專利名稱：聚乙二醇－滅活疫苗粘膜免疫劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫制劑。具體涉及聚乙二醇濃縮滅活病毒疫苗制備粘膜免疫劑。
背景技術(shù)：
為預(yù)防病毒性感染的呼吸道疾病，如嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)、病毒性流感及病毒性禽流感等，發(fā)展疫苗是十分迫切的需要。鑒于SARS病毒和流感病毒等可在組織細(xì)胞中培養(yǎng)，并可達(dá)到較高滴度，目前國內(nèi)外均首選研究滅活疫苗。有研究表明，由于某些病毒發(fā)病機(jī)理中可能有抗體增強(qiáng)反應(yīng)(antibody enhancement)，IgG抗體可能在此階段中產(chǎn)生不良反應(yīng)；某些病毒的全病毒疫苗(如流感病毒)注射難以誘生局部免疫反應(yīng)等現(xiàn)象。因此，經(jīng)病毒自然感染途徑進(jìn)行局部鼻粘膜免疫方式，漸受重視。鼻腔粘膜血管和淋巴管豐富，經(jīng)局部鼻腔免疫，疫苗易于進(jìn)入局部淋巴組織，誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答。經(jīng)鼻腔免疫可以主要誘生局部IgA抗體，可阻斷病毒經(jīng)呼吸道侵入人體，有效防治呼吸道病毒病的發(fā)生和發(fā)展。在其他微生物感染，如HIV等已證明局部粘膜免疫可誘生局部免疫應(yīng)答及一定量的血清抗體。
藥用級(jí)聚乙二醇(PEG)產(chǎn)品無毒、無刺激、具有良好的水溶性，其系列產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，可作為藥劑的輔料。隨著新藥的不斷開發(fā)，其用途越來越廣，常用作藥物載體，分散增溶劑等。已有研究利用聚乙二醇改造醫(yī)藥產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)-多肽類藥物，如α與β干擾素、白介素等，經(jīng)聚乙二醇改造的蛋白質(zhì)-多肽類藥物的結(jié)構(gòu)可延長藥物作用時(shí)間，減少用藥次數(shù)，而大大降低使用成本。改良型PEG-干擾素是一種更為有效的乙肝治療藥物，與標(biāo)準(zhǔn)干擾素比較，每周只需注射1次，且接受PEG-干擾素治療者的顯效反應(yīng)率要高出一倍左右。聚乙二醇化藥逐漸增多，如PEG化喜樹堿、PEG化紫杉醇、PEG化多肽類藥物和PEG化抗高血壓藥物等。
局部鼻粘膜免疫一般采用滴鼻或噴霧給藥。滴鼻疫苗以在鼻腔局部滯留時(shí)間較長而吸收良好為佳，同時(shí)疫苗病毒的濃度高而體積小并有利于疫苗制劑的穩(wěn)定，且對鼻粘膜不產(chǎn)生刺激作用。目前進(jìn)行的研究的疫苗控釋制劑主要是微球或其它微粒制劑，通過材料的選擇和包裹程度，可控制疫苗釋放速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)穩(wěn)定性和免疫原性的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑。具體涉及聚乙二醇濃縮滅活病毒疫苗制備粘膜免疫劑。
本發(fā)明聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑采用藥用級(jí)分子量4000～10000的聚乙二醇，濃縮、純化滅活病毒液及制備疫苗，利用聚乙二醇作為免疫佐劑對滅活疫苗蛋白修飾、連接，增強(qiáng)疫苗的穩(wěn)定性和免疫原性。
本發(fā)明所述的疫苗可以是蛋白疫苗或亞單位疫苗，所述的滅活病毒可以是經(jīng)呼吸道感染的病毒，如流感病毒、SARS冠狀病毒等。
本發(fā)明通過下述方法和步驟進(jìn)行，采用20-35％藥用級(jí)聚乙二醇按1∶2～1∶5的比例，加入已滅活的病毒培養(yǎng)液，按常規(guī)方法孵育24～72小時(shí)，經(jīng)聚乙二醇連接的病毒通過高速離心濃縮純化，病毒沉淀物溶解于磷酸緩沖鹽水使?jié)饪s50～200倍，即制成粗制滅活病毒粘膜免疫制劑。
本發(fā)明聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑其中聚乙二醇的使用濃縮可根據(jù)不同疫苗進(jìn)行調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用聚乙二醇不僅作為疫苗濃縮和純化的制劑，而且可作為疫苗的緩釋劑以延長疫苗在鼻腔的滯留時(shí)間，提高鼻粘膜吸收，且對局部鼻粘膜和纖毛無損傷。同時(shí)聚乙二醇將滅活疫苗蛋白連接的作用，具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑作用，特別是對粘膜免疫疫苗制劑，不僅可誘生局部免疫應(yīng)答產(chǎn)生分泌型IgA抗體，而且可誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答，血清中出現(xiàn)保護(hù)性抗體。
本發(fā)明將聚乙二醇(藥用級(jí))作為滴鼻病毒疫苗緩釋液，能增強(qiáng)疫苗的穩(wěn)定性，同時(shí)增強(qiáng)疫苗的免疫原性，特別是增強(qiáng)局部粘膜免疫應(yīng)答，具有佐劑樣的作用。


圖1是免疫小鼠血清抗SARS冠狀病毒的中和抗體效價(jià)，圖2是PEG-滅活SARS病毒疫苗粘膜免疫劑免疫小鼠的氣管-肺盥洗液中抗SARS FITC-IgA的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 聚乙二醇濃縮滅活SARS冠狀病毒將藥用級(jí)聚乙二醇6000配制成35％聚乙二醇/1.75M NaCl。按1∶5量加入已滅活的SARS冠狀病(CGMCC No.0977)毒液，置4℃孵育24小時(shí)。離心13,000rpm，30分鐘。去除上清，沉淀物溶于磷酸緩沖液(0.01M PBS，PH7.2)，使病毒濃縮至100倍，得粗制滅活SARS冠狀病毒粘膜免疫制劑。
實(shí)施例2 聚乙二醇濃縮滅活裂解甲型流感病毒將藥用級(jí)聚乙二醇8000配制成30％聚乙二醇/1.75M NaCl。按1∶4量加入已滅活的裂解甲型流感病毒液，H3N3巴拿馬株(2003年國內(nèi)應(yīng)用的生產(chǎn)株)置4℃孵育24小時(shí)。離心13,000rpm，30分鐘。去除上清，沉淀物溶于磷酸緩沖液(0.01M PBS，PH7.2)，使病毒濃縮至50倍，得粗制滅活禽流感病毒粘膜免疫制劑。
實(shí)施例3 聚乙二醇增強(qiáng)滴鼻SARS冠狀病毒疫苗的免疫原性SARS冠狀病毒(G250)滅活疫苗，免疫劑量每只小鼠50μg；PEG-SARS冠狀病毒滅活粘膜免疫制劑，免疫劑量每只小鼠20μg，分別經(jīng)滴鼻免疫Balb/c小鼠，每隔2周免疫1次，共免疫4次。第4次將強(qiáng)免疫后2周將小鼠處死，取血分離血清，并用磷酸緩沖液灌洗小鼠的氣管和肺。血清和氣管-肺灌洗液保存于-70℃，待檢。血清用于檢測抗-SARS冠狀病毒的中和抗體；氣管-肺灌洗液用于檢測抗-SARS冠狀病毒IgA(間接免疫熒光法)。結(jié)果顯示PEG-滅活疫苗滴鼻劑的免疫明顯高于滅活疫苗，(陰性結(jié)果，細(xì)胞不顯熒光)，血清中和抗體效價(jià)高于單獨(dú)滅活疫苗，更為有意義的是PEG-PEG-滅活疫苗滴鼻劑局部誘導(dǎo)的粘膜免疫應(yīng)答(IgA)明顯高于單獨(dú)滅活疫苗以及氫氧化鋁-滅活疫苗，提示聚乙二醇通過使病毒顆粒之間連接可以增強(qiáng)疫苗的免疫原性，特別是增強(qiáng)局部粘膜免疫應(yīng)答，具有佐劑樣的作用。此外，上述滅活病毒通過聚乙二醇連接后分子變大，蛋白穩(wěn)定時(shí)間延長，4℃保存，半年后仍然具有免疫原性。
表1是間接免疫熒光檢測免疫小鼠氣管-肺灌洗液中抗-SARS冠狀病毒IgA。
表1Immunized The way ofMouseFluorescence intensity of IF-IgA*Groups inoculation numberSARSV-alum s.c. 2 - -SARSV i.n. 5 - - -- ±SARSV-CpG i.n. 5 ++ + +±±SARSV - i.n. 5 +++ +++ ++ + ±SARSV-PEG i.n. 5 ++ ++ ++ ++ ++
權(quán)利要求
1.聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是以藥用級(jí)分子量4000～10000的聚乙二醇，濃縮、純化滅活病毒，制成疫苗粘膜免疫劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的滅活病毒是經(jīng)呼吸道感染的病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的滅活病毒是流感病毒或SARS冠狀病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的疫苗可以是蛋白疫苗或亞單位疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的聚乙二醇濃度為20-35％，聚乙二醇∶滅活病毒培養(yǎng)液比例為1∶2～1∶5，滅活疫苗濃縮50～200倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的聚乙二醇作為滅活病毒疫苗的緩釋劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的聚乙二醇作為稀釋液和穩(wěn)定劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是所述的聚乙二醇為免疫佐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的聚乙二醇-滅活疫苗粘膜免疫劑，其特征是其中聚乙二醇的使用濃縮可根據(jù)不同疫苗進(jìn)行調(diào)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種聚乙二醇－滅活疫苗粘膜免疫制劑。本發(fā)明采用藥用級(jí)聚乙二醇，濃縮、純化滅活病毒液及制備疫苗，利用聚乙二醇作為免疫佐劑對滅活疫苗蛋白修飾、連接，增強(qiáng)疫苗的穩(wěn)定性和免疫原性，及局部粘膜免疫應(yīng)答。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明能延長疫苗在鼻腔的滯留時(shí)間，提高鼻粘膜吸收，且對局部鼻粘膜和纖毛無損傷。免疫效果明顯高于滅活疫苗，4℃保存，半年后仍然具有免疫原性。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1562367SQ20041001752
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日
發(fā)明者瞿滌, 聞?dòng)衩? 姚忻 申請人:復(fù)旦大學(xué)