專利名稱：抑制hiv病毒融合的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制病毒融合的多肽，特別是涉及抑制HIV病毒融合的多肽。本發(fā)明還涉及所述多肽的用途。
背景技術(shù)：
一些具有包膜的病毒，如人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、人呼吸道合胞病毒和B型肝炎病毒的整個(gè)復(fù)制周期可以分為四部分病毒和細(xì)胞膜融合，遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；逆轉(zhuǎn)錄出病毒的DNA并整合到宿主細(xì)胞的染色體上；病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄，翻譯，修飾；病毒顆粒的組裝和出芽。這些病毒的共同點(diǎn)是生活周期中有膜融合過程，且融合過程中所參與的蛋白的結(jié)構(gòu)有相似之處。
以治療HIV感染的藥物為例，目前臨床上治療HIV感染的藥物可以分為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，蛋白酶抑制劑和進(jìn)入抑制劑(包括融合抑制劑)三類，分別針對(duì)上述病毒復(fù)制周期的不同環(huán)節(jié)。
逆轉(zhuǎn)錄酶抑制包括核苷類抑制劑和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑兩類，前者作用于新生的DNA鏈并造成合成終止，現(xiàn)有藥物有AZT、3TC、ddI、ddT、d4T和bacavir等，后者作用于逆轉(zhuǎn)錄酶并降低酶活性，現(xiàn)有藥物有Nevirapine、Efavirenz和Delavirdine等。
蛋白酶抑制劑通過影響酶對(duì)蛋白的正常切割，使得活性蛋白不能形成，新的病毒顆粒依然可以形成，但是由于缺少活性蛋白，不再具有感染性?，F(xiàn)有藥物有Saquinavir mesylate、Idinavir、Ritonavir、Amprenavir、Kaletra和Nelfinavir mesylate等。
HIV進(jìn)入抑制劑可抑制HIV病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程，其中融合抑制劑作用于病毒和細(xì)胞膜融合過程，目前該類藥物僅有一種融合抑制劑-T-20于2003年上市。
逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑類藥物在使用中出現(xiàn)抗藥性，是這兩類藥物使用受限的重要原因。從1987年第一個(gè)抗艾滋病藥物AZT應(yīng)用于臨床起即發(fā)現(xiàn)了此問題。另外，長期使用該兩類抑制劑，諸如脂肪分布異常、骨質(zhì)疏松等毒副作用也十分明顯。
臨床使用時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIV病毒融合抑制劑單獨(dú)應(yīng)用即可以大大降低病毒的荷載量，并且副作用很低。HIV病毒融合抑制劑還可以與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合使用，不僅可以降低這兩種藥物的使用量，從而降低副作用，還可以防止新的耐藥株的出現(xiàn)，是當(dāng)前抗HIV藥物研究的熱點(diǎn)方向。
已知HIV病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程包括以下幾步第一步，病毒的表面糖蛋白gp120與細(xì)胞表面受體蛋白CD4分子高親和力結(jié)合，構(gòu)象發(fā)生變化使病毒吸附到宿主細(xì)胞上；第二步，gp120與宿主細(xì)胞表面輔助受體(如CCR5，CXCR4等)相互作用，構(gòu)象進(jìn)一步發(fā)生變化，并與gp41分離，gp41N端的融合肽插入宿主細(xì)胞膜；第三步，gp41的CHR區(qū)(C-terminal heptad repeats)回折并靠近其NHR區(qū)(N-terminal heptad repeats)形成的α-螺旋三聚體，形成六聚體α-螺旋，拉近了病毒和細(xì)胞的距離，導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。進(jìn)入抑制劑作用于病毒進(jìn)入細(xì)胞前的階段，即從病毒和細(xì)胞的接觸到膜融合的階段。
目前正在進(jìn)行研究的HIV進(jìn)入抑制劑主要針對(duì)細(xì)胞表面的共同受體CCR5/CXCR4，CD4受體以及病毒表面糖蛋白gp120/gp41。
作用于gp120的進(jìn)入抑制劑有17b，2G12，BMS-378806，BMS-48803，12P1作用于gp41的進(jìn)入抑制劑(融合抑制劑)有DP107，T-20，T-1249，C34，IQN37，5-Helix作用于共同受體CCR5/CXCR4的進(jìn)入抑制劑AOP-RANTES，PRO140，UK-427857，TAK-779，TAK-220，PRO542作用于CD4受體的進(jìn)入抑制劑有TNX-355上述的幾類進(jìn)入抑制劑中，作用于共同受體CCR5/CXCR4的抑制劑現(xiàn)在認(rèn)為有著內(nèi)在的缺陷。眾所周知，CCR5/CXCR4是存在正常細(xì)胞表面的分子，除在HIV病毒進(jìn)入過程作為共同受體外，還是趨化因子和炎癥因子等的受體，因此長期的使用抑制劑競爭性的結(jié)合會(huì)引起問題，一些小分子的拮抗劑在臨床研究的時(shí)候就發(fā)現(xiàn)了對(duì)心臟的副作用(KenjiM.，et al.，Curr.Opion.，2004，4447-452)。
作用于gp120的進(jìn)入抑制劑主要是篩選或者從感染者體內(nèi)得到的抗體，小分子較少。目前僅得到17b和2G12兩個(gè)具有廣泛中和活性的抗體，其他的抗體有的在體外實(shí)驗(yàn)中具有中和活性，但是在體內(nèi)則沒有。目前的小分子抑制劑有BMS-378806，它結(jié)合于gp120上一個(gè)疏水口袋，另外通過肽庫篩選得到的小肽(12P1)可能具有與之相同的結(jié)合部位。
作用于CD4受體的進(jìn)入抑制劑目前研究的最少，因?yàn)樵隗w內(nèi)它是一個(gè)很重要的分子，對(duì)它的抑制很可能出現(xiàn)嚴(yán)重的副反應(yīng)。
作用于HIV-1病毒的表面糖蛋白gp41的抑制劑亦被稱為融合抑制劑，其中T-20是目前唯一應(yīng)用于臨床的多肽類HIV融合抑制劑。T-20對(duì)一些逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑耐藥的毒株仍然有效，并且副作用低。
T-20衍生于HIV-1LAI毒株gp41的CHR區(qū)，由36個(gè)氨基酸組成。gp41融合前構(gòu)象可以持續(xù)約30分鐘的時(shí)間，在這一段時(shí)間T-20可以作用于三個(gè)gp41分子的NHR區(qū)形成的α-螺旋三聚體。T-20的競爭性結(jié)合使gp41的CHR區(qū)不能結(jié)合NHR區(qū)，抑制螺旋六聚體的形成，病毒和宿主的細(xì)胞膜因此也不能相互靠近，膜融合過程受阻。
T-1249是T-20的第二代產(chǎn)品，由39個(gè)氨基酸組成，衍生于HIV-1LAI，HIV-2NIHZ，SIV mac251三種毒株的CHR區(qū)。在臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)gp41的CHR區(qū)僅僅一個(gè)氨基酸的突變就可以造成毒株對(duì)T-20的抗性，但是這些毒株仍然對(duì)T-1249敏感，這被認(rèn)為可能與其可以與膜相互作用的能力相關(guān)(Veiga A.S.，J.AM.CHEM.SOC.，2004，12614758-14763)。
最近的研究結(jié)果認(rèn)為，T-20不能和衍生于gp41的NHR區(qū)多肽N36在溶液中形成穩(wěn)定的螺旋六聚體，因此其可能和gp41、gp120的多個(gè)位點(diǎn)相互作用(LIU S.，J.Biol.Chem，2005，280，1211259-11273)，這與其設(shè)計(jì)原理相異。
作為目前效果最好的多肽類HIV融合抑制劑，T-20和T-1249還存在著一些不足一是它們的分子量相對(duì)其它抗HIV藥物來說較大，合成也相對(duì)困難；另外，由于HIV病毒的高突變性，在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了T-20的抗性毒株。
因此迫切需要有能克服上述不足的多肽類抑制病毒融合劑，這種融合抑制劑應(yīng)具有較短的氨基酸序列，以便于合成；與T-20的作用位點(diǎn)不同；增加藥物的溶解性和穩(wěn)定性，以加強(qiáng)療效并減少藥物用量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的抑制HIV病毒融合的多肽。該類多肽的氨基酸序列較短，作用位點(diǎn)與現(xiàn)有藥物不同，并且水溶性較好，活性高。
本發(fā)明提供的新型多肽的設(shè)計(jì)原理HIV-1的表面糖蛋白gp41的NHR區(qū)由于其高度的保守性可以作為理想的藥物作用靶點(diǎn)，而衍生于CHR區(qū)的多肽因?yàn)榭梢耘cNHR區(qū)相互作用成為該類藥物的先導(dǎo)多肽。本發(fā)明所提供的病毒融合抑制劑衍生于在中國內(nèi)地流行面積最廣和感染人數(shù)最多的B′亞型的RL42毒株的gp41的一段CHR序列，該段序列具有如下的氨基酸排列順序EIWNNMTWMEWEREIDNYTREIYTLIEESQNQ對(duì)HIV-1的表面糖蛋白gp41的序列分析結(jié)果顯示，在NHR區(qū)存在有兩個(gè)非常保守的區(qū)域，其一是“GIVQQQ”(L.T.Rimsky，et al，J.Virol.，1998，72986-993)，該區(qū)域任何一個(gè)氨基酸的改變即可造成T-20的耐藥，因此是T-20的主要作用位點(diǎn)；另外一個(gè)是Leu-565，Leu-566，Leu-568，Thr-569，Val-570，Trp-571，Gly-572，Ile-573，Lys-574，Leu-576，Gln-577等11個(gè)高度保守的氨基酸組成的長的疏水結(jié)構(gòu)域“Cavity”(Eckert D.M.，et al，Cell，1999，99103)。
在設(shè)計(jì)與NHR區(qū)結(jié)合的多肽抑制劑中，發(fā)明者重點(diǎn)考慮了與gp41的三聚體NHR區(qū)上的“Cavity”結(jié)構(gòu)域及其兩端相結(jié)合的序列，以往的抑制劑只考慮CHR序列中Trp628，Trp631，而忽略Trp623的作用。另外，發(fā)明者設(shè)計(jì)了與“Cavity”C端結(jié)合的螺旋序列，以增加與gp41NHR區(qū)域的疏水作用力；除去了對(duì)gp41的三聚體NHR結(jié)合能力較弱的序列，并引入親水氨基酸以增加抑制劑的水溶性，在多肽序列中的“I”及“I+4”位引入可產(chǎn)生離子鍵的酸性或堿性氨基酸，以增加自身形成螺旋的能力，最終形成本本發(fā)明。
本發(fā)明所提供的新型多肽在一級(jí)結(jié)構(gòu)上可以分為兩部分即靠近N端的7-11肽和靠近C端的25肽其序列按通式I排列α-X1-EWNN-X2-TWMEWER-X3-IE-X4-YTKLIY-X5-IL-X6-SQEQ-β通式I其中α選自氨基、乙酰基、馬來?；㈢牾；?、叔丁氧羰基、芐氧羰基、丹?；?；X1選自V、L、I或M中任意一個(gè)氨基酸；X2選自K、M、Q或L中任意一個(gè)氨基酸；X3選自K或E；X4選自N、E或D中任意一個(gè)氨基酸；X5選自D、E、K或R中任意一個(gè)氨基酸；X6選自D、E、K或R中任意兩個(gè)相同或不同氨基酸。
β選自酰胺基、羧基或羧基衍生物；通式I中的字母定義如下C-半胱氨酸；D-天冬氨酸；E-谷氨酸；I-異亮氨酸；K-賴氨酸；L-亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-絲氨酸；T-蘇氨酸；V-纈氨酸；W-色氨酸；Y-酪氨酸。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)在所述25肽的N端加上上述7～11肽后可以在水溶液中形成α-螺旋構(gòu)象，大大增加其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和與疏水結(jié)構(gòu)域“Cavity”的結(jié)合能力。
本發(fā)明的多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用構(gòu)象為D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸替換，以增加生物利用度及提高抑制活性。其中D-型的氨基酸指與組成蛋白質(zhì)的L-型的氨基酸相對(duì)的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括組成蛋白質(zhì)的不常見氨基酸和不組成蛋白質(zhì)的氨基酸，如5-羥基賴氨酸，甲基組氨酸，γ-氨基丁酸，高絲氨酸等；人工修飾的氨基酸指經(jīng)過甲基化，磷酸化等修飾的組成蛋白質(zhì)的常見L-型氨基酸。
本發(fā)明所述多肽可與大分子的載體或者多肽聯(lián)接，這些載體或者多肽包括但是不局限于蛋白質(zhì)，聚乙二醇，脂類物質(zhì)等。
本發(fā)明所述多肽包括其截?cái)嗖糠旨捌浣財(cái)嗖糠值男揎椢?。上述的多肽的截?cái)嗖糠譃榘ê?5-32個(gè)氨基酸的肽。截?cái)嗖糠值男揎椢镏傅氖鞘褂镁垡叶夹揎?、化學(xué)小分子(如馬來酰亞胺)以及蛋白質(zhì)的修飾物。
本發(fā)明所述多肽還包括上述通式加入單個(gè)和多個(gè)氨基酸插入物，替換物和/或缺失物。
本發(fā)明所述多肽還包括上述多肽(通式I)及其截?cái)辔锒嗑垠w，即幾個(gè)(1-4個(gè))相同的多肽通過氨基酸，如賴氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子連接在一起形成多聚體。
以下舉出幾個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的多肽，它們的結(jié)構(gòu)分別如下多肽1NH2-VEWNNKTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ-CONH2SEQ ID No1＝VEWNKTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ多肽2NH2-VEWNNMTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ-CONH2SEQ ID No2＝VEWNNMTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ多肽3NH2-VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2SEQ ID No3＝VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ多肽4Ac-VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2SEQ ID No4＝VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ多肽5Ac-VEWNNKTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2SEQ ID No5＝VEWNNKTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ以下多肽也有較好的抑制HIV病毒融合的作用多肽6NH2-NEKDLLEWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2多肽7NH2-RINNIPWSEAMWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2多肽8NH2-YDINYYTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ-CONH2多肽9NH2-(CVEWNNKTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQCONH2)2本發(fā)明所提供的多肽與T-20在序列結(jié)構(gòu)上顯著不同(T-20的序列結(jié)構(gòu)為Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2)。
本發(fā)明根據(jù)HIV病毒在膜融合過程中與細(xì)胞膜表面的受體分子的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)了可以與病毒表面糖蛋白gp41相結(jié)合的活性多肽。本發(fā)明的作用位點(diǎn)位于gp41分子上三聚體NHR的疏水“Cavity”結(jié)構(gòu)域及兩端，可以在低至納摩爾濃度完全抑制病毒的復(fù)制。
本發(fā)明所提供的多肽的優(yōu)點(diǎn)是1、易于合成T-20和T-1249分別由36個(gè)和39個(gè)氨基酸組成，合成時(shí)采用分段合成然后再連接的方法。本發(fā)明提供的抗HIV融合多肽可以僅由32個(gè)氨基酸組成，但仍具有高于T-20和T-1249的活性，且合成容易。
2、多肽序列和作用位點(diǎn)與現(xiàn)有藥物不同本發(fā)明的多肽序列和T-20、T-1249及其它已報(bào)道的融合多肽序列不同，作用位點(diǎn)也不同，已報(bào)道的多肽，如T-20，C34等主要作用于gp41的NHR疏水“Cavity”及其N端結(jié)合，本發(fā)明提供的多肽與gp41的疏水“Cavity”結(jié)構(gòu)域及兩端結(jié)合。
3、與天然肽和現(xiàn)有藥物相比活性更高我們合成了本發(fā)明多肽C端的25肽，其在1μM仍不能抑制病毒和細(xì)胞的融合，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的與本發(fā)明C端的25肽相似的天然序列肽抑制融合的活性低的結(jié)果一致(EC50為2.8±1.4μM(Marc F，et al.Nature structural biology.1999，6(10)953-960)。我們還合成了本發(fā)明的前端12個(gè)氨基酸的四聚體，其抑制病毒融合的IC50為2.6±0.1μM。文獻(xiàn)中報(bào)道的與本發(fā)明的N端相似的序列肽(SLEQIWNNMTWMQWDK)沒有檢測到活性(Hovanessian A G.，et al.Immunity，2004，21617-627)。
本發(fā)明在進(jìn)行肽鏈設(shè)計(jì)時(shí)重點(diǎn)考慮了與gp41的三聚體NHR區(qū)上的“Cavity”結(jié)構(gòu)域及其兩端相結(jié)合的序列相結(jié)合的序列，除去了結(jié)合能力較弱的序列。同時(shí)引入了親水氨基酸以增加本發(fā)明的水溶性，并在多肽序列中的“I”及“I+4”位引入可產(chǎn)生離子鍵的酸性或堿性氨基酸，使設(shè)計(jì)的序列具有較強(qiáng)的形成α-螺旋的能力，以更好的與上述區(qū)域結(jié)合。經(jīng)上述設(shè)計(jì)得到的本發(fā)明多肽較天然肽的活性有了很大的提高(約500倍)，其中多肽3、4的活性高于現(xiàn)有多肽藥物T-20(見實(shí)施例表3)，且對(duì)T-20的耐藥毒株依然有效(見
4、水溶性好由于在多肽分子中引入親水氨基酸，本發(fā)明的多肽均易溶于水，水溶性的提高便于提高藥物療效及藥物劑型開發(fā)。
本發(fā)明的多肽不僅可抑制HIV病毒與細(xì)胞的膜融合，實(shí)際上，對(duì)一些具有相似的膜融合過程的包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞同樣都有抑制作用，如人呼吸道合胞病毒(RSV)、肝炎病毒等。
本發(fā)明多肽的制備方法本發(fā)明的多肽可以通過多種方法生產(chǎn)如固相合成，液相合成，工程菌表達(dá)等。例如，和T-20的合成路線相似，先在樹脂上分段合成，然后在液相連接個(gè)多肽，以形成本發(fā)明的多肽；合成或提取可以表達(dá)本發(fā)明多肽的DNA序列，連接到某一載體上，并轉(zhuǎn)染到真核或者原核生物的細(xì)胞中，表達(dá)含有本發(fā)明所提供的多肽序列的蛋白質(zhì)或者多肽，經(jīng)提取和純化得到本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明多肽的使用方法本發(fā)明的多肽可以直接單獨(dú)用于HIV感染治療，也可以與一種或多種抗HIV藥物聯(lián)合使用，以達(dá)到提高整體治療效果的目的。這些抗HIV藥物來自于(但不局限于)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和進(jìn)入和融合抑制劑中的一種或幾種。上述的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括AZT、3TC、ddI、ddT、d4T、Abacavir、Nevirapine、Efavirenz和Delavirdine的一種或幾種。上述的蛋白酶抑制劑包括Saquinavir mesylate、Idinavir、Ritonavir、Amprenavir、Kaletra、Nelfinavir和mesylate的一種或幾種。上述的進(jìn)入和融合抑制劑包括T-20、T-1249、C34、IQN37、5-Helix、TAK-779、SCH-C及天然提取的蛋白質(zhì)等具有抑制病毒進(jìn)入的功能的多肽。
可以將含有本發(fā)明的多肽或其截?cái)辔?、衍生物及組合物的藥物直接給予病人，或者與適宜的載體或者賦型劑混合后給予病人，以達(dá)到治療HIV病毒感染的目的。這里的載體材料包括水溶性載體材料，如聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，有機(jī)酸等；難溶性載體材料，如乙基纖維素，膽固醇硬脂酸酯等；腸溶性載體材料，如醋酸纖維素酞酸酯和羧甲乙纖維素等。使用這些材料，可以制成如下的劑型片劑、栓劑、溶液、膠囊、氣霧劑、泡騰片和滴劑等。
使用上述的劑型，本發(fā)明所提供的抗HIV藥物及其衍生物、截?cái)辔锖皖愃莆锛敖M合物可以經(jīng)注射給藥，包括靜脈注射、皮下注射、腔內(nèi)注射等；呼吸道給藥，如鼻腔給藥；粘膜給藥，如鼻腔，在局部起效或經(jīng)粘膜吸收全身發(fā)揮作用；腔道給藥，如經(jīng)直腸和陰道給藥，局部起效或者經(jīng)吸收全身發(fā)揮作用。上述給藥途徑優(yōu)選的是經(jīng)注射給藥。


圖1是N36與多肽3的螺旋構(gòu)象及二者相互作用后構(gòu)象的改變，圖中，▲是復(fù)合物，●是多肽3，■是N36；圖2是N36與多肽6的螺旋構(gòu)象及二者相互作用后構(gòu)象的改變，▲是復(fù)合物，●是多肽6，■是N36；圖3是N36與多肽7的螺旋構(gòu)象及二者相互作用后構(gòu)象的改變，▲是復(fù)合物，●是多肽7，■是N36；圖4是N36與多肽9的螺旋構(gòu)象及二者相互作用后構(gòu)象的改變；▲是復(fù)合物，●是多肽9，■是N36；圖5是多肽3的HPLC分析圖；圖6是多肽4及其與N36形成的復(fù)合物的凝膠HPLC分析，圖中，1是復(fù)合物，2是多肽4，3是N36；圖7是多肽6及其與N36形成的復(fù)合物的凝膠HPLC分析，圖中，1是復(fù)合物，2是多肽6，3是N36。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1多肽的合成和純化本發(fā)明提供的多肽可以在美國應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI 433型固相合成儀上合成，多肽的修飾手工完成。該合成使用的氨基酸以Fmoc保護(hù)(美國Advanced Chemtech公司產(chǎn)品)，使用的樹脂為Rink樹脂(美國Advanced Chemtech公司產(chǎn)品)。合成時(shí)使用1-羥基苯并三唑(HoBt)(美國Advanced Chemtech公司產(chǎn)品)溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)(PE公司)中作為活化劑，使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(Acros公司)作為偶聯(lián)劑，使用哌啶(Piperidine)(上海吉爾生化)除去保護(hù)基。氨基酸均具有L-型化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們被依次偶聯(lián)在Rink樹脂上。
Rink樹脂的使用量與Fmc保護(hù)氨基酸的使用量按1∶5進(jìn)行，保護(hù)氨基酸如下Fmoc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH。氨基酸的偶聯(lián)按照儀器操作規(guī)程的進(jìn)行。
用人工方法將N-末端乙?；?。在反應(yīng)腔中加入肽樹脂、N-甲基吡咯烷酮(NMP)(用量為肽樹脂重量的8-15倍)、醋酸酐(1g樹脂上用0.5ml)，二異丙基乙酰胺(DIEA)(1g樹脂上用0.7ml)，在室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，樹脂用二氯甲烷、甲醇及N-甲基吡咯烷酮(NMP)各洗滌三次。
上述合成后的樹脂用裂解液(組成二巰基蘇糖醇(DTT)5％，水(5％)，三氟乙酸(TFA)88％，和三異丙基硅烷(TIPS)2％)(樹脂與裂解液的用量比例為0.5-1.0克樹脂/10毫升裂解液)裂解2.5～3.0小時(shí)，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分三氟乙酸后，用預(yù)冷的無水乙醚進(jìn)行沉淀，過濾得到初肽，用稀氨水溶解固體，濾液凍干。
上述凍干粗肽用反相HPLC進(jìn)行純化，純化柱為反相C18半制備柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)，梯度洗脫液為含有不同梯度的乙腈(含0.1％TFA)/水(含0.1％TFA)，收集目標(biāo)峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽。用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS Reflex III，Micromass公司)測定各多肽的分子量，結(jié)果與理論計(jì)算值相符。
多肽3的合成具體步驟如下稱取0.17gRink樹脂(0.1mmol，取代率0.6g/mmol)，各Fmoc保護(hù)氨基酸的用量為0.5mmol，以1-羥基苯并三唑(HoBt)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(Acros公司)為縮合劑，哌啶(Piperidine)(上海吉爾公司)脫保護(hù)劑，按美國應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI 433型固相合成儀的操作說明，適當(dāng)延長偶合時(shí)間(60-90min)及脫保護(hù)試劑時(shí)間(20-30min)，合成肽-樹脂。得肽樹脂0.52g。
取上述肽-樹脂0.52g，放入10ml裂解液中(組成0.5g二巰基蘇糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三異丙基硅烷(TIPS)，裂解3.0小時(shí)，用G3玻璃砂芯漏斗過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分濾液至殘余液體約2ml后，用100ml預(yù)冷的無水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置1小時(shí)，G4玻璃砂芯漏斗過濾得到初肽，用1％的稀氨水溶解固體，濾液凍干得粗肽0.33g，純度約為60％。
取粗肽0.1g用HPLC純化，色譜柱為反相C18半制備柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)。流動(dòng)相A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脫梯度為1-5min 10-45％A；5-30min，45-65％A，流速3ml/min，214nm檢測，每次上樣5mg。收集目標(biāo)組份，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽20mg。質(zhì)譜測定分子量為4163.20Da(理論計(jì)算值4162.67Da)。
多肽3的純度分析見附圖5，分析條件如下色譜柱Kromasil C-18柱(北京分析儀器廠，5μm，4.6×250mm)。流動(dòng)相A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脫梯度為1-5min 10-35％A；5-30min，35-65％A，流速1ml/min，214nm檢測各多肽HPLC的保留時(shí)間見表1。
表1 9個(gè)多肽的HPLC分析的出峰時(shí)間

注多肽6、8、9的洗脫條件同多肽3，其余5個(gè)多肽的分析條件除洗脫梯度(為1-5min10-25％A；5-32min，25-80％A)和色譜柱(Kromasil C-18柱，5μm，4.6×250mm)外均相同。
實(shí)施例2多肽3、6、7、9二級(jí)結(jié)構(gòu)的CD譜測定多肽在水溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)測定依下述方法進(jìn)行儀器JASCO J-715-150L型參數(shù)選擇分辨率0.1nm，波寬5.0nm，響應(yīng)時(shí)間4.0s，波長200-250nm溶解緩沖液50mM NaH2PO4(含150mM NaCl)pH＝7.2工作濃度10μMN36及本發(fā)明提供的多肽3、6、7、9用水溶解，濃度為2.5mM，然后以磷酸鹽緩沖液稀釋至10μM，在上述的參數(shù)下分別測定二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后將等量的N36及本發(fā)明混合后以磷酸鹽緩沖液稀釋至各自濃度均為10μM，37℃水浴中溫育30min，取溫育后的混合物在上述的參數(shù)下分別測定混合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
典型的α-螺旋在CD圖上顯示為208nm和222nm處有雙負(fù)峰，附圖1～4是N36與本發(fā)明多肽的螺旋構(gòu)象及二者相互作用后構(gòu)象的改變。從圖中可以看出，本發(fā)明的多肽與衍生于HIV gp41NHR區(qū)的N36有相互作用，二者的復(fù)合物在220nm處形成明顯的負(fù)峰。
實(shí)施例3凝膠HPLC檢測本發(fā)明的多肽和N36的結(jié)合作用凝膠柱TSK-G3000SWxl，5μm，7.8×300mm(日本TOSOH公司產(chǎn)品)儀器Bio-Rad 13507泵，Bio-DimensionTMUV/VIS檢測器流動(dòng)相50mM NaH2PO4(含150mM NaCl)pH＝7.2梯度0.8ml/min等梯度洗脫檢測波長UV 214nm步驟將N36及本發(fā)明的多肽4先以去離子水溶解，濃度為2.5mM。然后分別用50mMNaH2PO4(含150mM NaCl，pH＝7.2)稀釋至0.208mM，稀釋后的溶液各取30μl分別進(jìn)樣分析，按照上述條件進(jìn)行洗脫。取稀釋后的各溶液30μl，混合后在37℃水浴中溫育30min，取全部混合物上樣，分析條件同上。
結(jié)果在凝膠柱中，物質(zhì)依分子量大小進(jìn)行分離，其中分子量大的物質(zhì)首先被洗脫出來。在本試驗(yàn)中，本發(fā)明的多肽和N36形成復(fù)合物后分子量增大，先被洗脫出來，后洗脫的為單體分子。圖6顯示的第一峰(t＝12.2min)是多肽4及其與N36形成的復(fù)合物的洗脫峰；圖7顯示的第一峰是多肽6及其與N36形成復(fù)合物的洗脫峰(t＝12.50min)。
表2各多肽及與N36形成的復(fù)合物的保留時(shí)間

實(shí)施例4本發(fā)明的多肽對(duì)HIV病毒抑制作用本發(fā)明提供的多功能HIV進(jìn)入抑制劑具有抑制病毒和細(xì)胞膜融合的作用，通過以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定。所用細(xì)胞和病毒均來自于美國NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram。
實(shí)驗(yàn)一對(duì)HIV-1介導(dǎo)的細(xì)胞間的融合抑制作用HIV-1IIIB病毒感染的人淋巴細(xì)胞H9以熒光染料Calcein-AM(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)染色，然后與人淋巴細(xì)胞MT-2按一定的比例混合后加在96孔板上，分別加入本發(fā)明的9個(gè)多肽(見表3)，在37℃培養(yǎng)2小時(shí)，以未加本發(fā)明的多肽的細(xì)胞作為對(duì)照。在帶有標(biāo)尺的熒光倒置顯微鏡(Zeiss，Germany)下觀察融合和未融合的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)計(jì)算融合百分率和半數(shù)抑制劑量(IC50)、90％抑制劑量(IC90)。(Jiang S，et al.Procedings of SPIE.2000，3926，212-219.及Jiang S，et al.J.Virol.Meth.1999，80，85-96.)結(jié)果見表3實(shí)驗(yàn)二病毒中和作用以含10％胎牛血清(Gibco Laboratories)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco Laboratories，GrandIsland，NY)懸浮人淋巴細(xì)胞MT-2，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/毫升，然后鋪板.每孔體積為200μl。以100倍TCID50(半數(shù)感染劑量)濃度的HIV-1IIIB病毒進(jìn)行感染。本發(fā)明的多肽孔經(jīng)梯度稀釋后加入上述經(jīng)感染的病毒培養(yǎng)基中，以未加本發(fā)明的多肽的孔作為對(duì)照，然后培養(yǎng)過夜。第二天換為新鮮的培養(yǎng)基。37℃經(jīng)過四天的培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)物上清100μl，加入等體積的含5％Triton X-100的水，ELISA方法檢測p24的含量(Jiang，S，et al.J.Exp.Med.1991，174，1557-1563)。
結(jié)果見表3。
表3 9個(gè)多肽對(duì)HIV病毒的抑制活性

對(duì)表3的說明1、名詞解釋CF細(xì)胞融合/cell fusion；VN病毒中和試驗(yàn)/viral neutralization；2、多肽的純度細(xì)胞融合和中和實(shí)驗(yàn)所用的多肽均經(jīng)純化，除多肽4外(純度70％)純度大于90％。試驗(yàn)中以T-20作為對(duì)照，后者的純度大于95％。
3、上述每個(gè)數(shù)值均測四次，并取平均值。
實(shí)施例5本發(fā)明的多肽對(duì)T-20耐藥性HIV細(xì)胞株的融合抑制作用方法同實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)一，所不同的是使用臨床分離的T-20抗性毒株(92US657)感染細(xì)胞，其余相同。
本發(fā)明所提供的多肽3可以在1.0uM完全抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，而T-20則在3.2uM仍不能抑制病毒的復(fù)制。
結(jié)論多肽3抑制病毒的復(fù)制活性高于對(duì)照藥物T-20。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120>抑制HIV病毒融合的多肽及其用途<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>1Val Glu Trp Asn Asn Lys Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Lys Ile Glu1 5 10 15Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Glu Ile Leu Lys Lys Ser Gln Glu Gln20 25 30<210>2<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>2Val Glu Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Lys Ile Glu1 5 10 15Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Glu Ile Leu Lys Lys Ser Gln Glu Gln20 25 30
<210>3<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>3Val Glu Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu1 5 10 15Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln20 25 30<210>4<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>4Val Glu Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu1 5 10 15Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln20 25 30<210>5<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>5Val Glu Trp Asn Asn Lys Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu1 5 10 15Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln20 25 30
權(quán)利要求
1.通式I多肽α-X1-EWNN-X2-TWMEWER-X3-IE-X4-YTKLIY-X5-IL-X6-SQEQ-β通式I其中α選自氨基、乙酰基、馬來?；㈢牾；⑹宥⊙豸驶?、芐氧羰基、丹?；?；X1選自V、L、I或M中任意一個(gè)氨基酸；X2選自K、M、Q或L中任意一個(gè)氨基酸；X3選自K或E；X4選自N、E或D中任意一個(gè)氨基酸；X5選自D、E、K或R中任意一個(gè)氨基酸；X6選自D、E、K或R中任意兩個(gè)相同或不同氨基酸；β選自酰胺基、羧基或羧基衍生物；通式I中其余的字母定義如下C-半胱氨酸；D-天冬氨酸；E-谷氨酸；I-異亮氨酸；K-賴氨酸；L-亮氨酸；M-蛋氨酸N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-絲氨酸；T-蘇氨酸；V-纈氨酸；W-色氨酸；Y-酪氨酸。
2.權(quán)利要求1所述的通式I多肽，其中α選自氨基或乙?；沪逻x自酰胺基。
3.權(quán)利要求1所述的通式I多肽，其中X1是V；X2選自K或M；X4選自E或N；X5選自E或KX6選自E和K中兩個(gè)相同或不同氨基酸。
4.權(quán)利要求1所述的通式I多肽是以下多肽多肽1NH2-VEWNNKTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ-CONH2多肽2NH2-VEWNNMTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ-CONH2多肽3NH2-VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2多肽4Ac-VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2多肽5Ac-VEWNNKTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2。
5.用權(quán)利要求1、2、3或4中任一權(quán)利要求所述的多肽制備抑制病毒包膜融合的藥物的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用通式I多肽制備抑制病毒包膜融合的藥物的用途，所述病毒是HIV病毒、人呼吸道合胞病毒或肝炎病毒。
7.用權(quán)利要求1、2、3或4中任一權(quán)利要求所述的多肽制備治療HIV感染藥物的用途。
8.一種抑制病毒包膜融合的藥物組合物，其特征是含有權(quán)利要求1、2、3或4中任一權(quán)利要求所述的多肽。
9.權(quán)利要求8所述抑制病毒包膜融合的藥物組合物，所述病毒是HIV病毒、人呼吸道合胞病毒或肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制HIV病毒融合的多肽。根據(jù)HIV病毒在膜融合過程中與細(xì)胞膜表面的受體分子的作用機(jī)制，本發(fā)明設(shè)計(jì)了可以與病毒表面糖蛋白gp41相結(jié)合的活性多肽。所述多肽的作用位點(diǎn)位于gp41分子上三聚體NHR側(cè)面的“長穴”及兩端，能有效抑制HIV病毒的復(fù)制。本發(fā)明的多肽與現(xiàn)有藥物相比，分子量小、活性高、水溶性好。用本發(fā)明所述多肽可以制備抑制多種包膜病毒感染的藥物。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1793170SQ20051012647
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月14日
發(fā)明者戴秋云, 成健偉, 何玉先, 董銘心 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所