價配位饑餓激素多肽至藥學(xué)上可接受的聚羥基聚合物如糖類的優(yōu)選的實施例包括至少一種個饑餓激素多肽和至少一種個外源T-輔助表位的應(yīng)用，這些決定基分別配位到聚羥基聚合物(即外源T-輔助表位、彼此不熔的結(jié)合到作為載體主鏈的聚羥基聚合物的饑餓激素多肽)。當(dāng)執(zhí)行饑餓激素多肽區(qū)域的合適的B-細胞表位由短的肽伸展組成時，這種實施例是最優(yōu)選的-這是因為這是一種非常方便的獲得在最終的免疫原試劑中的選擇表位的多重出現(xiàn)的方法。
特別優(yōu)選的是，聚羥基聚合物的聚氨基酸的耦合是通過由肽酶分解的氨基鍵實現(xiàn)的。這種方法具有這樣的效果APCs將能夠繼續(xù)這種結(jié)構(gòu)，同時能夠處理該結(jié)構(gòu)和隨后在MHC-II中出現(xiàn)的外源T-細胞表位。
獲得肽(有益的饑餓激素多肽和外源的表位)的耦合的方法是激活合適的聚羥基聚合物和tresyl(三氟乙基-磺酰基)或其它合適的激活基團如馬來酰亞胺、p-氮苯基卡樂甲酸鹽(用于激活羥基和肽和聚羥基聚合物間的肽鍵的形成)和甲苯磺酰基(p-甲苯磺酰)。例如，可以制備WO 00/05316和US 5,874,469公開的活性多糖，并和通過傳統(tǒng)固體或液相肽合成技術(shù)制備的T-細胞表位和饑餓激素肽耦合。最終的產(chǎn)品包括聚羥基聚合物主鏈(如一個右旋糖苷主鏈)，并通過他們的N-末端或其它可用的氮氣部分、饑餓激素多肽和外源T-細胞表位連接。如果需要，合成饑餓激素多肽也是可以的，以便保護所有可得的氨基酸基團， 而不是在N-末端的一個、隨后耦合最終被保護的肽至tresylated右旋糖苷部分和最終不保護的最終變化。這種方法的特定實例在下述的實施例中公開。
不使用WO 00/05316和US 5,874,469中公開的水溶性多糖分子，使用交叉耦合的多糖分子也是一樣可能的，因而得到多肽和多聚糖之間的微粒配對被認為是導(dǎo)致多肽的免疫系統(tǒng)的改善的出現(xiàn)，當(dāng)注入配對和獲得對ACPs的靶子有吸引力的微粒時，兩個目的都達到了，即獲得了局部沉積效應(yīng)。使用這種微粒系統(tǒng)的方法在實例中也進行了詳述。
考慮到在下面饑餓激素多肽中引入修飾的選擇區(qū)域是a)公知和預(yù)知的B-細胞表位的保存，b)3D結(jié)果的保存，c)避免B-細胞表位出現(xiàn)在“生產(chǎn)者細胞”上等等。如上所述，不管怎樣，篩選一系列可以在不同位置引入T-細胞表位的修飾的饑餓激素分子是相當(dāng)容易的。
以饑餓激素成熟的形式和前肽(propeptide)的形式為目標的接種疫苗可以正視，這兩種形式被認為可以具有明顯的優(yōu)點。通過以前肽為靶子可以干擾導(dǎo)致成熟饑餓激素形成的酶的處理過程。如果所用的免疫原包括成熟饑餓激素和前饑餓激素的B-細胞表位，然后形成的抗體將具有最大的下調(diào)的成熟的饑餓激素不僅其有可能抑制成熟的饑餓激素，而且它的形成由于酶處理過程被初抑將降低，這是因為強的粘合抗體將“隱藏”分裂的位置和其它要發(fā)生的酶分裂的重要位置。
另一方面，如果要降低成熟饑餓激素的水平至較低的水平，優(yōu)選針對沒有包括足夠數(shù)量的成熟饑餓激素的前肽部分進行接種免疫。
最后，如果僅有興趣以成熟分子(和公知的非-饑餓激素具有很少一樣的序列)為靶，免疫原應(yīng)該包括成熟饑餓激素中的B-細胞表位。
由于本發(fā)明最優(yōu)選的實施例包括對抗人類饑餓激素的免疫，因此優(yōu)選的是上述討論的饑餓激素多肽是人類的饑餓激素多肽。然而，下述關(guān)于人類饑餓激素的任何討論能夠用于其它物種的饑餓激素，特別是列在應(yīng)用中的序列。可以理解，和人類序列變化相關(guān)的教導(dǎo)也調(diào)換到相關(guān)動物的相關(guān)序列從列舉的序列來看，其出現(xiàn)在能夠發(fā)現(xiàn)成熟饑餓激素肽序列的邊界，可以理解，人類序列中的任何特定的序列數(shù)據(jù)將偏移吸收在不同哺乳動物饑餓激素序列中的相應(yīng)序列。
在與人類饑餓激素相關(guān)的實施例中，特別優(yōu)選的是人類饑餓激素多肽通過取代至少一種個在SEQ ID NO11的氨基酸序列進行修飾，至少一種個相同或不同長度的氨基酸序列和含有外源TH表位?？蛇x擇的，外源TH表位可以簡單插入SEQ ID NO11。
進一步明確的，含有(完全的)引入到SEQ ID NO11的氨基酸序列的TH可以引入到任何氨基酸的SEQ ID NO11。即，任何氨基酸之后的引入是可能的SEQ ID NO11中的氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、10O、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117；并且，如果是加入，則在氨基酸1的前面。這也伴隨著下述氨基酸的缺失，即SEQ ID NO11中的氨基酸1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116和/或117。
然而，和針對前肽的免疫相比，對抗饑餓激素的前-前肽形式的免疫是相關(guān)的，這不是期望的，優(yōu)選的是，引入在下述任何氨基酸之后，即SEQID NO11中的氨基酸23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、和117(由于氨基酸23在人類饑餓激素的信號序列中是最后的氨基酸，所以在饑餓激素分子的前肽區(qū)域進行引入)，并且信號序列中沒有氨基酸是免疫原的部分。
在需要以完全的前肽為靶子的實施例中，和上所述比較，優(yōu)選的是避免前饑餓激素(proghrelin)中的B-細胞表位的破壞-因此，在此實施例中，外源TH表位的引入沒有或僅僅伴隨非常有限的SEQ ID NO11中的其中之一的氨基酸的缺失，這些氨基酸為氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。
另一方面，如果需要提供不包括在成熟饑餓激素序列中的“免疫原的“饑餓激素，和上所述比較，這些引入優(yōu)選包括SEQ ID NO11中的許多氨基酸的缺失，這些氨基酸的數(shù)目為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。從而，優(yōu)選的是非-破壞性(即B-細胞表位保存/缺失/取代)在SEQ ID NO11中的下述氨基酸中發(fā)生，這些氨基酸為52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。在這個實施例中，特別優(yōu)選的是所有的氨基酸1-51被消除。
最終，如果需要提供不包括前饑餓激素部分中的任何B-細胞表位的饑餓激素變型，該前饑餓激素沒有形成成熟分子的部分，然后外源TH表位的引入應(yīng)伴隨SEQ ID NO11中許多氨基酸的缺失，這些氨基酸為氨基酸52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。因而，優(yōu)選的是，優(yōu)選的是非-破壞性(即B-細胞表位保存/缺失/取代)在SEQ ID NO11中的下述氨基酸中發(fā)生，這些氨基酸為24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。在這個實施例中，最優(yōu)選的是所有的氨基酸52-117被消除。
本發(fā)明的另一實施例是饑餓激素類似物的出現(xiàn)，該類似物不包括這樣的饑餓激素的任何序列，該饑餓激素是有成果的連接至開始T-細胞應(yīng)答的MHC的II型分子。
利用免疫原使免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)抗-饑餓激素免疫反應(yīng)的機理如下值得注意的是，當(dāng)自體蛋白是佐劑時，存在的危險時在一些接種的個體中，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不能僅僅通過停止免疫而停止，其中佐劑強有力的突破了個體針對自體蛋白的耐藥性。這是因為，在這些個體中的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)很可能時通過自體蛋白的天然TH表位驅(qū)動的，由此產(chǎn)生的副作用時接種的個體自體蛋白能夠以符合自己的方式而成為免疫試劑因而一個自動免疫情況產(chǎn)生了。
依作者所掌握的知識來看，包括使用外源TH表位的優(yōu)選的方法從來沒有產(chǎn)生這樣的效果，因為抗-自體免疫反應(yīng)由外源的TH表位驅(qū)動，而且在免疫終止后，發(fā)明人重復(fù)演示了由優(yōu)選的技術(shù)刺激的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)實際上降低了。然而，理論上，免疫反應(yīng)由相關(guān)自體蛋白的自體TH表位驅(qū)動也可以在一些個體上發(fā)生-特別是考慮到相關(guān)的自體蛋白非常豐富，而其它治療性的相關(guān)的自體蛋白僅僅局部出現(xiàn)或在體內(nèi)很少量的出現(xiàn)，所以“自體免疫效果”沒有可能性；然而，對于饑餓激素，這種效果不能排除。
因此，一種非常簡單的避免這種自體免疫的方法是避免肽序列免疫原的內(nèi)含物作為TH表位(并且由于少于9個氨基酸的肽不能作為TH饑餓激素，使用短的片段是一種簡單易行的方法)。因此，本發(fā)明的這個實施例也用于確保免疫原不包括可以作為“自體刺激TH表位”的靶子饑餓激素的肽序列，該表位包括的序列僅僅包括目標蛋白序列中的保守取代，該目標蛋白也可以作為TH表位。
饑餓激素類似物免疫系統(tǒng)出現(xiàn)的優(yōu)選的實施例包括含有至少一種來源于肽的饑餓激素的嵌合肽的使用，該嵌合肽不有成效的和MHC的II型分子連接，并且至少一種外源的T-輔助表位。
而且，優(yōu)選的是衍生于肽的饑餓激素具有一B-細胞表位。如果免疫原的類似物是一個是特別有利的，其中含有一個或多個B-細胞表位的氨基酸序列以連續(xù)的序列或包括插入的序列代替，其中插入包括外源T-輔助表位當(dāng)在饑餓激素區(qū)域進行的合適的B-細胞表位由短的肽的伸展組成時，該實施例是最優(yōu)選的，并且不能有成效的連接到MHC的II型分子。因此，選擇的B-細胞表位或饑餓激素的表位包括最多9個相關(guān)動物的相關(guān)饑餓激素的連續(xù)氨基酸，即至少9個連續(xù)的氨基酸的序列號為9、10、11、12、13、14。
較短的肽是優(yōu)選的，如那些在饑餓激素氨基酸序列中至多有8、7、6、5、4或3個的連續(xù)氨基酸。
優(yōu)選的是，類似物包括至少序列號為9、10、11、12、13或14的序列，以上至少每個序列獨立的由饑餓激素中的氨基酸伸展組成，該饑餓激素選自由9、8、7、6、5、4和3個連續(xù)氨基酸組成的基團。
特別優(yōu)選的是，連續(xù)氨基酸從氨基酸殘基開始，氨基酸殘基選擇由SEQID NO9、10、11、12、13或14的下述殘基組成的基團殘基1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116，其中，可以給出連續(xù)伸展的長度和相關(guān)的饑餓激素多肽。
在上述所有的變型中，出現(xiàn)了成熟饑餓激素的n-辛酰化(octanyolated)的絲氨酸，優(yōu)選的是，以沒有辛酰化的方式制備免疫原的構(gòu)成物(或者以肽的合成或用不引入辛?；谋磉_系統(tǒng)自備這種構(gòu)成物)。這種方式確保了上述構(gòu)成物在CNS中沒有生理活性。
饑餓激素和修飾的饑餓激素多肽的制劑當(dāng)以服用的方式影響到饑餓激素多肽或修飾的饑餓激素多肽出現(xiàn)在動物的免疫系統(tǒng)時，多肽的劑型通常按照現(xiàn)有技術(shù)的規(guī)則進行。
通常，含有肽序列作為活性成分的疫苗的制備在本領(lǐng)域是很容易理解，如US4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770公開的實例在此處作為參考。代表性的，這種疫苗可以注射的方式如液體溶液或懸浮液的方式制備；溶于液體溶液或懸浮液的固體在注射前也可以制備。制備也可以乳化?；钚悦庖咴M分經(jīng)常和藥學(xué)上可接受的和活性組分相容的賦形劑混合。
例如，合適的賦形劑是水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇或類似物，以及上述的結(jié)合。除此之外，如果需要，疫苗可以含有少量的輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑，PH緩沖劑，或提高疫苗效果的佐劑；佐劑將在下面詳細說明。
通常，疫苗通過注射服用而不經(jīng)過腸道，例如，皮下的、皮內(nèi)的、皮層內(nèi)的、真皮的或肌肉。適合其它方式的服用的劑型包括栓劑，在某些情況下是口頭的、口腔的、舌下的、腹膜內(nèi)的、陰道內(nèi)的、肛門的、硬腦膜外的、脊骨的和顱骨內(nèi)的劑型。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和載體可以包括如聚亞烴基(polyalkalene)乙二醇或甘油三酸酯；這種栓劑可以從含有0.5％-10％的活性組分的混合物形成，優(yōu)選為1-2％。例如，口頭的劑型包括常用的賦形劑如藥物級別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，及其類似物。這些組分的形式為溶液、懸浮液、片劑、藥丸、膠囊、持續(xù)釋放的劑型或粉末，并含有10-95％的活性組分，優(yōu)選為25-75％。對于口服的劑型，霍亂毒素是有益的劑型助劑(也可能是結(jié)合配體)。
多肽可以中性或鹽的形式形成疫苗。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸式鹽(和肽的自由氨基一起形成)，并和無機酸如鹽酸或磷酸一起形成，或者是有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸和其類似物。和自由羧基一起形成的鹽也來自于無機堿如鈉、鉀、銨、鈣、或鎂的氫氧化物，有機堿如異丁胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、組織氨基酸、普魯卡因及其類似物。
疫苗以合適的劑量服用，這種劑量是治療上有效和免疫原的。服用的量取決于治療的對象，包括個體免疫系統(tǒng)鑲嵌免疫反應(yīng)的能力和需要保護的程度。合適的劑量為每次接種疫苗的活性組分為幾百毫克，范圍為0.1-2000毫克(即使高1-10毫克的量也是可預(yù)期的)，如0.5-2000毫克或0.5-1000毫克，優(yōu)選為1-500毫克，特別優(yōu)選的范圍為10-100毫克。合適的初始服用和追加注射(booster shot)的攝生法也是可變的，但是以隨后的接種或其它服用的初始服用來表示。
應(yīng)用的方式可以有很大不同。疫苗的任何傳統(tǒng)的服用方法都是可用的。這些方法包括生理可接受的基體、固體方式服用或生理可接受的膠體，非腸道的注射或類似的方法。疫苗的劑量取決于服用的路線，根據(jù)需要接種形成抗原的不同年齡的人會有不同。
一些疫苗的多肽在疫苗中是充分免疫原的，但是，如果疫苗進一步包括佐藥，一些免疫反應(yīng)會增強。
疫苗獲得輔助效果的各種方法是公知的。常用的原則和方法在THETheory and Practicai Application of Adjuvants″，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6，也在″VaccinesNew Generation Immunological″，1995，Gregorialdis G etal.(eds.)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9中詳細公開了，這兩篇文獻在此處引用并作參考。
特別優(yōu)選的是使用可以有利于突破自體抗原的自體耐藥性的佐劑；事實上，這對于未修飾的饑餓激素用作自動免疫的活性組分是必要的。合適佐劑的非限制例子選自由免疫靶子組成的基團；免疫調(diào)制佐劑如毒素、細胞因子和分枝桿菌的衍生物；油的形式；高分子；形成佐劑的膠束；皂角苷；免疫刺激的復(fù)矩陣(ISCOM matrix)；微粒；DDA；鋁佐劑；DNA佐劑；γ-菊粉；以及膠囊佐劑。通常要注意的是上述公開的化合物和試劑在類似物中可用作第一、第二和第三部分，也可用在本發(fā)明的疫苗的佐劑中。
佐劑的應(yīng)用包括試劑的應(yīng)用，如氫氧化鋁或磷酸鋁，通常在鹽的緩沖液中的百分比為0.05-0.1％，和0.25％的糖的合成高分子(如Carbopol)混合，以加熱的方式對疫苗中的蛋白質(zhì)進行積聚，溫度范圍為70℃-110℃，加熱時間為30秒-2分鐘，采用交叉耦合的方式進行積聚也是可以的。下述積聚是可以采用的通過胃液素將抗體(Fab片段)處理成白蛋白的再生作用，和細菌細胞如孢子蟲(C.parvum)或內(nèi)毒素或革蘭氏陰性細菌的脂多糖成分混合，在生理可接受的油賦形劑(oil vehicles)中的乳狀液，如二縮甘露醇單油酸鹽(Aracel A)，或用作代用品的有20％的碳氟化合物(Fluosol-DA)的乳狀液。和油如鯊烯和IFA的混合也是優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，DDA(二甲基二十八烷基溴化銨)是作為佐劑的有益的備選物，不僅包括DNA和γ-菊粉，而且弗氏完全或非完全的佐劑和糖萜素(quillaja saponins)如QuilA和QS2作為RIBI也是有益的。進一步的可能性是磷?；椭珹(MPL)，上述的C3和C3d，以及胞壁酰二肽(MDP)。
和佐劑的效果相比，油脂的形成是公知的，因此，根據(jù)本發(fā)明，油脂佐劑是優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，免疫刺激復(fù)矩陣類型(ISCOM矩陣)佐劑也是優(yōu)選的選擇，特別是由于這種佐劑的類型通過ACPs能夠上調(diào)MHC的II型表達。ISCOM矩陣由皂角苷(三萜系化合物)組成(比例可選擇的)，該皂角苷來自糖萜素、膽固醇和磷脂。當(dāng)和免疫原蛋白混合時，最終微粒的形成公知的是ISCOM微粒，其中皂角苷的比例為60-70％w/w。有關(guān)組合物和免疫刺激混合物的詳細情況可以在如上述的處理佐劑的文獻中找到，而且，Morein B etal.，1995，Clin.Immunother.3461-475和Barr IG and Mitchell GF，1996，Immunol.and Cell Biol.748-25(都作為此處的參考文獻)提供了制備完全的免疫刺激化合物的有用的方法。
獲得佐劑效果的另一高度有益的可能性(并且是優(yōu)選的)是采用Gosselin ET AL.，1992(此處用作參考)中公開的技術(shù)。簡單的說，相關(guān)免疫原如本發(fā)明的抗原的出現(xiàn)可以將抗原變?yōu)獒槍魏思毎?巨噬細胞上的FCY受體的抗體(或抗原結(jié)合抗體片段)。特別是抗原和抗-FcγRI之間的變化已用來提高接種疫苗的免疫性。
其它的可能性包括上述靶子和免疫調(diào)制物質(zhì)(i.a.細胞因子)的使用，這些物質(zhì)在修飾的饑餓激素中用作第一和第二部分。在這種關(guān)系上，象poly IC的細胞因子的合成誘導(dǎo)劑也是可能的。
合適的分枝桿菌的衍生物選自下述物質(zhì)組成的基團胞壁酰二肽、完全的弗氏佐劑RIBI和海藻糖二酯如TDM和TDE。
合適的免疫靶子佐劑選自下述物質(zhì)組成的基團CD40配合體、抗體或特定的粘合片段(和上述討論比較)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合適的高分子佐劑選自下述物質(zhì)組成的基團糖類如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑料高分子和橡膠如乳珠。
當(dāng)然，另一種調(diào)制免疫反應(yīng)的有益方法包括“實質(zhì)的淋巴腺”(VLN)(所有由Immunotherary，Inc.，360 lexington avenue，New York，NY10017-6501設(shè)計的醫(yī)療設(shè)備)中的饑餓激素免疫原(可選擇的和佐劑與藥學(xué)上可接受載體和賦形劑一起)。VLN(一纖細的管狀設(shè)備)模擬淋巴腺的功能和結(jié)構(gòu)。皮下VLN的插入和細胞因子和化學(xué)運動性的高潮一起產(chǎn)生了無菌炎癥的位置。T-、B-細胞和APCs很快應(yīng)答危險信號，跟蹤到發(fā)炎的位置并在VLN的多孔矩陣內(nèi)積聚。很明顯，當(dāng)使用VLN時，需要鑲嵌免疫反應(yīng)至抗原的必要的抗原劑量降低，免疫保護和使用勝過傳統(tǒng)的以Ribi作為佐劑的接種疫苗的VLN接種疫苗比較。該技術(shù)在Gelber C et al.，1998，″Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responsesto Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node″和″From the Laboratory to theClinic，Book of Abstracts，October 12th-15th 1998，Seascape Resort，Aptos，California″進行簡要的敘述。
許多事例已經(jīng)顯示，疫苗的微粒形成增加了蛋白質(zhì)免疫原的免疫性，因而是本發(fā)明另一優(yōu)選的實施例。
微粒制備成抗原和高分子、油脂、糖類制成共同制劑或適合制備微粒的其它分子，或者微粒可以是僅有抗原自身組成的均質(zhì)粒子。
以微粒為基體的高分子的實例有以微粒為基礎(chǔ)的PLGA和PVP(Gupta RKet AL.，1998)，其中高分子和抗原濃縮成固體粒子。以粒子為基礎(chǔ)的油脂可以制成在膠束里包裹抗原的油脂膠囊(稱為脂質(zhì)粒)(Pietrobon PJ，1995)。以粒子為基礎(chǔ)的糖類通常由合適的可降解的糖類乳淀粉或殼聚糖制成。降糖類和抗原進行混合并以一種工藝進行濃縮，該工藝和用于高分子粒子的類似(Kas HS et AL.，1997)。
僅由抗原組成的粒子可以通過各種噴霧和冷凍干燥的技術(shù)進行制備。特別適合本發(fā)明目的的是用于制備均一和可控尺寸的高臨界流體技術(shù)(York P，1999 & Shekunov B et al.，1999)。
期望疫苗至少每年服用一次，例如至少每年是1、2、3、4、5、6和12次。進一步明確期望每年1-12次，如對于需要的個體是每年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。前面已經(jīng)顯示，根據(jù)本發(fā)明，通過使用優(yōu)選的自動免疫誘導(dǎo)的記憶免疫性不是永久的，因而免疫系統(tǒng)需要定期的由類似物挑戰(zhàn)。
由于基因變異，不同個體可以和改變同一多肽的力量的免疫反應(yīng)進行反應(yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明，為了增加免疫反應(yīng)，疫苗可以包括幾種不同的多肽，也和上述討論的關(guān)于外源T-細胞表位的引入進行比較。免疫可以包括兩種或多種多肽，其中所有的多肽是上面描述的。
免疫因而抗原包括3-20種不同的修飾的或非修飾的多肽，如3-10種不同的多肽。然而，通常多肽的數(shù)目可以保持最少，如1-2種多肽。
至于本發(fā)明饑餓激素類似物的替代物，也可以用抗-同型抗體或普通的模擬簇(mimotopes)進行免疫。模仿饑餓激素表位制備抗-獨特型抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，一個特別有益的方法包括自體抗-獨特型抗體的使用，并和抗-獨特型抗體反應(yīng)，通過引入外源T輔助表位進行修飾，如本發(fā)明所述。模擬簇可以從自由肽的庫中分離出來，該自由肽的庫從噬菌體顯示對抗抗體中分離，并和饑餓激素結(jié)合。
核酸接種疫苗作為以肽基體的疫苗服用的替代物，核酸接種疫苗的技術(shù)(也稱之為“核酸免疫”、“遺傳免疫”和“基因免疫”)具有許多有益的特征。
首先，和傳統(tǒng)疫苗方法對比，核酸接種疫苗不要求消耗大量免疫原試劑產(chǎn)品(如以產(chǎn)生修飾饑餓激素的微生物的工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵的方式)。而且，不需要提純設(shè)備和免疫原的再打折計劃。最終，為了生成引入的核酸產(chǎn)品，由于核酸接種疫苗依賴于免疫個體的生化設(shè)備，所以希望產(chǎn)生表達產(chǎn)品的最佳的轉(zhuǎn)譯后的工藝；如果是自體菌苗接種，這就很重要，如上所述，由于原始的饑餓激素B-細胞表位的重要部分需要保存在修飾分子內(nèi)，也由于理論上B-細胞表位可以由任何(生物的)分子(如糖類，油脂和蛋白質(zhì)等)的部分組成；因此，免疫原的天然糖基化和脂化的模式對于所有的免疫性很重要，并期望確保具有產(chǎn)生免疫原的宿主。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選的實施例包括通過引入核酸影響修飾饑餓激素出現(xiàn)于免疫系統(tǒng)，該核酸降修飾的饑餓激素解碼為動物細胞，從而從引入的核酸細胞獲得體內(nèi)的表達。
在這個實施例中，引入的核酸優(yōu)選為DNA，其中DNA的形式為裸露的DNA、由負荷或非負荷的油脂形成的DNA、脂質(zhì)粒中形成的DNA、包括在病毒型載體內(nèi)的DNA、和轉(zhuǎn)染-便利蛋白質(zhì)或多肽形成的DNA、和靶向蛋白質(zhì)或多肽形成的DNA、和鈣沉淀劑形成的DNA、配位到惰性載體分子的DNA、在高分子中形成膠囊的DNA(如在PLGA(WO 98/31398中公開的膠囊技術(shù))或幾丁質(zhì)或殼聚糖)、以及和佐劑形成的DNA。本文中需要注意的是，實際上，所有和傳統(tǒng)疫苗形成的佐劑應(yīng)用有關(guān)的需要考慮的事情都應(yīng)用到DNA疫苗的形成。因此，此處以疫苗為基礎(chǔ)的多肽的佐劑的應(yīng)用相關(guān)的所有公開的內(nèi)容作必要的修正后應(yīng)用到核酸接種疫苗技術(shù)中。
至于上述詳細討論的以疫苗為基體的多肽的服用和服用計劃的路線，對于本發(fā)明的核酸疫苗和上述與多肽的服用和服用計劃的路線相關(guān)的討論修正后應(yīng)用到核酸中。需要增加的是，核酸疫苗可以是靜脈和動脈服用。
而且，在本領(lǐng)域公知的是，核酸疫苗可以用所謂的的基因槍進行服用，因此這種方式和其它等同的服用方式都包括在本發(fā)明中。最后，據(jù)報道，服用中核酸的VLN的使用產(chǎn)生了很好的結(jié)果，因此這種特異的服用方式是特別優(yōu)選的。
進一步，用作免疫試劑的核酸可以包括解碼1st、2nd和3rd部分的區(qū)域，如上述免疫物質(zhì)的形式，例如已討論的作為有益佐劑的細胞因子。本實施例優(yōu)選的方法包括在不同的閱讀框架或至少在不同助劑的控制下具有密碼區(qū)域的類似物和免疫調(diào)節(jié)劑(Immunomodulator)。因而，要避免類似物或表位成為免疫調(diào)節(jié)劑的輔助(partner)?？蛇x擇的，兩個不同的核苷片段可以使用，但是，當(dāng)同一分子中都包括密碼區(qū)域時，由于確定的共同表達，所以不是優(yōu)選的。
相應(yīng)的，本發(fā)明也涉及誘導(dǎo)對抗饑餓激素抗體產(chǎn)品的成分，該成分包括-本發(fā)明中的核酸片段或載體(和下述討論的載體比較)，以及-上述的藥學(xué)或生理上可接受的賦形劑和/或載體和/或佐劑在正常情況下，饑餓激素變異-解碼核酸以載體的形式引入，其中表達在病毒啟動子(viral promoter)的控制下。根據(jù)本發(fā)明，并和下述討論比較，將對載體和DNA片段有更多詳細的討論。
參照Donnelly JJ et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648與Donnelly JJ et AL.，1997，Life Sciences 60163-172，可以得到劑型相關(guān)以及核酸疫苗的詳細公開。這兩篇文獻在此處作為參考。
活疫苗第三個實現(xiàn)修飾饑餓激素出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)的替代物是采用活的疫苗的接技術(shù)。在活的疫苗中，對于動物，出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中是通過服用非病源微生物實現(xiàn)的，該非病源微生物和核酸片段一起轉(zhuǎn)化、或與結(jié)合有這種核酸片段的載體一起轉(zhuǎn)化。非病源微生物可以是任何合適的削弱的細菌鏈(通過通道削弱或通過由重組細胞DNA技術(shù)消除致病表達產(chǎn)品進行削弱)，如牛型分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG..、非病源鏈球菌spp.、E.大腸菌、沙門氏菌spp.、弧菌霍亂、志賀氏痢疾桿菌等。例如，回顧處理本領(lǐng)域活疫苗的制備方法可以在Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990中發(fā)現(xiàn)，這兩篇文獻在此作為參考。關(guān)于核酸片段和在活疫苗中用的載體將在下面詳細論述。
作為細菌活疫苗的替代物，本發(fā)明下面討論的核酸片段可以在非致命的病毒疫苗載體中結(jié)合，如牛痘和任何其它合適的痘病毒。
通常，非病源微生物活病毒對于動物只能服用一次，但在某些情況下，微粒獲得保護性免疫，一生不止服用一次。甚至在使用活的或病毒疫苗時，上述針對多肽免疫的計劃是非常有用的。
可選擇的，活的或病毒疫苗和先前的或隨后的多肽和/或核酸接種疫苗結(jié)合。例如，可以和活的或病毒疫苗一起影響初次免疫，該活的或病毒疫苗接著用多肽或核酸方法進行隨后的免疫。
微生物或病毒可以和含有解碼1st、2nd和3rd部分區(qū)域的核酸一起轉(zhuǎn)化，如上述免疫物質(zhì)的形式，例如已討論的作為有益佐劑的細胞因子。本實施例優(yōu)選的方法包括在不同的閱讀框或至少在不同助劑的控制下具有密碼區(qū)域的類似物和免疫調(diào)節(jié)劑。因而，要避免類似物或表位成為免疫調(diào)節(jié)劑的輔助。可選擇的，兩個不同的核苷片段可以使用。當(dāng)然，在同一閱讀框架中具有1st、2nd和3rd部分可以作為本發(fā)明的一表達產(chǎn)品和類似物，根據(jù)本發(fā)明，該實施例是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的方法在疾病治療和其它場合的應(yīng)用由上可知，對抗饑餓激素的接種疫苗可以提供一有效的對需要降低超重脂肪的方式。而且，已經(jīng)顯示，饑餓激素受體(GSH-R)和饑餓激素的共同表達確實在前列腺癌細胞中發(fā)生(Jeffry PL et al.，2002，JEndocrinol，172(3)R7-11)。據(jù)報道，GSG-R的表達也在內(nèi)分泌腫塊中表達(Volante M et al.，2002 J Clin En-docrinol Metab，87(3)1300-8)；Papotti M et al(2001，J Clin Endocrinol Metab，86(10)5052-9)等也已經(jīng)報道了胃的良性腫瘤的多數(shù)(75％)和腸內(nèi)分泌腫塊的25％對饑餓激素是免疫反應(yīng)性的。換句話說，本發(fā)明的方法可以作為治療肥胖、與饑餓激素和饑餓激素受體相關(guān)的癌癥。
必須注意的是，很少量的饑餓激素的循環(huán)可以導(dǎo)致食品中營養(yǎng)成分的損失。一具有這種低饑餓激素濃度的個體在必要時沒有飲食的動力。因而，為了確保治療的個體攝取必要的營養(yǎng)，當(dāng)前推薦的對人類的免疫治療方法應(yīng)和控制飲食一起進行。同時，為了避免一段時間后體重的銳減，減重的比例應(yīng)仔細的監(jiān)測；而且，應(yīng)確保在治療的個體進行鍛煉，以保證肌肉的重量等。
據(jù)報道的例子的試驗中，鼠饑餓激素的幾種免疫原的變型作為誘導(dǎo)對抗鼠自體饑餓激素的免疫反應(yīng)的免疫原。正如期望的一樣，免疫導(dǎo)致了鼠和自體鼠饑餓激素反應(yīng)的高濃度抗體誘導(dǎo)。然而，令人驚奇的，這些高抗體濃度伴隨著這些鼠中循環(huán)饑餓激素水平的增加，并且這也增加了所測試的鼠的體重。體重的增加是由于肌肉重量、體內(nèi)脂肪或兩者的增加，還不得而知。
不希望這些效果組成普遍的現(xiàn)象；有幾種解釋這種相應(yīng)免疫的免疫血清水平的增加-反饋環(huán)的存在，天然的調(diào)節(jié)饑餓激素產(chǎn)品應(yīng)答由饑餓激素上調(diào)的分子的濃度，-一些在受體上誘導(dǎo)抗-饑餓激素抗體的直接效果，并和連接到調(diào)節(jié)分子的饑餓激素競爭，-一效應(yīng)器分子的一些誘導(dǎo)抗-饑餓激素抗體的激活，其中通常由饑餓激素結(jié)合蛋白激活，因而刺激饑餓激素的產(chǎn)品，
-血流中全部免疫血清饑餓激素的上限濃度，由于饑餓激素結(jié)合的抗體的出現(xiàn)(即饑餓激素的分室作用(compartmentalization))，產(chǎn)生了大量的饑餓激素，并延長了饑餓激素的免疫血清半衰期；-饑餓激素和涉及控制饑餓激素表達等的“傳感受體(sensorreceptor)”或“誘惑受體(decoy receptor)”間的交互作用上一些抗體的阻礙效應(yīng)等。
根據(jù)本發(fā)明的試驗，沒有一種可能的解釋能夠被排除。特別的，在實例中測試的所有結(jié)構(gòu)包括成熟鼠饑餓激素的完整的序列，這意味著對抗所有可能的饑餓激素B-細胞表位的抗體必須在免疫鼠的免疫血清中出現(xiàn)。并且，例如，如果饑餓激素中表面的上調(diào)是抗體結(jié)合與饑餓激素結(jié)婚分子或受體的位點的結(jié)果，此處公開的許多饑餓激素結(jié)構(gòu)將不會誘導(dǎo)對饑餓激素產(chǎn)品具有刺激作用的抗體，因而這些結(jié)構(gòu)將初步導(dǎo)致期望的饑餓激素的下調(diào)。
可選擇的，如果效果僅僅是全部免疫血清中饑餓激素的可用量和免疫血清半衰期的延長的結(jié)果，當(dāng)使用對抗自體蛋白和其它分子的接種疫苗時，開創(chuàng)了嶄新的治療方法。例如，在激素可以在靶向組織施加它們的影響時，象饑餓激素等激素需要穿過抗體不能穿過的障礙。當(dāng)免疫活性的對抗這些分子時，分子內(nèi)(抗體-受限或自由的)的免疫血清的水平和它們的半衰期將增加，從而導(dǎo)致大量可得到的分子。由于將分子綁定在靶向器官的受體和所有免疫血清間的平衡狀態(tài)，該效果將荒謬的成為增加由分子施加的刺激的網(wǎng)，這是因為大量的分子能夠穿越抗體不能透過的障礙。
因此，抗體結(jié)合分子的出現(xiàn)導(dǎo)致了分子施加的影響的增加。這種觀念是新的，并且也能用于使用其它技術(shù)，其中特異分子的免疫血清的量可以增加(結(jié)合分子的可溶受體的服用，結(jié)合分子的單克隆抗體的服用)。
無論如何，這些特異的結(jié)果已經(jīng)鑒別了對抗饑餓激素的免疫的不確定使用，即其中有益饑餓激素水平增加的情況。極瘦弱和厭食等情況前面已經(jīng)建議用饑餓激素治療，以及治療管疾病如心力衰竭。這些疾病和癥狀在本發(fā)明的實施例中都是有用的，其中抗-饑餓激素免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)將導(dǎo)致循環(huán)饑餓激素水平的增加。
而且，在農(nóng)業(yè)中使用這些意外的效果也是有益的。這有助于增加母牛和其它動物的奶中脂肪的產(chǎn)量，其中脂肪沉積和脂肪的產(chǎn)率是和口感極討論的農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量相關(guān)的。
饑餓激素也可以是生長激素釋放的刺激劑，在某些情況下，增加生長激素的產(chǎn)量也是有益的，本發(fā)明的方法提供了替代物，所以可以避免重復(fù)服用生長激素。一些應(yīng)用包括試管肥料的使用(其中生長激素治療建議作為治療的佐劑)，在傷口包扎中應(yīng)用(如嚴重?zé)齻?和嚴重外傷的治療，如上所述的誘導(dǎo)農(nóng)業(yè)中動物的生長，延長心力衰竭病人的生命和作為“抗衰老”的藥物。
肽、多肽和本發(fā)明的組合物從上面可以明顯的看出，本發(fā)明是基于對抗饑餓激素抗原的個體免疫的概念。獲得這種免疫的優(yōu)選的方法是使用修飾的饑餓激素，進而提供現(xiàn)有技術(shù)中沒有公開的分子。
可以確信，此處討論的修飾的饑餓激素分子是有創(chuàng)造性的，因此本發(fā)明中的重要部分和饑餓激素類似物相關(guān)，該饑餓激素類似物來自動物饑餓激素，其中引入了修飾，修飾的結(jié)果是動物中類似物的免疫誘導(dǎo)了和未修飾的饑餓激素多肽交叉反應(yīng)的抗體的生成。優(yōu)選的是，當(dāng)討論使用修飾饑餓激素的本發(fā)明不同實施例的方法時，修飾的本質(zhì)和上述修飾的類型一致。因此，為了敘述本發(fā)明中的饑餓激素類似物，此處出現(xiàn)的和修飾饑餓激素分子相關(guān)的任何公開是相關(guān)的，任何公開經(jīng)過修正后，豆科應(yīng)用到這些類似物的描述中。
需要注意的是，優(yōu)選的修飾饑餓激素分子包括導(dǎo)致至少70％和饑餓激素一致的序列的多肽的生成，或者隨后在長度上至少有10個氨基酸。高度一致的序列是優(yōu)選的，如至少75％和至少為80％或85％。蛋白質(zhì)和氨基酸序列的一致性可以這樣計算(Nref-Ndif)·100/Nre；其中，當(dāng)兩個序列排列時，Ndif是非一致殘基的總數(shù)，Nref是其中之一的殘基的數(shù)目。因此，DNA序列AGTCAGTC和序列AATCAATC(Ndif＝2和Nref＝8)有75％的一致。
本發(fā)明也和實施本發(fā)明方法有益的成分相關(guān)。
因此，本發(fā)明也涉及含有免疫有效量的饑餓激素多肽的免疫原的成分，該多肽是動物的自體蛋白或如饑餓激素多肽的亞序列，所述的饑餓激素多肽或與免疫原可接受的佐劑一起形成的后續(xù)，以突破動物針對饑餓激素多肽的自體耐藥性，該成分進一步包括藥學(xué)上或生理上可接受額賦形劑和/或載體。換句話說，本發(fā)明的本部分和天然生成的饑餓激素多肽/后續(xù)的形成有關(guān)，并將在本發(fā)明方法實施例中公開。
本發(fā)明也涉及含有上述免疫有效量的饑餓激素類似物的免疫成分，所說的成分進一步含有藥學(xué)上和免疫上可接受的稀釋劑和/或賦形劑和/或載體和/或賦形劑和優(yōu)選的佐劑。換句話說，本發(fā)明的本部分包括修飾饑餓激素的形成，特別是上述的。當(dāng)修飾的和非修飾的饑餓激素的形成用作本發(fā)明的方法中對抗饑餓激素類似物的免疫時，佐劑、載體和賦形劑的選擇相應(yīng)的和所討論的一致。
根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法制備多肽。較長的多肽通常重組細胞基因技術(shù)進行準備，該技術(shù)包括引入將饑餓激素類似物解碼成合適的載體的核酸序列、與載體一起的合適的宿主細胞的轉(zhuǎn)化、核酸序列的表達、從宿主細胞或它們的培養(yǎng)的上清液中再生表達產(chǎn)品、以及后續(xù)的提純和可選擇的進一步修飾，如卷疊(refolding)或衍生。
較短的肽優(yōu)選通過公知的技術(shù)準備，即固體-或液相肽的合成。然而，該技術(shù)最近的進步已經(jīng)能夠生成完整長度的多肽和蛋白質(zhì)，因而通過合成的方法進行制備長結(jié)構(gòu)(long constructs)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中的核酸片段和載體從上述公開的內(nèi)容可以得知，修飾饑餓激素多肽可以通過重組細胞基因技術(shù)進行制備，也可以通過化學(xué)合成或半合成進行制備；當(dāng)修飾存在配對的蛋白質(zhì)載體(如KLH、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素和BSA)和非蛋白質(zhì)的分子如糖類高分子時，當(dāng)然也在修飾包括側(cè)鏈或側(cè)基添加至饑餓激素多肽衍生的肽鏈，后者的兩個選擇通常是很相關(guān)的。
對于重組細胞基因技術(shù)和核酸免疫，解碼修飾饑餓激素的核酸片段時重要的化學(xué)產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的重要部分和和解碼饑餓激素類似物的核酸片段相關(guān)，即饑餓激素衍生的多肽，該多肽包括添加或插入融合伴侶的天然饑餓激素序列，或優(yōu)選為饑餓激素衍生的多肽，其中該多肽通過插入和/或添加引入到外源T-細胞表位。本發(fā)明的核酸片段時DNA或RNA的片段。
本發(fā)明的核酸片段通常插入合適的載體，以形成克隆或負載有本發(fā)明核酸片段的表達載體；這種新穎的載體也時本發(fā)明的一部分。關(guān)于上述本發(fā)明的載體的詳細結(jié)構(gòu)將在下面變型細胞和微生物的部分進行討論。根據(jù)應(yīng)用的類型和目的，載體的形式不僅可以為質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型-染色體或病毒，而且，僅在某種細胞短暫表述的裸露的DNA是重要的載體。優(yōu)選的克隆和載體表達載體可以是自己復(fù)制，因而能夠高水平表達載體的高復(fù)制數(shù)目或隨后克隆的高水平復(fù)制。
本發(fā)明的載體一般的要點包括下述5’→3’中的特征和可操作的連接中的特征本發(fā)明中的針對核酸片段驅(qū)動表達的啟動子，可選擇的解碼前導(dǎo)肽的核酸片段序列使分泌物(細胞外的相或應(yīng)用在外周胞質(zhì))或整合成多肽片段的膜，本發(fā)明的核酸片段和解碼終止子的可選擇的核酸序列。當(dāng)使用生產(chǎn)菌株或細胞系中的表達載體載體時，是為了轉(zhuǎn)化細胞的穩(wěn)定性，優(yōu)選為引入宿主細胞的載體在宿主細胞基因組中是完整的。與之相比較，當(dāng)和用于動物中體內(nèi)表達載體的載體一起有效時(即使用DNA接種疫苗中的載體時)，為了安全起見，載體不能結(jié)合到宿主細胞的基因組；通常，裸露的DNA或非結(jié)合的病毒載體使用時，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，這些選擇是公知的。
本發(fā)明的載體用于將宿主細胞轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)本發(fā)明的修飾饑餓激素多肽。這種轉(zhuǎn)化的細胞，也是本發(fā)明的一部分，可以是培養(yǎng)細胞或細胞系，并被用于本發(fā)明的核酸片段的繁殖和載體?？蛇x擇的，轉(zhuǎn)化細胞可以是合適的或的疫苗同族，其中核酸片段(一個或多個復(fù)制的)被插入，以影響分泌或同化成病菌膜或修飾饑餓激素細胞壁。
本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細胞例如是細菌(如埃希氏菌種(如大腸桿菌)、桿狀菌(如枯草桿菌)、沙門氏菌或分支桿菌(優(yōu)選為非病原的，如M.bovisBGG)、酵母(如酵母蠟))和原體內(nèi)物?？蛇x擇的，轉(zhuǎn)化細胞來自于多細胞有機體，如菌類、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。和下述的細胞系和載體的討論比較，大部分優(yōu)選的細胞來自人類。最近的結(jié)果表明在使用商業(yè)可得到的黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)細胞系(絨鴨2(S2)細胞系和載體可以從Invitrogen得到)進行本發(fā)明饑餓激素類似物的重組細胞的生產(chǎn)時，效果很有吸引力，因此表達載體體系是特別優(yōu)選的。夜蛾(spodoptera)細胞(SF細胞)SF9和SF21是優(yōu)選的。
為了克隆和/或優(yōu)化表達載體，優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)化細胞可以復(fù)制本發(fā)明的核酸片段。細胞表達核酸是本發(fā)明優(yōu)選和有用的實施例；它們可以是小規(guī)?；虼笠?guī)模的修飾饑餓激素的制備，或者在某些情況下，非病原性細菌和疫苗組成和的疫苗。
當(dāng)通過轉(zhuǎn)化細胞生產(chǎn)本發(fā)明修飾的饑餓激素時，盡管遠不是必要的，表達載體的產(chǎn)品暴露在培養(yǎng)基或在轉(zhuǎn)化細胞表面進行是很方便的。
當(dāng)有效的生產(chǎn)細胞被鑒別時，在此基礎(chǔ)上，建立穩(wěn)定的細胞系是優(yōu)選的，該細胞系負載本發(fā)明的載體和表達解碼修飾饑餓激素的核酸片段。優(yōu)選的這種穩(wěn)定的細胞系隱藏或負載了本發(fā)明的饑餓激素類似物，因而有利于上述的提純。
通常，衍生于和宿主細胞相容的含有復(fù)制和控制序列的質(zhì)粒載體在相關(guān)的宿主細胞中使用。載體通常負載有復(fù)制的位置，以及能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，E.大腸桿菌通常用pBR322轉(zhuǎn)化，衍生于E.大腸桿菌物種(參照如Bolivar et al.，1977)的質(zhì)粒。pBR322質(zhì)?；蚝邪北任髁趾退沫h(huán)素抗性的基因，因而提供鑒別轉(zhuǎn)化細胞的簡單方式。pBR322質(zhì)?；蚱渌⑸镔|(zhì)粒或噬菌體必須也含有或修飾還有啟動子，該啟動子可以通過原核微生物進行表達。
大部分通常用在原核重組細胞DNA結(jié)構(gòu)的啟動子包括B-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動子體系(Chang et al.，1978；Itakura et AL.，1977；Goeddel et al.，1979)和色氨酸(trp)啟動子體系(Goeddel et AL.，1979；EP-A-0 036 776)。當(dāng)這些被普遍使用時，其它的微生物啟動子已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并被利用，有關(guān)這些核酸序列的詳細情況已經(jīng)公開，并能使技術(shù)人員將它們功能性的結(jié)合到質(zhì)粒載體(Siebwenlist et al.，1980)。來自原核生物的某些基因已經(jīng)通過自身的啟動子序列在E.大腸桿菌中充分表達，排除了通過人工方式加入另一啟動子的需求。
除了原核生物、真核生物，例如，酵母培養(yǎng)也可以使用，此處的啟動子應(yīng)該能夠驅(qū)動表達載體。食用酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或一般的面包酵母在真核生物中是最常用的，盡管大量的其它的同族也可以得到。例如，對于酵母中的表達載體，質(zhì)粒YRp7是常用的(Stinchcomb et AL.，1979；Kingsman et AL.，1979；Tschemper et AL.，1980)。這種質(zhì)粒已經(jīng)包含了trpl基因，該基因提供一針對缺乏在色氨酸如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)中生長的能力的酵母突變株的選擇標記。然后，作為酵母宿主細胞基因組的trpl損害的出現(xiàn)在色氨酸的缺乏時對通過生長探測轉(zhuǎn)化提供有效的氛圍。
酵母載體中合適的促進序列包括3-磷酸甘油酸鹽致活酶(Hitzman etAL.，1980)或其它的糖分解酶(Hess et AL.，1968；Holland et AL.，1978)，如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸鹽脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。在構(gòu)建合適的表達載體質(zhì)粒時，和這些基因相連的終止序列也綁定在序列的表達載體載體3’內(nèi)，該序列適合用來提供mRNA和終止的腺嘌呤。
具有由生長條件控制的轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點的其它的啟動子是這些啟動子種類酒精、脫氫酶2、異細胞色素C、磷酸酶、和氮素代謝相關(guān)的降解酶、前述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶、以及負責(zé)半乳糖和麥芽糖應(yīng)用的酶。含有酵母相容啟動子的任何質(zhì)粒載體、復(fù)制的來源和終止序列是合適的。
除了微生物，衍生于多細胞機體的細胞培養(yǎng)也可以用作宿主細胞。理論上，無論是來自脊椎動物或無脊椎動物培養(yǎng)，任何這種細胞培養(yǎng)也是有效的。然而，對于脊椎動物來說是最好的，并且，培養(yǎng)中的脊椎動物的繁殖(組織培養(yǎng))在近幾年已經(jīng)變成常用的工藝(Tissue Culture，1973)。這些有用宿主細胞系的例子包括VERO和海拉細胞，中國鼠的卵巢(CHO)的細胞系，W138、BHK、COS-7293、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF)細胞(作為全表達體系可以從i.a.Protein Sciences，1000 ResearchParkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.and from Invitrogen得到)，以及MDCK細胞系。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的細胞系是從Invitrogen，PO Box2312，9704 CH Groningen，The Netherlands得到的S2。
這種普通的細胞系的表達載體載體(如果需要)包括復(fù)制的來源，位于要表達的基因的前面的啟動子，沿著必要的核糖體結(jié)合位置、RNA結(jié)合位置、多聚腺苷酸化位置和轉(zhuǎn)錄終止者序列。
在哺乳細胞中的應(yīng)用，在表達載體載體上控制的功能經(jīng)常由病毒物質(zhì)提供。例如，通常用的啟動子衍生于多瘤病毒、腺病毒2和大部分的猿病毒40(SV40)。初期和后期的SV40啟動子特別有用，這是因為它們可容易的從作為片段的病毒上取得，該病毒也包括SV40病毒復(fù)制來源(Fiers etal.，1978)。如果包括從位于病毒復(fù)制來源對著BgII位置的HindIII位置延伸的約250bp序列，較小的或較大的SV40片段也可以使用。而且，如果這些控制序列和宿主細胞體系是相容的，利用啟動子或控制和所需基因序列相關(guān)的序列是可能和期望的。
復(fù)制來源可可以通過載體的構(gòu)建包括外生源，如可以是衍生于SV40或其它病毒(如多瘤病毒、Adeno、VSV、BPV)，也可以是由宿主細胞染色體復(fù)制機理提供的。如果載體和宿主細胞染色體結(jié)合，后者經(jīng)常是充分的。
用于饑餓激素類似物的識別很明顯，對于技術(shù)人員來說，不是天然的饑餓激素所有的變異或修飾可以在動物體內(nèi)產(chǎn)生和天然形態(tài)交叉反應(yīng)的抗體。
然而，為修飾饑餓激素分子建立有效的標準的監(jiān)測是不困難的，該饑餓激素完成此處討論的免疫活性的最少需求。
因此，本發(fā)明的另一部分是關(guān)于修飾饑餓激素多肽的識別方法，該饑餓激素多肽可以誘導(dǎo)對抗動物種群中未修飾饑餓激素的抗體，其中未修飾饑餓激素多肽是自體蛋白，該方法包括通過多肽合成或分子生物方法進行制備；一組相互之間不同的修飾饑餓激素多肽，其中氨基酸增加、插入、缺失或取代動物種群中的饑餓激素多肽中的氨基酸序列，因而成套的產(chǎn)生含有T-細胞表位、并和動物種群無關(guān)的氨基酸序列；或者制備解碼成套相互區(qū)別的修飾饑餓激素多肽的、成套的核酸片段；測試由成套成員的能力，通過動物種群誘導(dǎo)對抗未修飾饑餓激素的抗體的生成；識別和可選擇的分離成套中的成員，并誘導(dǎo)對抗動物種群中未修飾饑餓激素的抗體的生成，或者；識別和可選擇的分離由成套核酸片段中的成員解碼的多肽表達載體產(chǎn)品，該成套的核酸片段誘導(dǎo)了對抗動物種群中未修飾饑餓激素多肽的抗體的生成。
在本文中，“成套的相互區(qū)別的修飾饑餓激素多肽”是不一致的修飾饑餓激素多肽的集合體，例如，該多肽在上述討論的基礎(chǔ)上進行選擇(如和圓形二色性結(jié)合、NMR光譜，和/或饑餓激素射線衍射模式)。該成套可以包括僅有的幾個成員，但是可以預(yù)期的是，該成套可以含有幾百中成員。同時，成套的核酸片段是非一致核酸片段的集合體，每個解碼以同樣方式選擇的修飾的饑餓激素多肽。
成套成員的測試可以最終體內(nèi)的演示，而許多體外測試可以應(yīng)用，其中窄向下降的修飾饑餓激素數(shù)目可以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
由于引入外源T-細胞表位的目的是支持T-細胞幫助的B-細胞應(yīng)答，首要的是T-細胞增殖由修飾的饑餓激素誘導(dǎo)。T-細胞增殖可以由標準的增殖化驗體內(nèi)的測試。簡而言之，強化T-細胞的樣品從保存在培養(yǎng)基的標本中得到。培養(yǎng)的T-細胞和標本的APCs相接觸，該標本已經(jīng)吸收了修飾分子，并使其以T-細胞表位出現(xiàn)。監(jiān)測T-細胞的增殖，并和合適的控制(如T-細胞在培養(yǎng)基中和完整的APCs、天然饑餓激素接觸)相對比。可選擇的，增殖通過測試由T-細胞釋放的相關(guān)細胞因子濃度進行檢測，其中T-細胞是應(yīng)答外源T-細胞的識別。
已經(jīng)說明，至少有一種成套的修飾饑餓激素能夠誘導(dǎo)對抗饑餓激素的抗體的生成，可以制備至少含有一種修飾饑餓激素多肽的免疫原組分，該饑餓激素多肽能夠誘導(dǎo)對抗動物體內(nèi)未修飾饑餓激素的抗體的生成，起總未修飾饑餓激素多肽是自體蛋白，該方法包括成套成員的混合，并誘導(dǎo)動物種群的抗體的生成，該抗體和具有藥學(xué)上和生理上可接受的載體和/或賦形劑和/或稀釋劑和/或賦形劑的饑餓激素反應(yīng)，選擇性的至少和一種藥學(xué)上和生理上可接受的佐劑進行結(jié)合。
同時，也可以制備免疫原組分，該組分作為免疫原，并含有解碼免疫原的饑餓激素類似物的核酸片段，和上述討論的核酸接種疫苗進行比較。
本發(fā)明的上述各個方面通常通過初始制備本發(fā)明許多相互區(qū)別的核酸序列和載體插入這些合適的表達載體，和載體一起轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞，以及表達本發(fā)明的核酸序列來實現(xiàn)。這些步驟可以后續(xù)表達載體產(chǎn)品的分離。優(yōu)選的是，核酸序列和/和載體通過包括分子放大技術(shù)的方法的制備，如PCR和通過核酸合成的方法。
將饑餓激素耦合到聚羥基聚合物上含有T輔助表位和肽的分子將作為可得到的僅含有免疫的相關(guān)部分的疫苗分子，該T輔助表位和肽代表或包括共價連接到作為賦形劑的非免疫原聚合物分子的B-細胞表位，如多重激活的聚羥基聚合物。例如，如果疫苗的靶子是自體抗原，混雜的或所謂的通用的T-輔助表位可以使用。而且，增強免疫反應(yīng)的元素也可以耦合到賦形劑中，因而可以作為佐劑。這種元素可以是甘露糖、促噬菌肽(Tuftsin)、胞壁酰二肽、CpG基序等等，如免疫刺激或靶向肽。在這種情況下，隨后的疫苗產(chǎn)品佐劑的形成可以是不必要的，產(chǎn)品可以用純水或生理鹽水服用。
通過耦合細胞毒素T細胞(CTL)表位和T-輔助表位，可以產(chǎn)生特別適用于衍生于CTL表位的抗原的CTL。
促進吸收APC(如巨噬細胞)細胞因子(如甘露糖)的元素可以和CTL和T輔助表位一起耦合到賦形劑中，并提高CTL的應(yīng)答。
最終產(chǎn)品中B-細胞表位和T-輔助表位(P2和P30)的比率可以根據(jù)合成步驟中這些肽的濃度的不同而不同。如上所述，免疫原分子可以和如甘露糖、促噬菌肽、CpG基序或其它的免疫刺激物質(zhì)(此處描述的)一起標簽，如果有必要，通過將如這些物質(zhì)的胺化衍生物應(yīng)用到合成步驟中的碳酸鹽緩沖液中。
如果不溶的活性聚羥基聚合物用于結(jié)合含有B-細胞表位和T-輔助表位的肽，如上所述，該聚羥基聚合物可以是固相合成，并且，最終的產(chǎn)品可以通過清洗和過慮提純獲得。
耦合到三重激活聚羥基聚合物(肽，標簽等)的元素可以在低PH如4-5的情況下加到聚羥基聚合物中，并允許通過惰性分散在“膠體”中平衡分布。隨后，PH值可以升到9-10，使肽上的初級氨基和聚羥基聚合物上的tresyl基上的標簽開始反應(yīng)。肽如免疫刺激元素耦合后，該膠體粉碎形成適合免疫的尺寸。
因此，本發(fā)明的特異部分通常涉及含有至少一種衍生于有益蛋白的第一氨基酸序列的免疫原，其中至少以第一氨基酸序列含有至少已B-細胞和/或至少一種CTL表位，并且含有一外源T-輔助細胞表位的至少一種第二氨基酸序列，其中每個至少第一和至少第二氨基酸序列后和到藥學(xué)上可接受的活性聚羥基聚合物的載體上。
對于氨基酸序列，為了耦合到聚羥基聚合物上，通常需要用一合適的反應(yīng)基團“激活”聚羥基聚合物，從而形成至氨基酸序列的必要連接。
術(shù)語“聚羥基聚合物”和WO 00/05316公開的意思一致，即聚羥基聚合物和該申請中的特征一致。因此，該聚羥基聚合物使水溶的或不溶的(因而在制備免疫原時需要不同的合成步驟)。聚羥基聚合物可以從天然生成聚羥基化合物和合成聚羥基化合物中選擇。
特效藥和優(yōu)選的聚羥基聚合物是選自乙酰(acetan)、amypectin、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、阿拉伯樹膠、carregeenan、纖維素、環(huán)式糊精、右旋糖苷、帚叉藻聚糖(Furcellaran)、半乳甘露聚糖、白明膠、ghatti、葡聚糖、糖原、瓜爾豆、刺梧桐樹膠、魔芋/A(konjac/A)、刺槐豆膠(LOCUST BEAN GUM)、甘露聚糖、膠質(zhì)、亞麻、淀粉、tamarine、黃芪膠、黃原膠、木聚糖和利多卡因。右旋糖苷是特別優(yōu)選的。
然而，聚羥基聚合物也可以選擇高度分支聚合(乙烯亞胺)(PEI)、tetrathienylene vinylene、芳綸(poly-paraphenyl terephtalamide的長鏈)、聚(聚氨酯橡膠)、聚(硅氧烷)、聚二甲基硅氧烷、硅樹脂、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯酮)、聚(2-羥基異丁烯酸)、聚(N-乙烯吡咯酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-co-乙烯醋酸鹽)、聚(乙烯乙二醇)和衍生物，聚(甲基丙烯酸)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、聚酐和聚原磷酯(Polyorthoesters)。
討論中的聚羥基聚合物平均(重量)分子量(即激活前)通常至少為500，乳至少為1000，優(yōu)選的范圍為2500-2000000，特別優(yōu)選的是3000-1000000，更加優(yōu)選的范圍為5000-500000。在實例中已經(jīng)表明聚羥基聚合物的平均分子量范圍為10000-200000是特別優(yōu)選的。
聚羥基聚合物優(yōu)選為水溶性的，至少為10mg/ml，優(yōu)選至少為25mg/ml，如至少為50mg/ml，特別至少為100mg/ml，如在室溫時至少為150mg/ml。公知的是，即使如上述激活，右旋糖苷能夠滿足相關(guān)的水溶性的要求。
對于一些重要有用的聚羥基聚合物，未激活的聚羥基聚合物(即激活前的天然聚合物高分子)的C(碳原子)和OH基(羥基)間的比例范圍為1.3-2.5，優(yōu)選為1.6-2.1，特別優(yōu)選為1.85-2.05。不受限于任何特定的理論，可以相信的是，如未激活的聚羥基聚合物的C/OH比例表示了親水性的高低。聚乙烯乙醇和聚糖是符合這種要求的聚羥基聚合物的例子。可以相信的是，上述比例對于激活聚羥基聚合物，基本上和激活需要的相當(dāng)?shù)偷谋壤恢隆?br> 術(shù)語“聚羥基聚合物載體”表示的是負載氨基酸序列的免疫原的一部分。一般來說，聚羥基聚合物載體具有自己的外限，即氨基酸序列可以通過肽酶分解，如在處理免疫原的抗原表達細胞中。因此，聚羥基聚合物載體可以是具有活性基團的聚羥基聚合物，其中活性基團和氨基酸序列之間的鍵通過APC中的肽酶分解，或者，聚羥基聚合物載體可以是具有活性基團的聚羥基聚合物，如單L-氨基酸或許多D-氨基酸的連接子，其中銜接物的最后部分能夠連接到氨基酸序列，丙通過APC中的肽酶分解。
如上述，聚羥基聚合物負載有官能團(活性基團)，并使肽錨定到載體上?？蓱?yīng)用的官能團的范圍在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，如tresyl(三氟乙烯磺酸)、馬來酰亞胺(maleimido)、對-硝基苯氯甲酸鹽、氰溴化物、甲苯磺?；riflyl(三氟甲基磺酸)、pentafluorobenzenesulfonyl、以及乙烯砜基。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，官能團優(yōu)選的例子是tresyl、馬來酰亞胺、甲苯磺?；riflyl、pentafluorobenzenesulfonyl、對-硝基苯氯甲酸鹽和乙烯砜基，其中tresyl、馬來酰亞胺、甲苯磺?；鶊F是特別相關(guān)的。
激活聚羥基聚合物的tresyl能夠用所述的tresyl氯化物進行激活右旋糖苷進行制備，即WO 00/05316中的例子，或者用Gregorius et al.，J.Immunol.Meth.181(1995)65-73所述的方法。
激活聚羥基聚合物的馬來酰亞胺能夠用所述的對-馬來酰亞胺苯(maleimidophenyl)異氰酸鹽激活WO 00/05316中的例子3中的右旋糖苷?？蛇x擇的，馬來酰亞胺基團可以過量的引入到聚羥基聚合物中，隨后在TAD中引入的氨基和試劑(如琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲烷)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(SMCC)、硫-琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲烷)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(SULFO-SMCC)、琥珀酰亞胺基4-(P-馬來酰亞胺甲烷)丁酸鹽(SMPB)、硫-琥珀酰亞胺基4-(P-馬來酰亞胺甲烷)丁酸鹽(sulfo-SMPB)、N-γ-馬來酰亞胺丁酰氧-琥珀酰亞胺酯(GMBS)或N-γ-馬來酰亞胺丁酰氧-硫琥珀酰亞胺酯)反應(yīng)，如右旋糖苷，通過tresyl的衍生和二胺化合物(通常是H2n-CnH2n-NH2，其中n是1-20，優(yōu)選為1-8)一起激活聚羥基聚合物(如tresyl激活右旋糖苷(TAD))，如1，3-二胺丙烷。盡管激活的不同試劑和路線通常導(dǎo)致微有不同的馬來酰亞胺激活產(chǎn)品關(guān)于在馬來酰亞胺功能和激活發(fā)生的母羥基殘基之間的連接，每個和所有的都被認為是“馬來酰亞胺激活聚羥基聚合物”。
激活聚羥基聚合物的甲苯磺?；梢酝ㄟ^使用所述的甲苯磺?；然锛せ罴せ頦O 00/05316中的例子2的右旋糖苷制備。Triflyl和激活聚羥基聚合物的pentafluorobenzenesulfonyl可以通過相應(yīng)的酸的氯化物制成甲苯磺酰基或tresyl激活類似物。
激活聚羥基聚合物的氰溴化物可以通過用常規(guī)的方法將聚羥基聚合物和氰溴化物反應(yīng)進行制備。得到的官能團通常是具有聚羥基聚合物的兩個羥基的氰酸酯。
激活的程度可以通過自由羥基和激活基團(功能羥基基團)之間的比例表示?？梢韵嘈?，為了獲得聚羥基聚合物親水性和反應(yīng)性之間的優(yōu)選的平衡，聚羥基聚合物的自由羥基和激活基團之間的比例應(yīng)在250∶1至4∶1之間。優(yōu)選的比例在100∶1到6∶1之間，特別優(yōu)選在60∶1到8∶1之間，更加優(yōu)選的是40∶1到10∶1之間。
特別的，根據(jù)本發(fā)明，用于本方法中生成通用免疫原的有益的激活聚羥基聚合物是tresyl、甲苯磺?；⒓せ疃嗵堑鸟R來酰亞胺，特別是激活右旋糖苷(TAD)的tresyl、激活右旋糖苷(TosAD)的甲苯磺?；?、以及激活右旋糖苷(MAD)的馬來酰亞胺。
優(yōu)選的是，聚羥基聚合物載體和連接的氨基酸序列之間的鍵通過肽酶分解，如在APC中的處理抗原的肽酶活性劑。因此，至少第一和至少第二氨基酸序列通過氨基鍵或肽鍵耦合到激活的聚羥基聚合物載體上是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是，每個至少第一和至少第二氨基酸序列提供它們獨自氨基鍵的氮氣部分。
聚羥基聚合物載體可以是充分自由的氨基酸殘基，迫使活性基團為部分肽酶分解鍵提供，但是如上所述，載體可以是僅僅包括含有至少一種L-氨基酸的隔離物。
不過，至少第一和至少第二氨基酸序列通常通過在氨基酸序列的N-末端的氮氣結(jié)合到聚羥基聚合物的激活類型。


圖1鼠體內(nèi)是抗-饑餓激素濃度對抗自體饑餓激素的免疫。
鼠組(n＝10)用不同的饑餓激素自動免疫肽(肽3、4、5，分別對應(yīng)的SEQ ID NO15、16和17)進行免疫，以及用野生(wildtype)鼠饑餓激素(肽2)或來源于IgE(肽1)的陰性對照(negative control)肽。5個基團中的每一個成堆的sera(Pools of sera)(第三免疫后)用應(yīng)答酶免疫分析法(ELISA)的抗-饑餓激素抗體檢測，其中基板(plate)涂有一層饑餓激素(Bachem，2ug/ml)。Sera以起始稀釋1∶10的三倍進行濃度測試。作為sera與ELISA基板的非確定結(jié)合的陰極對照，用肽5進行免疫的、來自鼠的sera加入到非涂層的井(非涂層的)?？?饑餓激素抗體的結(jié)合用設(shè)有HRP的抗-鼠Ig第二抗體檢測(1∶1000稀釋，Dako)。
圖2免疫鼠的體重時間＝0時，初始研究的所有組的體重每周檢測一次。所有研究組在10周內(nèi)體重都增加了，但是與wt和控制相比(肽2和1，分別的)，動物體內(nèi)的饑餓激素(肽3-5)的水平越高，體重增加的越高。
圖3免疫鼠的進食從Time＝0.0時，對初始研究的所有組的免疫鼠的進食每周測一次。曲線顯示的是研究持續(xù)10周累積進食。顯然，體重顯示的差異沒有在累積進食中直接顯示。
圖4免疫動物中的血漿饑餓激素的水平為了規(guī)范饑餓激素，18小時的進食后抽取血的樣品。根據(jù)生產(chǎn)者的指令，用Phoenix的商用RIA成套工具(饑餓激素(鼠)-RIA成套工具)對鼠-饑餓激素中成堆的sera進行分析。來自11/4的第一數(shù)據(jù)是來自預(yù)抽取，而剩下的墊是注射后1周的抽取。
具體實施例方式
實例1通過免疫原的鼠饑餓激素對鼠進行免疫5肽通過標準的方法在肽合成設(shè)備上進行生產(chǎn)。肽是肽1，衍生于IgE的不相干控制的肽，也包括P2和P30表位(SEQ ID NO7和8，分別的)，肽2，成熟鼠的饑餓激素，SEQ ID NO9，殘基24-53，以及肽3-5，即SEQ ID NO15-17，分別的。
5肽注射到雄性Sprague-Dawley鼠的5個基團(n＝10)。四個是皮下注射，間隔3周，在400微升(包括佐劑；完整的弗氏佐劑，CFA，在第一次免疫中，不完全的弗氏佐劑，IFA，在強化免疫作用)中含有100微克的肽。
血樣在研究開始時禁食18個小時后抽取，接著每次注射后禁食一周。
根據(jù)生產(chǎn)者的指令，對于血漿鼠-饑餓激素，血樣通過使用商業(yè)的來自于鳳凰的RIA(饑餓激素(鼠)-RIA kit)進行分析，如圖4所示?？?饑餓激素的滴定用ELISA，其中從wt鼠饑餓激素(貝克曼)到抗-饑餓激素抗體的結(jié)合用HRP-共軛抗-鼠免疫球蛋白第二抗體(Dako)探測，如圖1所示。
體重、吸收的食物和水每周測一次，分別如圖2和圖3所示。
結(jié)果顯示，肽3-5可以誘導(dǎo)抗體和鼠饑餓激素反應(yīng)，其中相關(guān)的控制(肽)和野生的饑餓激素(肽2)不是。然而，令人驚奇的是，抗體的引入和免疫鼠的sera中饑餓激素水平的增加和體重的增加相聯(lián)系，其中在5組鼠的進食相差很大。
因此，體重的增加不能歸功于進食的增加，而是對抗饑餓激素的抗體在動物代謝中的變化。
實例2用進一步的變體進行疫苗導(dǎo)向研究理論上，實例1的研究可以用幾種其它候選的疫苗分子制成。根據(jù)上述的概念(WO 95/05849詳細敘述)，饑餓激素自體免疫的例子例如可以通過取代、或插入公知混雜T細胞表位至饑餓激素野生類型的蛋白質(zhì)(或插入自己的多肽變型中)進行構(gòu)建。取代是肽取代，和野生類型的序列的缺失的肽比較，其中插入的肽可以是相同或不同長度的。
對于通過體內(nèi)測試和監(jiān)測觀念的初始證據(jù)，發(fā)生在SEQ ID NO1-5的構(gòu)建可以用在鼠中。相應(yīng)的變型可以由P2和P30表位取代PADRE序列制成。
這些構(gòu)建將通過固相肽的合成進行合成制備。這將確保上述構(gòu)建缺少成熟的饑餓激素的生物活性，由于絲氨酸-3(成熟的饑餓激素中)的n-辛?；瘜τ陴囸I激素的生物活性好像是必不可少的。當(dāng)然，這種效果也可以通過利用重組細胞表達載體體系獲得，該體系不允許這種特異的后-轉(zhuǎn)譯后的修飾。
根據(jù)標準的協(xié)議(預(yù)先和在完全的弗氏佐劑中形成的結(jié)構(gòu)中制備，由在不完全的弗氏佐劑中形成的結(jié)構(gòu)中提升)，試驗動物的種群可以進行免疫，根據(jù)標準工藝，如在實例1中和形成的這些5種結(jié)構(gòu)的優(yōu)化的量一起使用，動物和一段時間后體重的增加/減少的控制的基團進行比較。導(dǎo)致體重減少(饑餓激素水平也減少)的變型將適合作為有益體重減少的的候選物，其中，例子1種模仿結(jié)果的變量將具有所述申請描述的其它結(jié)果。
序列表序列表<110>法麥克薩有限公司<120>針對自體饑餓激素的免疫<130>15451PCT00<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合到PADRE序列的成熟饑餓激素<400>1Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys15 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Lys Phe Val20 25 30Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala3540<210>2<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用插入的PADRE序列的成熟饑餓激素<400>2Gly Ser Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10 15Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys20 25 30Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg35 40<210>3<211>41<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE序列的成熟饑餓激素<400>3Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Lys Phe Val Ala1 5 1015Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys20 2530Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg35 40<210>4<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE序列的成熟饑餓激素<400>4Gly Ser Ser Phe Leu Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys20 25 30Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg35 40<210>5<211>40<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有替換的PADRE序列的成熟饑餓激素<400>5Gly Ser Ser Phe Leu Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys1 5 1015Ala Ala Ala Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys20 25 30
Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg3540<2l0>6<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Pan DR結(jié)合肽，PADRE<400>6Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>7<211>15<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>7Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>8<211>21<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>8Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 1015Ala Ser His Leu Glu20<210>9<211>501<212>DNA<2l3>Rattus rattus<220>
<221>外顯子<222>(31)..(384)<223>
<220>
<22l>misc_feature<222>(31)..(381)<223>饑餓激素pre-propeptide
<220>
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<220>
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<400>10ctcaccacca agacc atg ctg tct tca ggc acc atc tgc agt ttg ctg cta 51Met Leu Ser Ser Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu1 5 10ctc agc atg ctc tgg atg gac atg gcc atg gca ggc tcc agc ttc ctg99Leu Ser Met Leu Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu1520 25agc cca gag cac cag aaa gcc cag cag aga aag gaa tcc aag aag cca147Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro30 3540cca gct aaa ctg cag cca cga gct ctg gaa ggc tgg ctc cac cca gag195Pro Ala Lys Leu Gln pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu His Pro Glu45 50 55 60gac aga gga caa gca gaa gag aca gag gag gag ctg gag atc agg ttc243Asp Arg Gly Gln Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe65 70 75aat gct ccc ttc gat gtt ggc atc aag ctg tca gga gct cag tat cag291Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr Gln80 85 90cag cat ggc cgg gcc ctg ggg aag ttt ctt cag gat atc ctc tgg gaa339Gln His Gly Arg Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu95 100 105gag gtc aaa gag gcg cca gct gac aag taa ccacggacag gcctgacccc 389
Glu Val Lys Glu Ala Pro Ala Asp Lys110 115cgtgctttcc ttctcctgag caagaactca catccgcctc agcctcctcg gcaactccca 449gcactctcct accactttaa gaataaatgt tcacctgt487<210>11<211>511<212>DNA<213>類人<220>
<221>外顯子<222>(34)..(387)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(34)..(384)<223>饑餓激素pre-propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(103)..(384)<223>饑餓激素propeptide<220>
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<400>11gcaggcccac ctgtctgcaa cccagctgag gcc atg ccc tcc cca ggg acc gtc54Met Pro Ser Pro Gly Thr Val15tgc agc ctc ctg ctc ctc ggc atg ctc tgg ctg gac ttg gcc atg gca102Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala10 15 20ggc tcc agc ttc ctg agc cct gaa cac cag aga gtc cag cag aga aag150Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys25 30 35gag tcg aag aag cca cca gcc aag ctg cag ccc cga gct cta gca ggc198Glu Set Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly40 4550 55tgg ctc cgc ccg gaa gat gga ggt caa gca gaa ggg gca gag gat gaa246
Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu6065 70ctg gaa gtc cgg ttc aac gcc ccc ttt gat gtt gga atc aag ctg tca294Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser75 80 85ggg gtt cag tac cag cag cac agc cag gcc ctg ggg aag ttt ctt cag342Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln90 95 100gac atc ctc tgg gaa gag gcc aaa gag gcc cca gcc gac aag tga387Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala Pro Ala Asp Lys105 110 115tcgcccacaa gccttactca cctctctcta agtttagaag cgctcatctg gcttttcgct 447tgcttctgca gcaactccca cgactgttgt acaagctcag gaggcgaata aatgttcaaa 507ctgt 511<210>12<211>547<212>DNA<213>Canis familiaris<220>
<221>外顯子<222>(40)..(393)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(40)..(108)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(40)..(390)<223>饑餓激素pre-propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(109)..(390)<223>饑餓激素propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(109)..(192)<223>成熟的饑餓激素<400>12gaattcggca cgaggggaat cccaggcgca tctgacacc atg ccc tcc ctg ggg 54Met Pro Ser Leu Gly1 5
acc atg tgc agc ctg ctg ctc ttc agt gtg ctc tgg gtg gac ctg gcc 102Thr Met Cys Ser Leu Leu Leu Phe Ser Val Leu Trp Val Asp Leu Ala10 1520atg gcg ggc tcc agc ttc cta agt ccc gaa cac cag aaa cta cag cag 150Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Set Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln25 30 35aga aag gag tcc aag aag ccg ccg gcc aaa ctg cag ccc cga gcc cta 198Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu4045 50gaa ggc tcc ctt ggc cca gaa gac aca agt caa gtg gaa gag gca gag 246Glu Gly Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ser Gln Val Glu Glu Ala Glu55 6065gat gag ctg gaa atc cgg ttc aat gcc ccc ttt gat gtt gga atc aag 294Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys70 75 80 85ctg tca ggg cct cag tac cac cag cat ggc cag gca ctc ggg aag ttt 342Leu Ser Gly Pro Gln Tyr His Gln His Gly Gln Ala Leu Gly Lys Phe90 95100ctt caa gag gtt ctt tgg gaa gac acc aac gag gcc ctg gca gac gag 390Leu Gln Glu Val Leu Trp Glu Asp Thr Ash Glu Ala Leu Ala Asp Glu105 110 115tga tcatccacaa gatgggcctg cctgttctcc ccccacccta gaagcactca443cctgactttt acactgtttc tgcagctact cccagttctg agtggtacta gttgaagagg 503tgaataaaca ttcaaaccat aaaaaaaaaa aaaaaaaact cgag547<210>13<211>494<212>DNA<213>Sus scrofa<220>
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<221>sig_peptide<222>(9)..(79)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(362)<223>饑餓激素pre-propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(80)..(362)
<223>饑餓激素propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(80)..(164)<223>成熟的饑餓激素<400>13ctgaggcc atg ccc tcc acg ggg acc att tgc agc ctg ctg ctc ctc agc 50Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser1 510gtg ctc ctc atg gca gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttc ttg agc98Val Leu Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser15 20 25 30ccc gaa cac cag aaa gtg cag cag aga aag gag tcc aag aag cca gca 146Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala35 4045gcc aaa ctg aag ccc cgg gcc ctg gaa ggc tgg ctc ggc cca gaa gac 194Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp50 55 60agt ggt gag gtg gaa ggc acg gag gac aag ctg gaa atc cgg ttc aac 242Ser Gly Glu Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn6570 75gcc ccc tgt gat gtt ggg atc aag ttg tca ggg gct cag tcc gac cag 290Ala Pro Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser Asp Gln8085 90cac ggc cag ccc ctg ggg aaa ttt ctc cag gac atc ctc tgg gaa gag 338His Gly Gln Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu95 100 105 110gtc act gag gcc ccg gcc gac aag tga ttgtccctga gaccagccac 385Val Thr Glu Ala Pro Ala Asp Lys115ctctgttctc ccagcctcct aagggctcac ctggcttcca ggacgcttcc actatcacac 445ccagctctga gggatgctag cctgggaggt gaataaacat tcagactgg 494<210>14<211>488<212>DNA<213>Bos taurus<220>
<221>外顯子<222>(4)..(354)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(4)..(72)
<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(351)<223>饑餓激素pre-propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(73)..(351)<223>饑餓激素propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(73)..(153)<223>成熟的饑餓激素<400>14gcc atg ccc gcc ccg tgg acc atc tgc agc ctg ctg ctg ctc agc gtg48Met Pro Ala Pro Trp Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val1 510 15ctc tgc atg gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttt ctg agc ccc gaa96Leu Cys Met Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu20 2530cat cag aaa ctg cag aga aag gaa gct aag aag cca tca ggc aga ctg 144His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu35 4045aag ccc cgg acc ctg gaa ggc cag ttt gac ccg gag gtg gga agt cag 192Lys Pro Arg Thr Leu Glu Gly Gln Phe Asp Pro Glu Val Gly Ser Gln50 55 60gcg gaa ggt gca gag gac gag ctg gaa atc cgg ttc aac gcc ccc ttt 240Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 7075aac att ggg atc aag cta gca ggg gct cag tcc ctc cag cat ggc cag 288Ash Ile Gly Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gln Ser Leu Gln His Gly Gln80 85 9095acg ttg ggg aag ttt ctt cag gac atc ctt tgg gaa gaa gct gaa gaa 336Thr Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Glu Glu100 105 110acc ctg gct aac gag tga gtggccctgg gaccaaccac ctgtccgttc 384Thr Leu Ala Asn Glu115tcccaccctc agaagctctc acctggcttc cgggacactt ccgagaccac gtggggctct 444gaggggtact agagtaggca gtgaataaat gctcagatgg atgc 488<210>15<211>64<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>成熟的rat饑餓激素with added epitopes<400>15Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly1510 15Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu2025 30Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Phe Asn Asn Phe Thr35 40 45Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu50 55 60<210>16<211>68<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有添加的表位的成熟的饑餓激素<400>17Glu Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 510 15Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His2025 30Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu3540 45Gln Pro Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr50 5560Glu Leu Glu Glu65<210>17<211>68<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有添加的表位的成熟的饑餓激素<400>17Glu Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 510 15Leu Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg20 25 30Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Phe Asn Asn3540 45Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His50 55 60Leu Glu Glu Glu65
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1、一種治療和/或預(yù)防和/或改善肥胖或其它疾病和體內(nèi)脂肪沉積過量的癥狀的方法，該方法包括通過對抗動物中、包括人類中的饑餓激素的免疫向下調(diào)節(jié)饑餓激素，該方法包括將免疫有效量的免疫原有效提呈給動物免疫系統(tǒng)，該免疫原選自至少一種饑餓激素多肽或其亞序列，其配方使含有饑餓激素多肽或其亞序列的動物的免疫誘導(dǎo)對抗動物自體饑餓激素的抗體的產(chǎn)生，以及至少一種摻入在同一分子中的饑餓激素類似物，至少一種饑餓激素的B-細胞的表位，以及至少一種不是來自饑餓激素的化學(xué)部分，以使用類似物免疫動物誘導(dǎo)對抗饑餓激素的抗體的生成。
2、一種增加動物體重的方法，該方法包括通過對抗動物中的饑餓激素的免疫向上調(diào)節(jié)饑餓激素，該方法包括將免疫有效量的免疫原有效提呈給動物免疫系統(tǒng)，該免疫原選自至少一種饑餓激素多肽或其亞序列，其配方使含有饑餓激素多肽或其亞序列的動物的免疫誘導(dǎo)對抗動物自體饑餓激素的抗體的產(chǎn)生，以及至少一種摻入在同一分子中的饑餓激素類似物，至少一種饑餓激素的B-細胞的表位，以及至少一種不是來自饑餓激素的化學(xué)部分，以使用類似物免疫動物誘導(dǎo)對抗饑餓激素的抗體的生成。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中免疫原是饑餓激素類似物。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中類似物已經(jīng)保存了饑餓激素B-細胞表位的重要部分，其中類似物也包括至少一種外源T-細胞輔助淋巴細胞表位(TH表位)，和/或至少一種影響類似物靶向一抗原提呈細胞(APC)的或B-淋巴細胞的第一部分，和/或至少一種刺激免疫系統(tǒng)的第二部分，和/或至少一種優(yōu)化類似物出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中的第三部分。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分通過連接到合適的側(cè)鏈饑餓激素或其亞序列出現(xiàn)在類似物中。
6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中類似物是饑餓激素多肽，該饑餓激素多肽通過至少一種氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加進行修飾。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中類似物是融合多肽。
8、根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加允許在類似物中基本保留饑餓激素的所有的三級結(jié)構(gòu)。
9、根據(jù)權(quán)利要求4和5-8中任一權(quán)利要求所述的方法，從屬于于權(quán)利要求4，其中類似物包括至少一種饑餓激素B-細胞表位的復(fù)制和/或半抗原的引入。
10、根據(jù)權(quán)利要求4和5-9中任一權(quán)利要求所述的方法，從屬于于權(quán)利要求4，其中外源T-細胞表位在動物中是免疫顯型的。
11、根據(jù)權(quán)利要求4和5-10中任一權(quán)利要求所述的方法，從屬于于權(quán)利要求4，其中外源T-細胞表位是混雜的。
12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中至少一種外源T-細胞表位選自天然混雜的T-細胞表位和肽人工肽MHC-II結(jié)合序列。
13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中天然的T-細胞表位選自破傷風(fēng)類毒素表位，如P2或P30，白喉類毒素表位，流感病毒hemagluttinin表位，和P.惡性瘧原蟲CS表位。
14、根據(jù)權(quán)利要求4和5-13中任一權(quán)利要求所述的方法，從屬于權(quán)利要求4，其中第一部分是B-淋巴細胞特異表面抗原或APC特異表面抗原的實質(zhì)的特異結(jié)合配體，如在B-淋巴細胞或APC上具有一受體的半抗原或醣類。
15、根據(jù)權(quán)利要求4和5-14中任一權(quán)利要求所述的方法，從屬于權(quán)利要求4，其中第二部分選自細胞因子和熱休克蛋白。
16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中細胞因子選自干擾素γ(IFN-γ)、Flt3L、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，或是其有效部分；其中的熱休克蛋白選自HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和鈣網(wǎng)蛋白(CRT)，或是其有效部分。
17、根據(jù)權(quán)利要求4和5-16中任一權(quán)利要求所述的方法，從屬于權(quán)利要求4，其中第三部分是脂類屬性，如棕櫚?；?、十四烷基、法呢基、香葉酯-香葉酯基、GPI-錨和N-乙酰甘油二酯。
18、根據(jù)前述的任一權(quán)利要求所述的方法，其中免疫原含有用相同或不同長度的氨基酸序列取代至少一種饑餓激素多肽內(nèi)的氨基酸序列，所述的長度可以在類似物中產(chǎn)生外源TH表位。
19、根據(jù)前述的任一權(quán)利要求所述的方法，其中饑餓激素多肽包括對應(yīng)于SEQ ID NO11中氨基酸24-51或其亞序列的氨基酸序列，其中在類似物中插入氨基酸序列產(chǎn)生外源TH表位，或者至少一種氨基酸序列被在類似物中產(chǎn)生外源TH表位的相同或不同長度的氨基酸序列取代，其中的引入在任何一種下述氨基酸后進行，SEQ ID NO11中的氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117；其中可以缺失的氨基酸是SEQ ID NO11中的氨基酸1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116和/或117。
20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中類似物選自具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的氨基酸序列的多肽。
21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中免疫原的聚氨基酸共價或非共價連接到能夠影響抗原決定簇的多重復(fù)制的提呈的載體分子上，其中聚氨基酸選自饑餓激素多肽、饑餓激素亞序列和饑餓激素類似物。
22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中載體分子含有或由藥學(xué)上可接受的激活的聚羥基聚合物組成。
23、根據(jù)從屬權(quán)利要求3的權(quán)利要求22所述的方法，其中聚羥基聚合物作為載體主鏈分別連接到1)饑餓激素多肽或其亞序列和2)外源TH表位。
24、根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中聚氨基酸通過被肽酶裂解的鍵結(jié)合到聚羥基聚合物上，如酰胺鍵或肽鍵。
25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的聚氨基酸提供相應(yīng)酰胺鍵的氮部分。
26、根據(jù)權(quán)利要求22-25中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物載體基本沒有氨基酸殘基。
27、根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚氨基酸通過在氨基酸序列的N-末端的氮結(jié)合到激活的聚羥基聚合物上。
28、根據(jù)權(quán)利要求22-27中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物是水溶性的。
29、根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物是水不溶性的。
30、根據(jù)權(quán)利要求22-29中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物選自天然生成的聚羥基化合物和合成的聚羥基化合物。
31、根據(jù)權(quán)利要求22-30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物是多醣。
32根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中多醣選自乙酰、支鏈淀粉、瓊脂樹膠、瓊脂糖、藻酸鹽、阿拉伯樹膠、carregeenan、纖維素、環(huán)式糊精、右旋糖苷、帚叉藻聚糖(Furcellaran)、半乳甘露聚糖、白明膠、茄替膠、葡聚糖、糖原、瓜耳膠、刺梧桐樹膠、魔芋/A(konjac/A)、刺槐豆膠(LOCUSTBEAN GUM)、甘露聚糖、果膠、膠質(zhì)、亞麻、淀粉、tamarine、黃芪膠、黃原膠、木聚糖和木葡聚糖。
33、根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中聚羥基聚合物是右旋糖苷。
34、根據(jù)權(quán)利要求22-30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物選自高分支聚(乙烯亞胺)(PEI)、tetrathienylene vinylene、芳綸(poly-paraphenyl terephtalamide的長鏈)、聚(聚氨酯橡膠)、聚(硅氧烷)、聚二甲基硅氧烷、硅樹脂、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯酮)、聚(2-羥基異丁烯酸)、聚(N-乙烯吡咯酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-co-乙烯醋酸鹽)、聚(乙烯乙二醇)和衍生物，聚(甲基丙烯酸)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、聚酐和聚原磷酯。
35、根據(jù)權(quán)利要求22-34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中激活前的聚羥基聚合物的平均分子量至少為500。
36、根據(jù)權(quán)利要求22-35中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚羥基聚合物由選自下述的官能團激活tresyl(三氟乙基磺?；?、馬來酰亞胺、p-氮苯基卡樂甲酸鹽和甲苯磺酰基(p-甲苯磺酰)。
37、根據(jù)權(quán)利要求22-36中任一權(quán)利要求所述的方法，進一步包括至少一種與聚羥基聚合物偶聯(lián)的進一步聚氨基酸，所述的至少一種進一步的聚氨基酸選自下述基團免疫刺激肽或靶向肽。
38、根據(jù)前述的任一權(quán)利要求所述的方法，其中有效量的免疫原通過選自非腸道的方式服用到動物體內(nèi)如皮下的、真皮的、皮層內(nèi)的、皮內(nèi)的和肌肉的方式；腹膜的方式；口服的方式；口腔的方式；舌下的方式；硬腦膜外的方式；脊髓的方式；肛門的方式和顱內(nèi)的方式。
39、根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中的有效量為0.5微克～2000微克之間的饑餓激素多肽、其亞序列及其類似物。
40、根據(jù)權(quán)利要求27或38所述的方法，其中饑餓激素多肽或類似物包含在虛擬淋巴結(jié)(VLN)裝置內(nèi)。
41、根據(jù)權(quán)利要求38-40中任一權(quán)利要求所述的方法，其中饑餓激素多肽及其亞序列，或者饑餓激素類似物和佐劑一起配制，該佐劑有利于打破對自身抗原的自身耐受。
42、根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一權(quán)利要求所述的方法，其中通過將編碼免疫原的核酸引入到動物細胞影響免疫原向免疫系統(tǒng)的提呈，因而通過引入的核酸的細胞獲得體內(nèi)表達。
43、根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中引入的核酸(s)選自裸露的DNA、與帶電或不帶電的脂質(zhì)配制的DNA、配制進脂質(zhì)粒的DNA、包含在病毒載體內(nèi)的DNA、和轉(zhuǎn)染-便利蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA、和靶向蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA、和鈣沉淀劑配制的DNA、與惰性載體分子偶聯(lián)的DNA、在幾丁質(zhì)或殼聚糖中包裹的DNA、以及與佐劑配制的DNA。
44、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中核酸(s)包含在VLN裝置內(nèi)。
45、根據(jù)權(quán)利要求38-44中任一權(quán)利要求所述的方法，其中包括每年至少服用/引入一次，如服用/引入至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次。
46、來源于動物饑餓激素多肽的饑餓激素多肽的類似物，其中該類似物引入了修飾，因而用類似物免疫動物誘導(dǎo)了對抗動物自體饑餓激素多肽的抗體的生成。
47、一種免疫原的成分，其含有權(quán)利要求46所述的免疫原有效量的類似物，該成分進一步含有藥學(xué)上和免疫學(xué)上抗原接受的載體和/或賦形劑，以及可選擇的佐劑。
48、一種如權(quán)利要求4-20中任一權(quán)利要求所述的編碼類似物的核酸片段。
49、一種如權(quán)利要求48所述的負載有核酸片段的載體，如能夠自體復(fù)制的載體。
50、根據(jù)權(quán)利要求49所述的載體，選自下述基團質(zhì)粒、抗菌素、粘粒、微型-染色體和病毒。
51、根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的載體，包括在5’→3’的方向和可操作的聯(lián)結(jié)中，根據(jù)權(quán)利要求48所述的針對核酸片段驅(qū)動表達的啟動子(promoter)，可選擇的編碼能夠?qū)⒍嚯钠畏置诨蛘线M膜的前導(dǎo)肽的核酸序列，根據(jù)權(quán)利要求51的核酸片段，和可選擇的終止子。
52、根據(jù)權(quán)利要求49-51中任一權(quán)利要求所述的載體，當(dāng)引入到宿主細胞時，能夠或不能整合進宿主細胞。
53、根據(jù)權(quán)利要求51或52所述的載體，其中所述的啟動子驅(qū)動真核細胞和/或原核細胞內(nèi)的表達。
54、負載權(quán)利要求49-53中任一權(quán)利要求所述的載體的轉(zhuǎn)化細胞，如能夠復(fù)制權(quán)利要求52所述的核酸片段的轉(zhuǎn)化細胞。
55、根據(jù)權(quán)利要求54所述的轉(zhuǎn)化細胞，該細胞是選自下述的微生物細菌、酵母、原生動物或來源于選自下述多細胞機體的細胞真菌、昆蟲細胞如S2或SF細胞、植物細胞和哺乳動物細胞。
56、根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的轉(zhuǎn)化細胞，該細胞表達權(quán)利要求48所述的核酸片段，如在其表面分泌或攜帶根據(jù)權(quán)利要求46所述的類似物的轉(zhuǎn)化細胞。
57、根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一權(quán)利要求所述的方法，其中通過應(yīng)用非病源體的微生物或病毒影響向免疫系統(tǒng)的提呈，其中非病源體的微生物攜帶編碼和表達饑餓激素多肽、亞序列或類似物的的核酸片段。
58、在自體宿主細胞中誘導(dǎo)對抗饑餓激素多肽抗體生成的成分，該成分包括-權(quán)利要求52所述的核酸片段或根據(jù)權(quán)利要求53-57中任一項所述的載體，和-藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑和/或佐劑。
59、一穩(wěn)定的細胞系，該細胞系攜帶有權(quán)利要求49-53任一項所述的載體，并表達權(quán)利要求48所述的核酸片段，且在其表面上可選擇的分泌或攜帶權(quán)利要求46所述的類似物。
60、一種制備權(quán)利要求54-56中任一權(quán)利要求所述的細胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求48所述的核酸片段或權(quán)利要求53-57中任一項所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。
權(quán)利要求
1.針對包括人類的動物中自體饑餓激素免疫的方法，該方法包括將免疫有效量的免疫原有效提呈給動物免疫系統(tǒng)，該免疫原選自至少一種饑餓激素多肽或其亞序列，其配方使含有饑餓激素多肽或其亞序列的動物的免疫誘導(dǎo)對抗動物自體饑餓激素的抗體的產(chǎn)生，以及至少一種摻入在同一分子中的饑餓激素類似物，至少一種饑餓激素的B-細胞的表位，以及至少一種不是來自饑餓激素的化學(xué)部分，以使用類似物免疫動物誘導(dǎo)對抗饑餓激素的抗體的生成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中免疫原是饑餓激素類似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中類似物已經(jīng)保存了饑餓激素B-細胞表位的實質(zhì)部分，其中類似物也包括至少一種外源T-細胞輔助淋巴細胞表位(TH表位)，和/或至少一種影響類似物靶向一抗原提呈細胞(APC)的或B-淋巴細胞的第一部分，和/或至少一種刺激免疫系統(tǒng)的第二部分，和/或至少一種優(yōu)化類似物出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中的第三部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分通過連接到合適的側(cè)鏈饑餓激素或其亞序列出現(xiàn)在類似物中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中類似物是饑餓激素多肽，該饑餓激素多肽通過至少一種氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加進行修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中類似物是融合多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加進行修飾在類似物中基本保留饑餓激素的所有的三級結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一項所述的方法，其中類似物包括至少一種饑餓激素B-細胞表位的復(fù)制和/或半抗原的引入。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項所述的方法，其中外源T-細胞表位在動物中是免疫顯型的。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9中任一項所述的方法，其中外源T-細胞表位是混雜的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中至少一種外源T-細胞表位選自天然混雜的T-細胞表位和肽人工肽MHC-II結(jié)合序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中天然的T-細胞表位選自破傷風(fēng)類毒素表位，如P2或P30，白喉類毒素表位，流感病毒hemagluttinin表位，和P.惡性瘧原蟲CS表位。
13.根據(jù)權(quán)利要求3-12中任一項所述的方法，其中第一部分是B-淋巴細胞特異表面抗原或APC特異表面抗原的實質(zhì)的特異結(jié)合配體，如在B-淋巴細胞或APC上具有一受體的半抗原或糖類。
14.根據(jù)權(quán)利要求3-13中任一項所述的方法，其中第二部分選自細胞因子和熱休克蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中細胞因子選自干擾素γ(IFN-γ)、Flt3L、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和的粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，或是其有效部分其中的熱休克蛋白選自HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和鈣網(wǎng)蛋白(CRT)，或是其有效部分。
16.根據(jù)權(quán)利要求3-15中任一項所述的方法，其中第三部分是脂類屬性，如棕櫚?；?、十四烷基、法呢基、香葉酯-香葉酯基、GPI-錨和N-乙酰甘油二酯。
17.根據(jù)前述的任一項所述的方法，其中免疫原含有用相同或不同長度的氨基酸序列取代至少一種饑餓激素多肽內(nèi)的氨基酸序列，所述的長度可以在類似物中產(chǎn)生外源TH表位。
18.根據(jù)前述的任一項所述的方法，其中饑餓激素多肽包括對應(yīng)于SEQID NO11中氨基酸24-51或其亞序列的氨基酸序列，其中在類似物中插入氨基酸序列產(chǎn)生外源TH表位，或者至少一種氨基酸序列被在類似物中產(chǎn)生外源TH表位的相同或不同長度的氨基酸序列取代，其中的引入在任何一種下述氨基酸后進行，SEQ ID NO11中的氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117；其中可以缺失的氨基酸是SEQ ID NO11中的氨基酸1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116和/或117。
19.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法其中類似物選自具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的氨基酸序列的多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中免疫原的聚氨基酸共價或非共價連接到能夠影響抗原決定簇的多重復(fù)制的提呈的載體分子上，其中聚氨基酸選自饑餓激素多肽、饑餓激素亞序列和饑餓激素類似物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中載體分子含有或由藥學(xué)上可接受的激活的聚羥基聚合物組成。
22.根據(jù)從屬于權(quán)利要求3的權(quán)利要求21所述的方法，其中聚羥基聚合物作為載體主鏈分別連接到1)饑餓激素多肽或其亞序列和2)外源TH表位。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其中聚氨基酸通過被肽酶裂解的鍵結(jié)合到聚羥基聚合物上，如酰胺鍵或肽鍵。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的聚氨基酸提供相應(yīng)酰胺鍵的氮部分。
25.根據(jù)權(quán)利要求21-24中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物載體基本沒有氨基酸殘基。
26.根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項所述的方法，其中聚氨基酸通過在氨基酸序列的N-末端的氮結(jié)合到激活的聚羥基聚合物上。
27.根據(jù)權(quán)利要求21-26中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物是水溶性的。
28.根據(jù)權(quán)利要求21-26中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物是水不溶性的。
29.根據(jù)權(quán)利要求21-28中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物選自天然生成的聚羥基化合物和合成的聚羥基化合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求21-29中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物是多糖。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中多糖選自乙酰、支鏈淀粉、瓊脂樹膠、瓊脂糖、藻酸鹽、阿拉伯樹膠、carregeenan、纖維素、環(huán)式糊精、右旋糖苷、帚叉藻聚糖(Furcellaran)、半乳甘露聚糖、白明膠、茄替膠、葡聚糖、糖原、瓜耳膠、刺梧桐樹膠、魔芋/A(konjac/A)、刺槐豆膠(LOCUST BEAN GUM)、甘露聚糖、果膠、膠質(zhì)、亞麻、淀粉、tamarine、黃芪膠、黃原膠、木聚糖和木葡聚糖。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中聚羥基聚合物是右旋糖苷。
33.根據(jù)權(quán)利要求21-29中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物選自高分支聚(乙烯亞胺)(PEI)、tetrathienylene vinylene、芳綸(poly-paraphenyl terephtalamide的長鏈)、聚(聚氨酯橡膠)、聚(硅氧烷)、聚二甲基硅氧烷、硅樹脂、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯酮)、聚(2-羥基異丁烯酸)、聚(N-乙烯吡咯酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-co-乙烯醋酸鹽)、聚(乙烯乙二醇)和衍生物，聚(甲基丙烯酸)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、聚酐(Polyanhydrides)和聚原磷酯(Polyorthoesters)。
34.根據(jù)權(quán)利要求21-33中任一項所述的方法，其中激活前的聚羥基聚合物的平均分子量為至少500。
35.根據(jù)權(quán)利要求21-34中任一項所述的方法，其中聚羥基聚合物由選自下述的官能團激活tresyl(三氟乙基磺酰基)、馬來酰亞胺、p-氮苯基卡樂甲酸鹽和甲苯磺?；?p-甲苯磺酰)。
36.根據(jù)權(quán)利要求21-35中任一項所述的方法，進一步包括至少一種與聚羥基聚合物偶聯(lián)的進一步聚氨基酸，所述的至少一種進一步的聚氨基酸選自下述基團免疫刺激肽或靶向肽。
37.根據(jù)前述的任一項所述的方法，其中有效量的免疫原通過選自非腸道的方式服用到動物體內(nèi)如皮下的、真皮的、皮層內(nèi)的、皮內(nèi)的和肌肉的方式；腹膜的方式；口服的方式；口腔的方式；舌下的方式；硬腦膜外的方式；脊髓的方式；肛門的方式和顱內(nèi)的方式。
38.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中的有效量為0.5微克～2000微克之間的饑餓激素多肽、其亞序列及其類似物。
39.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法，其中饑餓激素多肽或類似物包含在虛擬淋巴結(jié)(VLN)裝置內(nèi)。
40.根據(jù)權(quán)利要求20-39中任一項所述的方法，其中饑餓激素多肽及其亞序列，或者饑餓激素類似物和佐劑一起配制，該佐劑有利于打破對自身抗原的自身耐受。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其中通過將編碼免疫原的核酸引入到動物細胞影響免疫原向免疫系統(tǒng)的提呈，因而通過引入的核酸的細胞獲得體內(nèi)表達。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中引入的核酸選自裸露的DNA、與帶電或不帶電的脂質(zhì)配制的DNA、配制進脂質(zhì)粒的DNA、包含在病毒載體內(nèi)的DNA、和轉(zhuǎn)染-便利蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA、和靶向蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA、和鈣沉淀劑配制的DNA、與惰性載體分子偶聯(lián)的DNA、在幾丁質(zhì)或殼聚糖中包裹的DNA、以及與佐劑配制的DNA。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中核酸包含在VLN裝置內(nèi)。
44.根據(jù)權(quán)利要求37-43中任一項所述的方法，其中包括每年至少服用/引入一次，如服用/引入至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次。
45.根據(jù)前述任一項所述的方法，其中免疫的結(jié)果是自體饑餓激素下調(diào)。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-44中任一項所述的方法，其中免疫的結(jié)果是自體饑餓激素上調(diào)。
47.一種治療和/或預(yù)防和/或改善肥胖或特征為體內(nèi)脂肪沉積過量為特征的其它疾病和狀態(tài)的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法下調(diào)饑餓激素至體內(nèi)脂肪的總量明顯下降的程度。
48.一種增加動物體重的方法，例如人類，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法上調(diào)動物體內(nèi)的自體饑餓激素。
49.來源于動物饑餓激素多肽的饑餓激素多肽的類似物，其中該類似物引入了修飾，因而用類似物免疫動物誘導(dǎo)了對抗動物自體饑餓激素多肽的抗體的生成。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的類似物，由權(quán)利要求3-36中任一權(quán)利要求所定義。
51.一種致免疫的組合物，其含有—動物體內(nèi)固有的免疫原有效量的饑餓激素多肽或所述饑餓激素多肽的亞序列，所述的饑餓激素多肽或其亞序列與免疫學(xué)上可接受的佐劑一起配制以打破動物針對饑餓激素多肽的自體耐受性，該組合物進一步含有藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，或—免疫原有效量的根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的類似物，該組合物進一步含有藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，以及可選擇的佐劑。
52.一種編碼如權(quán)利要求3-19中任一項所述的類似物的核酸片段。
53.一種攜帶根據(jù)權(quán)利要求52所述的核酸片段的載體，如能夠自體復(fù)制的載體。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的載體，選自質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型—染色體和病毒。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54所述的載體，在5’→3’的方向和可操作的連接的包括啟動根據(jù)權(quán)利要求52所述的核酸片段表達的啟動子，可選擇的編碼能夠?qū)⒍嚯钠畏置诨蛘线M膜的前導(dǎo)肽的核酸序列，根據(jù)權(quán)利要求51的核酸片段，和可選擇的終止子。
56.根據(jù)權(quán)利要求53-55中任一項所述的載體，當(dāng)引入到宿主細胞時，能夠或不能整合進宿主細胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或56所述的載體，其中所述的啟動子驅(qū)動真核細胞和/或原核細胞內(nèi)的表達。
58.攜帶權(quán)利要求53-57中任一項所述的載體的轉(zhuǎn)化細胞，如能夠復(fù)制權(quán)利要求52所述的核酸片段的轉(zhuǎn)化細胞。
59.根據(jù)權(quán)利要求60所述的轉(zhuǎn)化細胞，該細胞是選自下述的微生物細菌、酵母、原體內(nèi)物或來源于選自下述多細胞機體的細胞真菌、昆蟲細胞如S2或SF細胞、植物細胞和哺乳動物細胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的轉(zhuǎn)化細胞，該細胞表達權(quán)利要求52所述的核酸片段，如在其表面分泌或攜帶根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的類似物的轉(zhuǎn)化細胞。
61.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其中通過應(yīng)用非病源體的微生物或病毒影響向免疫系統(tǒng)的提呈，其中非病源體的微生物攜帶編碼和表達饑餓激素多肽、亞序列或類似物的的核酸片段。
62.在自體宿主中誘導(dǎo)針對饑餓激素多肽的抗體生成的組合物，該組合物包括—權(quán)利要求52所述的核酸片段或根據(jù)權(quán)利要求53-57中任一項所述的載體，和—藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑和/或佐劑。
63.一種穩(wěn)定的細胞系，該細胞系攜帶有權(quán)利要求53-57任一項所述的載體，并表達權(quán)利要求52所述的核酸片段，且在其表面上可選擇的分泌或攜帶權(quán)利要求49或50所述的類似物。
64.一種制備權(quán)利要求58-60中任一項所述的細胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求52所述的核酸片段或權(quán)利要求53-57中任一項所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。
65.一種識別修飾的饑餓激素多肽的方法，該饑餓激素多肽能夠誘導(dǎo)對抗動物種群中未修飾的饑餓激素多肽的抗體，其中該未修飾饑餓激素多肽是自體蛋白質(zhì)，該方法包括—通過肽合成或遺傳工程技術(shù)制備一組相互之間不同之間不同的修飾饑餓激素多肽，其中氨基酸被添加、插入、缺失或取代動物種群中的饑餓激素多肽中的氨基酸序列，因而成組的產(chǎn)生含有對動物種群是外源的T-細胞表位的氨基酸序列；或者制備編碼一組相互之間不同的修飾的饑餓激素多肽的核酸片段；—測試成組修飾的饑餓激素多肽或核酸片段成員通過動物種群對抗未修飾饑餓激素多肽誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力；以及—識別和可選擇的分離成組修飾的饑餓激素多肽成員，該多肽明顯誘導(dǎo)對抗動物種群中未修飾的饑餓激素多肽的抗體的產(chǎn)生，或者識別和可選擇的分離由成組核酸片段成員編碼的多肽表達產(chǎn)物，該成組的核酸片段明顯誘導(dǎo)對抗動物種群中未修飾饑餓激素多肽的抗體的產(chǎn)生。
66.一種制備致免疫的組合物的方法，包括至少一種修飾的饑餓激素多肽，該饑餓激素多肽能夠誘導(dǎo)動物種群中對抗未修飾饑餓激素多肽的抗體，其中該未修飾饑餓激素多肽是自體蛋白，該方法包括—通過肽合成或遺傳工程技術(shù)制備一組相互之間不同的修飾饑餓激素多肽，其中氨基酸增加、插入、缺失或取代動物種群中的饑餓激素多肽的氨基酸序列，因而成組的產(chǎn)生含有T-細胞表位、并對動物種群來說是外源的氨基酸序列；—測試組修飾員通過動物種群誘導(dǎo)對抗未修飾饑餓激素多肽的抗體的產(chǎn)生的能力；以及—混和組員，該組員明顯誘導(dǎo)動物種群中抗體的生成，該抗體和具有藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的饑餓激素多肽反應(yīng)，可選擇的和至少一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的佐劑結(jié)合。
67.根據(jù)權(quán)利要求65或66所述的方法，其中組員的制備包括制備相互之間不同的氨基酸序列，每個序列是權(quán)利要求62所述的氨基酸序列，將核酸序列插入到合適的表達載體中，用載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞或宿主動物，影響核酸序列的表達，可選擇的接著分離表達載體產(chǎn)物。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中核酸序列和/或載體的制備通過分子擴增技術(shù)如PCR的輔助或核酸合成的輔助實現(xiàn)。
69.饑餓激素多肽或其亞序列用于制備含有用于下調(diào)動物體內(nèi)饑餓激素的佐劑的致免疫組合物的用途。
70.饑餓激素多肽或其亞序列用于制備含有用于下調(diào)動物體內(nèi)饑餓激素的佐劑的致免疫組合物的用途。
71.饑餓激素多肽或其亞序列用于制備含有用于治療、預(yù)防或改善以體內(nèi)脂肪沉積過量為特征的肥胖的佐劑的致免疫組合物的用途。
72.饑餓激素多肽其亞序列用于制備含有用于治療、預(yù)防或改善厭食、萎靡不振、外傷或燒傷、或輔助體外受精治療的佐劑的致免疫組合物的用途。
73.饑餓激素多肽類似物用于制備致免疫組合物的用途，所述的致免疫組合物可選擇的包括用于動物體內(nèi)下調(diào)饑餓激素的佐劑。
74.饑餓激素多肽類似物用于制備致免疫組合物的用途，所述的致免疫組合物可選擇的包括用于治療、預(yù)防或改善以體內(nèi)脂肪沉積過量為特征的肥胖的佐劑。
75.饑餓激素多肽類似物用于制備致免疫組合物的用途，所述的致免疫組合物可選擇的包括用于動物體內(nèi)上調(diào)饑餓激素的佐劑。
76.饑餓激素多肽類似物用于制備致免疫組合物的用途，所述的致免疫組合物可選擇的包括治療、預(yù)防或改善厭食、萎靡不振、外傷或燒傷、或輔助體外受精治療的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開的新穎的方法主要是對抗自體饑餓激素的免疫。免疫通過服用自體饑餓激素的類似物的而實現(xiàn)，所述的類似物能夠誘導(dǎo)對抗自體饑餓激素多肽的抗體的生成。特別優(yōu)選的免疫原是自體饑餓激素，其中通過引入單個或幾個外源的免疫顯型和混雜的T－細胞表位進行修飾。本發(fā)明也公開了對抗饑餓激素的核酸接種疫苗，該接種疫苗利用活的疫苗，以及有利于接種疫苗的方法和手段。這些方法和手段包括類似物和藥學(xué)上的劑型的制備，以及核酸片段、載體、轉(zhuǎn)化細胞、多肽和藥學(xué)劑型的制備。
文檔編號A61K39/39GK1694724SQ03825086
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月12日
發(fā)明者T·E·G·鮑文, S·克里斯勒 申請人:法麥克薩有限公司