專利名稱：體內(nèi)抑制病毒復(fù)制的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制病毒復(fù)制的方法、治療癌癥的方法、治療和/或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，以及同時(shí)抑制病毒復(fù)制和治療癌癥或治療和/或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法等。
背景技術(shù)：
病毒感染是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，每年有數(shù)百萬人的死亡可直接歸因于幾種病毒，包括肝炎和HIV。
肝炎是人類肝臟的一種疾病。它表現(xiàn)為肝臟的炎癥，通常由病毒感染引起。已知有幾種病毒可以引起病毒性肝炎，例如肝炎A、B、C、D、E和G型病毒。其中，HBV和HCV最為嚴(yán)重。
丙型肝炎病毒(HCV)在世界范圍內(nèi)廣泛流行，有1億7千萬以上的人被感染。在病毒性疾病中，它比1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)分布廣泛5倍，今年將有大約10000美國人死于由慢性HCV感染導(dǎo)致的肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)(Sun CA，Wu DM，Lin CC，Lu SN，You SL，Wang LY，Wu MH，Chen CJ.2003.丙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和協(xié)同因子臺灣12008個(gè)男性的遠(yuǎn)景調(diào)查，Am J Epidemiol157674-682；Herrine SK.2002.走近慢性丙型肝炎病毒感染的病人，Ann Intern Med 136747-757；Hoofnagle JH.2002.丙型肝炎的過程和結(jié)果，Hepatology 36S21-S29；Lauer GM，Walker BD.2001.丙型肝炎病毒感染，N Engl J Med 34541-52；Liang TJ，Rehermann B，Seeff LB，Hoofnagle JH.2001.丙型肝炎的發(fā)病機(jī)理、自然史、治療和預(yù)防，AnnIntern Med 132296-305)。此外，盡管有獻(xiàn)血者篩選計(jì)劃機(jī)構(gòu)，在美國、西歐和亞洲HCV的流行持續(xù)增加。在大多數(shù)HCV感染的病人中出現(xiàn)向慢性病的發(fā)展。此外，HCV每年在1-4％的所有慢性感染個(gè)體中引起HCC。而且，即使是在那些沒有肝硬化的人中HCC也可能發(fā)生(Shiratori Y，Shiina S，Teratani T，Imamura M，Obi S，Sato S，Koike Y，Yoshida H，Omata M.2003.在腫瘤切除后使用干擾素療法在患有與丙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌的病人中改善了預(yù)后，Ann Int Med138299-306；Smith MW，Yue ZN，Geiss GK，Sadovnikova NY，Carter VS，Boix L，Lazaro CA，Rosenberg GB，Bumgarner RE，F(xiàn)austo N，Bruix J，Katze MG.2003.在丙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌中鑒定新的腫瘤指標(biāo)，Cancer Res 63859-864；Yoshizawa H.2002.日本的與丙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌在可預(yù)見的將來預(yù)測其它國家，Oncology 62(Suppl1)8-17；Colombo M.1999.與丙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌的自然史和發(fā)病機(jī)理，J Hepatology 31(Suppl 1)25-30)。鑒于現(xiàn)在HCV感染在30到50歲人群中的流行，據(jù)估計(jì)在美國HCC的發(fā)病率和死亡率在未來的10到20年中將會(huì)增加1倍(El-Serag HB.2002.美國的肝細(xì)胞癌和丙型肝炎。Hepatology 36S74-S83)。據(jù)估計(jì)在全世界有5億人感染丙型肝炎。目前沒有有效的免疫方法可以使用，丙型肝炎只能夠通過其它的預(yù)防措施來控制，例如改善衛(wèi)生和保健條件，阻斷傳播途徑。
目前，除了外科切除之外對HCC還沒有有效的治療方法(Ryder SD.2003.成年人中肝細(xì)胞癌(HCC)的診斷和治療指南，Gut 52(SupplIII)iii1-iii8；E1-Serag HB.2001.美國的肝細(xì)胞癌和丙型肝炎，Hepatology 36S74-S83；E1-Serag HB.2001.肝細(xì)胞癌的全球流行病學(xué)，Clin Liver Dis 587-107；DiMaio M，DeMaio E，Perrone F，Pegnata S，Daniele B.2002.肝細(xì)胞癌全身性治療，J Clin Gastroenterol 35(Suppl.2)S109-S114；Curley SA，Izzo F，Ellis LM，Vauthey JN，Vallone P.2000.在110個(gè)患有肝硬化的病人中肝細(xì)胞癌的射頻摘除，Ann Surg232381-391；Watkins KT，Curley Sa.2000.肝臟和膽管，臨床腫瘤學(xué)(第二版)，MD Abeloff，JO Armitage，AS Lichter，JE Niederhuber主編，NewYorkChurchill Livingstone出版社，第1681-1748頁)。但是只有不到5％的HCC病人符合外科手術(shù)要求，只有大約1％的病人實(shí)際上進(jìn)行了切除。即使是在那些進(jìn)行了切除的病人中，HCC的復(fù)發(fā)也是常見的，特別是在那些感染了HCV的人中。
氨基酸脫療對于某些癌癥的治療是有效的方法。盡管正常的細(xì)胞不需要精氨酸，許多癌癥細(xì)胞系對于這種氨基酸來說是營養(yǎng)缺陷的。因此，癌癥，包括但不限于HCC，可以被精氨酸脫療選擇性殺死(EnsorCM，Holtsberg FW，Bomalaski JS，Clark MA.2002.PEG化的精氨酸脫亞胺酶(ADI-SS PEG20000)在體外和體內(nèi)抑制了人的黑素瘤和肝細(xì)胞癌，Cancer Res 625443-5440；Takaku H，Misawa S，Hayashi H和Miyazaki K.(1993).來自精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)的抗腫瘤酶精氨酸脫亞胺酶的聚乙二醇化學(xué)修飾，Jpn.J.Cancer Res.841195-1200；Takaku H，Takase M，Abe S，Hayashi H和Miyazaki K.(1992).從精氨酸支原體純化的精氨酸脫亞胺酶的體內(nèi)抗腫瘤活性，Int.J.Cancer51244-249；Sugimura K，Ohno T，Kussyama T，Azuma I.1992.人類黑素瘤細(xì)胞系在體外對精氨酸支原體脫亞胺酶的生長抑制活性的高敏感性，Melanoma Res.2191-196)。這種療法容易忍受，因?yàn)榫彼嵩谌梭w中不是一種必需氨基酸(Rose WC.1949.人類的氨基酸需求，F(xiàn)edProc 8546-552；Snyderman，S.，E.，Boyer，A.，和L.E.Holt 1959.嬰兒的精氨酸需求，J.Dis.Child.97192，至于綜述可以參見Rodgers QR.1994.精氨酸需求在物種中的變化，紀(jì)念Willard J.Visek研討會(huì)會(huì)議錄——從氨到癌癥和基因表達(dá)，特別出版物86-1994年4月，Illinois大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，211 Mumford Hall，Urbana，IL 61801，第9-21頁)，它可以從瓜氨酸合成。ADI將細(xì)胞外的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，它可以被正常的細(xì)胞攝取并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為精氨酸，但是不能被癌細(xì)胞，特別是HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈ο匏倜妇被晁岷铣擅?Ensor CM，Holtsberg FW，Bomalaski JS，Clark MA.2002.PEG化的精氨酸脫亞胺酶(ADI-SS PEG20000)在體外和體內(nèi)抑制了人的黑素瘤和肝細(xì)胞癌，Cancer Res 625443-5440)。這種不能表達(dá)精氨基琥珀酸合成酶的性質(zhì)最近被其他人所證實(shí)(Shen LJ，Lin WC，Beloussow K，Shen WC.2003.對細(xì)胞培養(yǎng)物中重組的精氨酸脫亞胺酶的抗增殖活性的抗性與內(nèi)源的酶——精氨基琥珀酸合成酶相關(guān)，Cancer Lett 191165-170)。我們已經(jīng)將這種對精氨基琥珀酸合成酶缺陷的研究擴(kuò)展到其它腫瘤(Dillon BJ，Prieto VG，Curley SA，Ensor CM，Holtsberg FW，Bomalaski JS，Clark MA.2003.精氨基琥珀酸合成酶缺陷在人類癌癥中的發(fā)生率和分布的方法一種鑒定對脫精氨酸敏感的癌癥的方法，Cancer(待出版))。ADI-SS PEG20000的人類臨床試驗(yàn)的初步結(jié)果表明這種療法作為抗癌療法既安全又有效。
乙型肝炎病毒感染可以導(dǎo)致多種類型的肝臟損傷。此外，慢性乙型肝炎病毒感染已經(jīng)與隨后的肝細(xì)胞癌(一種主要的死亡原因)的發(fā)展建立了聯(lián)系?，F(xiàn)在對HBV感染的預(yù)防是接種乙型肝炎病毒疫苗，它既安全又有效。但是，疫苗在治療那些已經(jīng)感染的人(即攜帶者和病人)時(shí)是無效的。
獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)是一種致命的疾病，報(bào)道的病例在過去的幾年中急劇增加。AIDS病毒是在1983年首次鑒定的。它有幾個(gè)名字和縮寫。它是第三個(gè)知道的嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-III)，具有在免疫系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力，引起嚴(yán)重的細(xì)胞毀壞。AIDS病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒，是一種在復(fù)制過程中使用逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒。這種特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒也被稱為淋巴腺病相關(guān)病毒(LAV)、AIDS相關(guān)病毒(ARV)，以及最近的人免疫缺陷病毒(HIV)。迄今為止已經(jīng)描述了兩種不同的HIV家族，即HIV-1和HIV-2。此處使用的縮寫“HIV”在廣義上是指人免疫缺陷病毒。
1型和2型單純皰疹病毒(HSV)是持久性的病毒，通常感染人類；它們引起多種令人煩惱的人類疾病。1型HSV引起口腔“唇皰疹”(復(fù)發(fā)性唇皰疹)，2型HSV引起生殖器皰疹，它在世界許多地方已經(jīng)變成了一種主要的性病。目前對生殖器皰疹沒有完全令人滿意的治療方法。此外，盡管并不常見，HSV也可以引起腦炎(一種威脅生命的腦部感染)(Holvey主編的Merck手冊，1972；Whitley，單純性皰疹病毒，病毒學(xué)(第二版)，Raveb出版社(1990))。由HSV引起的最嚴(yán)重的紊亂是樹枝狀角膜炎，這是一種眼部感染，在角膜上產(chǎn)生分支狀病變，可以導(dǎo)致永久性的瘢痕和失明。HSV的眼部感染是失明的主要原因。HSV也是一種難以治愈的病毒，如果不是不能治愈的話。
抗病毒療法目前的抗病毒療法面臨幾個(gè)難題。首先，有效的抗病毒藥物相對較少。許多現(xiàn)有的抗病毒藥物引起不利的或不希望的副反應(yīng)。大多數(shù)有效的療法(例如接種疫苗)只對單一的病毒株是高度特異的。病毒經(jīng)常經(jīng)歷突變，以至于它變得對藥物或疫苗具有抗性。
許多現(xiàn)有的治療病毒感染的方法以α-干擾素(IFN-α)為中心。據(jù)信α-干擾素與細(xì)胞受體結(jié)合，啟動(dòng)了一個(gè)包括參與蛋白合成的酶的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。這最終導(dǎo)致了抗病毒活性/反應(yīng)。但是，來自各種臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，大約40％用α-干擾素治療的病人最初對療法有反應(yīng)，但是他們中有70％在治療結(jié)束后復(fù)發(fā)(Damen，M.，和Bresters，D.，在H.W.主編的Curr.Stud.Hematol.Blood Transf.，Darger出版社，1998，Basel)?？偟膩碚f，只在10-30％的病人中觀察到了長期的療效和反應(yīng)(Houghton，M.，F(xiàn)ields，B.N.等，野外病毒學(xué)，Raven出版社1996，Philadelphia)。此外還觀察到了許多副反應(yīng)，例如嚴(yán)重的流行感冒、疲勞、肌肉和頭痛，甚至抑郁癥、體重減輕和腹瀉(Damen，M.，和Bresters，D.，在H.W.主編的Curr.Stud.Hematol.Blood Transf.，Darger出版社1998，Basel)。
HCV療法目前HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)療法是PEG化的α-干擾素和利巴韋林(ribavirin)。盡管這種療法可以產(chǎn)生持續(xù)的抗病毒反應(yīng)，但有大量的病人對這種療法沒有反應(yīng)或被排除在這種療法之外(Falck-Ytter Y，Kale H，Mullen KD，Sarbah SA，Sorescu L，McCullough AJ.2002.在丙型肝炎患者中抗病毒治療方法的效果驚人地小，Ann Intern Med 136288-292；Fried MW.2002.丙型肝炎療法的副反應(yīng)及其管理，Hepatology36S237-S244；Fried MW，Shiffman ML，Reddy KR，Smith C，Marinos G，Goncales FL Jr，Haussinger K，Diago M，Carosi G，Dhumeaux K，Craxi A，Lin A，Hoffman J，Yu J.2002.用于慢性丙型肝炎病毒感染的PEG化α-2a干擾素加利巴韋林，N Engl J Med 347975-982；Herrine SK.2002.走近慢性丙型肝炎病毒感染的病人，Ann Intern Med 136747-757；LauerGM，Walker BD.2001.丙型肝炎病毒感染，N Engl J Med 34541-52；Liang TJ，Rehermann B，Seeff LB，Hoofnagle JH.2001.丙型肝炎的發(fā)病機(jī)理、自然史、治療和預(yù)防，Ann Intern Med 132296-305；Manns MP，McHuntchinson JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，Goodman ZD，Koury K，Ling M-H，Albrecht JK.2001.PEG化α-2b干擾素加利巴韋林與α-2b干擾素加利巴韋林在慢性丙型肝炎最初治療中的比較隨機(jī)化試驗(yàn)，Lancet 358958-965)。例如，最近對PEG-IFNα-2a(PegasysTN)加利巴韋林和PEG-IFNα-2b(PegintronTN)加利巴韋林的研究證明大約56％被研究的病人具有持續(xù)的病毒反應(yīng)(Dantzler TD，Lawitz EJ.2003.在對以前的療法無反應(yīng)的人中治療慢性丙型肝炎，Curr Gastroenterol Rep 578-85；Masci P，Bukowski RM，Patten PA，Osborn BL，Borden EC.2003.新的和修飾的α-干擾素臨床前和臨床數(shù)據(jù)，Curr Oncol Rep 5108-113；Chandler G，Sulkowski MS，Jenckes MW，Torbenson MS，Herlong HF，Bass EB，Gebo KA.2002.慢性丙型肝炎的治療系統(tǒng)的綜述，Hepatology 36S135-S144；DiBisceglie AM，Hoofnagle JH.2002.丙型肝炎的最適療法，Hepatology 36S121-127；Fried MW.2002.丙型肝炎療法的副反應(yīng)及其管理，Hepatology36S237-S244；Lindsay KL.2002.丙型肝炎療法介紹，Hepatology36S114-S120；Lopez-Guerrero JA，Carrasco L.1998.一氧化氮對兩種人類細(xì)胞系的脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的影響，J.Virol 722538-2540；Wedemeyer H，Wiegand J，Cornberg M，Manns MP.；聚乙二醇-干擾素在丙型肝炎病毒療法中的現(xiàn)狀，J Gastroenterol Hepatol.2002年12月，17 Suppl 3S344-S350；Manns MP，McHuntchinson JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，Goodman ZD，Koury K，Ling M-H，Albrecht JK.2001.PEG化α-2b干擾素加利巴韋林與α-2b干擾素加利巴韋林在慢性丙型肝炎最初治療中的比較隨機(jī)化試驗(yàn)，Lancet358958-965)。但是，對于HCV 1a和1b這些在美國和西歐最常見的基因型來說，反應(yīng)只有大約46％。HCV 2和3基因型反應(yīng)較好(76％-82％)。此外，在臨床試驗(yàn)中對被研究的病人來說反應(yīng)率只有大約50％；這并不代表整個(gè)病人人群，因此存在偏差(Dantzler TD，Lawitz EJ.2003.在對以前的療法沒有反應(yīng)的病人中治療慢性丙型肝炎，CurrGastroenterol Rep 578-85；Masci P，Bukowski RM，Patten PA，Osborn BL，Borden EC.2003.新的和修飾的α-干擾素臨床前和臨床數(shù)據(jù)，CurrOncol Rep 5108-113；Chandler G，Sulkowski MS，Jenckes MW，Torbenson MS，Herlong HF，Bass EB，Gebo KA.2002.慢性丙型肝炎的治療系統(tǒng)的綜述，Hepatology 36S135-S144；DiBisceglie AM，Hoofnagle JH.2002.丙型肝炎的最適療法，Hepatology 36S121-127；Fried MW.2002.丙型肝炎療法的副反應(yīng)及其管理，Hepatology36S237-S244；Fried MW，Shiffman ML，Reddy KR，Smith C，Marinos G，Goncales FL Jr，Haussinger K，Diago M，Carosi G，Dhumeaux K，Craxi A，Lin A，Hoffman J，Yu J.2002.用于慢性丙型肝炎病毒感染的PEG化α-2a干擾素加利巴韋林，N Engl J Med 347975-982；Lindsay KL.2002.丙型肝炎療法介紹，Hepatology 36S114-S120；López-Guerrero JA，Carrasco L.1998.一氧化氮對兩種人類細(xì)胞系的脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的影響，J.Virol 722538-2540；Wedemeyer 2002，Manns MP，McHuntchinson JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，Goodman ZD，Koury K，Ling M-H，Albrecht JK.2001.PEG化α-2b干擾素加利巴韋林與α-2b干擾素加利巴韋林在慢性丙型肝炎最初治療中的比較隨機(jī)化試驗(yàn)，Lancet 358958-965)。例如在美國的一項(xiàng)大型研究中，根據(jù)選擇的判據(jù)從1337個(gè)潛在的病人中排除了404個(gè)(或大約30％)(McHutchinson JG，Gordon SC，Schiff ER，Shiffman ML，Lee WM，Rustgi VK，等，1998，α-2b干擾素單獨(dú)或與利巴韋林結(jié)合作為慢性丙型肝炎的最初治療方法，Hepatitis Interventional Therapy Group，N EnglJ Med 3391485-1492)。其它的大型研究經(jīng)常不能描述它們的篩選判據(jù)或登記病人的百分?jǐn)?shù)。一項(xiàng)最近在美國由一家大的教學(xué)醫(yī)院進(jìn)行的研究注意到所有HCV患者中的72％沒有用IFN治療，其原因例如醫(yī)學(xué)或精神病學(xué)上的禁忌征候、正在進(jìn)行的物質(zhì)或酒精濫用、沒有堅(jiān)持到評估步驟、正常的肝臟酶、或者甚至是病人寧愿放棄治療(Falck-Ytter Y，Kale H，Mullen KD，Sarbah SA，Sorescu L，McCullough AJ.2002.在丙型肝炎患者中抗病毒治療方法的效果驚人地小，Ann Intern Med136288-292)。同樣的結(jié)果已經(jīng)被其它人所證實(shí)(Diamond C，Lee JH.2002.在患有丙型肝炎的病人中使用抗病毒療法，Annals Intern Med1371012)。因此，在HCV感染人群中很大的一部分由于各種醫(yī)學(xué)或精神病學(xué)上的禁忌征候而沒有接受現(xiàn)有的“最好的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)”的治療。即使是在美國和西歐使用了“最好的”病人的研究中，也只有大約50％能夠獲得持續(xù)的病毒反應(yīng)。
α-干擾素也有嚴(yán)重的副作用，在PEG化和非PEG化的制劑中發(fā)生的頻率大致相同(Masci P，Bukowski RM，Patten PA，Osborn BL，Borden EC.2003.新的和修飾的α-干擾素臨床前和臨床數(shù)據(jù)，CurrOncol Rep 5108-113；Fried MW.2002.丙型肝炎療法的副反應(yīng)及其管理，Hepatology 36S237-S244；Wedemeyer 2002，Herrine SK.2002.走近慢性丙型肝炎病毒感染的病人，Ann Intern Med 136747-757；LauerGM，Walker BD.2001.丙型肝炎病毒感染，N Engl J Med 34541-52；Liang TJ，Rehermann B，Seeff LB，Hoofnagle JH.2001.丙型肝炎的發(fā)病機(jī)理、自然史、治療和預(yù)防，Ann Intern Med 132296-305)。這些副作用包括類似流感的疾病，在多達(dá)82％被研究的病人中伴隨著發(fā)燒、寒戰(zhàn)、肌肉疼痛和身體不適，在大約20％的病人中伴隨著神經(jīng)精神病學(xué)的并發(fā)癥，例如抑郁癥、易怒和焦慮。在大約5％中發(fā)生骨髓萎縮，伴隨著粒性白細(xì)胞減少癥、貧血或血小板減少癥，脫發(fā)癥的發(fā)生率也相當(dāng)。這些副作用通常非常嚴(yán)重，以至于使用α-干擾素的繼續(xù)治療被中止，從而進(jìn)一步限制了IFN療法的使用。因此，需要新的治療HCV的方法。
HIV的治療方法已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種治療HIV的藥物，包括azidovudine(AZT)、去羥肌苷(didanosine)(雙脫氧肌苷，ddI)、d4T、扎西他濱(zalcitabine)(雙脫氧胞苷，ddC)、內(nèi)維拉平(Nevirapine)、拉米夫定(lamivudine)(epivir，3TC)、沙奎那維(Saquinavir)(Invirase)、利托那韋(ritonavir)(Norvir)、茚地那韋(indinavir)(Crixivan)以及地拉韋定(delavirdine)(Rescriptor)。參見M.I.Johnston和D.F.Hoth，Science，260(5112)，1286-1293(1993)和D.D.Richman，Science，272(5270)，1886-1888(1996)。對于HCV的可選擇的療法是利巴韋林。利巴韋林是一種抗病毒藥物，其靶病毒活性范圍廣。利巴韋林是一種帶有修飾堿基(1-β-D-核糖呋喃基-1，2，4-三唑-3-羧酰胺)的鳥苷類似物，已被建議抑制細(xì)胞中的酶——肌苷單磷酸脫氫酶，導(dǎo)致三磷酸鳥苷的減少(Damen，M.，和Bresters，D.，在H.W.主編的Curr.Stud.Hematol.Blood Transf.，Darger出版社1998，Basel)。但是，利巴韋林將引起副作用(Christie，J.M.和Chapman，R.W.，HospMed.60，357(1999))。特別是利巴韋林在患者紅細(xì)胞中積累，可引起溶血性貧血。
AIDS疫苗(Salk氏疫苗)已經(jīng)被試驗(yàn)，幾種蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以作為HIV的抑制劑，它們是來自CD8的趨化因子。除了上面的合成的核苷類似物、蛋白和抗體之外，幾種植物和來自植物的物質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有體外的抗HIV活性。但是，HIV病毒不容易被毀滅，也沒有好的機(jī)制可以阻止宿主細(xì)胞復(fù)制病毒。
脫精氨酸的體外使用在過去的30年中，許多研究已經(jīng)表明細(xì)胞外的精氨酸為病毒在體外復(fù)制所必需。歷史上，這已經(jīng)通過制作缺陷精氨酸的組織培養(yǎng)基以及將血清透析用做補(bǔ)充培養(yǎng)基(complement)以獲得無精氨酸的培養(yǎng)基而完成。使用這種方法達(dá)成了脫精氨酸，導(dǎo)致抑制了大量不同的病毒家族的復(fù)制，包括腺病毒(Rouse HC，Bonifas VH，Schlesinger RW.1963.腺病毒復(fù)制對精氨酸的依賴和通過胸膜肺炎類生物抑制噬菌斑的形成，Virology 20357-365)、皰疹病毒(Tankersley RW Jr.1964.單純皰疹病毒在人類細(xì)胞中的氨基酸需求，J Bacteriol 87608-613)、SV40(Goldblum N，Ravid Z，Becker Y.1968.精氨酸和其它氨基酸的停藥對腫瘤和SV40病毒的病毒抗原合成的影響，J Gen Virol 3143-146)、細(xì)胞肥大病毒(Minamishima Y，Benyesh-Melnick M.1969.細(xì)胞肥大病毒感染中的精氨酸依賴事件，Bacteriol Proc 170334-339)、呼吸道合胞病毒(Levine S，Buthala D，Hamilton RD.1971.呼吸道合胞病毒復(fù)制的晚期同步化，Virology 45390-400)、多形瘤病毒(Winters AL，ConsigliRA，Rogers OR 1972.在多形瘤感染的小鼠胚胎細(xì)胞中的非功能性精氨酸生物合成途徑，Biochem Biophys Res Comm 471045-1051)、新城疫病毒(Illnuma M，Maemo K，Matsumoto T.1973.新城疫病毒裝配的研究病毒復(fù)制中的精氨酸依賴性步驟，Virology 51205-215)、麻疹病毒(Romano N，Scarlata G.1973.麻疹病毒在HeLa細(xì)胞中的氨基酸需求，Arch Gesamte Virus Forschung 43359-366)、流感病毒(Lisok TP，Sominina AA.1977.流感病毒繁殖的改進(jìn)方法.I.在細(xì)胞培養(yǎng)液中增強(qiáng)病毒的繁殖，Acta Virol 21234-240)、以及可能是更相關(guān)的痘苗病毒(Holterman OA.1969.在Earle氏L細(xì)胞中繁殖痘苗病毒的氨基酸需求，J Gen Virol 4585-591；Singer SH，F(xiàn)itzgerald EA，Barile MF，Kirschstein RL.1970.支原體對痘苗病毒生長的影響精氨酸的需求，Proc Soc Exp Biol Med 1331439-1442；Obert G，Tripier F，Guir J.1971.痘苗病毒在KB細(xì)胞中晚期mRNA轉(zhuǎn)錄的精氨酸需求，Biochem BiophysRes Comm 44362-367；Archard LC，Williamson JD.1971.脫精氨酸對痘苗病毒復(fù)制的影響，J Gen Virol 12249-258)、以及兔痘病毒(Cooke BC，Williamson JD.1973.在兔痘病毒感染的小鼠肉瘤180細(xì)胞中瓜氨酸的利用增強(qiáng)，J Gen Virol 21339-348)。痘苗病毒是包括天花病毒的正痘病毒屬的原型成員。病毒復(fù)制的抑制在體外被觀察到，即使被感染的細(xì)胞的蛋白合成和復(fù)制不受影響。
降解精氨酸的酶已經(jīng)知道，包括精氨酸脫亞胺酶(ADI)。但是，與使用這樣的外源蛋白進(jìn)行治療相關(guān)的問題是它的抗原性。Takaku，H，Misawa，S，Hayashi H和Miyazaki K.(1993).來自精氨酸支原體的抗腫瘤酶精氨酸脫亞胺酶的聚乙二醇化學(xué)修飾，Jpn.J.Cancer Res.841195-1200)描述了利用聚乙二醇經(jīng)由氰尿酰氯連接基團(tuán)對來自精氨酰支原體的精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾。但是修飾的蛋白在代謝時(shí)是有毒的，因?yàn)閺那枘蝓Ｂ冗B接基團(tuán)中釋放了氰化物。
對能夠抑制病毒復(fù)制而沒有與現(xiàn)有工藝相關(guān)的問題的方法有需求。本發(fā)明的針對于這些目的以及其它的重要目的。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及了調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的方法，包括給病人施用與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶。本發(fā)明還涉及了同時(shí)調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和治療癌癥的方法，包括例如肉瘤、肝細(xì)胞瘤和黑素瘤。本發(fā)明還涉及確定個(gè)體對病毒感染可被精氨酸脫療的方法、改善肝功的方法等。本發(fā)明的這些和其它的方面將在下面本發(fā)明的詳細(xì)描述中闡述。
發(fā)明詳述概述本發(fā)明是基于意外的發(fā)現(xiàn)，即用聚乙二醇修飾的ADI抑制病毒的復(fù)制。ADI可以通過或不通過連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)鍵合，盡管在有些實(shí)施方案中使用了連接基團(tuán)。例如PEG-20000表現(xiàn)出了有用的酶活性水平、抗原性、循環(huán)半衰期和效力，并且相對容易制造。
降低胞外精氨酸抑制病毒復(fù)制的機(jī)理尚不了解。食草類動(dòng)物例如人和小鼠(與對精氨酸有絕對需求的肉食類動(dòng)物不同)(綜述可以參見Rodgers QR.1994.精氨酸需求在物種中的變化，紀(jì)念Willard J.Visek研討會(huì)會(huì)議錄——從氨到癌癥和基因表達(dá)，特別出版物86-1994年4月，Illinois大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，211 Mumford Hall，Urbana，IL 61801，第9-21頁)以及大多數(shù)細(xì)胞的生長不需要精氨酸，因?yàn)樗梢允褂脙煞N胞內(nèi)酶(精氨基琥珀酸合成酶和精氨基琥珀酸裂解酶)從瓜氨酸合成。因此如果細(xì)胞可以得到瓜氨酸，消除細(xì)胞外的精氨酸不會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的精氨酸水平。因?yàn)椴《镜膹?fù)制是細(xì)胞內(nèi)過程，因此沒有預(yù)料到細(xì)胞外精氨酸的減少能夠抑制病毒的復(fù)制。
盡管不希望被理論所束縛，降低細(xì)胞外的精氨酸可以抑制病毒復(fù)制的一種可能的機(jī)制是通過抑制一氧化氮的合成。一氧化氮從細(xì)胞外的精氨酸合成，因此消除精氨酸的這個(gè)庫有效地抑制了這種重要代謝物的生產(chǎn)。盡管一氧化氮被認(rèn)為對某些病毒感染具有保護(hù)性(Akaike T，Maeda H.2000.一氧化氮和病毒感染，Immunology 101300-308)，抑制一氧化氮的合成已經(jīng)顯示阻斷了淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Campbell IL，Samimi A，Chiang CS.1994.可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶的表達(dá)，小鼠中的神經(jīng)病理學(xué)和臨床特征與淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎的關(guān)聯(lián)，J Immunol 1533622-3629)和HIV(Blond D，Raoul H，LeGrand R，Dormont D.2000.在初級人巨噬細(xì)胞中一氧化氮的合成增強(qiáng)了人免疫缺陷病毒的復(fù)制，J Virol 748904-8912)的復(fù)制。一氧化氮合成的抑制也已經(jīng)顯示出保護(hù)動(dòng)物免受流感(Akaike T，Noguchi Y，Ijiri S，SetoguchiK，Suga M，Zheng YM，Dietzschold B，Maeda H.1996.流感病毒誘導(dǎo)的肺炎的發(fā)病機(jī)理一氧化氮和氧自由基的參與，Proc Natl Acad Sci USA932448-2453；Karupiah G，Chen J-H，Mahalingam S，Nathan CF，MacMicking JD.1998.在一氧化氮合成酶2缺陷的小鼠中的γ-干擾素依賴型的流感A病毒的快速清除以及針對鞏固性肺炎的保護(hù)，J ExpMed 1881541-1546)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(López-Guerrero JA，Carrasco L.1998.一氧化氮對脊髓灰質(zhì)炎病毒感染兩種人類細(xì)胞系的影響，J Virol722538-2540)、狂犬病毒(Ubol S，Sukwattanapan C，Maneerat Y.2001.可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶延遲了狂犬病毒感染的小鼠的死亡，J MedMicrobiol 50238-42)和黃熱病病毒(Kreil TR，Eibl MM.1996.一氧化氮和病毒感染在體外針對黃熱病病毒沒有抗病毒活性，以及在體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中對發(fā)病機(jī)理貢獻(xiàn)的證據(jù)，Virology 219304-306)的致命影響。但是，這些以前使用的一氧化氮合成抑制劑由于它們的毒性(肝功衰竭、抽搐和死亡)在動(dòng)物和人類中受到限制。因此，尚不清楚從培養(yǎng)基中消除精氨酸(一種明顯的消除一氧化氮產(chǎn)生的方法)導(dǎo)致對病毒復(fù)制的抑制是否是病毒復(fù)制抑制發(fā)生時(shí)的唯一機(jī)制。一氧化氮和病毒感染的這種刺激/抑制的二重性也在其它的病理事件中用一氧化氮觀察到了(Colasanti M，Suzuki H.2000.一氧化氮的二重性，Trends Pharm Sci21249-252)。因此一氧化氮的抑制不應(yīng)該被期望能夠取消感染事件所有隨之而來的事件(Bogdan C.2001.一氧化氮和免疫系統(tǒng)，NatureImmunology 2907-916)。但是，與過去使用的一氧化氮合成抑制劑不同，ADI-PEG 20在抑制一氧化氮的產(chǎn)生中表現(xiàn)得安全和有效，可以被用來幫助闡述這種生物介質(zhì)在防止病毒感染中的作用。
定義在本公開中，可以使用下面的縮寫PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脫亞胺酶；SS，琥珀酰亞胺基琥珀酸酯；SSA，琥珀酰亞胺基琥珀酰胺；SPA，琥珀酰亞胺基丙酸酯；和NHS，N-羥基-琥珀酰亞胺。
用聚乙二醇共價(jià)修飾的ADI(帶有或不帶連接基團(tuán))在下文中可以被稱為“ADI-PEG”或“PEG-ADI”。
“聚乙二醇”或“PEG”是指環(huán)氧乙烷和水的縮合聚合物的混合物，以支鏈和直鏈的形式，用通式H(OCH2CH2)nOH代表，其中n至少為4?！熬垡叶肌被颉癙EG”與數(shù)字下綴結(jié)合使用時(shí)是指它的大約平均分子量。例如PEG-5000(PEG5)是指具有平均分子量大約5000的聚乙二醇分子；PEG-12000(PEG12)是指具有平均分子量大約12000的聚乙二醇分子；PEG-20000(PEG20)是指具有平均分子量大約20000的聚乙二醇分子。
本文使用的術(shù)語“個(gè)體”是指動(dòng)物，在有些實(shí)施方案中是哺乳動(dòng)物。在有些實(shí)施方案中是人。術(shù)語“個(gè)體”包括從這樣的動(dòng)物中獲得的生物樣品。
本文使用的術(shù)語“病毒疾病”是指由病毒引起的疾病和紊亂。病毒疾病包括但不限于感染動(dòng)物或哺乳動(dòng)物包括人的病毒。人類病毒包括來自下列病毒科的病毒痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、細(xì)小病毒、嗜肝DNA病毒、小核糖核酸病毒、杯狀病毒、星狀病毒、披膜病毒、黃熱病病毒、冠狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、棒狀病毒、線狀病毒、Borna、呼腸弧病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。
可以通過本發(fā)明治療的病毒和相關(guān)疾病的例子包括但不限于天花病毒(天花)；皰疹病毒例如單純皰疹病毒(唇皰疹)、水痘帶狀皰疹(水痘，帶狀皰疹)、Epstein-Barr病毒(單核血球增多癥，伯基特氏淋巴瘤)、KSHV(卡波濟(jì)氏肉瘤)和細(xì)胞肥大病毒(失明)；腺病毒；肝炎(A/B/C)；脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、風(fēng)疹、黃熱病、西尼羅河病毒、登革熱、馬腦脊髓炎、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和煙草花葉病毒。
在有些實(shí)施方案中病毒是下列病毒中的一種或多種HIV、流感、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹、乙型肝炎、丙型肝炎和其它的肝炎病毒株、卡波濟(jì)氏肉瘤、鼻病毒、西尼羅河病毒、天花和牛痘等等。
本文使用的“調(diào)節(jié)”意味基因表達(dá)的增加(刺激)或減小(抑制)。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，抑制是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)形式。
本文使用的術(shù)語“抑制”是指與基線相比在質(zhì)量或數(shù)量上的降低或減少。例如，就本發(fā)明而論，病毒復(fù)制的抑制是指與基線相比病毒復(fù)制的降低。在有些實(shí)施方案中，降低了大約30％、大約40％、大約50％、大約60％、大約70％、大約75％、大約80％、大約85％、大約90％、大約95％、大約99％和大約100％。本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以容易地確定病毒的復(fù)制是否已經(jīng)被抑制，以及抑制到什么程度。
本文使用的術(shù)語“大約”是指在數(shù)值的+/-20％、+/-15％、+/-10％、或+/-5％范圍內(nèi)。
本文使用的術(shù)語“生物相容性”是指一般來說對生物功能沒有傷害、不會(huì)引起任何程度的不可接受的毒性，包括引起過敏癥和疾病狀態(tài)的材料或化合物。
“循環(huán)半衰期”是指在將修飾的ADI注射到病人中后，一直到ADI的量已經(jīng)被清除到最初血清峰值水平的一半所需要的時(shí)間。循環(huán)半衰期可以在任何相關(guān)的物種中測定，包括人或小鼠。
本文使用的術(shù)語“共價(jià)鍵結(jié)合”、“鍵合”和“偶聯(lián)”可以相互交換使用，是指共價(jià)鍵連接ADI與PEG分子，既可以是直接的也可以通過連接基團(tuán)。
本文使用的術(shù)語“治療有效量”是指能夠有效地產(chǎn)生所需的治療反應(yīng)的本發(fā)明化合物的量。特定的治療有效量顯然隨著一些因素而變化，例如所治療的具體病癥、病人的身體條件、被治療的哺乳動(dòng)物或動(dòng)物的種類、治療的持續(xù)時(shí)間、同時(shí)進(jìn)行的治療(如果有的話)的性質(zhì)、以及使用的具體劑型和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。在改善肝功的情況下，術(shù)語“治療有效量”是指能夠改善肝功的與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的量。在有些實(shí)施方案中，治療有效量能夠有效改善個(gè)體的Child-Pugh等級或Mayo末期肝病(MELD)評分。在有些實(shí)施方案中，治療有效量能夠有效改善肝功，這是基于對肝功指標(biāo)的比較，包括但不限于膽紅素水平、肌酸水平和國際標(biāo)準(zhǔn)率。
本文使用的術(shù)語“抑制病毒復(fù)制的有效量”是指含有經(jīng)由連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)鍵合的ADI的化合物，給個(gè)體施用后導(dǎo)致病毒復(fù)制的水平降低，因而在個(gè)體中減少了可檢測的病毒，即病毒效價(jià)或病毒負(fù)荷減少所需要的量。為了確定抑制病毒復(fù)制的有效量，可以在用本發(fā)明的化合物進(jìn)行治療之前確定個(gè)體的病毒負(fù)荷，然后再進(jìn)行治療。病毒復(fù)制的水平可以通過任何常規(guī)方法進(jìn)行定量，包括例如在給藥化合物之前和之后對樣品中的病毒粒子的實(shí)際數(shù)量進(jìn)行定量，以及在給藥化合物之前和之后對樣品中存在的一種或多種病毒抗原的水平進(jìn)行定量。在有些實(shí)施方案中，“抑制病毒復(fù)制的有效量”是將血漿精氨酸濃度減少到大約5μM以下所需要的量。測量血漿精氨酸濃度的方法在本技術(shù)領(lǐng)域是廣為人知的。
分析病毒復(fù)制的方法也為人們提供了確定病毒抑制劑的功效的能力，對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說是熟悉的。這樣的分析方法可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。HCV已知在黑猩猩中發(fā)生，其中的感染非常類似于在人類中觀察到的。在與靈長類非常相近的樹鼯屬和免疫缺陷的小鼠中也有實(shí)驗(yàn)性感染的報(bào)道(Xie，Z.C.等，Virology，244，513(1998)；Schinazi，R.F.等，Antiviral Chem.Chemother.10，99，(1999))。
抑制病毒復(fù)制對減輕病毒感染的嚴(yán)重性或病毒感染的癥狀有貢獻(xiàn)。
本文使用的術(shù)語“預(yù)防有效量”是指有效產(chǎn)生所需的預(yù)防反應(yīng)的本發(fā)明化合物的量。特定的預(yù)防有效量顯然隨著一些因素而變化，例如具體的病毒、病人的身體條件、被治療的哺乳動(dòng)物或動(dòng)物的種類、治療的持續(xù)時(shí)間、同時(shí)進(jìn)行的治療(如果有的話)的性質(zhì)、以及使用的具體劑型和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。
本文使用的“組合療法”是指需要治療的病人施用另一種藥物結(jié)合PEG-ADI來治療疾病。組合療法可以是連續(xù)的療法，個(gè)體首先用一種或多種藥物治療，然后再用其它藥物治療，也可以兩種或多種藥物同時(shí)給藥。
本文使用的詞組“精氨酸脫療”是指在一種治療方案中使用的試劑減少、最少化或消除了病人中的精氨酸水平。精氨酸脫療通常使用ADI來進(jìn)行。精氨酸脫療和用在精氨酸脫療中的試劑在承認(rèn)的美國專利申請系列號09/023809(1998年2月13日提交)、現(xiàn)在的美國專利6183738(2001年2月6日授權(quán))和在審的美國專利申請系列號09/504280(2000年2月15日提交)中有詳細(xì)的描述，在此以其全文分別引為參考。
本文使用的術(shù)語“懷疑已接觸一種或多種病毒的個(gè)體”是指個(gè)體還沒有被診斷為一種或多種病毒陽性，但是由于最近可能將他們與病毒接觸的高?；顒?dòng)而可能已接觸一種或多種病毒。例如，懷疑已接觸HIV的個(gè)體是指已經(jīng)被一根與含有HIV的樣品或HIV感染的個(gè)體接觸過的針刺到的個(gè)體。這樣的例子包括但不限于實(shí)驗(yàn)室或研究樣品或來自病人的的血液、精液、身體分泌物等的樣品。被懷疑接觸HCV的個(gè)體包括已經(jīng)接受了未知質(zhì)量的血液輸血的個(gè)體。被輸?shù)难嚎赡苓€沒有被測試，或表明血液不含HCV的測試結(jié)果是不可信的或令人懷疑的。在有些實(shí)施方案中，懷疑被病毒感染的個(gè)體包括通過另一個(gè)個(gè)體，包括例如通過性交、與另一個(gè)個(gè)體的體液接觸、共用皮下注射針頭等，而已接觸病毒的個(gè)體。病毒所來自的個(gè)體可能已經(jīng)也可能還沒有測試病毒的存在和/或不存在。術(shù)語“懷疑已接觸一種或多種病毒的個(gè)體”還包括已經(jīng)被診斷為一種病毒陽性但同時(shí)也被至少一種其他病毒感染的個(gè)體。例如通常那些被HIV感染的個(gè)體對一種或多種類型的肝炎也是陽性的。這樣的個(gè)體可以被分類為對一種或多種病毒是“高危的”。
本文使用的術(shù)語“選擇性抑制”是指選擇性地抑制病毒的復(fù)制，在有些實(shí)施方案中是病毒mRNA水平的CC50/EC50％比率。SI大于10被視為反映了對病毒復(fù)制的選擇性抑制。
本文使用的術(shù)語“樣品”是指來自病人的生物材料。本發(fā)明分析的樣品不限于任何特定的類型。樣品以非限制性例子包括單細(xì)胞、多細(xì)胞、組織、腫瘤、生物流體、生物分子或任何前述物質(zhì)的上清液或提取物。例子包括用于活檢而取出的組織、在切除時(shí)取出的組織、血液、尿液、淋巴組織、淋巴液、腦脊液、粘液和糞便樣品。所用的樣品基于分析方式，檢測方法，被分析的腫瘤、組織、細(xì)胞或提取物的性質(zhì)而變化。制備樣品的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是廣為人知的，可以進(jìn)行容易的改造以獲得與使用的方法相容的樣品。
ADI精氨酸脫亞胺酶催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，可以被用來消除精氨酸。在本發(fā)明中，精氨酸脫亞胺酶基因可以衍生、克隆或生產(chǎn)自任何來源，包括例如微生物、重組生物技術(shù)或它們的任何組合。精氨酸脫亞胺酶可以從支原體(Mycoplasma)屬的微生物克隆。在有些實(shí)施方案中，精氨酸脫亞胺酶從精氨酸支原體、人形支原體(Mycoplasmahominus)、關(guān)節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritides)或它們的任何組合克隆。在有些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的精氨酸脫亞胺酶可以具有SEQ IDNOs1-10和13-21中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。
天然的精氨酸脫亞胺酶可以在微生物中發(fā)現(xiàn)，具有抗原性，在病人中可以快速從循環(huán)系統(tǒng)中清除。這些問題可以通過用聚乙二醇(PEG)共價(jià)修飾精氨酸脫亞胺酶而克服。用聚乙二醇共價(jià)修飾的精氨酸脫亞胺酶(帶有或不帶連接基團(tuán))在下文中稱為“ADI-PEG”。與天然的精氨酸脫亞胺酶相比，ADI-PEG保留了它的大部分酶活性，具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)低的抗原性和更長的循環(huán)半衰期，在腫瘤的治療中更為有效。
伴隨著從生物體中分離精氨酸脫亞胺酶出現(xiàn)了一些缺點(diǎn)。盡管在體外能夠有效殺死腫瘤細(xì)胞，從亞臭假單胞菌(Pseudomonas putida)分離的精氨酸脫亞胺酶在體內(nèi)不能表現(xiàn)出效能，這是因?yàn)樗谥行詐H下酶活力很低，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中被快速地從循環(huán)中清除。來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶(SEQ ID NO5)已經(jīng)被描述，例如Takaku H，Takase M，Abe S，Hayashi H和Miyazaki K.(1992).從精氨酸支原體純化的精氨酸脫亞胺酶的體內(nèi)抗腫瘤活性，Int.J.Cancer 51244-249，以及美國專利No.5474928，其內(nèi)容在此以其全文引為參考。與這樣的異源蛋白在治療中的使用相關(guān)的問題是它的抗原性。Takaku，H，Misawa，S，Hayashi H和Miyazaki K.(1993)，來自精氨酸支原體的抗腫瘤酶精氨酸脫亞胺酶的聚乙二醇化學(xué)修飾，Jpn.J.Cancer Res.841195-1200)描述了利用聚乙二醇經(jīng)由氰尿酰氯連接基團(tuán)對來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾。修飾后的蛋白在代謝時(shí)是有毒的，因?yàn)閺那枘蝓Ｂ冗B接基團(tuán)中釋放了氰化物。
通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶也提供了某些缺點(diǎn)。例如在大腸桿菌(Escherichia coli)中生產(chǎn)的精氨酸脫亞胺酶沒有酶活性，因此必須先變性然后適當(dāng)?shù)貜?fù)性才使它變得有酶活性。常用的對大腸桿菌生產(chǎn)的精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行復(fù)性的方法是分離無活性的酶，在鹽酸胍中將其溶解，然后通過快速稀釋至低離子強(qiáng)度的緩沖液而使其復(fù)性。最后一步需要非常大量的緩沖液，因而使得精氨酸脫亞胺酶的生產(chǎn)既費(fèi)錢也費(fèi)時(shí)。但是，重組技術(shù)也有一些優(yōu)點(diǎn)，例如更利于發(fā)酵的微生物可以用做宿主。此外，這些發(fā)酵的宿主一般來說具有更低的致病性，可以獲得大量的精氨酸脫亞胺酶。已經(jīng)顯示大腸桿菌可以生產(chǎn)大量的支原體精氨酸脫亞胺酶。
精氨酸脫亞胺酶的化學(xué)和遺傳修飾可能影響它的生物學(xué)活性。例如，已經(jīng)顯示精氨酸脫亞胺酶通常具有抗原性，在病人中被快速地從循環(huán)中清除。但是，也已經(jīng)顯示帶有聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶制劑減少了抗原性，增加了酶的循環(huán)半衰期(Abuchowski等，Cancer Biochem，Biophys.7175-186(1984)；Abuchowski等，J.Biol.Chem.2523582-3586(1977))。特別是精氨酸脫亞胺酶可以被聚乙二醇共價(jià)修飾。用聚乙二醇共價(jià)修飾的精氨酸脫亞胺酶(帶有或不帶連接基團(tuán))在下文中稱為“ADI-PEG”。在美國專利申請系列號09/023809中，Clark描述了用聚乙二醇對來自人形支原體(SEQ ID NO1)、精氨酸支原體(SEQ IDNO5)和關(guān)節(jié)炎支原體(SEQ ID NO7)的精氨酸脫亞胺酶的改良的修飾，其內(nèi)容在此以其全文引為參考。與天然的精氨酸脫亞胺酶相比，ADI-PEG保留了它的大部分酶活性，具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)低的抗原性和更長的循環(huán)半衰期，在腫瘤的治療中更為有效。為了本發(fā)明目的，用聚乙二醇對任何精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行的修飾可以被稱為PEG化。
已經(jīng)了解到來自其它生物體的精氨酸脫亞胺酶可能也具有相應(yīng)于人形支原體的精氨酸脫亞胺酶的112位的PEG化位點(diǎn)。例如來自化膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)的精氨酸脫亞胺酶在104位具有賴氨酸，來自肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的精氨酸脫亞胺酶在106位具有賴氨酸，以及來自Qiardia intestinalis的精氨酸脫亞胺酶在114位具有賴氨酸。此外，來自某些生物體的精氨酸脫亞胺酶可能在相應(yīng)于人形支原體的精氨酸脫亞胺酶的112位的同樣的普遍位置具有賴氨酸。來自這些生物體的精氨酸脫亞胺酶的賴氨酸位置如下所示表1來自不同生物體的精氨酸脫亞胺酶的PEG化位點(diǎn)
現(xiàn)在已經(jīng)相信將聚乙二醇連接到這些賴氨酸或其組合上可能使酶失活?，F(xiàn)在已經(jīng)相信在這些賴氨酸上的氨基酸取代可能導(dǎo)致蛋白在PEG化后失去少量的酶活性。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中提供了對精氨酸脫亞胺酶肽鏈的某些氨基酸取代。這些氨基酸取代提供了在PEG化后失去少量活性的修飾的精氨酸脫亞胺酶，即經(jīng)過PEG化后，PEG化后修飾的精氨酸脫亞胺酶中酶活性的減少少于PEG化后未修飾的精氨酸脫亞胺酶中酶活性的減少。通過消除酶的催化區(qū)域處或其附近的PEG化位點(diǎn)，可以獲得最適的PEG化，不象傳統(tǒng)那樣損失活性。正如上面討論的那樣，來自某些生物體的精氨酸脫亞胺酶其PEG化位點(diǎn)位于肽鏈的不同位置。盡管對本發(fā)明沒有限制，現(xiàn)在已經(jīng)相信精氨酸脫亞胺酶可能在酶的催化區(qū)域處或其附近具有賴氨酸，這些位點(diǎn)的PEG化可以使酶失去活性。通過消除至少一個(gè)這樣的PEG化位點(diǎn)，可以進(jìn)行PEG化并保留更多的酶活性。根據(jù)本發(fā)明，在有些實(shí)施方案中賴氨酸被谷氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或其組合取代。在有些實(shí)施方案中賴氨酸被谷氨酸取代。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，修飾的人形支原體的精氨酸脫亞胺酶在Lys112、Lys374、Lys405、Lys408或其組合或其分組合上有氨基酸取代。在有些實(shí)施方案中，修飾的人形支原體的精氨酸脫亞胺酶的氨基酸取代為Lys112到Glu112、Lys374到Glu374、Lys405到Glu405、Lys408到Glu408或它們的組合。在有些實(shí)施方案中，修飾的人形支原體的精氨酸脫亞胺酶112位的賴氨酸被谷氨酸取代(SEQ IDNO2)。
因此本發(fā)明在精氨酸脫亞胺酶肽鏈上提供了某些氨基酸取代。這樣的氨基酸取代可以消除精氨酸脫亞胺酶肽鏈中有問題的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。這樣的氨基酸取代改進(jìn)了修飾的精氨酸脫亞胺酶的復(fù)性。這些氨基酸取代使得使用較少量的緩沖液快速復(fù)性修飾的精氨酸脫亞胺酶成為可能。這些氨基酸取代也可以增加復(fù)性的修飾的精氨酸脫亞胺酶的產(chǎn)量。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，修飾的精氨酸脫亞胺酶在Pro210有單一的氨基酸取代。正如上面提到的，人形支原體的精氨酸脫亞胺酶在210位有氨基酸脯氨酸。盡管對本發(fā)明沒有限制，現(xiàn)在已經(jīng)相信210位氨基酸脯氨酸的存在導(dǎo)致正常肽鏈中的彎曲或扭折，增加了精氨酸脫亞胺酶復(fù)性(即重新折疊)的難度。取代210位的脯氨酸使得使用較少量的緩沖液快速復(fù)性修飾的精氨酸脫亞胺酶成為可能。取代210位的脯氨酸也可以增加復(fù)性的修飾的精氨酸脫亞胺酶的產(chǎn)量。在有些實(shí)施方案中，210位的脯氨酸被絲氨酸取代(SEQ ID NO3)。應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，210位的其它取代也可以進(jìn)行。取代的例子包括Pro210到Thr210、Pro210到Arg210、Pro210到Asn210、Pro210到Gln210或Pro210到Met210。通過消除這些與野生型精氨酸脫亞胺酶210位的氨基酸相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以使酶獲得適當(dāng)?shù)闹匦抡郫B。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，修飾的精氨酸脫亞胺酶具有多個(gè)氨基酸取代。修飾的精氨酸脫亞胺酶可以具有至少一個(gè)氨基酸取代，它消除了位于或臨近酶的催化區(qū)域的PEG化位點(diǎn)。修飾的精氨酸脫亞胺酶也可以具有至少一個(gè)氨基酸取代，它消除了那些干擾酶的復(fù)性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。因此氨基酸取代為本發(fā)明提供了修飾的精氨酸脫亞胺酶。氨基酸取代使得無需損失酶活性而對修飾的精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行PEG化。氨基酸取代使得使用較少量的緩沖液快速復(fù)性修飾的精氨酸脫亞胺酶成為可能。氨基酸取代也可以增加復(fù)性的修飾的精氨酸脫亞胺酶的產(chǎn)量。在有些實(shí)施方案中，修飾的人形支原體的精氨酸脫亞胺酶包括用絲氨酸取代210位的脯氨酸和用谷氨酸取代112位的賴氨酸(SEQID NO4)。但是，正如上面討論的，應(yīng)該理解修飾的精氨酸脫亞胺酶可以包括其他取代。在有些實(shí)施方案中，可以在野生型精氨酸脫亞胺酶的112和/或210位進(jìn)行保守的氨基酸取代。
修飾的精氨酸脫亞胺酶在JM101細(xì)胞中的表達(dá)如前面Takaku等，同上的描述。修飾的精氨酸脫亞胺酶包括112位的谷氨酸和210位的絲氨酸。在有些實(shí)施方案中，修飾的人形支原體的精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列是SEQ ID NO4的序列。
在有些實(shí)施方案中精氨酸脫亞胺酶是來自人形支原體、肺炎支原體(Mycoplasma pneumonias)、精氨酸支原體、Qiardia intestinalis、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、Borrelia burgdorferi、Borrelia afzellii、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniaes)、清酒乳芽孢桿菌(Lactobacillus sake)或Qiardia intestinalis的精氨酸脫亞胺酶。
在有些實(shí)施方案中精氨酸脫亞胺酶是來自人形支原體的精氨酸脫亞胺酶(SEQ ID NO1)。在有些實(shí)施方案中，精氨酸脫亞胺酶與SEQ IDNO1相比取代或缺失了至少一個(gè)脯氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，至少一個(gè)脯氨酸殘基的取代或缺失包括取代或缺失位于或相應(yīng)于SEQID NO1的210位殘基的脯氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)脯氨酸殘基包括用絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甲硫氨酸取代或缺失位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的210位殘基的脯氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)脯氨酸殘基包括用絲氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的210位殘基的脯氨酸殘基。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中精氨酸脫亞胺酶被修飾，含有至少一個(gè)氨基酸取代或缺失，其中修飾的精氨酸脫亞胺酶與SEQ ID NO1相比在催化區(qū)域處或其附近的PEG化位點(diǎn)數(shù)被減少了。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)賴氨酸殘基包括取代或缺失位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的112、374、405或408位殘基的至少一個(gè)賴氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)賴氨酸殘基包括用谷氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQID NO1的112、374、405或408位殘基的至少一個(gè)賴氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)賴氨酸殘基包括用谷氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQ IDNO1的112位殘基的賴氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)賴氨酸殘基包括用谷氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的112位殘基的賴氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，修飾的精氨酸脫亞胺酶還包括取代或缺失至少一個(gè)脯氨酸殘基。
在有些實(shí)施方案中，至少一個(gè)脯氨酸殘基的取代或缺失包括用絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甲硫氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的210位殘基的脯氨酸殘基。
在有些實(shí)施方案中，精氨酸脫亞胺酶含有修飾后與SEQ ID NO1相比在催化區(qū)域或其附近失去至少一個(gè)PEG化位點(diǎn)的精氨酸脫亞胺酶，其中該修飾的精氨酸脫亞胺酶位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的112、374、405或408位殘基含有至少一個(gè)氨基酸取代或缺失。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)氨基酸包括用谷氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的112位殘基的賴氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)氨基酸還包括取代或缺失至少一個(gè)脯氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，取代或缺失至少一個(gè)脯氨酸殘基包括取代或缺失位于或相應(yīng)于SEQ IDNO1的210位殘基的脯氨酸殘基。在有些實(shí)施方案中，至少一個(gè)脯氨酸殘基的取代或缺失包括用絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甲硫氨酸取代位于或相應(yīng)于SEQ ID NO1的210位殘基的脯氨酸殘基。
在有些實(shí)施方案中，來自人形支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO1的112位賴氨酸殘基(SEQ ID NO2)。在有些實(shí)施方案中，來自人形支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用絲氨酸取代SEQ ID NO1的210位脯氨酸殘基(SEQ ID NO3)。在有些實(shí)施方案中，來自人形支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO1的112位賴氨酸殘基和用絲氨酸取代SEQ ID NO1的210位脯氨酸殘基(SEQ ID NO4)。在有些實(shí)施方案中，來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO5的111位賴氨酸殘基(SEQ IDNO6)。在有些實(shí)施方案中，來自關(guān)節(jié)炎支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO7的111位和112位賴氨酸殘基(SEQ IDNO8)。在有些實(shí)施方案中，來自關(guān)節(jié)炎支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO7的111位賴氨酸殘基(SEQ ID NO9)。在有些實(shí)施方案中，來自關(guān)節(jié)炎支原體的精氨酸脫亞胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO7的112位賴氨酸殘基(SEQ ID NO10)。
這樣的修飾和/或取代以及核苷酸和多肽序列被描述在美國專利No.6183738(2001年2月6日授權(quán))和共同未決的美國專利申請系列號09/564559(2000年5月4日提交)中，在此以其全文分別引為參考。
聚乙二醇有許多聚乙二醇可以獲得，它們在分子量和連接基團(tuán)上有所不同。這些PEG對蛋白的抗原性、免疫原性和循環(huán)半衰期的影響可發(fā)生變化(Zalipsky，S.和Lee，C.聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，第347-370頁，Plenum出版社，紐約，1992年；Monfardini，C.等，Bioconjugate Chem，6，62-69，1995；Delgado C，F(xiàn)rancis GE，F(xiàn)isher D，PEG結(jié)合的蛋白的使用和性質(zhì)，Crit.Rev.Ther，Drug Carrier Sys.，9249-304，1992)。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，每個(gè)聚乙二醇分子的平均分子量為大約10000到大約50000；從大約12000到大約40000，從大約15000到大約30000；以及大約20000。一般來說，分子量30000或以上的聚乙二醇難以溶解，制成的產(chǎn)品的產(chǎn)量大大降低。
聚乙二醇可以是支鏈的也可以是直鏈的。在有些實(shí)施方案中聚乙二醇是直鏈。一般來說增加聚乙二醇的分子量傾向于減少ADI的免疫原性。具有本發(fā)明所描述的分子量的聚乙二醇可以被用來結(jié)合ADI以及生物相容的連接基團(tuán)，以治療病毒疾病。
PEG化ADI可以經(jīng)由生物相容的連接基團(tuán)與PEG共價(jià)鍵合，使用的方法在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的，例如Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；Zalipsky，S.和Lee，C.聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，J.M.Harris主編，Plenum出版社，紐約，第21章，1992年，其內(nèi)容在此以其全文引為參考。
用來共價(jià)鍵合PEG和ADI的連接基團(tuán)可以是任何相容的連接基團(tuán)。在有些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)是生物相容的連接基團(tuán)。正如上面所討論的，“生物相容”表明化合物或基團(tuán)是無毒性的，可以在體外或體內(nèi)使用而不會(huì)引起損傷、不適、疾病或死亡。PEG可以經(jīng)由例如醚鍵、酯鍵、硫氫鍵或酰胺鍵與連接基團(tuán)鍵合。合適的連接基團(tuán)包括例如酯基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸基、羰基、羥基、糖、琥珀酰亞胺基(包括例如琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基羧基甲酸酯(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))、環(huán)氧基、氧基羰基咪唑基(包括例如羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、trysylate基、醛基、異氰酸基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、組氨酸基或伯胺。在有些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)是酯基或琥珀酰亞胺基。在有些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)是SS、SPA、SCM、SSA或NHS。
在本發(fā)明中，具體的連接基團(tuán)不表現(xiàn)出影響PEG-ADI的循環(huán)半衰期或其酶的比活性。但是，如果使用了連接基團(tuán)，在有些實(shí)施方案中重要的是使用生物相容的連接基團(tuán)。與蛋白相連的PEG既可以是在SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG時(shí)的單鏈，也可以是在PEG2-NHS時(shí)的支鏈PEG。
此外，ADI可以通過氨基、硫氫基、羥基或羰基直接與PEG偶聯(lián)(即不帶有連接基團(tuán))。在有些實(shí)施方案中，PEG偶聯(lián)到ADI的賴氨酸殘基上。
ADI-PEGADI上連接PEG增加了ADI的循環(huán)半衰期。ADI上的PEG分子數(shù)量表現(xiàn)出與酶的循環(huán)半衰期相關(guān)，而保留的酶活力的量表現(xiàn)出與所用的PEG的平均分子量相關(guān)。增加ADI上的PEG單位的數(shù)量降低了酶的酶活。此外，已經(jīng)知道有些PEG制劑難以生產(chǎn)，生成的產(chǎn)物產(chǎn)量相對低。因此，為了獲得有效的產(chǎn)物，在循環(huán)半衰期、抗原性、生產(chǎn)效率和酶活之間需要一個(gè)平衡。
一般來說，PEG被連接到ADI的伯胺上。聚乙二醇在精氨酸脫亞胺酶上結(jié)合位點(diǎn)的選擇由蛋白活性結(jié)構(gòu)域中每個(gè)位點(diǎn)的功能所決定，正如專業(yè)技術(shù)人員公知的。PEG可以被連接到精氨酸脫亞胺酶的一級胺上而基本上不損失酶活。例如，從精氨酸支原體、關(guān)節(jié)炎支原體和人形支原體克隆的ADI具有大約17個(gè)可以被這個(gè)步驟修飾的賴氨酸。換句話說，這17個(gè)賴氨酸都是ADI經(jīng)由生物相容的連接基團(tuán)，例如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS與PEG連接的可能位點(diǎn)。PEG也可以連接到ADI上的其它位點(diǎn)，這對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容是顯然的。
ADI上可以共價(jià)鍵合從1到大約30個(gè)PEG分子。在有些實(shí)施方案中，ADI用大約7到大約15個(gè)PEG分子、從大約9到大約12個(gè)PEG分子來修飾。換句話說，精氨酸脫亞胺酶中大約30％到大約70％的一級氨基被PEG修飾，精氨酸脫亞胺酶中大約40％到大約60％、大約45％到大約55％以及大約50％的一級氨基被PEG修飾。在有些實(shí)施方案中，當(dāng)PEG與ADI的末端共價(jià)鍵合時(shí)，只有一個(gè)PEG分子被利用。增加ADI上PEG單位的數(shù)量增加了酶的循環(huán)半衰期。但是增加ADI上PEG單位的數(shù)量降低了酶的比活性。因此，在有些實(shí)施方案中需要在這二者之間達(dá)到平衡，這對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容是顯然的。
在本發(fā)明中，在有些實(shí)施方案中連接基團(tuán)經(jīng)由馬來酰亞胺基與精氨酸脫亞胺酶的伯胺結(jié)合。一旦與精氨酸脫亞胺酶偶聯(lián)，SS-PEG在PEG后有酯鍵，可以賦予這個(gè)位點(diǎn)對血清酯酶的敏感性，可以在體內(nèi)從ADI上釋放出PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS沒有酯鍵，因此它們對血清酯酶不敏感。
用于本發(fā)明的某些連接基團(tuán)的結(jié)構(gòu)式如下。

治療方法在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制個(gè)體中病毒復(fù)制的方法，包括給所述個(gè)體施用治療或預(yù)防性有效量的包含經(jīng)由連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)鍵合的ADI的化合物，其中各個(gè)聚乙二醇分子的平均分子量為大約10,000到大約30,000。在一些實(shí)施方案中，ADI修飾有聚乙二醇分子，各個(gè)分子的平均分子量為大約20,000。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基，酰胺基，酰亞胺基，氨基甲酸酯基，酯基，環(huán)氧基，羧基，羥基，糖，酪氨酸基，半胱氨酸基，組氨酸基及其組合。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)為琥珀酰亞胺基琥珀酸酯。在一些實(shí)施方案中，有大約7到大約15個(gè)聚乙二醇分子鍵合于精氨酸脫亞胺酶。在一些實(shí)施方案中，有大約9到大約12個(gè)聚乙二醇分子鍵合于精氨酸脫亞胺酶。在一些實(shí)施方案中，精氨酸脫亞胺酶衍生自支原體屬的微生物。在一些實(shí)施方案中，精氨酸脫亞胺酶衍生自精氨酸支原體，人形支原體，關(guān)節(jié)炎支原體及其組合。在一些實(shí)施方案中，病毒為HCV。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括下列步驟在給藥精氨酸脫亞胺酶之前，同時(shí)或之后給藥治療有效量的其他抗病毒劑。
本發(fā)明化合物之一的治療有效量為有效抑制病毒復(fù)制的量。一般而言，治療起始時(shí)用小劑量，隨后以小的增量增加，直到在環(huán)境下實(shí)現(xiàn)最佳效果。通常，本發(fā)明化合物的治療劑量為大約1到大約200mg/kg，從每周兩次到每兩周大約一次。例如，劑量可為大約1mg/kg，每周一次，以2ml靜脈內(nèi)注射，到大約20mg/kg，每3天一次?；衔镆砸粋€(gè)劑量在全療程中連續(xù)或間歇給藥。ADI-PEG的給藥可每天幾次，每天一次，每周一次或每兩周一次。
在一些實(shí)施方案中，ADI-PEG給藥的周劑量為至少大約40IU/m2，至少大約80IU/m2，至少大約160IU/m2，或至少大約200IU/m2。在一些實(shí)施方案中，給藥的劑量使精氨酸的血漿水平降低至小于大約10μM，5μM，1μM，或100nM。在一些實(shí)施方案中，ADI-PEG20以周劑量為大約160IU/m2給藥，導(dǎo)致患者血漿水平小于大約5μM。
本發(fā)明提供抑制一種或多種病毒在個(gè)體中復(fù)制的方法，包括給所述個(gè)體施用治療或預(yù)防有效量的與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶。在一些實(shí)施方案中，病毒為人類病毒。在一些實(shí)施方案中，病毒為HCV。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體感染有兩種或多種不同的病毒。在一些實(shí)施方案中，兩種或多種病毒為HIV和HCV。在一些實(shí)施方案中，在給藥時(shí)或給藥之前感染病毒的存在和/或身份是未知的。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括下列步驟在給藥精氨酸脫亞胺酶之前，同時(shí)或之后，給藥治療有效量的其他抗病毒劑。
本發(fā)明還提供治療懷疑已接觸一種或多種病毒的個(gè)體的方法，包括給所述個(gè)體施用治療或預(yù)防有效量的與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶。如上所述，將一些未被診斷為感染有一種或多種病毒的個(gè)體置于可能會(huì)接觸病毒的環(huán)境中。如上所述，懷疑接觸一種或多種病毒的個(gè)體的治療也包括給藥其他治療劑。預(yù)防性療程可結(jié)合周期性監(jiān)控病毒感染的指示進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明治療開始之后，個(gè)體對一種或多種病毒被診斷為陽性。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制病毒在個(gè)體中復(fù)制的方法，所述個(gè)體處于一種或多種病毒的風(fēng)險(xiǎn)之中。所述方法包括給所述個(gè)體施用一定量的含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物，以有效抑制病毒復(fù)制。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制病毒在個(gè)體中復(fù)制的方法，所述個(gè)體已被鑒定為患有病毒感染。所述方法包括給所述個(gè)體施用一定量的含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物，以有效抑制病毒復(fù)制。
在一些實(shí)施方案中，含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物在濃度小于0.1mM時(shí)，就能使得在測量病毒復(fù)制的體外分析中50％以上細(xì)胞的病毒復(fù)制有效抑制至少50％。在一些實(shí)施方案中，含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物在濃度小于0.05mM時(shí)，就能使得在測量病毒復(fù)制的體外分析中50％以上細(xì)胞的病毒復(fù)制有效抑制至少50％。在一些實(shí)施方案中，含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物在濃度小于0.01mM時(shí)，就能使得在測量病毒復(fù)制的體外分析中50％以上細(xì)胞的病毒復(fù)制有效抑制至少50％。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供同時(shí)治療腫瘤和抑制一種或多種病毒在個(gè)體中復(fù)制的方法。所述方法包括給所述個(gè)體給藥治療或預(yù)防有效量的經(jīng)由連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)鍵合的精氨酸脫亞胺酶。在一些實(shí)施方案中，腫瘤選自黑素瘤，肉瘤和肝癌。在一些實(shí)施方案中，腫瘤為肝癌，而病毒為HCV。在一些實(shí)施方案中，腫瘤的存在和/或身份在治療時(shí)是未知的。在一些實(shí)施方案中，病毒的存在和/或身份在治療時(shí)是未知的。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在給藥精氨酸脫亞胺酶之前，同時(shí)或之后，給藥治療有效量的其他抗病毒劑。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)個(gè)體中一氧化氮水平的方法，包括給所述個(gè)體給藥治療或預(yù)防有效量的與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)是抑制一氧化氮水平。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在給藥精氨酸脫亞胺酶之前，同時(shí)或之后，給藥治療或預(yù)防有效量的其他抗病毒劑。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體已被鑒定為感染有一種或多種病毒。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定病毒復(fù)制對調(diào)節(jié)精氨酸水平的靈敏度的方法，包括將樣品與包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物接觸，以及測量病毒RNA的水平或病毒RNA的產(chǎn)物。測量病毒RNA的水平或其產(chǎn)物的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選擇性抑制病毒在感染有一種或多種病毒的個(gè)體中復(fù)制的方法。所述方法包括給所述個(gè)體給藥治療或預(yù)防有效量的包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物。在一些實(shí)施方案中，病毒為HCV。在一些實(shí)施方案中，SI大于10，大于15，大于20，或大于25。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改善個(gè)體肝功的方法，包括給所述個(gè)體給藥治療或預(yù)防有效量的包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定肝功的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，一種或多種指標(biāo)的相對數(shù)量在無癥患者和患有肝病或紊亂的病人之間進(jìn)行比較。
在一些實(shí)施方案中，肝功的評價(jià)方法采用Child-Pugh等級或mayo末期肝病(MELD)評分。肝功分級的Child-Pugh等級利用若干因素來預(yù)測肝病的死亡率。在Child-Pugh等級中涉及的因素包括膽紅素水平，肌酸水平，國際標(biāo)準(zhǔn)率(INR，也稱為凝血酶原時(shí)間(血液凝結(jié)能力的量度))，腹水的存在，以及腦病的等級。級別分配給肝功異常增加的水平；級別“A”反映Child-Pugh評分為5-6點(diǎn)，并且顯示肝異常的最低水平。級別“B”反映Child-Pugh評分為7-9點(diǎn)，并且顯示肝異常的中間水平。級別“C”反映Child-Pugh評分為10-15點(diǎn)，并且顯示肝異常的最高水平。肝功分級的MELD評分涉及膽紅素水平，肌酸水平以及國際標(biāo)準(zhǔn)化比。
在一些實(shí)施方法中，在給藥與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶之前，個(gè)體肝功為Child-Pugh水平A，水平B，或水平C。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定個(gè)體可被精氨酸脫療的方法，所述個(gè)體已知患有一種或多種病毒感染。所述方法包括從個(gè)體中獲得病毒樣品，以及在適于病毒復(fù)制的條件下，比較病毒在存在和缺乏包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物的樣品中的復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，在與ADI-PEG接觸的樣品中的病毒復(fù)制抑制至少40％，至少50％，或至少80％，是個(gè)體作為精氨酸脫療的候選對象的指示；而通過ADI-PEG抑制病毒復(fù)制小于40％，小于30％，或小于20％，是個(gè)體不作為精氨酸脫療的候選對象的指示。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療個(gè)體中一種或多種病毒感染的方法。所述方法包括確定個(gè)體是否是如上所述的精氨酸脫療的候選對象，以及如果個(gè)體是精氨酸脫療的候選對象，則用精氨酸脫療治療個(gè)體，而如果個(gè)體不是精氨酸脫療的候選對象，則用常規(guī)抗病毒處理治療個(gè)體。
確定給藥的最有效途徑和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí)施方案中，采用每周兩次服藥，持續(xù)至少幾周。通常，抗病毒化合物會(huì)給藥延長的時(shí)間段，并且可給藥個(gè)體一生。確定給藥的最有效途徑和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？蓪?shí)施單次或多次給藥，一個(gè)劑量水平和模式由醫(yī)生選擇。
當(dāng)然，給藥劑量將隨公知因素而變，這些因素諸如，特定藥劑的藥效特征及其給藥方式和途徑；個(gè)體的年齡，健康狀況和/或體重；癥狀的性質(zhì)和程度；同時(shí)治療的種類；治療頻率；個(gè)體所顯現(xiàn)的癥狀，以及所需的效果。
在大多數(shù)病毒感染的情形下，對抗病毒治療反應(yīng)的癥狀或標(biāo)準(zhǔn)居于病毒復(fù)制水平的中心。用于病毒循環(huán)其中的RNA水平和變化的測試是標(biāo)準(zhǔn)的，并可應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物，包括人。在人類患者中，對肝活性進(jìn)行測試。一個(gè)示例性測試為ALT(血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶)測試。ALT主要在肝臟中發(fā)現(xiàn)，但在心臟和其他組織中也存在，只是含量較小，其在診斷肝功中是有用的。成人正常范圍為0到大約48U/L，成人最適讀數(shù)為大約24U/L。這些標(biāo)準(zhǔn)中的一種或多種改善預(yù)示著有效量或治療。
化合物可與合適的藥物稀釋劑，填充劑，賦形劑或載體(在此統(tǒng)稱為可藥用載體)混合給藥，可藥用載體的選擇根據(jù)給藥所需的形式以及與常規(guī)藥物實(shí)踐相一致。例如，在一些實(shí)施方案中，ADI-PEG可與磷酸鹽緩沖液或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何適當(dāng)溶液混合后再注射。如果需要，ADI-PEG劑型可以固體(冷干物)或液體給藥。
本發(fā)明的組合物根據(jù)待用給藥方式加以配制。在藥物組合物為可注射的情形下，它們是無菌，無熱原和無顆粒的。在一些實(shí)施方案中，組合物為等滲制劑。在一些實(shí)施方案中，等滲性添加劑包括氯化鈉，葡萄糖，甘露醇，山梨醇和乳糖中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，組合物以諸如磷酸鹽緩沖液的等滲溶液提供。組合物的穩(wěn)定劑在一些實(shí)施方案中包括明膠和白蛋白。
本發(fā)明還提供治療個(gè)體廣譜遺傳上多種多樣的病毒的方法，包括該所述個(gè)體施用治療有效量的包含經(jīng)由連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)鍵合的ADI的化合物。
組合療法本發(fā)明的化合物可另與其他抗病毒化合物組合提供組合療法。任何公知的抗病毒劑可與本發(fā)明的組合物組合，只要該組合不會(huì)消除化合物ADI-PEG的抗病毒活性。在HIV情形下，ADI-PEG與AZT，TC-3或蛋白酶抑制劑的組合療法比任意藥劑單個(gè)都更有效。在肝炎情形下，ADI-PEG與阿昔洛韋(cyclovir)，泛昔洛韋(famciclovir)或伐西洛韋(valacyclovir)，利巴韋林(ribavirin)，干擾素或β球蛋白中的一種或多種組合作為組合療法給藥。對皰疹而言，重組α干擾素可與ADI-PEG用作組合療法。
適用于組合療法的其他抗病毒劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且包括但不限于下列抗病毒劑中的一種或多種AZT(齊多夫定(zidovudine)，Retrovir)，ddI(去羥肌苷(didanosine)，Videx)，3TC(拉米夫定(lamivudine)，Epivir)，d4T(司他夫定(stavudine)，Zerit)，阿巴卡韋(abacavir)(Ziagen)，ddC(扎西他濱(zalcitabine)，Hivid)，內(nèi)維拉平(nevirapine)(Viramune)，地拉韋定(Delavirdine)(Rescriptor)，茚地那韋(indinavir)(Crixivan)，利托那韋(ritonavir)(Norvir)，奈非那韋(nelfinavir)(Viracept)，沙奎那維(saquinavir)，洛匹那韋/利托那韋(lopinavir/ritonavir)(Kaletra)，安普那韋(Amprenavir)(Agenerase)，阿扎那韋(Atazanavir)，替拉那韋(tipranavir)，融合抑制劑T-20，白介素-2，羥基脲，AR177(Zintevir)，福米韋生(fomivirsen)鈉(Vitravene)，GEM132，GEM 91，GEM 92，AMD 3100，正二十二烷醇(1-二十二烷醇)，PR02000，T-1249，T-20，阿比朵爾(arbidol)，SP-303(Virend)，金絲桃素(hypericin)(VIMRxyn)，MDL 28574，SC-48334，ADA，咪喹漠特(imiquimod)(Aldera)，ISIS 5320，瑞西喹漠(resiquimod)，阿德福韋(adefovir dipivoxil)(Preveon)，DAPD，恩曲他濱(emtricitabine)(Coviracil)，恩替卡韋(entecavir)，拉米夫定(lamivudine)(Zeffix，Epivir-HBV，Heptovir，Heptodin)，金剛烷胺(amantadine)(Symmetrel)，奧司他韋(oseltamivir)(Tamiflu)，吡羅達(dá)韋(pirodavir)，普來可那利(pleconaril)(VP-63843)，利巴韋林(ribavirin)(Virazid/Virazide/Virazole)，金剛乙胺(rimantadine)(Flumadine)，WIN 54954，扎納米韋(zanamivir)(Relenza)，膦甲酸(foscarnet)(Foscavir)，maribavir，ABT-378，阿替韋啶(atevirdinemesylate)，綿毛胡桐內(nèi)酯A(calanolide A)，capravirine，依發(fā)韋侖(efavirenz)(Sustiva)，emivirine(Coactinon)，GW420 867X(aka HBY1293)，HBY 097，L-697，66I，洛韋胺(loviride)，MIV-150，PETT-5，R165335-TMC125，他韋林(talviraline)，tivirapine，曲韋定(trovirdine)，阿昔洛韋(acyclovir)(Zovirax)，嗅呋啶(brivudin)(Helpin，Zostrex)，西多福韋(cidofovir)(Vistide(靜脈內(nèi)))，F(xiàn)orvade(局部)，環(huán)HPMPC，泛昔洛韋(famciclovir)(Famvir)，非西他濱(fiacitabine)，非阿尿苷(fialuridine)，更昔洛韋(ganciclovir)(Cymvene/Cytovene)，GW-273175X，碘脫氧尿苷(idoxuridine)(Herpid，Kerecid/Herplex Liquifilm，Idoxene，Virudox，Iduridin，Stoxil)，羅布卡韋(lobucavir)，奈替夫定(netivudine)(Zonavir)，噴昔洛韋(penciclovir)(Vectavir/Denavir)，索立夫定(sorivudine)(Usevir)，三氟尿苷(trifluridine)(Viroptic)，伐西洛韋(valaciclovir)(Valtrex；Zelitrex)，valomaciclovir硬脂酸鹽(MIV-606)，阿糖腺苷(vidarabine)(Vira-A)，935U83，阿巴卡韋(abacavir)(Ziagen/Trizivir)，阿的福韋(adefovir)，adefovirdipivoxil(Preveon)，alovudine，AzdU，CS-92，DAPD，去羥肌苷(didanosine)(Videx)，dOTC，恩曲他濱(emtricitabine)(Coviracil)，fozivudine tidoxil，拉米夫定(lamivudine)(Epivir/Combivir/Trizivir)，羅布卡韋(lobucavir)，lodenosine，司他夫定(stavudine)(Zerit)，替諾福韋(tenofovir)(Viread)，tenofovir disoproxil富馬酸鹽，扎西他濱(zalcitabine)(Hivid)，齊多夫定(zidovudine)(Retrovir)，A-77003，AG7088，安普那韋(amprenavir)(Agenerase)，BMS-232632，地拉韋啶(delavirdine)(Rescriptor)，DMP-323，DMP-450，GW 433 908，茚地那韋(indinavir)(Crixivan)，KNI-272，lasinavir，洛匹那韋(lopinavir)(Kaletra)，Mozenavir，奈非那韋(nelfinavir)(Viracept)，PD178390，利托那韋(ritorlarir)(Norrir)，RPI312，沙奎那維(Saquinavir)(Invirase/Fortovase)，SC-52151，SDZ PRI 053，替普那韋(tipranavir)，U-103017，U-96988，羥基脲(Hydrea)，AGI549，膦甲酸(foscarnet)(Foscavir)，LiGLA，阿昔洛韋-伐西洛韋(Aciclovir-Valaciclovir)，泛昔洛韋(Famciclovir)，碘脫氧尿苷(Idoxuridine)，更昔洛韋(Ganciclovir)，膦甲酸(Foscarnet)，西多福韋(Cidofovir)，和阿德福韋(Adefovir)，恩福韋地(enfuvirtide)，萬賽維(Valcyte)，克力夫定(clevudine)，胸腺法新(thymalfasin)，IL-12等。
組合療法可以順序進(jìn)行，即先用一種藥劑治療，再用另一種藥劑治療，或者用兩種藥劑同時(shí)治療。順序療法在第一種療法完成后但在第二種療法開始前的合理時(shí)間內(nèi)。用兩種藥劑同時(shí)治療可以每天相同的劑量或單獨(dú)的劑量進(jìn)行。例如，在一些實(shí)施方案中，第1天用一種藥劑治療，而在第2天用另一種藥劑治療。實(shí)際方案取決于在治療的疾病，感染的嚴(yán)重性和對治療的反應(yīng)。
本發(fā)明化合物的體內(nèi)給藥途徑將隨所需用途而變。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識到的，給藥本發(fā)明的ADI-PEG組合物，例如對粘膜組織可通過吸入或栓劑，而對陰道，直腸，尿道，口腔和舌下組織可通過灌洗進(jìn)行，以及口服，局部，鼻內(nèi)，腹膜內(nèi)，腸胃外，靜脈內(nèi)，淋巴內(nèi)，腫瘤內(nèi)，肌內(nèi)，間隙內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下，眼內(nèi)，滑液內(nèi)，經(jīng)上皮和經(jīng)皮方式。本發(fā)明化合物的口服給藥劑型可以為片劑，膠囊，丸藥，粉劑，顆粒，酏劑，酊劑，懸浮液，糖漿和乳劑。本發(fā)明化合物還可在靜脈內(nèi)(團(tuán)注或灌注)，腹膜內(nèi)，皮下，或肌內(nèi)形式給藥，全部采用藥物領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的劑型。
實(shí)施例本發(fā)明進(jìn)一步在下列實(shí)施例中闡述，所述實(shí)施例為說明之目的，不應(yīng)解釋成限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1重組ADI的生產(chǎn)精氨酸支原體(ATCC 23243)，人形支原體(ATCC 23114)和關(guān)節(jié)炎支原體(ATCC 23192)的培養(yǎng)物獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland)。
將精氨酸脫亞胺酶克隆自精氨酸支原體，人形支原體和關(guān)節(jié)炎支原體，并且表達(dá)在大腸桿菌(E.coli)中，如S.Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)所述，其內(nèi)容在此以其全文引作參考。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，各種蛋白的酶比活，Km，Vmax和最適pH的特征揭示出它們在生化上彼此是不可分的。最適pH采用檸檬酸緩沖液(pH5-6.5)，磷酸緩沖液(pH6.5-7.5)和硼酸緩沖液(pH7.5-8.5)確定。Km和Vmax的確定方法是將酶與各種不同濃度的精氨酸溫育，并且定量測定瓜氨酸的產(chǎn)生。各種酶的Km為大約0.02-0.06μM，而Vmax為大約15-20μmol/min/mg，所述值皆在彼此誤差范圍內(nèi)。
通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，利用下列來自公布的精氨酸支原體(M.Arginini)序列的引物對，對精氨酸脫亞胺酶基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述M.arginini序列，例如由T.Ohno等，Infect.Immun.，583788-3795(1990)所述，其內(nèi)容在此以其全文引作參考5’-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3’(SEQ ID NO11)5’-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3’(SEQ IDNO12)。
將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物以BamH I-Hind III片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒pQE16中。DNA序列分析顯示該片段具有與Ohno等，Infect.Immun.，同上所述的精氨酸脫亞胺酶基因相同的序列。將在支原體中編碼色氨酸的ADI基因的5個(gè)TGA密碼子通過寡核苷酸導(dǎo)向的突變在基因表達(dá)于大腸桿菌之前改變?yōu)門GG密碼子，正如，例如，由J.R.Sayers等，Biotechniques，13592-596(1992)所教導(dǎo)的。重組ADI以包含體表達(dá)的水平為總細(xì)胞蛋白的10％。
上述3種支原體的各個(gè)蛋白具有約95％的同源性，并且容易地通過柱層析純化。近1.2g的純蛋白可分離自1升的發(fā)酵液。重組ADI在37℃下穩(wěn)定大約2周，以及在4℃下存儲(chǔ)時(shí)穩(wěn)定至少8個(gè)月。正如由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法所確定的，蛋白對精氨酸具有高親和性(0.04μM)，而最適生理pH為大約7.2到大約7.4。
實(shí)施例2重組ADI的復(fù)性和純化將ADI蛋白復(fù)性，方法與Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)中所述稍有區(qū)別，其內(nèi)容在此以其全文引作參考。使100g的細(xì)胞漿重懸在800ml的10mM K2PO4 pH7.0，1mM EDTA(緩沖液1)中，在微型流化儀(microfluidizer)(Microfluidics Corporation，Newton，MA)中通過兩次將細(xì)胞破碎。加入Triton X-100至終濃度為4％(v/v)。勻漿液在4℃下攪拌30分鐘，然后以13,000g離心30min。收集沉淀，并重懸于1升含有0.5％Triton X-100的緩沖液1中。利用100kD截留級的中空纖維濾筒(Microgon Inc.，Laguna Hills，CA)，將溶液對5倍體積的變性緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.5，10mM DTT)透析。加入鹽酸胍至終濃度6M，并在4℃下攪拌溶液15min。該溶液稀釋100倍至重新折疊緩沖液1(10mm K2PO4，pH7.0)中，并在15℃下攪拌48小時(shí)，顆粒通過15,000×g離心去除。
所得上清液在預(yù)先平衡在重新折疊緩沖液中的Q Sepharose FastFlow(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)柱上濃縮。利用含有0.2M NaCl的重新折疊緩沖液稀釋ADI。純化工藝生成ADI蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析評估，其純度大于95％。8g純復(fù)性ADI蛋白產(chǎn)自1kg的細(xì)胞漿，其對應(yīng)于200mg純化的ADI/升發(fā)酵液。
ADI活性的確定方法與Oginsky等，Meth.Enzymol.，(1957)3639-642所述的方法稍有修飾。把10μl樣品的0.1M Na2PO4，pH7.0(BUN分析緩沖液)置于96孔微量滴定板上，加入40μl的0.5mM精氨酸的BUN分析緩沖液，覆蓋平板并在37℃溫育15min。加入20μl的完全BUN試劑(Sigma Diagnostics)，并在100℃下溫育平板10分鐘。然后，冷卻平板至22C，通過微型滴定板讀數(shù)儀(MolecularDevices，Inc)在490nm處分析。一個(gè)IU為每分鐘將1μmol的L-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-瓜氨酸的酶量。蛋白濃度的確定利用Pierce考馬斯亮蘭蛋白分析試劑(Pierce Co.，Rockford，IL)，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。純化的ADI制劑的酶活為17-25IU/mg。
實(shí)施例3PEG與ADI的連接在100mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4中，將PEG共價(jià)鍵合于ADI。簡而言之，AID的磷酸鹽緩沖液與100M過量的PEG混合。反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)，然后充分透析混合物以去除未摻入的PEG。
進(jìn)行第一實(shí)驗(yàn)，其中對PEG-ADI組合物中所用的連接基團(tuán)的效果進(jìn)行評價(jià)。把PEG 10,000和ADI經(jīng)由下列4種不同的連接基團(tuán)共價(jià)鍵合酯基或馬來酰亞胺基，包括SS，SSA，SPA和SSPA，其中各個(gè)PEG分子的平均分子量為5,000，10,000，12,000，20,000，30,000和40,000；環(huán)氧基，PEG-環(huán)氧基，其中各個(gè)PEG分子的平均分子量為5,000；以及支化PEG基團(tuán)，PEG2-NHS，其中各個(gè)PEG分子的平均分子量為10,000，20,000和40,000。
將5IU的所得組合物注射到小鼠(每組5只小鼠)中。為了確定精氨酸的血清水平，從小鼠后眼窩叢中放血(100μl)。采集后立即加入等體積的50％(w/v)的三氯乙酸。離心(13,000×g，30min)去除沉淀，取出上清液，在-70℃下冷凍存儲(chǔ)。然后，利用Beckman Instruments的全自動(dòng)氨基酸分析儀和試劑，遵從廠商提供的流程，對樣品進(jìn)行分析。該方法對瓜氨酸的靈敏度極限約為2-6μM，測量的再現(xiàn)性在約8％以內(nèi)。血清精氨酸的量由氨基酸分析確定。共價(jià)鍵合PEG和ADI的連接基團(tuán)對ADI減少體內(nèi)血清精氨酸的能力沒有一點(diǎn)影響。
進(jìn)行第二實(shí)驗(yàn)，其中評估了連接基團(tuán)和PEG的分子量對體內(nèi)血清瓜氨酸水平的影響。小鼠(每組5只)以5.0IU的量施用各種不同的ADI和PEG-ADI的組合物。為了確定瓜氨酸的血清水平，從小鼠后眼窩叢中放血(100μl)。采集后立即加入等體積的50％(w/v)的三氯乙酸。離心(13,000×g，30min)去除沉淀，取出上清液，在-70℃下冷凍存儲(chǔ)。然后，利用Beckman Instruments的全自動(dòng)氨基酸分析儀和試劑，遵從廠商提供的流程，對樣品進(jìn)行分析。該方法對瓜氨酸的靈敏度極限約為2-6μM，測量的再現(xiàn)性在約8％以內(nèi)。確定瓜氨酸的量，估計(jì)曲線下面積，并且表示成μmol天。
結(jié)果表明，PEG的分子量決定了PEG-ADI組合物的有效性。PEG-ADI組合物的有效性似乎未基于PEG與ADI連接的方法或途徑。
結(jié)果顯示，PEG的最適分子量為大約20,000。盡管在藥效方面，PEG30,000似乎優(yōu)于PEG20,000，但是PEG30,000可溶性較差，這使得它難以發(fā)揮作用?；诿富罨厥盏漠a(chǎn)率對PEG5,000和PEG12,000而言，為大約90％；對于PEG20,000而言為大約85％，以及對于PEG30,000而言為大約40％。所以，在一些實(shí)施方案中，PEG20,000似乎是產(chǎn)率和循環(huán)半衰期之間的良好平衡，正如由瓜氨酸的產(chǎn)生所確定。
在第三實(shí)驗(yàn)中，利用ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000，確定了血清精氨酸消耗和瓜氨酸產(chǎn)生的劑量反應(yīng)。小鼠(每組5只小鼠)單注射施用0.05IU，0.5IU或5.0IU的ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000。在指示時(shí)間，如上所述，采集血清，進(jìn)行氨基酸分析以定量測定血清精氨酸和血清瓜氨酸。兩種劑型均誘導(dǎo)了劑量依賴的血清精氨酸減少和血清瓜氨酸升高。然而，通過ADI-SS-PEG20,000誘導(dǎo)的效果比通過ADI-SS-PEG5,000誘導(dǎo)的效果更顯著和具有更長的持續(xù)時(shí)間。
實(shí)施例4循環(huán)半衰期用單劑量5.0IU的天然精氨酸脫亞胺酶或修飾有聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的各種不同的制劑靜脈內(nèi)注射Balb C小鼠(每組5只小鼠)。為了確定精氨酸和瓜氨酸的血清水平，從小鼠后眼窩叢中放血(100μl)。采集后立即加入等體積的50％(w/v)的三氯乙酸。離心(13,000×g，30min)去除沉淀，取出上清液，在-70℃下冷凍存儲(chǔ)。然后，利用BeckmanInstruments的全自動(dòng)氨基酸分析儀和試劑，遵從廠商提供的流程，對樣品進(jìn)行分析。該方法對精氨酸的靈敏度極限約為6pM，測量的再現(xiàn)性在約8％以內(nèi)。
從單劑量給藥天然ADI或ADI-SS-PEG中檢測劑量依賴的血清精氨酸水平的減少和血清瓜氨酸水平的升高。然而，血清精氨酸減少和血清瓜氨酸升高是短期的，不久就返回到正常。精氨酸消耗的半衰期概括在下表2中。
表2血清精氨酸消耗的半衰期
實(shí)施例5PEG修飾的ADI的抗原性為了確定天然ADI，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性，按照例如Park，Anticaner Res.，同上，和Kamisaki，J.Pharmacol.Exp.Ther.，同上中所述的程序進(jìn)行操作。簡而言之，Balb C小鼠(每組5只小鼠)每周用約0.5IU(100μg的蛋白)的天然ADI，ADI-SS-PEG5,000，或ADI-SS-PEG20,000靜脈內(nèi)注射，歷時(shí)12周。在實(shí)驗(yàn)開始和第4，8和12周從動(dòng)物后眼窩叢中放血(0.05ml)。血清分離并存儲(chǔ)在-70℃。通過ELISA確定抗ADI IgG的效價(jià)。向96孔微量滴定板的各個(gè)孔中加入50μg的ADI，并在室溫下溫育4小時(shí)。平板用PBS沖洗，然后用牛血清白蛋白(1mg/ml)包被，以封閉非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)，并在4℃存儲(chǔ)過夜。次日，小鼠血清稀釋后加入到孔中。1小時(shí)后，平板用PBS沖洗，并將與過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗小鼠IgG加入到孔中。平板溫育30min，接著利用微量滴定板讀數(shù)儀測量所得UV吸光度。效價(jià)定義為最高的血清稀釋度，其導(dǎo)致背景吸光度的兩倍增加(約0.50OD)。
與天然ADI相比，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性是顯著低的。例如，少至4次注射天然ADI導(dǎo)致大約106的效價(jià)，而4次注射任意PEG-ADI制劑不能產(chǎn)生任何可測量的抗體。然而，在8次注射后，ADI-PEG5,000的效價(jià)為大約102，ADI-PEG20,000直到12次注射后才誘導(dǎo)出如此多的免疫應(yīng)答。結(jié)果表明，PEG與ADI的連接減弱對蛋白的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例6給人施用PEG5,000-ADI和PEG20,000-ADI離體與正常人血清溫育，通過氨基酸分析確定對精氨酸濃度的影響，其中酶發(fā)現(xiàn)是完全有活性的，并能夠以與包括小鼠的實(shí)驗(yàn)中相同的動(dòng)力學(xué)降解所有可檢測的精氨酸。以0.1ml體積在37℃反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。
另外，精氨酸和瓜氨酸在人血清中的水平與小鼠中發(fā)現(xiàn)的相同。PEG-蛋白在人中比其在小鼠中循環(huán)時(shí)間更長。例如，PEG共軛的腺苷脫亞胺酶，天冬酰胺酶，葡糖腦苷脂酶，尿酸酶，血球蛋白和超氧化物歧化酶的循環(huán)半衰期都長于同樣制劑在小鼠中的5-10倍。過去認(rèn)為，人劑量通常為小鼠中所用的1/5到1/10。因此，PEG-ADI在人中比在小鼠中應(yīng)循環(huán)更長的時(shí)間。
實(shí)施例7ADI-PEG20的抗病毒活性在通過轉(zhuǎn)染人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh7(Blight等，HCV RNA復(fù)制在細(xì)胞培養(yǎng)物中的有效起始(EffcientInitiation of HCV RNA Replication in Cell Culture)，Science 2000 2901972-1974)而衍生的穩(wěn)定的HCV RNA復(fù)制細(xì)胞系A(chǔ)VA5中進(jìn)行測試。
體外復(fù)制分析使用通過轉(zhuǎn)染人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh7而衍生的穩(wěn)定的HCVRNA復(fù)制細(xì)胞系A(chǔ)VA5。AVA5細(xì)胞的分裂培養(yǎng)物用4種濃度的測試化合物(每種濃度3個(gè)培養(yǎng)物)每天處理一次，歷時(shí)3天(每次加入化合物時(shí)更換培養(yǎng)基)?？偣?個(gè)未處理的對照培養(yǎng)物，以及用10，3，和1IU/mlα干擾素(有抗病毒活性，但沒有細(xì)胞毒性)，以及100，10和1μM ribavirin(沒有抗病毒活性和細(xì)胞毒性)處理的三份培養(yǎng)物，用作對照。HCV RNA和細(xì)胞β-肌動(dòng)蛋白RNA水平利用斑點(diǎn)印跡雜交在化合物的最后劑量后24小時(shí)進(jìn)行評價(jià)。3-肌動(dòng)蛋白RNA水平用于使各個(gè)樣品中的細(xì)胞RNA量標(biāo)準(zhǔn)化。在用于抗病毒分析的單獨(dú)平板上進(jìn)行毒性分析。培養(yǎng)毒性分析用細(xì)胞，用測試化合物處理，程序和培養(yǎng)條件與抗病毒評價(jià)中所用的相同。各個(gè)化合物以4種濃度測試，每種濃度三份培養(yǎng)物。在最后處理后24小時(shí)，中性紅染料的攝取用于確定毒性的相對水平。510nm處的內(nèi)在化染料的吸光度用于定量分析。測試培養(yǎng)物中的值與9個(gè)未處理細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行比較，未處理細(xì)胞維持在與測試培養(yǎng)物相同的平板上。計(jì)算50％和90％抗病毒有效濃度(EC50，EC90)和50％細(xì)胞毒性濃度(CC50)，并用于生成選擇性指數(shù)(CC50/EC50)。S.I.為10或更大視為選擇性抗病毒效果。
ADI-PEG20的抗病毒活性當(dāng)這些細(xì)胞的分裂培養(yǎng)物有50％匯合時(shí)，向其中加入單劑量的ADI-PEG20(0.01IU/ml)。作為對照，α干擾素(10IU/ml)和ribavirin(100μM)用作陽性對照。處理3天后，利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，RNA分離自培養(yǎng)物，以及通過斑點(diǎn)印跡進(jìn)行分析。確定HCV mRNA的量，并與肌動(dòng)蛋白的mRNA(用作對照)比較。確定抑制50％對照水平的HCVmRNA所需的藥物(ADI，α干擾素或raboviron)量。導(dǎo)致50％抑制肌動(dòng)蛋白mRNA的任何劑量的藥物被視為具有非特異抑制活性。獲白該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示下。
這些數(shù)據(jù)表明，ADI-PEG體外抑制HCV病毒復(fù)制幾乎與α干擾素一樣好，并比ribavirin更好。
實(shí)施例8AVA5細(xì)胞的分裂培養(yǎng)物用各種濃度的PEG-ADI(或者在對照實(shí)驗(yàn)中為α干擾素或ribavirin)處理3天。同上分析HCV mRNA水平。利用中性紅確定細(xì)胞生存能力。確定抑制50％(IC50)和90％(IC90)的HCVmRNA水平的濃度。還確定殺死50％的細(xì)胞(CC50)的藥物濃度。計(jì)算CC50/EC50以確定選擇性指數(shù)(SI)。SI＞10被視為選擇性抑制病毒復(fù)制。結(jié)果示下。
這些數(shù)據(jù)確認(rèn)，ADI-PEG20抑制HCV復(fù)制，以及該藥物是選擇性的。
實(shí)施例9腫瘤患者中的抗病毒活性和NO合成在既患有肝細(xì)胞癌又長期感染有HCV的患者中測試ADI-PEG20的抗腫瘤活性。利用通過Hoffman La Roche開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)臨床分析，還確定HCV在這些患者血漿中的病毒效價(jià)。在用ADI-PEG20處理之前獲得血漿。每周一次用160IU/m2的ADI-PEG20注射患者，歷時(shí)3周。用ADI-PEG 20第3次注射后1周，從患者中分離血漿，并再次利用同樣的分析方法測定HCV效價(jià)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果示下。
這些數(shù)據(jù)表明，用ADI-PEG處理長期感染有HCV的病人導(dǎo)致HCV在其血漿中的效價(jià)顯著降低。此外，由于α干擾素僅在約50％的病人中有效，并且通常需要3-6個(gè)月處理才能實(shí)現(xiàn)HCV效價(jià)減少50％，ADI-PEG 20在這方面似乎更有效。
根據(jù)Richard Simon對快速最佳兩步階段2測試的統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)(Simon R.1989.對II期臨床試驗(yàn)的最佳兩步設(shè)計(jì)(Optimal two-stagedesigns for phase II clinical trials).Control Clin Trials 101-10；SimonRM，Steinberg SM，Hamilton M，Hildesheim A，Khleif S，Kwak LW，Mackall CL，Schlom J，Topalian SL，Berzofsky JA.2001.對早期臨床開發(fā)治療性癌癥疫苗的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Clinical trial designs for the earlyclinical development of therapeutic cancer vaccines)。J Clin Oncol191848-1854)，ADI-SS PEG 20,000在患有不能施行手術(shù)的HCC的個(gè)體的階段2研究中進(jìn)行測試。該測試得到了意大利衛(wèi)生部和當(dāng)?shù)匮芯繖z查委員會(huì)(institutional review board)的批準(zhǔn)，在意大利那不勒斯的Pascale National Cancer Institute進(jìn)行。所有測試對象根據(jù)Helsinki聲明提供了知情同意書?？偣灿?8位患有不能施行手術(shù)的HCC的個(gè)體在該研究中登記，它們長期感染有HCV(Izzo提交)。在此研究中，3位死于進(jìn)行性疾病，未能接受全部3個(gè)輪次的治療，因而被排除在進(jìn)一步分析之外。所有剩余15位測試對象以最佳生物劑量接受3個(gè)輪次(每個(gè)輪次由每周1次，共4次注射組成)的ADI-SS PEG 20,000。最佳生物劑量定義成血漿精氨酸從靜止水平約130μM減少到檢測水平之下(＜2μM)至少持續(xù)7天的ADI-SS PEG 20,000的量(約160IU/m2)。
該療法對腫瘤作用通過每4周一次CT掃描進(jìn)行評價(jià)。根據(jù)國立癌癥研究所(NCI)的標(biāo)準(zhǔn)，將反應(yīng)定義成進(jìn)行性疾病(PD)，穩(wěn)定疾病(SD)，部分反應(yīng)(PR)或完全反應(yīng)(CR)。該測試結(jié)果顯示，在患有HCC和HCV的15位測試對象中可見下列反應(yīng)
在該研究之前或過程中，沒有一個(gè)測試對象曾接受任何全身性抗腫瘤治療(或抗病毒治療)。在研究過程中，每周至少兩次進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)室測試，每周一次采集血漿樣品，并存儲(chǔ)在-70℃中。正是這些冷凍的血漿樣品其后用于HCV的測試。
HCV效價(jià)測定和人血漿樣品的血清型分類利用標(biāo)準(zhǔn)臨床聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析，Cobas Amplicor HCV監(jiān)控儀測試，版本2.0，Roche Diagnostics(Germer 1999)在醫(yī)院傳染性疾病臨床實(shí)驗(yàn)室中確定HCV病毒效價(jià)?；蛐鸵灶愃品绞酱_定。在ADI-SS PEG 20,000處理之前和治療12周之后，對采集的血漿樣品確定病毒效價(jià)。
NO合成用ADI-SS PEG 20,000處理導(dǎo)致劑量依賴的血漿精氨酸的降低和NO合成的同時(shí)降低(數(shù)據(jù)未示出)。盡管該處理顯著減少NO水平，但該處理對血壓或心臟速率沒有可測量的影響。
下表3列出了ADI-SS PEG 20,000對肝炎C效價(jià)和肝功測試的影響。
表3ADI-SS PEG 20,000對肝炎C效價(jià)和肝功測試的影響
備注所有后RX值為在OBD處3輪次后的值。
本說明書中所述的專利，Genbank登錄號，專利申請和出版物分別在此以其全文引作參考。
除了在此描述的之外，本發(fā)明的各種不同的修飾在參照上述說明書后對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的修飾也應(yīng)落入隨附的權(quán)利要求書中的范圍內(nèi)。
序列表<110>德西涅RX制藥公司(DesigneRx Pharmaceuticals Inc.)<120>體內(nèi)抑制病毒復(fù)制的方法(METHODS FOR INHIBITING VIRAL REPLICATION IN VIVO)<130>SCT052002-47<150>US 60/427,497<151>2002-11-18<160>21<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>409<212>PRT<213>Mycoplasma hominus<400>1Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile50 55 60Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu85 90 95Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys100 105 110Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu115 120 125Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu130 135 140Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp145 150 155 160
Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr165 170 175Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn180 185 190His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys195 200 205Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu210 215 220Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu225 230 235 240Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val245 250 255Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp260 265 270Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn275 280 285Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu290 295 300Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser305 310 315 320Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala325 330 335Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr340 345 350Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys355 360 365Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His370 375 380Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met385 390 395 400
Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp405<210>2<211>409<212>PRT<213>Mycoplasma hominus<400>2Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile50 55 60Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu85 90 95Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Glu100 105 110Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu115 120 125Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu130 135 140Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp145 150 155 160Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr165 170 175Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn180 185 190
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210 215 220Leu Ser Lys Asp Val Leu Ala Val Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp Ala225 230 235 240Ala Ser Ile Glu Lys Leu Leu Val Asn Ile Phe Lys Lys Asn Val Gly245 250 255Phe Lys Lys Val Leu Ala Phe Glu Phe Ala Asn Asn Arg Lys Phe Met260 265 270His Leu Asp Thr Val Phe Thr Met Val Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile275 280 285His Pro Glu Ile Glu Gly Asp Leu His Val Tyr Ser Val Thr Tyr Glu290 295 300Asn Glu Lys Leu Lys Ile Val Glu Glu Lys Gly Asp Leu Ala Glu Leu305 310 315 320Leu Ala Gln Asn Leu Gly Val Glu Lys Val His Leu Ile Arg Cys Gly325 330 335Gly Gly Asn Ile Val Ala Ala Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser340 345 350Asn Thr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val Val Val Val Tyr Asp Arg Asn355 360 365Thr Val Thr Asn Lys Ile Leu Glu Glu Tyr Gly Leu Arg Leu Ile Lys370 375 380Ile Arg Gly Ser Glu Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Phe Glu Arg Glu Glu Val405<210>15<211>410<212>PRT<213>Borrelia burgdorferi<400>15Met Glu Glu Glu Tyr Leu Asn Pro Ile Asn Ile Phe Ser Glu Ile Gly1 5 10 15
Arg Leu Lys Lys Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Leu Glu Asn20 25 30Leu Thr Pro Leu Ile Met Lys Asn Phe Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr35 40 45Leu Lys Val Ala Arg Gln Glu His Glu Val Phe Val Asn Ile Leu Lys50 55 60Asp Asn Ser Val Glu Ile Glu Tyr Val Glu Asp Leu Val Ser Glu Val65 70 75 80Leu Ala Ser Ser Val Ala Leu Lys Asn Lys Phe Ile Ser Gln Phe Ile85 90 95Leu Glu Ala Glu Ile Lys Thr Asp Gly Val Ile Asn Ile Leu Lys Asp100 105 110Tyr Phe Ser Asn Leu Thr Val Asp Asn Met Val Ser Lys Met Ile Ser115 120 125Gly Val Ala Arg Glu Glu Leu Lys Asp Cys Glu Phe Ser Leu Asp Asp130 135 140Trp Val Asn Gly Ser Ser Leu Phe Val Ile Asp Pro Met Pro Asn Val145 150 155 160Leu Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Ile Gly Asn Gly Ile Thr Ile165 170 175Asn Lys Met Tyr Thr Lys Val Arg Arg Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu180 185 190Tyr Ile Phe Lys Tyr His Ser Ala Tyr Lys Glu Asn Val Pro Ile Trp195 200 205Phe Asn Arg Trp Glu Glu Thr Ser Leu Glu Gly Gly Asp Glu Phe Val210 215 220Leu Asn Lys Asp Leu Leu Val Ile Gly Ile Ser Glu Arg Thr Glu Ala225 230 235 240Gly Ser Val Glu Lys Leu Ala Ala Ser Leu Phe Lys Asn Lys Ala Pro245 250 255
Phe Ser Thr Ile Leu Ala Phe Lys Ile Pro Lys Asn Arg Ala Tyr Met260 265 270His Leu Asp Thr Val Phe Thr Gln Ile Asp Tyr Ser Val Phe Thr Ser275 280 285Phe Thr Ser Asp Asp Met Tyr Phe Ser Ile Tyr Val Leu Thr Tyr Asn290 295 300Ser Asn Ser Asn Lys Ile Asn Ile Lys Lys Glu Lys Ala Lys Leu Lys305 310 315 320Asp Val Leu Ser Phe Tyr Leu Gly Arg Lys Ile Asp Ile Ile Lys Cys325 330 335Ala Gly Gly Asp Leu Ile His Gly Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly340 345 350Ala Asn Val Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Ile Ala Tyr Ser Arg355 360 365Asn His Val Thr Asn Lys Leu Phe Glu Glu Asn Gly Ile Lys Val His370 375 380Arg Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys385 390 395 400Met Ser Met Ser Leu Val Arg Glu Asp Ile405 410<210>16<211>409<212>PRT<213>Borellia afzellii<400>16Met Glu Glu Tyr Leu Asn Pro Ile Asn Ile Phe Ser Glu Ile Gly Arg1 5 10 15Leu Lys Lys Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Leu Glu Asn Leu20 25 30Thr Pro Phe Ile Met Lys Asn Phe Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu35 40 45
Glu Val Ala Arg Gln Glu His Glu Val Phe Ala Ser Ile Leu Lys Asn50 55 60Asn Leu Val Glu Ile Glu Tyr Ile Glu Asp Leu Ile Ser Glu Val Leu65 70 75 80Val Ser Ser Val Ala Leu Glu Asn Lys Phe Ile Ser Gln Phe Ile Leu85 90 95Glu Ala Glu Ile Lys Thr Asp Phe Thr Ile Asn Leu Leu Lys Asp Tyr100 105 110Phe Ser Ser Leu Thr Ile Asp Asn Met Ile Ser Lys Met Ile Ser Gly115 120 125Val Val Thr Glu Glu Leu Lys Asn Tyr Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu130 135 140Val Asn Gly Ala Asn Leu Phe Ile Ile Asp Pro Met Pro Asn Val Leu145 150 155 160Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Ile Gly Asn Gly Val Thr Ile Asn165 170 175Lys Met Phe Thr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu Tyr180 185 190Ile Phe Lys Tyr His Pro Val Tyr Lys Glu Asn Val Pro Ile Trp Leu195 200 205Asn Arg Trp Glu Glu Ala Ser Leu Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val Leu210 215 220Asn Lys Gly Leu Leu Val Ile Gly Ile Ser Glu Arg Thr Glu Ala Lys225 230 235 240Ser Val Glu Lys Leu Ala Ile Ser Leu Phe Lys Asn Lys Thr Ser Phe245 250 255Asp Thr Ile Leu Ala Phe Gln Ile Pro Lys Asn Arg Ser Tyr Met His260 265 270Leu Asp Thr Val Phe Thr Gln Ile Asp Tyr Ser Val Phe Thr Ser Phe275 280 285
Thr Ser Asp Asp Met Tyr Phe Ser Ile Tyr Val Leu Thr Tyr Asn Pro290 295 300Ser Ser Ser Lys Ile His Ile Lys Lys Glu Lys Ala Arg Ile Lys Asp305 310 315 320Val Leu Ser Phe Tyr Leu Gly Arg Lys Ile Asp Ile Ile Lys Cys Ala325 330 335Gly Gly Asp Leu Ile His Gly Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ala340 345 350Asn Val Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Ile Ile Ala Tyr Ser Arg Asn355 360 365His Val Thr Asn Lys Leu Phe Glu Glu Asn Gly Ile Lys Val His Arg370 375 380Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp Ile405<210>17<211>580<212>PRT<213>Giardia intestinalis<400>17Met Thr Asp Phe Ser Lys Asp Lys Glu Lys Leu Ala Gln Ala Thr Gln1 5 10 15Gly Gly Glu Asn Glu Arg Ala Glu Ile Val Val Val His Leu Pro Gln20 25 30Gly Thr Ser Phe Leu Thr Ser Leu Asn Pro Glu Gly Asn Leu Leu Glu35 40 45Glu Pro Ile Cys Pro Asp Glu Leu Arg Arg Asp His Glu Gly Phe Gln50 55 60Ala Val Leu Lys Glu Lys Gly Cys Arg Val Tyr Met Pro Tyr Asp Val65 70 75 80
Leu Ser Glu Ala Ser Pro Ala Glu Arg Glu Val Leu Met Asp Gln Ala85 90 95Met Ala Ser Leu Lys Tyr Glu Leu His Ala Thr Gly Ala Arg Ile Thr100 105 110Pro Lys Met Lys Tyr Cys Val Ser Asp Glu Tyr Lys Arg Lys Val Leu115 120 125Ser Ala Leu Ser Thr Arg Asn Leu Val Asp Val Ile Leu Ser Glu Pro130 135 140Val Ile His Leu Ala Pro Gly Val Arg Asn Thr Ala Leu Val Thr Asn145 150 155 160Ser Val Glu Ile His Asp Ser Asn Asn Met Val Phe Met Arg Asp Gln165 170 175Gln Ile Thr Thr Arg Arg Gly Ile Val Met Gly Gln Phe Gln Ala Pro180 185 190Gln Arg Arg Arg Glu Gln Val Leu Ala Leu Ile Phe Trp Lys Arg Leu195 200 205Gly Ala Arg Val Val Gly Asp Cys Arg Glu Gly Gly Pro His Cys Met210 215 220Leu Glu Gly Gly Asp Phe Val Pro Val Ser Pro Gly Leu Ala Met Met225 230 235 240Gly Val Gly Leu Arg Ser Thr Tyr Val Gly Ala Gln Tyr Leu Met Ser245 250 255Lys Asp Leu Leu Gly Thr Arg Arg Phe Ala Val Val Lys Asp Cys Phe260 265 270Asp Gln His Gln Asp Arg Met His Leu Asp Cys Thr Phe Ser Val Leu275 280 285His Asp Lys Leu Val Val Leu Asp Asp Tyr Ile Cys Ser Gly Met Gly290 295 300Leu Arg Tyr Val Asp Glu Trp Ile Asp Val Gly Ala Asp Ala Val Lys305 310 315 320
Lys Ala Lys Ser Ser Ala Val Thr Cys Gly Asn Tyr Val Leu Ala Lys325 330 335Ala Asn Val Glu Phe Gln Gln Trp Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Thr Ile340 345 350Val Arg Ile Pro His Glu Tyr Gln Leu Ala Tyr Gly Cys Asn Asn Leu355 360 365Asn Leu Gly Asn Asn Cys Val Leu Ser Val His Gln Pro Thr Val Asp370 375 380Phe Ile Lys Ala Asp Pro Ala Tyr Ile Ser Tyr Cys Lys Ser Asn Asn385 390 395 400Leu Pro Asn Gly Leu Asp Leu Val Tyr Val Pro Phe Arg Gly Ile Thr405 410 415Arg Met Tyr Gly Ser Leu His Cys Ala Ser Gln Val Val Tyr Arg Thr420 425 430Pro Leu Ala Pro Ala Ala Val Lys Ala Cys Glu Gln Glu Gly Asp Gly435 440 445Ile Ala Ala Ile Tyr Glu Lys Asn Gly Glu Pro Val Asp Ala Ala Gly450 455 460Lys Lys Phe Asp Cys Val Ile Tyr Ile Pro Ser Ser Val Asp Asp Leu465 470 475 480Ile Asp Gly Leu Lys Ile Asn Leu Arg Asp Asp Ala Ala Pro Ser Arg485 490 495Glu Ile Ile Ala Asp Ala Tyr Gly Leu Tyr Gln Lys Leu Val Ser Glu500 505 5l0Gly Arg Val Pro Tyr Ile Thr Trp Arg Met Pro Ser Met Pro Val Val515 520 525Ser Leu Lys Gly Ala Ala Lys Ala Gly Ser Leu Lys Ala Val Leu Asp530 535 540Lys Ile Pro Gln Leu Thr Pro Phe Thr Pro Lys Ala Val Glu Gly Ala545 550 555 560
Pro Ala Ala Tyr Thr Arg Tyr Leu Gly Leu Glu Gln Ala Asp Ile Cys565 570 575Val Asp Ile Lys580<210>18<211>413<212>PRT<213>Clostridium perfringens<400>18Met Arg Asp Asp Arg Ala Leu Asn Val Thr Ser Glu Ile Gly Arg Leu1 5 10 15Lys Thr Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Ile Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Asp Leu Leu Asp Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Lys35 40 45Val Ala Arg Glu Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Thr Leu Arg Glu Ala50 55 60Gly Val Glu Val Leu Tyr Leu Glu Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Glu65 70 75 80Thr Ser Asp Glu Val Lys Gln Gln Phe Ile Ser Glu Phe Ile Asp Glu85 90 95Ala Gly Val Glu Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala Leu Ile Glu Tyr Phe100 105 110Asn Ser Phe Ser Asp Asn Lys Ala Met Val Asp Lys Met Met Ala Gly115 120 125Val Arg Lys Glu Glu Leu Lys Asp Tyr His Arg Glu Ser Leu Tyr Asp130 135 140Gln Val Asn Asn Val Tyr Pro Phe Val Cys Asp Pro Met Pro Asn Leu145 150 155 160Tyr Phe Thr Arg Glu Pro Phe Ala Thr Ile Gly His Gly Ile Thr Leu165 170 175Asn His Met Arg Thr Asp Thr Arg Asn Arg Glu Thr Ile Phe Ala Lys
180 185 190Tyr Ile Phe Arg His His Pro Arg Phe Glu Gly Lys Asp Ile Pro Phe195 200 205Trp Phe Asn Arg Asn Asp Lys Thr Ser Leu Glu Gly Gly Asp Glu Leu210 215 220Ile Leu Ser Lys Glu Ile Leu Ala Val Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp225 230 235 240Ser Ala Ser Val Glu Lys Leu Ala Lys Lys Leu Leu Tyr Tyr Pro Asp245 250 255Thr Ser Phe Lys Thr Val Leu Ala Phe Lys Ile Pro Val Ser Arg Ala260 265 270Phe Met His Leu Asp Thr Val Phe Thr Gln Val Asp Tyr Asp Lys Phe275 280 285Thr Val His Pro Gly Ile Val Gly Pro Leu Glu Val Tyr Ala Leu Thr290 295 300Lys Asp Pro Glu Asn Asp Gly Gln Leu Leu Val Thr Glu Glu Val Asp305 310 315 320Thr Leu Glu Asn Ile Leu Lys Lys Tyr Leu Asp Arg Asp Ile Lys Leu325 330 335Ile Lys Cys Gly Gly Gly Asp Glu Ile Ile Ala Ala Arg Glu Gln Trp340 345 350Asn Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Val Val355 360 365Tyr Ser Arg Asn Tyr Val Thr Asn Glu Ile Leu Glu Lys Glu Gly Ile370 375 380Lys Leu His Val Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly385 390 395 400Pro Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp Leu405 410<210>19
<211>413<212>PRT<213>Bacillus licheniformis<400>19Met Ile Met Thr Thr Pro Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Pro Leu1 5 10 15Lys Thr Val Met Leu Lys Arg Pro Gly Arg Glu Leu Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Glu Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Pro35 40 45Ala Val Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Glu Thr Leu Lys Gln Gln50 55 60Gly Ala Glu Val Leu Tyr Leu Glu Lys Leu Thr Ala Glu Ala Leu Asp65 70 75 80Asp Ala Leu Val Arg Glu Gln Phe Ile Asp Glu Leu Leu Thr Glu Ser85 90 95Lys Ala Asp Ile Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Lys Glu Phe Leu Leu100 105 110Thr Phe Asp Ala Asp Ser Met Val Glu Gln Val Met Ser Gly Ile Arg115 120 125Lys Asn Glu Leu Glu Arg Glu Lys Lys Ser His Leu His Glu Leu Met130 135 140Glu Asp His Tyr Pro Phe Tyr Leu Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe145 150 155 160Thr Arg Asp Pro Ala Ala Ala Ile Gly Ser Gly Leu Thr Ile Asn Lys165 170 175Met Lys Glu Pro Ala Arg Arg Arg Glu Ser Leu Phe Met Arg Tyr Ile180 185 190Ile Asn His His Pro Arg Phe Lys Gly His Glu Ile Pro Val Trp Leu195 200 205Asp Arg Asp Phe Lys Phe Asn Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val Leu210 215 220
Asn Glu Glu Thr Val Ala Ile Gly Val Ser Glu Arg Thr Thr Ala Gln225 230 235 240Ala Ile Glu Arg Leu Val Arg Asn Leu Phe Gln Arg Gln Ser Arg Ile245 250 255Arg Arg Val Leu Ala Val Glu Ile Pro Lys Ser Arg Ala Phe Met His260 265 270Leu Asp Thr Val Phe Thr Met Val Asp Arg Asp Gln Phe Thr Ile His275 280 285Pro Ala Ile Gln Gly Pro Glu Gly Asp Met Arg Ile Phe Val Leu Glu290 295 300Arg Gly Lys Thr Ala Asp Glu Ile His Thr Thr Glu Glu His Asn Leu305 310 315 320Pro Glu Val Leu Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Asp Val Asn Leu Ile325 330 335Phe Cys Gly Gly Gly Asp Glu Ile Ala Ser Ala Arg Glu Gln Trp Asn340 345 350Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Thr Tyr355 360 365Asp Arg Asn Tyr Ile Ser Asn Glu Cys Leu Arg Glu Gln Gly Ile Lys370 375 380Val Ile Glu Ile Pro Ser Gly Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro385 390 395 400Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Tyr Arg Glu Asp Val Lys405 410<210>20<211>408<212>PRT<213>Enterococcus faecalis<400>20Met Ser His Pro Ile Asn Val Phe Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Thr1 5 10 15
Val Met Leu His Arg Pro Gly Lys Glu Leu Glu Asn Leu Met Pro Asp20 25 30Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Glu Lys Ala35 40 45Gln Ala Glu His Asp Ala Phe Ala Glu Leu Leu Arg Ser Lys Asp Ile50 55 60Glu Val Val Tyr Leu Glu Asp Leu Ala Ala Glu Ala Leu Ile Asn Glu65 70 75 80Glu Val Arg Arg Gln Phe Ile Asp Gln Phe Leu Glu Glu Ala Asn Ile85 90 95Arg Ser Glu Ser Ala Lys Glu Lys Val Arg Glu Leu Met Leu Glu Ile100 105 110Asp Asp Asn Glu Glu Leu Ile Gln Lys Ala Ile Ala Gly Ile Gln Lys115 120 125Gln Glu Leu Pro Lys Tyr Glu Gln Glu Phe Leu Thr Asp Met Val Glu130 135 140Ala Asp Tyr Pro Phe Ile Ile Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr145 150 155 160Arg Asp Asn Phe Ala Thr Met Gly His Gly Ile Ser Leu Asn His Met165 170 175Tyr Ser Val Thr Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Gly Gln Tyr Ile Phe180 185 190Asp Tyr His Pro Arg Phe Ala Gly Lys Glu Val Pro Arg Val Tyr Asp195 200 205Arg Ser Glu Ser Thr Arg Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser210 215 220Lys Glu Val Val Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp Ala Ala Ser225 230 235 240Ile Glu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Phe Glu Gln Lys Leu Gly Phe Lys245 250 255
Asn Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Glu His Arg Lys Phe Met His Leu260 265 270Asp Thr Val Phe Thr Met Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile His Pro275 280 285Glu Ile Glu Gly Gly Leu Val Val Tyr Ser Ile Thr Glu Lys Ala Asp290 295 300Gly Asp Ile Gln Ile Thr Lys Glu Lys Asp Thr Leu Asp Asn Ile Leu305 310 315 320Cys Lys Tyr Leu His Leu Asp Asn Val Gln Leu Ile Arg Cys Gly Ala325 330 335Gly Asn Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser Asn340 345 350Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Val Val Tyr Asp Arg Asn Thr355 360 365Ile Thr Asn Lys Ala Leu Glu Glu Ala Gly Val Lys Leu Asn Tyr Ile370 375 380Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met Ser385 390 395 400Met Pro Leu Tyr Arg Glu Asp Leu405<210>21<211>409<212>PRT<213>Lactobacillus sake<400>21Met Thr Ser Pro Ile His Val Asn Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Thr1 5 10 15Val Leu Leu Lys Arg Pro Gly Lys Glu Val Glu Asn Ile Thr Pro Asp20 25 30Ile Met Tyr Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Pro Thr Ile35 40 45
Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Gln Thr Leu Arg Asp Asn Gly Val50 55 60Glu Val Leu Tyr Leu Glu Asn Leu Ala Ala Glu Ala Ile Asp Ala Gly65 70 75 80Asp Val Lys Glu Ala Phe Leu Asp Lys Met Leu Asn Glu Ser His Ile85 90 95Lys Ser Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Lys Asp Tyr Leu Ile Ser Met100 105 110Ala Thr Leu Asp Met Val Glu Lys Ile Met Ala Gly Val Arg Thr Asn115 120 125Glu Ile Asp Ile Lys Ser Lys Ala Leu Ile Asp Val Ser Ala Asp Asp130 135 140Asp Tyr Pro Phe Tyr Met Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg145 150 155 160Asp Pro Ala Ala Ser Met Gly Asp Gly Leu Thr Ile Asn Lys Met Thr165 170 175Phe Glu Ala Arg Gln Arg Glu Ser Met Phe Met Glu Val Ile Met Gln180 185 190His His Pro Arg Phe Ala Asn Gln Gly Ala Gln Val Trp Arg Asp Arg195 200 205Asp His Ile Asp Arg Met Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser Asp210 215 220Lys Val Leu Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Ser Ala Gln Ser Ile225 230 235 240Glu Glu Leu Ala Lys Val Leu Phe Ala Asn His Ser Gly Phe Glu Lys245 250 255Ile Leu Ala Ile Lys Ile Pro His Lys His Ala Met Met His Leu Asp260 265 270Thr Val Phe Thr Met Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile His Pro Gly275 280 285
Ile Gln Gly Ala Gly Gly Met Val Asp Thr Tyr Ile Leu Glu Pro Gly290 295 300Asn Asn Asp Glu Ile Lys Ile Thr His Gln Thr Asp Leu Glu Lys Val305 310 315 320Leu Arg Asp Ala Leu Glu Val Pro Glu Leu Thr Leu Ile Pro Cys Gly325 330 335Gly Gly Asp Ala Val Val Ala Pro Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser340 345 350Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Thr Tyr Asp Arg Asn355 360 365Tyr Val Ser Asn Glu Asn Leu Arg Gln Tyr Gly Ile Lys Val Ile Glu370 375 380Val Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Leu Val Arg Arg Lys Thr40權(quán)利要求
1.一種抑制個(gè)體中一種或多種病毒復(fù)制的方法，包括以有效抑制所述個(gè)體中病毒復(fù)制的量給所述個(gè)體施用包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟給所述個(gè)體施用一種或多種選自抗生素，抗病毒，抗真菌和抗原生動(dòng)物藥物的化合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟給所述個(gè)體施用一種或多種其他抗病毒化合物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗病毒化合物為下列物質(zhì)中的一種或多種azidovudine(AZT)，去羥肌苷(二脫氧肌苷，ddI)，d4T，扎西他濱(二脫氧胞嘧啶，ddC)，內(nèi)維拉平，拉米夫定(epivir，3TC)，沙奎那維(Invirase)，利托那韋(諾億亞)，茚地那韋(Crixivan)，地拉韋定(Rescriptor)，PEG化的干擾素α(IFN)，或利巴韋林。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物以肌內(nèi)，皮內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物在濃度小于大約1mM時(shí)，就能使得在測量病毒復(fù)制的分析中50％以上細(xì)胞的病毒復(fù)制有效抑制至少50％。
7.權(quán)利要求1的方法，其中與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶有效抑制病毒復(fù)制的量為每周大約40IU/m2到大約160IU/m2。
8.權(quán)利要求1的方法，其中與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶有效抑制病毒復(fù)制的量為每周大約160IU/m2。
9.權(quán)利要求1的方法，其中與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶有效抑制病毒復(fù)制的量使血漿精氨酸水平降低至小于5μM。
10.權(quán)利要求1的方法，其中精氨酸脫亞胺酶經(jīng)由連接基團(tuán)共價(jià)鍵合于聚乙二醇，其中各個(gè)所述聚乙二醇分子的分子量為大約10,000到大約30,000。
11.權(quán)利要求1的方法，其中各個(gè)所述聚乙二醇分子的分子量為大約20,000。
12.權(quán)利要求10的方法，其中連接基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基，酰胺基，酰亞胺基，氨基甲酸酯基，酯基，環(huán)氧基，羧基，羥基，糖，酪氨酸基，半胱氨酸基，組氨酸基及其組合。
13.權(quán)利要求10的方法，其中連接基團(tuán)為琥珀酰亞胺基琥珀酸酯。
14.權(quán)利要求1的方法，其中大約7到大約15個(gè)聚乙二醇分子鍵合于精氨酸脫亞胺酶。
15.權(quán)利要求1的方法，其中大約9到大約12個(gè)聚乙二醇分子鍵合于精氨酸脫亞胺酶。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述精氨酸脫亞胺酶衍生自支原體屬的微生物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述微生物選自精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)，人形支原體(Mycoplasma hominus)，關(guān)節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritides)及其組合。
18.權(quán)利要求1的方法，其中精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列為SEQID NO1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，13，14，15，16，17，18，19，20或21。
19.權(quán)利要求1的方法，其中精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列為SEQID NO1或4。
20.權(quán)利要求1的方法，其中病毒為肝炎病毒。
21.權(quán)利要求1的方法，其中病毒為HCV。
22.權(quán)利要求1的方法，其中病毒為HCV 1b。
23.一種治療懷疑已接觸一種或多種病毒的個(gè)體的方法，包括下列步驟給所述個(gè)體施用一定量的包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物，以有效抑制病毒在所述個(gè)體中的復(fù)制。
24.一種抑制病毒在個(gè)體中復(fù)制的方法，所述個(gè)體處于一種或多種病毒的風(fēng)險(xiǎn)之中，所述方法包括給所述個(gè)體施用一定量的含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物，以有效抑制病毒在所述個(gè)體中的復(fù)制。
25.一種抑制病毒在個(gè)體中復(fù)制的方法，所述個(gè)體已被鑒定為感染有一種或多種病毒，所述方法包括給所述個(gè)體施用一定量的含有與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物，以有效抑制病毒在所述個(gè)體中的復(fù)制。
26.一種在個(gè)體中同時(shí)治療腫瘤和抑制一種或多種病毒復(fù)制的方法，所述方法包括下列步驟給所述個(gè)體施用治療或預(yù)防有效量的含有經(jīng)由連接基團(tuán)與聚乙二醇共價(jià)鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物，以有效抑制腫瘤生長和病毒復(fù)制。
27.權(quán)利要求26的方法，其中個(gè)體在給藥組合物之前已被鑒定為患有一種或多種病毒感染。
28.權(quán)利要求26的方法，其中腫瘤為黑素瘤，肉瘤或肝癌。
29.權(quán)利要求26的方法，其中腫瘤為肝細(xì)胞瘤。
30.權(quán)利要求23-27任一項(xiàng)的方法，其中病毒為肝炎病毒。
31.權(quán)利要求23-27任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒為HCV。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤為肝細(xì)胞瘤，而所述病毒為HCV。
33.一種調(diào)節(jié)個(gè)體中一氧化氮水平的方法，包括給所述個(gè)體施用一定量的與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶，以有效調(diào)節(jié)一氧化氮。
34.權(quán)利要求33的方法，其中精氨酸脫亞胺酶經(jīng)由連接基團(tuán)共價(jià)鍵合于聚乙二醇，其中多個(gè)所述聚乙二醇分子的分子量為大約10,000到大約30,000。
35.權(quán)利要求33的方法，其中多個(gè)所述聚乙二醇分子的分子量為大約20,000。
36.權(quán)利要求34的方法，其中連接基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基，酰胺基，酰亞胺基，氨基甲酸酯基，酯基，環(huán)氧基，羧基，羥基，糖，酪氨酸基，半胱氨酸基，組氨酸基中的一種或多種。
37.權(quán)利要求34的方法，其中大約7到大約12個(gè)聚乙二醇分子鍵合于精氨酸脫亞胺酶。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述精氨酸脫亞胺酶衍生自支原體屬的微生物。
39.一種確定病毒復(fù)制對調(diào)節(jié)精氨酸水平的靈敏度的方法，包括(a)將含有一種或多種病毒的樣品與包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物接觸；以及(b)在存在和缺乏包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物下比較病毒復(fù)制的水平；其中在與精氨酸脫亞胺酶接觸的樣品中病毒復(fù)制降低是病毒靈敏度對精氨酸脫亞胺酶的指示。
40.一種確定病毒復(fù)制對調(diào)節(jié)一氧化氮水平的靈敏度的方法，包括(a)將含有一種或多種病毒的樣品與包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物接觸；以及(b)在存在和缺乏包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物下比較病毒復(fù)制的水平；其中在與精氨酸脫亞胺酶接觸的樣品中病毒復(fù)制降低是病毒靈敏度對一氧化氮的指示。
41.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述化合物給所述個(gè)體施用，同時(shí)給藥所述包含與聚乙二醇鍵合的精氨酸脫亞胺酶的組合物。
42.一種選擇性抑制病毒在需要其的個(gè)體中復(fù)制的方法，包括給所述個(gè)體施用治療或預(yù)防有效量的包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中病毒為HCV。
44.一種改善個(gè)體肝功的方法，包括給所述個(gè)體施用治療有效量的包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中肝功利用Child-Pugh等級或Mayo終端肝病評分進(jìn)行評價(jià)。
46.權(quán)利要求44的方法，其中肝功的評價(jià)方法是測量至少一種肝功指標(biāo)，其中所述指標(biāo)為膽紅素，白蛋白，凝血酶原時(shí)間，腹水存在，或腦病的等級。
47.權(quán)利要求44的方法，其中在給藥包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物之前，所述個(gè)體的肝功為Child-Pugh水平A。
48.權(quán)利要求44的方法，其中在給藥包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物之前，所述個(gè)體的肝功為Child-Pugh水平B。
49.權(quán)利要求44的方法，其中在給藥包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物之前，所述個(gè)體的肝功為Child-Pugh水平C。
50.一種鑒定個(gè)體可被精氨酸脫療的方法，所述個(gè)體已知患有一種或多種病毒感染，所述方法包括a)從個(gè)體中獲得包含一種或多種病毒的樣品；以及b)在適于病毒復(fù)制的條件下，將在接觸有包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物的樣品中的病毒復(fù)制，與缺乏包含鍵合于聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物的樣品中的病毒復(fù)制進(jìn)行比較，其中病毒在所述樣品中的復(fù)制抑制至少40％是個(gè)體作為精氨酸脫療的候選對象的指示；而病毒復(fù)制的抑制小于40％是個(gè)體不作為精氨酸脫療的候選對象的指示。
51.一種治療個(gè)體中一種或多種病毒的方法，包括a)根據(jù)權(quán)利要求50，確定個(gè)體是否是精氨酸脫療的候選對象；b)如果個(gè)體是精氨酸脫療的候選對象，則用精氨酸脫療治療個(gè)體；以及c)如果個(gè)體不是精氨酸脫療的候選對象，則用常規(guī)抗病毒處理治療個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及體內(nèi)調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的方法，包括給個(gè)體施用治療或預(yù)防有效量的包含修飾有聚乙二醇的精氨酸脫亞胺酶的組合物，涉及同時(shí)調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和治療癌癥的方法，以及涉及調(diào)節(jié)患者中一氧化氮水平的方法等。
文檔編號A61K38/50GK1809378SQ03825264
公開日2006年7月26日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月18日
發(fā)明者邁克·A·克拉克 申請人:德西涅Rx制藥公司